Summary
כלי דם הוא מפתח לגישות בהנדסת רקמות מוצלחת. לכן, טכנולוגיות אמינות נדרשות כדי להעריך את ההתפתחות של רשתות כלי דם ברקמות מבנים. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, יעיל וחסכונית כדי לחזות ולכמת כלי דם בגוף חי.
Abstract
כלי דם בלתי מספקים נחשב לאחד הגורמים העיקריים המגבילים את ההצלחה הקלינית של מבני רקמות מהונדסות. על מנת להעריך אסטרטגיות חדשות שמטרתם לשפר את כלי הדם, שיטות אמינות נדרשות לבצע בצמיחה של כלי דם חדשים לתוך פיגומים ביו המלאכותי לעין ולכמת את התוצאות. במהלך השנים של השנים האחרונות, הקבוצה שלנו הציגה מודל פגם עור מלא המאפשר ההדמיה הישירה של כלי דם על ידי שקוף ומספק את האפשרות של כימות באמצעות פילוח דיגיטלי. במודל זה, אחד בניתוח יוצר פגמי עור מלאים בחלק האחורי של עכברים ומחליף אותם עם החומר שנבדק. יכולים גם להיות משולבים מולקולות או תאים של עניין בחומרים כאלה כדי ללמוד ההשפעה הפוטנציאלית שלהם. לאחר זמן תצפית של בחירה של האדם עצמו, חומרי explanted להערכה. פצעים דו צדדיים לספק את האפשרות של ביצוע השוואות פנימיות הבלמזער חפצים בין אנשים, כמו גם של הפחתת מספר בעלי החיים הדרושים למחקר. בהשוואה לגישות אחרות, השיטה שלנו מציעה ניתוח פשוט, אמין וחסכוני. אנחנו צריכים ליישם את המודל הזה ככלי שגרתי לביצוע הקרנה ברזולוציה גבוהה בעת בדיקת כלי דם של חומרים ביולוגיים שונים וגישות ביו הפעלה.
Introduction
בעשורים האחרונים, הנדסת רקמות נפתחה אופציה טיפולית חדשה שתחליף את מומי רקמה עם תאים של הגוף עצמו 1. על מנת לתמוך בתהליך הפיזיולוגי של התחדשות רקמות, פיגומים מעוצבים כמבנה מתכלה, המספק תרחיש שבו תאים מהמיטה הפצע יכולים לגדול ולשחזר את הפגם 2,3.
כלי דם בלתי מספקים נחשב למכשול העיקרי, אשר מחזיק בגב פריצת הדרך הקלינית של פיגומי bioartificial 4. עם ingrowth של תאים, הביקוש לחומרים מזינים וחמצן עליות וכלי דם של החומר הופך להיות חיוני. כלי דם בלתי מספקים או מתעכבים ולכן יכולים להוביל לנימק של מוצרי רקמות מהונדסות 5 מרכזי. בנוסף, כלי דם מספקים לתאים המוסמכים חיסוניים ולהסיר את שאריות חילוף חומרים באזור ההתחדשות. שיעורי זיהום גבוהים והתחדשות נמוכה הם רקחלק מההשלכות של זלוף דם בלתי מספק נצפו בהנדסת רקמות, המיועדות להיות נמנע על ידי הגדלת כלי הדם של הפיגומים 6,7.
כמה אסטרטגיות שמטרתם לשפר את מיקוד כלי דם על עצם את תפקיד המפתח של החומר הביולוגי עצמו ומייקרו של הפיגום. יש מאמצי מחקר אינטנסיביים לפיתוח גישות חדשות בהעברת תהליך הריפוי מתיקון להתחדשות, ובכך (מחדש) יצירת רקמה עם המאפיינים הפיסיולוגיים הקרובים ביותר לאחד כדי להיות משוחזר 8,9. Biomaterials שנחקרו והוערכו בכל הקשור לפוטנציאל ההתחדשות שלהם כלול קולגן, פיברין, chitosan ו10,11 אלגינט. ניתן להשתמש בחומרים ביולוגיים אלה ושילוב כעמוד השדרה לבניית פיגומים חדשים תוך שימוש באסטרטגיות שונות כגון decellularization רקמה, הרכבה עצמית, דיגום מהיר וelectrospinning 12. כדי enhאהה יכולת ההתחדשות של הגוף עצמו, יכולים להיות bioactivated פיגומים. השילוב של צמיחת angiogenic רקומביננטי גורמי 13 או גן וקטורי קידוד לגורמים כגון 14 הראו כדי לשפר את כלי הדם של הפיגום. השימוש בתאי גזע הוכח באופן נרחב כדי להיות אסטרטגיה מבטיחה לשפר את כלי הדם, שבו תאי סטרומה mesenchymal ובתאי האנדותל צברו את מירב תשומת הלב 15,16. גישות אחרות מנסות לבנות מבנים המכילים רשתות כלי טרומיות לפני ההשתלה 17. למרות מאמצים אינטנסיביים בעיצוב פיגום ביו ההפעלה שלהם, אין אסטרטגיה השתפרה כלי דם ברמה משמעותית מבחינה קלינית ו, למעט תחליפי עורי בפציעות לשרוף מסיביות, התרגום של חומרים מהונדסים לשגרה הקלינית מתרחש רק בהיסוס 18 .
אחת הסיבות לכך שכלי דםשל מבני רקמות מלאכותיים עדיין היא בעיה בלתי פתורה, הוא הקושי להעריך את ההצלחה של טכנולוגיות חדשות בin vivo גישות. למרות שניסויים במבחנה עשויים לספק תובנות חשובות של פוטנציאל כלי הדם של פיגומים, מודלים של בעלי החיים מתאימים נדרשים ללמוד פרמטרים מרכזיים כגון ההתאמה הביולוגית של החומר, את הבטיחות ויעילות של הטיפול ו, בעלת חשיבות מיוחדת, כלי הדם של הרקמות לבנות. לכן, כלים אמין לחזות ולכמת רשתות כלי דם בגוף חי הן חיוניים.
במחקר זה אנו מציגים שיטה פשוטה ואמינה המאפשרת הדמיה וכימות של רשת כלי הדם בתוך פיגומי explanted. שיטה זו מבוססת על שקוף רקמה ופילוח דיגיטלי. מאחר ושיטה זו אינה פולשני, היא מאפשרת ניתוחים מולקולריים והיסטולוגית נוספים של חומר היעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת פיגומים
- צור דגימות של הפיגומים באמצעות 12 מ"מ אגרופים ביופסיה.
- להציג את המולקולות ביו או תאים לפיגום, לנקז את הפיגומים על ידי בעדינות לוחץ אותם עם גזה סטרילית. ואז רעננות הפיגומים על ידי הוספת 160 μl של תמיסה המכילה מולקולות או תאים של העניין ביו. בדוק היטב את ההצלחה של bioactivation עם תאים באמצעות מבחני חילוף חומרים כגון מבחני MTT.
- במידת צורך, לתקן את התרכובות או תאים להיבדק בתוך הפיגום על ידי מתן אותם, למשל בפתרון הפיברין-תרומבין או הידרוג'ל, שוב דרך להחזרת נוזלים כמתואר בשלב 1.2.
הערה: שלב זה יכול להיות של מועיל כאשר תרכובות או תאים אינן מכאנית לצרף לחומר. אפשר גם לשלוט בדינמיקת שחרורו של התרכובות .. - הכן את רשתות titanized, שתוצבנה תחת כל פיגום בכל קבוצת ניסוי ובקרה, על ידי חיתוךחתיכות גרם החוצה בצורה עגולה, כ 14 מ"מ קוטר.
הערה: רשת titanized עובדת כגבול פיזי הנדרש כדי לתחום הרקמה מחדש מהמיטה הפצע.
2 בעלי חיים
- לפני היישום של המודל שהוצג, להתייעץ חוקי הגנה על בעלי חיים המתאימים ולקבל אישור מהרשויות המקומיות. בעבודה זו, כל הניסויים בוצעו עם עכברים, על פי מעשה רווחת בעלי החיים הגרמני הנוכחי ואושרו על ידי ממשלת מחוז בוואריה העליונה (Regierung פון Oberbayern).
- לבחור בזהירות את בעלי החיים ומתח. למרות שהמודל הוקם לעכברים, זה יכול להיות מתורגם לבעלי חיים נפוצים אחרים, כגון חולדות, ארנבות או חזירים.
- במקרה שאתה עובד עם בעלי חיים פרווה, לגלח את הגב של בעלי החיים לפני ההשתלה של הפיגומים.
הערה: עבודה זו משתמשת בעכברים של 6 עד 8 שבועות של גיל עם משקל גוף בין 20 גרם ו25 גרם, בגילים שונים אך וbיכולות לשמש גם משקולות ody.
.3 הרדמה
- תנהל את הפעילות בתנאים סטריליים. על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף הנורמלית של בעל החיים, להשתמש במחצלת התחממות.
- לפני inhalative הרדמה בעלי החיים מקבלים Buprenorphin במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, תת עורי כל שעה 8.
- מניחים את החיה בהרדמה inhalative (Isoflurane) או להחיל נהלי תקן מקבילים. לאשר הרדמה או על ידי לוחץ בעדינות את אצבעות רגליו של בעל החיים או באמצעות צביטת עור.
- כדי למנוע exsiccosis, להזריק 0.5 תת עורי תמיסת מלח פיסיולוגי מ"ל בתחילת המבצע.
.4 כריתת העור
- מניחים את החיה במצב שכיבה ולסמן את קו האמצע של הגב של העכבר עם עט קבוע קצה קנס (איור 1 א).
- הגדר את אזור הכריתה. הנח את הפגמים באזור המוצג בFiguמחדש 1C. שים לב שאם הפגמים ממוקמים גם caudally, בעלי החיים נוטים יותר כדי להסיר את התחבושות ופיגומים.
- צור עגול פגמים דו צדדיים באמצעות אגרוף ביופסיה 10 מ"מ (איור 1). האגרוף צריך להיות בכפייה בזהירות על העור ואסור להשתמש בו כדי לחתוך לחלוטין דרך העור, אלא להתוות את אזור הכריתה (איורים 1 ג & 1E).
- הרם בעדינות את העור הניכר עם מלקחיים ולחתוך לאורך המעגל המסומן באמצעות מספריים קנס כירורגית (איור 1F). במקרה של דימום, לדחוס בזהירות עם גזה סטרילית. תיאור צעד אחר צעד של הכריתה מוצג באיור 1.
הערה: הפגם נוצר עם אגרוף קטן יותר מאשר אחד ליצירת הפיגומים, כדי לפצות הגדלה של הפגם בשל גמישות העור.
.5 פיגום השרשה
- על מנת לפנות מקום לטיטהnized רשת, להאריך את ההפרדה של עור ורקמה בסיסית בגבולות הפצע ל2-4 מ"מ (איור 2 א).
- הנח את titanized רשת לפגם באופן ישיר על מיטת הפצע ומתחת לקצות הפצע (איורים 2 א & B).
- מקום פיגומים ישירות על הרשת.
- תפר את הפיגומים לקצות פצע הסמוכים עם 4 עד 6 קשרים יחידים, והשאיר את הקצוות מעט מעל הפיגום (איור 2 ג).
הערה: יש להימנע משימוש בתפרים מתכלים. - לתפור פצע שקוף הלבשה מעל הפגמים כדי להגן על הפיגום, ובמקביל לאפשר ניטור של אזור הפצע (איור 2 ד).
.6 לאחר ניתוח טיפול
- שמור עכבר אחד לכלוב כדי למנוע מניפולציה הדדית של ההלבשה ופיגומים.
- להעריך את המצב הכללי של בעלי החיים על בסיס יומי על ידי פעילות התבוננות מנוע, משקל גוף, סימנים של כאב, סובלנותלהלבשה ואוטומטית הטלת המום. גם לפקח על אזור הפצע לדימום, מקומי וסימנים מערכתיים של זיהום ואת עמדתו של הרוטב.
- על מנת למזער את הכאב של בעלי החיים, להזריק Buprenorphin יומי במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף או משככי כאבים שווי ערך.
- אם העכבר מסיר או נזקי ההלבשה הפצע, להחליף או לצרף אותו בהרדמה.
.7 המתת חסד וexplantation של הפיגום
- בנקודות זמן רצויים, להקריב בעלי החיים על ידי מינון יתר של Pentobarbital (150 מ"ג / קילוגרם).
- לסמן את האתר של כריתת עור עם סמן קבוע, אשר צריך לכלול את הפיגומים וכמה שיותר את העכבר בחזרה עור כ( איור 3 א) האפשריים.
- לחתוך את העור לאורך הקווים המסומנים במספריים או סכין מנתחים. לנתק את כל העור, כולל הפיגומים ורשת titanized, מהרקמה הבסיסית דרך הכנה בוטה (Fiתרשים 3 ב).
- מניחים את רקמת explanted השרועה על צלחת פטרי (איור 3 ג וד)
.8 ויזואליזציה וכימות של רשת כלי הדם
- שקוף:
- הגדרת התקן שקוף, על ידי ההרכבה צלחת פטרי מעל מקור חזק של אור הלבן (100 הנורה סטנדרטית ואט).
- תקן את מצלמה דיגיטלית מעל transilluminator להשיג תמונות דיגיטליות.
- מניחים את הדגימות במהופך על צלחת פטרי על המכשיר השקוף.
- קח את התמונות של הפיגומים מלאים במצב מקרו, כמו גם של אזורים שווים בגודלן של עור רגיל. לאחסן את התמונות בפורמט TIFF לניתוח דיגיטלי נוסף.
- שמור את הרקמה לאנליזה ביוכימית או היסטולוגית נוספת.
- פילוח דיגיטלי וכימות:
- הורד והתקן את תוכנת VesSeg-הכלי, אשר ניתן להשיג frEE תשלום ב: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255.
- פתח את התמונה עם תוכנת VesSeg-הכלי.
- בחר את האזור בתמונה מכוסה על ידי הפיגום לניתוח דיגיטלי (תמונה → בחר).
- כדי להגדיל את החדות של כלי להשתמש באפשרות "thresholding Hysteresis" (תמונת מסנן → thresholding Hysteresis → שיפור כלי → Top Hat-שינוי → שיפור כלי חישוב).
- להמשיך עם הפילוח של מפת הכלי (גבולות סף → התמונה → מסנן → thresholding Hysteresis שיפור כלי). בחר את הסף הראשון ("כיסוי כלי השיט"), כך שכל פיקסל, וזה אפילו מרחוק כמו כלי-, יופיע תחת כותרת כלי. בחר את הסף השני ("כיסוי רקע"), כך שרק אלה פיקסלים שהם במיוחד יופיעו תחת כותרת כלי כמו ספינה.
- בדוק את הצעת הפילוח האוטומטית באופן ידני להוסיף כלי שאינם נתפסו ולחסל את המבנים חיוביים שגויים נפוצים, אשר בדרך כלל הם מבנים כגון שערות או תפרים ארוכים ודקים, כמו כלי.
- לחשב את אורכו של כלי השיט והשטח הכולל המכוסה על ידי ספינות (סטטיסטיקת תמונת → התמונה → סטטיסטיקת תמונה בינארי).
הערה: לחישוב הכלי-האורכים, כלים במפת כלי כתוצאה מכך הם דלילים לקווים ברוחב של פיקסל אחד 20.
- לנתח את אזור עור הילידים תחת אותם הפרמטרים כמו הפיגומים, קביעת ערך של 100% לרקמות המקומיות ומתייחס הפיגום לשווי ש. לדוגמא, אם אחוז הפיקסלים הלבנים הוא 60% ברקמה הנורמלית ו30% בפיגום, זה היה מייצג כלי דם 50% מהפיגום. הערה: כיסוי כלי הלבן הצטרף לשטח של ריבוע סביב הפיגום. התאם את מספר consi כיסוי פיקסלים הלבניםדרינג שהשטח של המעגל הוא (R π x 2) הקטן יותר באופן משמעותי מאשר מרובע (4 x R 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פגם עור אמין דו צדדי מלא ניתן ליצור בעכבר (איור 1) שבו העור יכול להיות מוחלף על ידי חומר ביולוגי תחת מחקר (איור 2). כאן, אין סיבוכים עיקריים שנצפו במהלך או לאחר ההליך האופרטיבי, לא סימנים מקרוסקופית של זיהום או תגובת גוף זרה. במקרים נדירים, פיגום הולך לאיבוד כאשר עכבר מסיר אותו. התכווצות פצע מעולם לא נצפתה (איור 3). שקוף רקמה אפשר להדמיה ברורה של מבנים וכלי דם של עד 30 מיקרומטר ברוחב, בדגימת רקמה שלמה שכללה את שניהם, רקמות ילידים ופיגומים מושתלים (איור 4). לאחר פילוח דיגיטלי, ניתן לכמת כלי קלות בזמנים רצויים לפרסם השתלה. לדוגמא, 2 שבועות לאחר ההשתלה, רמות כלי הדם של 62.28 ± 8.6% נצפו (ממוצע ± סטיית ההתקן של ממוצע, n = 8) 21. בסך הכל, כ -25 דקות &# 160; לכל בעלי חיים (2 פיגומים) נדרש להשתלה, 5 דקות לקציר רקמה ומדמיין ו10 דקות לניתוח דיגיטלי של דגימה אחת. כנקודה סופית, שיטה זו אינה משפיעה על איכות רקמת explanted לניתוח נוסף. לדוגמא, ניתן להשיג בקלות חלבונים ותמציות RNA מהמדגם על ידי שיטות סטנדרטית.
איור 1 פגם עור מלא. קו האמצע של הגב של העכבר מסומן עם עט קצה קנס וביופסיה משמשת לסמן את השטח היה הפגם ייווצר (A, B, C, D). ברגע שהאזורים מוגדרים, עור מלא מוסר עם מספריים כירורגיות סטנדרטיים כפי שניתן לראות בצילום התקריב של ההכנה (E ו F). Fתוצאת INAL של הפגם מוצגת ב( D) ומוגדל ב( G). ברים סולם מייצגים 1 סנטימטר בABCD ו5 מ"מ בEFG. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 השרשה של הפיגום. לפני ההשתלה של הפיגום, רשת ממוקמת לתוך הפגם ישירות על מיטת הפצע ומתחת לקצות הפצע (A, B). הפיגומים הבא מונחים על הרשת ונתפרו לקצות הפצע (C). לבסוף, הלבשה פצע שקופה ממוקמת ונתפרה לעור (D). סרגל קנה מידה מייצג 5 מ"מ ב( A, B, C) ד 1 סנטימטר (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 explantation רקמות. לניתוח רקמת העור המלא מהחלק האחורי של החיה הוסר בניתוח (A, B) והשתרע על צלחת פטרי (C). לשקוף העור מתהפך ותמונה דיגיטלית נלקחה (D). הסרת העור ליד הפיגומים הכרחית לנורמליזציה של נתונים כלי הדם. ברים סולם מייצגים 1 סנטימטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s = "jove_content" FO: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 4 השתקפות אור, פילוח דיגיטלי וכימות. רקמת עור הייתה נכרתה ורשת כלי הדם בתוך שדמיין ידי שקוף (תמונות העליונות) עור מלא של הגב () ואזורים מפורטים של העור האם של (B) והפיגום (C ) מוצגים. חיצים מראים אזורים מוגדלים ב( ב) ו (ג). כל אחת מהתמונות התחתונות מראה את התוצאות של תהליך הפילוח הדיגיטלי לתמונה הממוקמת ישירות מעל. ברים סולם מייצגים 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש צורך בהקמת גישות מוצלחות בשיפור זלוף דם במבני רקמה מהונדסת, הדורש פיתוח שיטות אמינות חדשות ללמוד את תהליכי כלי הדם בתוך החומרים הביולוגיים. שיטות נפוצות להכנת כלי דם פיגום גלוי vivo לשעבר כוללות שימוש במיקרוסקופ, אשר מספק כלי ברזולוציה גבוהה. ברוב המקרים, אם כי, בשיטה זו מוגבלת לניתוח של אזורי רקמה קטנים ונוטה להיות יקר זמן רב. יתר על כן, לעתים קרובות כולל תיוג משוכלל ושיטות צביעה, שבו לא ניתן להבחין בין כלי דם perfused מאינם פונקציונליים אלה 22. שיטות בשימוש על מנת להעריך את הפונקציונליות של כלים הן טומוגרפיה מחשב, הדמיה בתהודה מגנטית וטומוגרפיה אלקטרון פוזיטרון. שיטות אלה יש חסרונות של ציוד יקר מאוד ורזולוציה נמוכה כוח 23. אסטרטגיה הנפוצה נוספת לדמיין כלי דם היאשימוש בכלי דם יציקות ואחריו קורוזיה כימית של הרקמה 24. שיטה זו מאפשרת להשיג מבנה 3D נציג של רשת כלי הדם, אך התוצאות מאוד משתנות בהתאם לרמה של זלוף ורקמות המלאכותיים לא יכול לשמש למחקרים ביוכימיים נוספים, כגון חלבון או ניתוח RNA. קרום העוף chorioallantoic המודל (CAM) 25 והמודל קאמרי skinfold במכרסמים 26,27 הראו להיות שיטות יעילות לניתוח אנגיוגנזה, זלוף נימים וזרימת דם. לאחרונה, מודל תא skinfold כמו כן נעשה שימוש עבור יישומי הנדסת רקמות הערכת אסטרטגיות כלי דם מבוססי MSC בפיגומי פוליאוריטן נקבוביים 28. יתרונות אלה השיטות הנוכחיים חשובים להדמית in vivo ולייצג יעד אטרקטיבי לשיטה המתוארת כאן.
המודל המוצג כאן פותח כדי להתגבר על החסרונות של השיטות מ 'entioned לעיל. מנצל את המאפיינים הפנימיים הייחודיים של העור, פגמים מלאים נוצרים ומשמשים להערכת כלי דם של חומרים ביולוגיים. עור הוא איבר חיצוני, המאפשר הדמיה ומניפולציה של הרקמה קלה יותר. בגלל מבנה פני השטח והומוגנית הגדול שלה, יכולים להיות שנוצרו פגמים מרובים אשר עושים השוואות פנימיות אפשריות, תוך הפחתת מספר בעלי החיים הדרושים למחקר. בשל הסימטריה Antero-האחורי של החיה, פגמים בין שתי המדינות הם הציעו, לעומת זאת; ההשפעה של תופעות מערכתיות יש לשקול בעת שני הצדדים בהשוואה זה לזה. לבסוף, עור היא רקמה די שקופה המייצגת איבר אופטימלי של בחירה לשקופה. למרות שהשיטה המתוארת כאן מתאימה לרקמות רבות ושונות ילידים וכמה חומרים ביולוגיים, פרוטוקול זה היה במקור הוקם לשימוש עם פיגום מבוסס קולגן בשכבה כפולה, כי הוא אישר FDA-וקליני המשמש לדהתיקון rmal. תנאי חשוב ליישומה של שיטה זו הוא שהפיגום צריך להיות שקוף באופן חלקי. תלוי בחומר הפיגום שנבחר, ייתכן שיידרש כמה עיבוד של הפרוטוקול. בעבר, הקבוצה שלנו השתמשה במודל כדי להראות עד כמה היישום של תאי מזנכימה אדם לפיגומים משפר כלי הדם שלהם 29.
מצלמה דיגיטלית רגילה ומקור אור מספיקים להדמיה של רשת כלי הדם, אשר ניתן לכמת באמצעות תוכנה חופשית. הפילוח האוטומטי של התמונות על ידי VesSeg-הכלי מורכב משני שלבים. בשלב הראשון, התמונה נלקחה מרשת כלי הדם היא שמוביל למפת כלי חומר ניגוד. לאחר מכן, אלגוריתם הפילוח בוחר את אזורי הספינה ולבסוף, הצעת הפילוח מוצגת כתמונה (איור 4) 30. בשלב עיבוד שני, תוך שימוש בעובדה שכולים מחוברים structures (כלומר פיקסלים כלי לתלות יחד מרחבית), פילוח שני משמש לבחירה מראשונה רק את הפיקסלים כלי האמיתיים וכל הפיקסלים הכלי האמיתיים. לכן, תווית סופית של "אחד" מוענקת רק לפיקסלים אלה נמוך ביטחון כלי שיט מהתמונה הראשונה שמחוברים על שרשרת של שכנים לפיקסל כלי ברמה ודאות גבוהה בתמונה השנייה.
מאחר שלא תוספים כימיים נחוצים, שיטה זו היא גם חסכונית. ניתוח דיגיטלי מציג שחזור טוב בקביעת ממדי כלי, מרחקי intravascular, מספר נקודות הסתעפות, אזור כלי דם ואורך הכולל של רשת כלי דם. יש לנו הראינו בעבר כי רשת כלי דם יכולה להיות דמיין טובה יותר על ידי שקוף שלא דרך מחקרי רדיו אנגיוגרפיה ביום 31 ב. הנוכחות של רשת טיטניום יש תפקיד כפול. מצד אחד, הוא מונע התכווצות פצע, שהוא חסרון נפוץ של השימוש במו העכברdels; מצד השני, זה מספק גבול פיזי בין הפיגום ומיטת הפצע. מכיוון שרוב הפיגומים מתכלים, הפונקציה הנזכרת לאחרונה היא קריטית לdelimitate פיזי הגבול בין הפיגום ומיטת הפצע במהלך הקציר של הפיגומים. בין החסרונות העיקריים של שיטה זו הוא הצורך של explanting הפיגומים ולכן לרסן של הניתוח לנקודת זמן אחת; כך התצפית הדינמית של כלי דם אינה אפשרית עם ההגדרה הנוכחית. בעיה נוספת היא ששיטה זו מוגבלת לחומרים ביולוגיים שקופים למחצה המאפשרים שקופה. לבסוף, למרות שהליך הפעולה אינו דורש מיומנויות כירורגיות מיוחדות, עקומת למידה של כ 6 - 12 בעלי חיים המופעלים צריכה להיחשב להשתלט על השיטה כראוי.
אנחנו מציגים את זמן וגישה חסכונית המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה וכימות של מבנים וכלי דם, representing שיטה אידיאלית כדי להשוות כלי דם בחומרים ביולוגיים שונים או אסטרטגיות פיגום-bioactivation שונות. שיטה זו היא קלה להקמה ואינה דורשת ציוד מיוחד. תכונה מרכזית של מודל זה היא שאחרי הדמיה כלי, רקמות יכולות לשמש עוד ללימודים כגון היסטולוגית או ניתוח מולקולרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
סכסוך של הצהרת ריבית:
כל המחברים: אין
גילויים פיננסיים:
אף אחד מהמחברים יש אינטרס כלכלי בכל אחד מהמוצרים, המכשירים, או התרופות שהוזכרו בכתב היד הזה.
Acknowledgments
תבנית התחדשות עורי Integra סופקה באדיבות על ידי תאגיד Lifesciences Integra. מקורות של קרנות התומכות בעבודה: עבודה זו מומנו באופן חלקי מוקדם Translational II פרס CIRM-BMBF ומרכז FONDAP לרגולצית הגנום הן לJTE על ידי (Nr 15,090,007.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
References
- Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
- Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
- Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
- Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
- Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
- Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
- Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
- Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
- Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
- Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
- des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
- Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
- Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
- Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
- Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
- Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
- Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
- Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
- Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
- Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
- Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
- Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
- Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
- Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
- Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
- Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
- Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
