Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Full huddefekt modell for å evaluere vaskularisering av biomaterialer Published: August 28, 2014 doi: 10.3791/51428
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1, 1,4
1Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital rechts der Isar, Technische Universität München, 2Institute for Signal Processing, University of Lübeck, 3Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zürich, 4FONDAP Center for Genome Regulation, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile

Summary

Vascularization er nøkkelen til tilnærminger i vellykket tissue engineering. Derfor er pålitelige teknologier som kreves for å vurdere utviklingen av vaskulære nettverk i vev-konstruksjoner. Her presenterer vi en enkel og kostnadseffektiv metode for å visualisere og kvantifisere vascularization in vivo.

Abstract

Utilstrekkelig vascularization anses å være en av de viktigste faktorene som begrenser den kliniske suksessen vev-konstruert konstruksjoner. For å vurdere nye strategier som tar sikte på å bedre vascularization, er pålitelige metoder som kreves for å gjøre in-vekst av nye blodkar i bio-kunstig stillaser synlige og kvantifisere resultatene. I løpet av de siste par årene, har vår gruppe innført et komplett hud defekt modell som gjør det mulig direkte visualisering av blodårer ved transilluminasjon og gir mulighet for kvantifisering gjennom digital segmentering. I denne modellen, en kirurgisk skaper komp hud defekter i ryggen av mus, og erstatter dem med materialet som testes. Molekyler eller celler av interesse kan også bli innarbeidet i slike materialer for å undersøke deres potensielle effekt. Etter en observasjonsperiode på ens eget valg, er materialer Eksplanterte for evaluering. Bilaterale sår gi muligheten for å gjøre interne sammenligninger thpå minimere gjenstander blant enkeltpersoner så vel som for å redusere antall dyr som trengs for studien. I forhold til andre metoder, vår fremgangsmåte gir en enkel, pålitelig og kostnadseffektivt analyse. Vi har implementert denne modellen som en rutinemessig verktøy for å utføre høy oppløsning screening ved testing vascularization av ulike biomaterialer og bio-aktiverings tilnærminger.

Introduction

I de siste tiårene har tissue engineering åpnet opp en ny terapeutisk alternativ for å erstatte vev defekter med kroppens egne celler en. For å støtte den fysiologiske prosessen med vev gjenfødelse, er stillasene utformet som et biologisk nedbrytbart struktur, som gir et scenario der celler fra sårbunnen kan vokse og gjenopprette feilen 2,3.

Utilstrekkelig vascularization er ansett å være den viktigste hindringen, som holder tilbake den kliniske gjennombrudd bioartificial stillaser fire. Med innvekst av celler, blir behovet for næringsstoffer og oksygen øker og vaskularisering av materialet viktig. Utilstrekkelig eller forsinket vascularization kan derfor føre til sentral nekrose av vev-utviklet produkter fem. I tillegg blodkar gi immun kompetente celler og fjerne de metabolske rester i regenererende området. Høye infeksjonsrater og lav regenerering er barenoen av konsekvensene av utilstrekkelig blod perfusjon observert i tissue engineering, som har som mål å være avverget ved å øke vaskularisering av stillasene 6,7.

Flere strategier som tar sikte på å bedre vascularization fokus på den viktige rollen av biomateriale selv og mikrostrukturen av stillaset. Det er intensiv forskningsinnsats for å utvikle nye tilnærminger i skiftende helbredelsesprosessen fra reparasjon til regenerering, og dermed (re) genererer en vev med de nærmeste fysiologiske egenskapene til en å bli restaurert 8,9. Biomaterialer som ble studert og vurdert med hensyn til deres regenererende potensial inkludert kollagen, fibrin, kitosan og alginat 10,11. Disse biomaterialer kan brukes og kombineres som en ryggrad for å bygge nye stillasene ved hjelp av ulike strategier som vev decellularization, selvbygging, rapid prototyping og electro 12. For å ENHning kroppens egen evne til reproduksjon, kan stillaser bli bioactivated. Inkorporering av rekombinant angiogen vekstfaktorer 13 eller gen-vektorer som koder for slike faktorer som 14 har vist seg å forbedre vaskulariseringen av stillaset. Bruken av stamceller har blitt mye vist seg å være en lovende strategi for å forbedre vaskulariseringen, hvor mesenchymale stromale celler og endoteliale stamceller har fått mest oppmerksomhet 15,16. Andre tilnærminger forsøke å bygge konstruksjoner som inneholder prefabrikkerte fartøy nettverk før transplantasjonen 17. Til tross for intensiv innsats i stillaset utforming og deres bio-aktivering, har ingen strategi forbedret vascularization på et klinisk signifikant nivå, og med unntak av dermal utskiftninger i massive brannskader, er oversettelsen av bioengineered materialer inn i klinisk rutine bare foregår nølende 18 .

En av grunnene til at vascularizationav kunstig vev konstruerer er fortsatt et uløst problem, er vanskeligheten for å vurdere effekten av ny teknologi i in vivo tilnærminger. Selv om in vitro eksperimenter kan gi viktig innsikt i vaskularisering potensialet av stillas, er egnede dyremodeller som kreves for å studere viktige parametere som biokompatibilitet av materialet, sikkerheten og effektiviteten av behandlingen, og av særlig betydning, at vaskularisering i vevet konstruere. Derfor, for å pålitelige verktøy visualisere og kvantifisere blodårer nettverk in vivo er avgjørende.

I denne studien presenterer vi en enkel og pålitelig metode som gjør det mulig for visualisering og kvantifisering av det vaskulære nettverket inne eksplanterte stillaser. Denne metoden er basert på vev transilluminasjon og digital segmentering. Etter denne metode er ikke-invasiv, tillater det ytterligere molekylære og histologiske analyser av målet materiale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av stillas

  1. Generere prøver av stillasene ved hjelp av 12 mm biopsi stempler.
  2. Å introdusere bioaktive molekyler eller celler i stillaset, avløp stillasene ved å klemme forsiktig dem med en steril kompress. Deretter rehydrere stillasene ved å tilsette 160 pl av en oppløsning inneholdende de biologisk aktive molekyler eller celler av interesse. Dobbeltsjekk suksessen bioaktive med celler gjennom metabolske analyser som MTT-analyser.
  3. Hvis det er nødvendig, fikse forbindelsene eller celler som skal testes inn i stillaset ved å levere dem, for eksempel i et fibrin-trombin-løsning eller en hydrogel, igjen gjennom rehydrering som beskrevet i trinn 1.2.
    MERK: Dette trinnet kan være av nyttig når forbindelser eller cellene ikke mekanisk feste til materialet. Man kan også styre frigjørings dynamikken av forbindelsene ..
  4. Forbered titanized maskene, som vil bli plassert under hver stillas i alle eksperiment og kontrollgruppe, etter Cutting ut rundt formede stykker, ca 14 mm i diameter.
    MERK: titanized mesh fungerer som en fysisk grense som kreves for å avgrense den regenererte vev fra såret seng.

2. Dyr

  1. Før gjennomføring av den presenterte modellen, ta kontakt med de tilsvarende beskyttelse lover dyr og innhente tillatelse fra lokale myndigheter. I dette arbeidet ble alle eksperimenter utført med mus, i henhold til gjeldende tyske dyrevernloven og godkjent av District regjeringen i Oberbayern (Regierung von Oberbayern).
  2. Velge dyret og press forsiktig. Selv om modellen ble etablert for mus, kan det oversettes til andre vanlige dyr, slik som rotter, kaniner eller svin.
  3. I tilfelle du arbeider med pelsdyr, barbere baksiden av dyrene før implantasjon av stillasene.
    MERK: Dette arbeidet bruker mus på 6 til 8 ukers alder med en kroppsvekt mellom 20 g og 25 g, men ulike aldre og bOdy vekter kan også brukes.

3. Anestesi

  1. Gjennomføre operasjonen under sterile betingelser. For å opprettholde dyrets normale kroppstemperatur ved å bruke en oppvarmingsmatte.
  2. Før inhalativ anestesi dyrene mottar Buprenorphin i en dose på 0,05-0,1 mg / kg kroppsvekt, subkutant hver 8. time.
  3. Plasser dyret i henhold Inhalativ anestesi (isofluran) eller bruke tilsvarende standard prosedyrer. Bekreft anestesi enten ved å klemme forsiktig dyrets tær eller gjennom en hud klype.
  4. For å hindre exsiccosis, injisere 0,5 ml fysiologisk saltoppløsning subkutant i begynnelsen av operasjonen.

4. Eksisjon av huden

  1. Plasser dyret i en utsatt posisjon og markere midtlinjen av musen er tilbake med en fin spiss permanent penn (figur 1A).
  2. Definer excision området. Plasser defekter i området vist i Figure 1C. Merk at dersom feilen er plassert for caudally, dyr er mer utsatt for å fjerne dressinger og stillasene.
  3. Lag runde bilaterale feil med en 10 mm biopsi punsj (figur 1B). Punch bør nøye tvunget mot huden og må ikke brukes til å kutte helt gjennom huden, men å avgrense excision området (Tall 1C & 1E).
  4. Forsiktig løft av markert hud med pinsett og et langsgående snitt langs den merkede sirkelen hjelp av gode kirurgiske saks (figur 1F). I tilfelle av blødning, nøye komprimere med steril kompress. En trinn-for-trinn beskrivelse av eksisjon er vist i figur 1.
    MERK: Feilen er laget med en mindre trøkk enn en for generering av stillas, for å kompensere utvidelsen av mangelen på grunn av hudens elastisitet.

5. Stillas Implantasjon

  1. For å gjøre plass til Titakjent mesh, forlenge separasjon av hud og underliggende vev på såret grenser for 2-4 mm (figur 2A).
  2. Plasser titanized mesh i defekten direkte på såret seng og under sårkantene (Tall 2A & B).
  3. Sted stillaser direkte over mesh.
  4. Suturer stillasene til de tilstøtende sårkantene med 4 til 6 enkle knop, forlater kantene litt over stillaset (figur 2C).
    MERK: Unngå bruk av biologisk nedbrytbare sting.
  5. Suturer en gjennomsiktig sårbandasjen ovenfor defekter for å beskytte stillaset samtidig som den tillater overvåking av sårområdet (figur 2D).

6. Postoperativ Care

  1. Hold en mus per bur for å avverge gjensidig manipulasjon av bandasjen og stillaser.
  2. Ut den generelle tilstand til dyret på en daglig basis ved å observere motorisk aktivitet, kroppsvekt, tegn på smerte, toleransetil dressing og auto-lemlestelse. Også overvåke sårområdet for blødning, lokale og systemiske tegn på infeksjon, og stillingen av bandasjen.
  3. For å minimalisere smerte for dyret, injisere Buprenorphin daglig i en dose på 0,05-0,1 mg / kg kroppsvekt eller tilsvarende smertestillende medikamenter.
  4. Hvis musen fjerner eller skader såret dressing, erstatte eller sette den på igjen under narkose.

7. Eutanasi og Forklaring av stillaset

  1. På ønskede tidspunkter, ofre dyrene ved overdoser av Pentobarbital (150 mg / kg).
  2. Viser stedet huden excision med en permanent markør, som bør inkludere stillasene og så mye av musen tilbake huden som mulig (figur 3A).
  3. Langsgående snitt i huden langs den merkede linjen med en saks eller en skalpell. Løsne hele huden, inkludert stillasene og titanized mesh, fra den underliggende vev gjennom sløv forberedelse (Fifigur 3B).
  4. Plasser det eksplanterte vevet strukket ut på en petriskål (figur 3C og D)

8. visualisering og kvantifisering av den vaskulære nettverket

  1. Transilluminasjon:
    1. Sett opp en transilluminasjon enhet, ved å montere en petriskål over en sterk kilde til hvitt lys (100 Watt standard lyspære).
    2. Løs et digitalkamera over transilluminator å få digitale bilder.
    3. Plasser prøvene opp ned på petriskål over transilluminasjon enheten.
    4. Ta bilder av de komplette stillas i makromodus samt av like store områder av normal hud. Lagre bildene i TIFF-format for videre digital analyse.
    5. Lagre vev for videre biokjemisk eller histologisk analyse.
  2. Digital segmentering og kvantifisering:
    1. Last ned og installer VesSeg-Tool programvare, som kan fås free fritt på: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
    2. Åpne bildet med VesSeg-Tool programvare.
    3. Velg område av bildet dekket av stillas for digital analyse (Bilde → Velg).
    4. For å øke kontrasten av skip bruker alternativet "Hysterese thresholding" (Bilde → Vessel forbetring → Hysterese thresholding → Top-Hat transformasjon → Beregn fartøy ekstrautstyr).
    5. Fortsett med segmentering av kartet fartøyet (Bilde → Vessel forbetring → Hysterese thresholding → Threshold grenser). Velg den første terskel ("Vessel dekning"), slik at hver piksel, som er enda eksternt fartøy-lignende, vil bli merket som fartøyet. Velg den andre terskel ("Bakgrunn dekning"), slik at bare de piksler som er spesielt fartøy-lignende vil bli merket som skip.
    6. Sjekk den automatisk segmentering forslaget manuelt å legge til ikke-fanget fartøy og for å eliminere vanlige falske positive strukturer, som vanligvis er lange og tynne, fartøy-lignende strukturer som hår eller suturer.
    7. Beregne lengden av fartøyene og den generelle området som dekkes av skip (Bilde → Bilde statistikk → binære bildet statistikk).
      MERK: For beregning av fartøyet lengder, er fartøy i fartøy kartet den resulterende tynnet til linjer med en bredde på en piksel 20.
  3. Analyser innfødte huden området under de samme parametrene som stillasene, tildele en verdi på 100% til den opprinnelige vev og forholde stillaset til denne verdien. For eksempel, hvis andelen av hvite piksler, er 60% i normalt vev, og 30% i stillaset, vil det representere en 50% vaskularisering av stillaset. Merk: Den hvite skip dekningen er tildelt arealet av en firkant rundt stillaset. Juster antall hvite piksler Dekning consi, all den tid det området av sirkelen er betydelig mindre (π x R 2) enn den firkantede (4 x R 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En pålitelig bilateral fulle huddefekt kan opprettes i mus (figur 1) hvor huden kan bli erstattet av et biomateriale under studien (figur 2). Her er ingen store komplikasjoner observert under eller etter operative prosedyren, verken makroskopiske tegn på infeksjon eller fremmedlegeme reaksjon. I sjeldne tilfeller blir et stillas tapt når en mus fjerner den. Sår sammentrekning ble aldri observert (figur 3). Tissue transilluminasjon tillates klar visualisering av vaskulære strukturer på opptil 30 mikrometer i bredde, på en helt vevsprøve som inkluderte både opprinnelig vev og implantert stillaser (figur 4). Etter digital segmentering, kan fartøy være lett kvantifiseres på ønskede tider poste implantasjon. For eksempel, to uker etter implantering, ble vaskularisering nivåer av 62.28 ± 8,6% observert (gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdi, n = 8) 21. Til sammen ca 25 min &# 160; per dyr (2 stillaser) er nødvendig for implantasjon, 5 min for vev høsting og picturing og 10 min for digital analyse av én prøve. Som et avsluttende punkt, har denne metoden ikke påvirke kvaliteten av eksplantert vev for videre analyse. For eksempel kan proteiner og RNA-ekstrakter lett bli oppnådd fra prøven ved hjelp av standardmetoder.

Figur 1
Figur 1. Full huddefekt. Midtlinjen av musens tilbake er merket med en fin spiss penn og en biopsi punsj brukes til å markere området ble feilen vil bli opprettet (A, B, C og D). Når områdene er definert, er full hud fjernes med standard kirurgiske saks som sett i nærbilde av preparatet (E og F). En fInal følge av mangelen er vist i (D) og forstørret i (G). Scale barer representerer en cm i ABCD og 5 mm i EFG. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Implantering av stillaset. Før innsetning av stillaset, er en maske som er lagt inn i det defekte direkte på såret og under sårkantene (A og B). Neste stillasene er plassert over nettingen og sutureres til sårkantene (C). Til slutt blir en transparent sårbandasje plassert og sutureres til huden (D). Scale bar representerer 5 mm i (A, B, og C) end 1 cm (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Tissue explantation. For vev-analyse hele huden på baksiden av dyret blir fjernet kirurgisk (A og B) og strukket ut på en petriskål (C). For transilluminasjon huden er snudd opp ned, og et digitalt bilde er tatt (D). Fjerning av huden ved siden av stillasene er nødvendig for å normalisere de vaskularisering data. Scale barer representerer en cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 4. transilluminasjon, digital segmentering og C kvantifisering. Folie vev ble skåret ut og den vaskulære nettverk innen ble visualisert ved transilluminasjon (øvre bilder) Full hud på baksiden (A) og detaljerte områder av det opprinnelige hud (B), og stillaset ( ) er vist. Piler viser forstørrede områder i (B) og (C). Hver av de nedre bilder viser resultatene av den digitale segmenteringsprosess for bildet som ligger rett ovenfor. Scale barer representerer 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er behov for å etablere vellykkede tilnærminger i å forbedre blodperfusjon i vev konstruert konstruerer, som krever utvikling av nye pålitelige metoder for å studere vascularization prosesser innenfor biomaterialer. Vanlige metoder for fremstilling av stillaset vaskularisering ex vivo synlig omfatter bruk av mikroskopi, noe som gir en høy oppløsning verktøyet. I de fleste tilfeller, er imidlertid denne fremgangsmåte begrenset til analyse av små vevsområder og har en tendens til å være kostbart og tidkrevende. Videre omfatter det ofte utførlig merking og fargemetoder, hvor blodårer perfundert ikke kan skilles fra ikke-funksjonelle seg 22. Metoder i bruk for å vurdere funksjonaliteten til fartøyene er datatomografi, magnetic resonance imaging og positron electron tomography. Disse metodene har ulempene med ekstremt kostbart utstyr og lav oppløsning kraft 23. En annen mye brukt strategi for å visualisere vascularization erBruken av vaskulær kaster etterfulgt av kjemisk korrosjon av vevet 24. Denne metoden gjør det mulig å oppnå en representativ 3D-strukturen til det vaskulære nettverk, men resultatene varierer sterkt, avhengig av nivået av kunstig perfusjon og vev kan ikke brukes for ytterligere biokjemiske studier, for eksempel proteiner eller RNA-analyse. Kyllingen chorioallantoic membran (CAM) modellen 25 og den skinfold kammeret modell hos gnagere 26,27 har vist seg å være effektive metoder for å analysere angiogenese, kapillær perfusjon og blodstrøm. Nylig har skinfold kammeret modellen også blitt brukt for tissue engineering applikasjoner evaluere MSC-baserte vascularization strategier i porøse polyuretan stillaser 28. Disse metodene innebærer viktige fordeler for in vivo avbildning og representerer et attraktivt mål for fremgangsmåten beskrevet her.

Modellen som presenteres her er utviklet for å overvinne manglene ved metodene mentioned ovenfor. Å dra nytte av den unike iboende egenskapene til huden, er komp defekter laget og brukt til å evaluere vaskularisering av biomaterialer. Hud er en ytre organ, som tillater lettere visualisering og manipulering av vevet. På grunn av sin store overflate og homogen struktur, kan flere defekter lages som gjør interne sammenligninger mulig, samtidig redusere antall dyr er nødvendig for undersøkelsen. På grunn av den antero-posterior symmetri av dyret, blir bilaterale defekter foreslått, imidlertid; påvirkning av systemiske effekter bør vurderes når begge sider i forhold til hverandre. Til slutt, er huden en ganske gjennomsiktig vev som representerer et optimalt organ grepet av transilluminasjon. Selv om metoden er beskrevet her er egnet for mange forskjellige opprinnelige vev og flere biomaterialer ble opprinnelig etablert denne protokollen som skal brukes sammen med et dobbelt-lags kollagenbasert stillaset som er FDA-godkjent klinisk og brukes for dermal reparasjon. En viktig forutsetning for gjennomføringen av denne metoden er at stillaset må være delvis gjennomsiktige. Avhengig av den valgte stillasmateriale, kan noe tilpasning av protokollen være nødvendig. Tidligere har vår gruppe benyttet modellen for å vise hvordan anvendelsen av humane mesenchymale celler til stillas forbedrer deres vaskularisering 29.

En standard digitalt kamera og en lyskilde som er tilstrekkelig for visualisering av vaskulære nettverket, noe som kan kvantifiseres gjennom fri programvare. Halvautomatisk segmentering av bildene ved VesSeg-Tool består av to trinn. I det første trinnet, vil bildet tas fra det vaskulære nettverket er kontrastforsterket fører til et fartøy kart. Deretter, velger segmentering algoritmen beholderområdene og til slutt, er segmenter forslaget presenteres som et bilde (figur 4) 30. I et andre prosesstrinn, ved hjelp av det faktum at fartøyene er tilkoblet structures (som betyr at fartøy piksler henge sammen romlig), er en annen segmentering brukes til å velge fra den første bare de sanne fartøy piksler og alle sanne fartøy piksler. Derfor er en sluttetikett på "en" tildeles bare til de lav-tillit fartøy piksler fra det første bildet som er forbundet over en kjede av naboer til en høy grad av tillit fartøy piksel i det andre bilde.

Siden ingen kjemiske tilsetningsstoffer er nødvendig, er denne metoden også kostnadseffektiv. Digital analyse viser en god reproduserbarhet på å bestemme fartøyets dimensjoner, intravaskulære avstander, antall forgrening poeng, vascularized området og total lengde på vaskulære nettverk. Vi har tidligere vist at blodkaret nettverket kan bedre visualisert ved transilluminasjon enn gjennom radio angiografiske undersøkelser 31. Nærværet av titan mesh har en dobbel funksjon. På den ene side hindrer den såret sammentrekning, som er en vanlig ulempe ved bruk av muse models; på den annen side, gir det en fysisk grense mellom stillaset og sårbunnen. Fordi de fleste stillasene er biologisk nedbrytbare, er det sistnevnte funksjon kritisk til fysisk delimitate grensen mellom stillaset og såret sengen under høsting av stillasene. Blant de viktigste ulemper ved denne fremgangsmåte er behovet for eksplantasjon stillasene og derfor begrense av analysen til en eneste gang punkt; således den dynamiske observasjon av vaskularisering er ikke mulig med den nåværende setting. Et annet problem er at denne metoden er begrenset til halvgjennomsiktige biomaterialer som tillater transilluminasjon. Til slutt, selv om driftsmåten krever ikke spesielle kirurgiske ferdigheter, en læringskurve på ca 6 - 12 opererte dyr må vurderes å mestre metoden riktig.

Vi innfører en tid og kostnadseffektiv metode som gjør det mulig med høy oppløsning visualisering og kvantifisering av vaskulære strukturer, representing en ideell metode for å sammenligne vascularization i ulike biomaterialer eller ulike stillas-bioaktive strategier. Denne metoden er enkel å etablere og krever ikke spesialutstyr. Et viktig trekk ved denne modellen er at etter fartøy visualisering, vev kan videre brukes til studier som histologisk eller molekylær analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Interessekonflikt utsagn:

Alle forfattere: Ingen

Finansielle opplysninger:

Ingen av forfatterne har en økonomisk interesse i noen av produktene, enheter eller narkotika som er nevnt i dette manuskriptet.

Acknowledgments

Integra dermal regenerasjon malen ble vennlig levert av Integra Lifesciences Corporation. Finansieringskilder støtter arbeidet: Dette arbeidet ble delvis finansiert av CIRM-BMBF Tidlig Translasjonell II Award og FONDAP Center for Genome regulering både til jte (Nr 15090007.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 Ethicon, Norderstedt, Germany 698G Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1050
Biopsy punches (12 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1250
Digital camera  Ricoh, Hannover, Germany Cx1
Gazin Mullkompresse  Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany 13622 Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA 88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia  Baxter, Unterschleissheim, Germany 100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu Charles River, Sulzfeld, Germany Strain code 088 Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g 
Buprenorphine (0.3 mg/ml) Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight PFM Medical AG, Köln, Germany 6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany B1332020110614 Fibrin-thrombin solution 
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK M6275009/10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
  2. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
  3. Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
  4. Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
  5. Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
  6. Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
  7. Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
  8. Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
  9. Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
  10. Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
  11. Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
  12. Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
  13. des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
  14. Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
  15. Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
  16. Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
  17. Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
  18. Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
  19. Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
  20. Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
  21. Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
  22. Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
  23. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
  24. Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
  25. Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
  26. Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
  27. Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
  28. Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
  29. Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
  30. Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
  31. Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).

Tags

Bioteknologi biomaterialer vaskularisering tissue engineering transilluminasjon digital segmentering hud defekt stillas matrise,
En Full huddefekt modell for å evaluere vaskularisering av biomaterialer<em&gt; In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schenck, T. L., Chávez, M. N.,… More

Schenck, T. L., Chávez, M. N., Condurache, A. P., Hopfner, U., Rezaeian, F., Machens, H. G., Egaña, J. T. A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo. J. Vis. Exp. (90), e51428, doi:10.3791/51428 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter