Summary
Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.
Abstract
Onvoldoende vascularisatie wordt beschouwd als een van de belangrijkste factoren die het klinische succes van weefselengineering constructen zijn. Om nieuwe strategieën die gericht zijn op het verbeteren van de vascularisatie te evalueren, zijn betrouwbare methoden nodig om de in-groei van nieuwe bloedvaten in bio-kunstmatige steigers zichtbaar maken en kwantificeren van de resultaten. In de afgelopen paar jaar, heeft onze groep een volledige huid defect model dat de directe visualisatie van de bloedvaten zorgt door transilluminatie en biedt de mogelijkheid tot kwantificering via digitale segmentatie geïntroduceerd. In dit model, een chirurgisch creëert volle huidafwijkingen in de rug van muizen en vervangt ze door het geteste materiaal. Moleculen of cellen van belang kan ook in dergelijke materialen worden opgenomen om de mogelijke gevolgen te bestuderen. Na een observatie tijd van de eigen keuze, worden materialen geëxplanteerd voor evaluatie. Bilaterale wonden bieden de mogelijkheid van het maken van interne vergelijkingen thop het minimaliseren artefacten onder zowel particulieren als van het verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor het onderzoek. In vergelijking met andere benaderingen, biedt onze methode een eenvoudige, betrouwbare en kosteneffectieve analyse. We hebben dit model uitgevoerd als een routine instrument om hoge-resolutie screening uitvoeren bij het testen vascularisatie van verschillende biomaterialen en bio-activatie benaderingen.
Introduction
In de afgelopen decennia is tissue engineering opent een nieuwe therapeutische optie om weefsel gebreken te vervangen door het lichaam de eigen cellen 1. Om het fysiologische proces van weefselregeneratie ondersteunen, steigers ontworpen als een biologisch afbreekbare structuur, die een scenario waar de cellen van het wondbed kan groeien en terugzetten van het defect 2,3 geeft.
Onvoldoende vascularisatie wordt beschouwd als het belangrijkste obstakel, dat de klinische doorbraak van bioartificiële steigers 4 tegenhoudt zijn. Met de ingroei van cellen, de vraag naar voedingsstoffen en zuurstof toeneemt en vascularisatie van het materiaal essentieel. Onvoldoende of vertraagde vascularisatie kan dus leiden tot centrale necrose van weefsel vervaardigde producten 5. Bovendien bloedvaten voorzien immuuncompetente cellen en verwijder de metabolische residuen in de regenererende gebied. Hoge infectiedruk en lage regeneratie zijn alleeneen aantal van de gevolgen van onvoldoende doorbloeding waargenomen in tissue engineering, die gericht worden afgewend door het verhogen van de doorbloeding van de steigers 6,7.
Verschillende strategieën die gericht zijn op het verbeteren van vascularisatie aandacht voor de belangrijke rol van het biomateriaal zelf en de microstructuur van het schavot. Er zijn intensieve onderzoeksinspanningen om nieuwe benaderingen te ontwikkelen in het verschuiven van het genezingsproces van de reparatie aan regeneratie, waardoor (re) genereren van een weefsel met het dichtst fysiologische eigenschappen om de een te restaureren 8,9. Biomaterialen die werden onderzocht en geëvalueerd met betrekking tot hun regeneratief potentieel inclusief collageen, fibrine, chitosan en alginaat 10,11. Deze biomaterialen kunnen worden gebruikt en gecombineerd als een ruggengraat voor de bouw van nieuwe steigers met behulp van verschillende strategieën, zoals weefsel decellularisatie, zelf-assemblage, rapid prototyping en electospinning 12. Om ENHkomstig het lichaam de eigen regeneratieve capaciteit, kunnen de steigers worden bioactivated. De opname van recombinant angiogene groeifactoren 13 of gen vectoren die coderen voor factoren 14 heeft aangetoond dat vascularisatie van de steiger te verbeteren. Het gebruik van stamcellen is algemeen blijkt een veelbelovende strategie om vascularisatie, waar mesenchymale stromale cellen en endotheliale progenitorcellen de meeste aandacht hebben gekregen 15,16 verbeteren. Andere benaderingen proberen constructen die geprefabriceerde schipverkeer vóór transplantatie 17 bevatten bouwen. Ondanks intensieve inspanningen steiger ontwerp en de bio-activatie heeft geen strategie verbeterd vascularisatie in een klinisch significant niveau, met uitzondering van dermale vervanging in massieve brandwonden, wordt de vertaling van bioengineered materialen in de klinische routine enige plaats aarzelend 18 .
Een van de redenen waarom de vascularisatiekunstmatige weefselconstructen nog een onopgelost probleem, is het moeilijk om het succes van nieuwe technologieën in vivo mogelijkheden te evalueren. Hoewel in vitro experimenten belangrijke inzichten van de vascularisatie potentieel van steigers kunnen bepalen, worden gepaste diermodellen moeten essentiële parameters bestuderen zoals de biocompatibiliteit van het materiaal, de veiligheid en werkzaamheid van de behandeling en van bijzonder belang, de vascularisatie van het weefsel construeren. Daarom betrouwbare visualiseren en kwantificeren netwerken bloedvat in vivo essentieel.
In deze studie presenteren we een eenvoudige en betrouwbare methode die de visualisatie en kwantificering van het vasculaire netwerk binnen geëxplanteerde scaffolds toelaat. Deze methode is gebaseerd op tissue transillumination en digitale segmentatie. Aangezien deze werkwijze is niet-invasief, laat verdere moleculaire en histologische analyses van het doelmateriaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van de steigers
- Genereer monsters van de steigers door het gebruik van 12 mm biopsie stoten.
- Om bioactieve moleculen of cellen te introduceren in het schavot, tap de steigers door ze zachtjes knijpen met een steriel gaasje. Hydrateren vervolgens de steigers door toevoeging 160 pl van een oplossing die het biologisch actieve moleculen of cellen plaats. Dubbele controle van het succes van bioactivatie met cellen door metabole testen zoals MTT Testen.
- Indien nodig vast of de verbindingen te testen cellen in de scaffold door afleveren, bijvoorbeeld in een fibrine-trombine oplossing of een hydrogel, wederom door rehydratie zoals beschreven in stap 1.2.
OPMERKING: Deze stap kan van pas komen wanneer verbindingen of cellen niet mechanisch hechten aan het materiaal. Men kan ook de afgifte dynamiek van de verbindingen te controleren .. - Bereid de titanized mazen, die onder elke steiger in elk experiment en controle groep zal worden geplaatst, door cutting out ronde gevormde stukken, ongeveer 14 mm in diameter.
OPMERKING: De titanized netwerk werkt als een fysieke grens vereist om de geregenereerde weefsel uit het wondbed begrenzen.
2 Dieren
- Voorafgaand aan de uitvoering van het gepresenteerde model, raadpleeg de bijbehorende dieren bescherming wetten en het verkrijgen van toestemming van de lokale autoriteiten. In dit werk, werden alle experimenten uitgevoerd met muizen, volgens de huidige Duitse dierenwelzijn te handelen en door het District regering van Opper-Beieren (Regierung von Oberbayern) goedgekeurd.
- Kiezen voor het dier en de stam voorzichtig. Hoewel het model is vastgesteld voor muizen, kan deze worden vertaald naar andere gemeenschappelijke dieren, zoals ratten, konijnen en varkens.
- In het geval dat u werkt met pelsdieren, scheren de rug van de dieren vóór de implantatie van de steigers.
OPMERKING: Dit werk maakt gebruik van muizen van 6 tot 8 weken oud met een lichaamsgewicht tussen 20 g en 25 g echter verschillende leeftijden en body gewichten kunnen ook worden gebruikt.
3 Anesthesie
- Voeren de operatie onder steriele omstandigheden. Om de normale lichaamstemperatuur van het dier te houden, gebruik dan een warming mat.
- Vóór anesthesie inhalatief krijgen de dieren buprenorfine in een dosis van 0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht, subcutaan om 8 uur.
- Plaats het dier onder inhalatieve anesthesie (isofluraan) of een gelijkwaardige standaard procedures toe te passen. Bevestig anesthesie hetzij door knijpen tenen van het dier of door een huid knijpen.
- Om exsiccose voorkomen, injecteer 0,5 ml fysiologische zoutoplossing subcutaan aan het begin van de operatie.
4 Excisie van de Huid
- Plaats het dier in een liggende positie en markeer de middellijn van de muis is terug met een fijne punt permanente pen (figuur 1A).
- Definieer de excisie gebied. Plaats de gebreken in de in Figu gebiedre 1C. Merk op dat als de gebreken te caudaal geplaatst, dieren zijn meer vatbaar voor de verbanden en de steigers te verwijderen.
- Maak ronde bilaterale defecten met behulp van een 10 mm biopsie punch (Figuur 1B). De stempel moet zorgvuldig worden gedwongen tegen de huid en mogen niet worden gebruikt om volledig snijden door de huid, maar de excisie gebied (Figuren 1C en 1E) bakenen.
- Til uit de gemarkeerde huid met een pincet en de incisie langs de gemarkeerde cirkel met behulp van fijne chirurgische schaar (Figuur 1F). In het geval van bloeden, zorgvuldig te comprimeren met een steriel gaasje. Een stap-voor-stap beschrijving van de excisie wordt getoond in figuur 1.
OPMERKING: Het defect is gemaakt met een kleinere punch dan de ene voor het genereren van de steigers, om de uitbreiding van het gebrek te compenseren als gevolg van de elasticiteit van de huid.
5 Steiger Implantatie
- Om ruimte te maken voor de titaseerde mesh, breiden de scheiding van de huid en het onderliggende weefsel bij de wond grenzen voor 2-4 mm (Figuur 2A).
- Plaats de titanized maas in het defect direct aan het wondbed en onder de wondranden (Figuren 2A en B).
- Plaats steigers direct boven het gaas.
- Hecht de steigers aan de aangrenzende wondranden met 4 tot 6 enkele knopen, waarbij de randen iets meer dan de steiger (figuur 2C).
OPMERKING: Vermijd het gebruik van biologisch afbreekbare hechtingen. - Hechtdraad een transparant wondverband boven de gebreken naar het schavot te beschermen terwijl ze de controle van de wond (figuur 2D).
6 postoperatieve zorg
- Houd een muis per kooi om de wederzijdse manipulatie van de dressing en de steigers af te wenden.
- Evalueer de algemene toestand van de dieren dagelijks door het observeren motorische activiteit, lichaamsgewicht, tekenen van pijn, tolerantienaar de kleedkamer en zelfverminking. Ook toezien op de wond gebied voor bloeden, lokale en systemische tekenen van infectie en de positie van de dressing.
- Om de pijn van het dier te beperken, injecteren buprenorfine per dag bij een dosering van 0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht of vergelijkbare analgetica.
- Als de muis verwijdert of beschadigt het wondverband, vervangen of sluit hem onder narcose.
7 Euthanasie en Explantatie van de Steiger
- Op gewenste tijdstippen, offeren de dieren bij overdosis van pentobarbital (150 mg / kg).
- Markeert de plaats van huidexcisie met een permanente marker die moet de steigers en zoveel van de muis rugvel mogelijk (figuur 3A).
- Incise de huid langs de gemarkeerde lijnen met een schaar of een scalpel. Maak de gehele huid, inclusief de steigers en de titanized gaas, van het onderliggende weefsel door stomp voorbereiding (Fifiguur 3B).
- Plaats de geëxplanteerd weefsel uitgestrekt op een petrischaal (Figuur 3C en D)
8 visualisatie en kwantificatie van de Vasculaire Netwerk
- Transillumination:
- Het opzetten van een transillumination apparaat, door het monteren van een petrischaal boven een sterke bron van wit licht (100 Watt standaard gloeilamp).
- Fix een digitale camera boven de transilluminator om digitale foto's te verkrijgen.
- Plaats de monsters ondersteboven op de petrischaal via transilluminatie-apparaat.
- Neem foto's van de complete steigers in de macro-modus, alsmede van even grote gebieden van de normale huid. Bewaar de afbeeldingen in een TIFF-formaat voor verdere digitale analyse.
- Sla het weefsel voor verdere biochemische of histologische analyse.
- Digitale segmentatie en kwantificering:
- Download en installeer de VesSeg-Tool-software, die kan worden verkregen free van lading op: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
- Open de foto met de VesSeg-Tool.
- Selecteer het gebied van de afbeelding onder de steiger voor digitale analyse (Afbeelding → Select).
- Om het contrast van de schepen te vergroten Gebruik de optie 'hysteresis drempeling "(Beeld → Vessel enhancement filter → hysteresis drempeling → Top-Hat transformatie → Bereken verbetering vat).
- Ga verder met de segmentatie van de kaart vaartuig (Afbeelding → enhancement Vessel filter → hysteresis drempeling → Drempel grenzen). Selecteer de eerste drempel ("Vessel dekking"), dus elke pixel, dat is zelfs op afstand schip-achtige, zal als schip worden geëtiketteerd. Selecteer de tweede drempel ("Achtergrond dekking"), zodat alleen de pixels die bijzonder schip-achtige zal als schepen worden geëtiketteerd.
- Controleer de automatische segmentatie voorstel handmatig niet-ingenomen vaartuigen commentaar en gemeenschappelijke vals-positieve structuren die gewoonlijk lang en dun, verblijf-achtige structuren zoals haren of hechtingen te elimineren.
- Bereken de lengte van de schepen en het totale gebied dat door schepen (Afbeelding → Afbeelding statistieken → Binary statistieken).
OPMERKING: Bij de berekening van het schip-lengten zijn vaartuigen in de uiteindelijke kaart vaartuig verdund lijnen met een breedte van een pixel 20.
- Analyseer de natieve huid onder dezelfde parameters als de steigers, toewijzen van een waarde van 100% voor de natieve weefsel en verbinden de steiger die waarde. Bijvoorbeeld, indien het aantal witte pixels is 60% in het normale weefsel en 30% in het skelet, zou 50% vascularisatie van de steiger te vertegenwoordigen. Opmerking: De witte vaartuigen dekking is toegewezen aan de oppervlakte van een vierkant rondom het schavot. Pas het aantal witte pixels dekking consiDering dat het gebied van de cirkel is beduidend kleiner (π x R2) dan het vierkant (4 x R2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een betrouwbare bilaterale full skin defect kan worden gemaakt in de muizen (figuur 1) waarbij de huid kan worden vervangen door een biomateriaal bestudeerd (figuur 2). Hier worden zonder complicaties tijdens of na de operatieve procedure, noch macroscopische verschijnselen van infectie of vreemd lichaam reactie. In zeldzame gevallen wordt een steiger verloren wanneer een muis verwijdert deze. Wondcontractie werd niet waargenomen (figuur 3). Tissue transilluminatie toegelaten duidelijke visualisatie van vasculaire structuren tot 30 urn breedte, in een geheel weefselmonster dat zowel natief weefsel en geïmplanteerd scaffolds (Figuur 4) opgenomen. Na digitale segmentatie, konden schepen gemakkelijk worden gekwantificeerd op gewenste tijdstippen na implantatie. Bijvoorbeeld, 2 weken na implantatie, vascularisatie niveaus van 62.28 ± 8,6% waargenomen (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde, n = 8) 21. In totaal ongeveer 25 min &# 160; per dier (2 scaffolds) zijn nodig voor de implantatie, 5 min voor weefsel oogsten en afbeeldingsrelatie en 10 min voor digitale analyse van een monster. Als laatste punt, is deze methode geen invloed op de kwaliteit van het geëxplanteerde weefsel voor verdere analyse. Bijvoorbeeld kunnen eiwitten en RNA extracten gemakkelijk verkregen worden uit het monster door standaardwerkwijzen.
Figuur 1 Volledige huiddefect. De lijn van de rug van de muis is aangegeven met dunne stift pen en een biopsie pons wordt gebruikt om het gebied te markeren zijn het defect wordt gecreëerd (A, B, C en D). Zodra de gebieden zijn bepaald, wordt de volledige huid verwijderd met standaard chirurgische schaar zoals te zien in de close-up van het preparaat (E en F). Een fspronkelijke gevolg van het defect wordt weergegeven in (D) en vergroot in (G). Schaal balken geven 1 cm in ABCD en 5 mm in EFG. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Implantatie van de steiger. Voorafgaand aan de implantatie van de steiger, wordt een maas in het defect geplaatst direct op het wondbed en onder de wondranden (A en B). Volgende steigers via gaas geplaatst en gehecht aan de wondranden (C). Tenslotte wordt een transparant wondverband geplaatst en gehecht aan de huid (D). Schaalbalk is 5 mm (A, B, en C) eend 1 cm in (D). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Tissue explantatie. Voor weefselonderzoek de volledige huid van de rug van het dier wordt operatief verwijderd (A en B) en uitgestrekt op een petrischaal (C). Voor transillumination de huid op zijn kop gezet en een digitale foto wordt gemaakt (D). Verwijdering van de huid naast de steigers noodzakelijk voor normalisatie van de vascularisatie data. Schaal balken geven 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Transilluminatie digitale segmentatie en kwantificatie. Huidweefsel werd uitgesneden en het vasculaire netwerk binnen werd zichtbaar gemaakt door transilluminatie (bovenste foto) volledige huid van de rug (A) en gedetailleerde gebieden van de natieve huid (B) en de steiger (C ) getoond. Pijlen tonen de vergrote gebieden (B) en (C). Elk van de onderste foto toont de resultaten van het digitale segmentatie werkwijze voor de afbeelding direct hierboven. Schaal balken geven 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er moet succesvolle benaderingen kunnen verbeteren doorbloeding in tissue engineered constructen, die de ontwikkeling van nieuwe betrouwbare methoden vereist de vascularisatie processen binnen de biomaterialen bestuderen. Algemene methoden voor het maken steiger vascularisatie ex vivo toegankelijk omvatten het gebruik van microscopie, waarbij een hoge-resolutie tool biedt. In de meeste gevallen echter is deze werkwijze beperkt tot de analyse van kleine weefselgebieden en vaak kostbaar en tijdrovend. Bovendien omvat vaak uitgebreide etikettering en kleuringen, waar bloed perfusie schepen niet te onderscheiden van niet-functionele degenen 22. Methoden in gebruik om te beoordelen van de functionaliteit van de schepen zijn computertomografie, magnetische resonantie beeldvorming en positron electron tomografie. Deze werkwijzen hebben de nadelen van zeer kostbaar materiaal en laag oplossend vermogen 23. Een andere veel gebruikte strategie om vascularisatie te visualiseren is hetgebruik van vasculaire afgietsels gevolgd door chemische corrosie van het weefsel 24. Deze methode maakt het mogelijk om een representatief 3D structuur van het vasculaire netwerk te verkrijgen, maar de resultaten sterk afhankelijk van het niveau van kunstmatige perfusie en weefsels kunnen niet worden gebruikt voor verdere biochemische studies, zoals eiwit of RNA analyse. De kip chorioallantoïsmembraan (CAM) model 25 en de huidplooi kamermodel bij knaagdieren 26,27 hebben aangetoond dat effectieve methoden zijn om angiogenese, capillaire perfusie en de bloedstroom te analyseren. Onlangs heeft de huidplooi kamermodel ook gebruikt voor tissue engineering toepassingen evalueren van MSC-gebaseerde vascularization strategieën in poreuze polyurethaan steigers 28. Deze werkwijzen onderhavige belangrijke voordelen voor in vivo beeldvorming en vormen een aantrekkelijk doel voor de hier beschreven werkwijze.
De hier gepresenteerde model ontwikkeld om de tekortkomingen van de werkwijzen m overwinnenboven eld. Gebruik makend van de unieke intrinsieke eigenschappen van de huid, worden vol fouten gemaakt en gebruikt om vascularisatie van biomaterialen evalueren. Huid is een extern orgaan dat gemakkelijker visualisatie en manipulatie van het weefsel toelaat. Vanwege het grote oppervlak en homogene structuur, kunnen meerdere defecten ontstaan, die interne vergelijkingen mogelijk te maken, terwijl vermindering van het aantal benodigde dieren voor de studie. Door de antero-posterior symmetrie van het dier, zijn bilaterale defecten waren echter; de invloed van systemische effecten worden overwogen wanneer beide zijden met elkaar vergeleken. Tenslotte huid is een vrij transparante weefsel een optimale orgaan keuze transilluminatie vertegenwoordigen. Hoewel de hier beschreven werkwijze is geschikt voor vele verschillende natieve weefsels en verschillende biomaterialen, was dit oorspronkelijk protocol, die worden gebruikt met een dubbellaags collageen gebaseerde scaffold die FDA-goedgekeurd en klinisch gebruikt voor dermal reparatie. Een belangrijke voorwaarde voor de uitvoering van deze methode is dat de steiger is gedeeltelijk transparant zijn. Afhankelijk van het gekozen dragermateriaal, kunnen sommige aanpassing van het protocol nodig. Eerder heeft onze fractie het model gebruikt om te tonen hoe de toepassing van menselijke mesenchymale cellen scaffolds verbetert hun vascularisatie 29.
Een standaard digitale camera en lichtbron voldoende voor de visualisatie van het vasculaire netwerk, dat kan worden gekwantificeerd via vrije software. De semi-automatische segmentatie van de foto's door de VesSeg-Tool bestaat uit twee stappen. In de eerste stap, de foto genomen van het vasculaire netwerk contrastmiddel leidend tot een map verblijf. Vervolgens wordt de segmentatie algoritme selecteert de gebieden schip en tenslotte wordt de segmentatie voorstel gepresenteerd als een beeld (figuur 4) 30. In een tweede processtap met het feit dat bloedvaten verbonden structures (wat betekent dat vaartuig pixels samen te hangen ruimtelijk), wordt een tweede segmentatie gebruikt voor het selecteren van de eerste alleen de echte schip pixels en alle ware vat pixels. Daarom een laatste label van "een" wordt alleen toegekend aan die lage vertrouwen vaartuig pixels vanaf de eerste afbeelding die zijn aangesloten op een keten van buren om een high-vertrouwen schip pixel in het tweede beeld.
Aangezien geen chemische additieven nodig zijn, deze methode ook kosteneffectief. Digitale analyse blijkt een goede reproduceerbaarheid bij het bepalen van de afmetingen vaartuig, intravasculaire afstanden, het aantal vertakkingen, gevasculariseerd gebied en de totale lengte van het vasculaire netwerk. We hebben eerder aangetoond dat het netwerk bloedvat beter kan worden gevisualiseerd door transilluminatie van door radio-angiografische studies 31. De aanwezigheid van de titaan gaas heeft een dubbele functie. Enerzijds, voorkomt wondcontractie, wat een algemeen nadeel van het gebruik van muis models; anderzijds, het een fysieke grens tussen het skelet en het wondbed. Omdat de meeste steigers zijn biologisch afbreekbaar, de laatstgenoemde in essentieel fysiek begrenzen de grens tussen het skelet en het wondbed tijdens het oogsten van de steigers. Een van de belangrijkste nadelen van deze werkwijze is de noodzaak van explanterende de scaffolds en derhalve het beperken van de analyse op een enkel tijdstip; waardoor de dynamische waarneming van vascularisatie is niet mogelijk met de huidige instelling. Een ander probleem is dat deze werkwijze beperkt tot semi-transparante biomaterialen die transilluminatie mogelijk. Tot slot, hoewel de operatie procedure vereist geen speciale chirurgische vaardigheden, een leercurve van ongeveer 6 vereisen - 12 geopereerde dieren moeten worden overwogen om de methode goed te beheersen.
We introduceren een tijd en goedkopere wijze die hoge-resolutie visualisatie en kwantificatie van vasculaire structuren, r staatepresenting een ideale methode om te vergelijken vascularisatie in verschillende biomaterialen of andere steiger-bioactivatie strategieën. Deze methode is eenvoudig vast te stellen en vereist geen speciale apparatuur nodig. Een essentieel kenmerk van dit model is dat na verblijf visualisatie, weefsels kunnen verder worden gebruikt voor studies zoals histologische en moleculaire analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Belangenconflict verklaring:
Alle auteurs: Geen
Financiële informatieverschaffing:
Geen van de auteurs heeft een financieel belang in een van de producten, apparaten, of in dit manuscript vermelde geneesmiddelen.
Acknowledgments
Integra dermale regeneratie template werd vriendelijk door Integra LifeSciences Corporation. Bronnen van fondsen ter ondersteuning van het werk: Dit werk werd deels gefinancierd door de CIRM-BMBF Early Translationeel II Award en de FONDAP Center for Genome regelgeving zowel JTE (Nr 15090007.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
References
- Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
- Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
- Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
- Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
- Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
- Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
- Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
- Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
- Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
- Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
- des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
- Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
- Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
- Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
- Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
- Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
- Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
- Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
- Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
- Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
- Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
- Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
- Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
- Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
- Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
- Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
- Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
