Summary
Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.
Abstract
Vascolarizzazione insufficiente è considerata uno dei principali fattori limitanti il successo clinico di costrutti tissutale. Al fine di valutare nuove strategie che mirano a migliorare la vascolarizzazione, metodi affidabili sono tenuti ad effettuare la in-crescita di nuovi vasi sanguigni in impalcature visibili bio-artificiale e quantificare i risultati. Negli ultimi due anni, il nostro gruppo ha introdotto un modello di difetto completo della pelle che consente la visualizzazione diretta dei vasi sanguigni da parte transilluminazione e fornisce la possibilità di quantificazione attraverso la segmentazione digitale. In questo modello, si crea chirurgicamente difetti pieni di pelle nella parte posteriore di topi e li sostituisce con il materiale testato. Molecole o cellule di interesse possono anche essere incorporati in tale materiale, per studiare il loro effetto potenziale. Dopo un periodo di osservazione di uno di propria scelta, i materiali vengono espiantati per la valutazione. Ferite bilaterali offrono la possibilità di fare confronti interni tha minimizzare gli artefatti tra individui nonché di diminuire il numero di animali necessari per lo studio. In confronto ad altri approcci, il nostro metodo offre una semplice, efficace analisi affidabile ed economica. Abbiamo implementato questo modello come strumento di routine per eseguire lo screening ad alta risoluzione durante il test vascolarizzazione di diversi biomateriali e approcci bio-attivazione.
Introduction
Negli ultimi decenni, l'ingegneria dei tessuti ha aperto una nuova opzione terapeutica per sostituire difetti del tessuto con le cellule del corpo 1. Al fine di sostenere il processo fisiologico di rigenerazione tissutale, ponteggi sono progettati come una struttura biodegradabile, che fornisce uno scenario in cui le cellule dal letto della ferita possono crescere e ripristinare il difetto 2,3.
Vascolarizzazione insufficiente è considerata il principale ostacolo, che trattiene la svolta clinico di scaffold bioartificiali 4. Con la ricrescita delle cellule, la domanda di sostanze nutritive e di ossigeno aumenta e vascolarizzazione del materiale diventa essenziale. Vascolarizzazione insufficiente o ritardato può quindi portare a necrosi centrale dei prodotti dell'ingegneria tissutale 5. Inoltre, i vasi sanguigni forniscono le cellule immunocompetenti e rimuovere i residui metabolici nella zona rigenerante. Gli alti tassi di infezione e la bassa rigenerazione sono soloalcune delle conseguenze di una insufficiente perfusione sanguigna osservato in ingegneria dei tessuti, che mirano ad essere evitato aumentando la vascolarizzazione dei ponteggi 6,7.
Diverse strategie che mirano a migliorare la vascolarizzazione attenzione sul ruolo chiave del biomateriale stesso e la microstruttura del patibolo. Ci sono sforzi di ricerca intensivi per sviluppare nuovi approcci nello spostare il processo di guarigione dalla riparazione alla rigenerazione, quindi (ri) generazione di un tessuto con le proprietà fisiologiche più vicino a quello da ristrutturare 8,9. Biomateriali che sono stati studiati e valutati con riferimento al loro potenziale rigenerativo inclusi collagene, fibrina, chitosano e alginato 10,11. Questi biomateriali possono essere utilizzati e combinati come una spina dorsale per la costruzione di nuove impalcature utilizzando diverse strategie come decellularization tessuto, auto-assemblaggio, prototipazione rapida e elettrospinning 12. Per ENHANCE propria capacità rigenerativa del corpo, ponteggi possono essere bioattivato. L'incorporazione di crescita angiogenico ricombinante fattori di 13 o vettori di geni che codificano per fattori 14 ha dimostrato di migliorare la vascolarizzazione del patibolo. L'uso di cellule staminali è stato ampiamente dimostrato di essere una strategia promettente per migliorare la vascolarizzazione, dove le cellule stromali mesenchimali e le cellule progenitrici endoteliali hanno guadagnato più attenzione 15,16. Altri approcci tentano di costruire costrutti che contengono le reti dei vasi prefabbricati prima del trapianto 17. Nonostante intensi sforzi nella progettazione patibolo e la loro bio-attivazione, nessuna strategia è migliorata vascolarizzazione a livello clinicamente significativo e, con l'eccezione di sostituzioni dermici in massicce ustioni, la traduzione di materiali bioengineered nella routine clinica si sta solo posto esitante 18 .
Una delle ragioni per cui vascolarizzazionedi costrutti di tessuto artificiale è ancora un problema irrisolto, è la difficoltà di valutare il successo delle nuove tecnologie negli approcci in vivo. Anche se gli esperimenti in vitro possono fornire importanti intuizioni del potenziale vascolarizzazione di ponteggi, modelli animali appropriati sono tenuti a studiare i parametri chiave quali la biocompatibilità del materiale, la sicurezza e l'efficacia del trattamento e, di particolare importanza, la vascolarizzazione del tessuto costruire. Pertanto, strumenti affidabili per visualizzare e quantificare le reti dei vasi sanguigni in vivo sono essenziali.
In questo studio presentiamo un metodo semplice e affidabile che permette la visualizzazione e la quantificazione della rete vascolare all'interno ponteggi espiantati. Questo metodo si basa sulla transilluminazione tessuto e segmentazione digitale. Poiché questo metodo è non invasivo, permette ulteriori analisi molecolari e istologiche del materiale bersaglio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Preparazione di Ponteggi
- Generare campioni dei ponteggi utilizzando 12 millimetri pugni biopsia.
- Per introdurre molecole bioattive o cellule nel patibolo, drenare i ponteggi da loro stringendo delicatamente con una garza sterile. Poi reidratare i ponteggi aggiungendo 160 ml di una soluzione contenente le molecole bioattive o cellule di interesse. Ricontrollare il successo di bioattivazione con cellule attraverso saggi metaboliche come MTT saggi.
- Se necessario, fissare i composti o le cellule da testare all'interno del ponteggio fornendo loro, ad esempio in una soluzione di fibrina-trombina o un idrogel, ancora attraverso reidratazione come descritto al punto 1.2.
NOTA: Questo passaggio può essere utile quando i composti o le cellule non attribuiscono meccanicamente al materiale. Si può anche controllare le dinamiche di rilascio dei composti .. - Preparare le maglie titanized, che saranno collocati sotto ogni impalcatura in ogni gruppo di sperimentazione e di controllo, da Cutting i pezzi a forma rotonda, di circa 14 mm di diametro.
NOTA: La maglia titanized funziona come un confine fisico richiesto per delimitare il tessuto rigenerato dal letto della ferita.
2. Animali
- Prima attuazione del modello presentato, consultare le leggi di protezione degli animali corrispondenti e ottenere il permesso da parte delle autorità locali. In questo lavoro, tutti gli esperimenti sono stati effettuati con topi, secondo l'attuale atto benessere degli animali tedesca e approvati dal governo distretto dell'Alta Baviera (Regierung von Oberbayern).
- Scegliere con cura l'animale e la tensione. Anche se il modello è stato stabilito per i topi, che può essere tradotto ad altri animali comuni, come ratti, conigli e maiali.
- Nel caso in cui si sta lavorando con gli animali pelo, radere la parte posteriore degli animali prima dell'impianto degli scaffold.
NOTA: Questo lavoro utilizza topi di 6 a 8 settimane di età con un peso corporeo compreso tra 20 ge 25 g, ma diverse età e bpesi ody possono anche essere utilizzati.
3 Anestesia
- Effettuare l'operazione in condizioni sterili. Al fine di mantenere la normale temperatura corporea dell'animale, utilizzare un tappetino riscaldante.
- Prima di inalazione anestesia gli animali ricevono buprenorfina alla dose di 0,05-0,1 mg / kg di peso corporeo, per via sottocutanea ogni 8 ore.
- Posizionare l'animale in anestesia per inalazione (isoflurano) oppure applicare procedure standard equivalenti. Confermare l'anestesia sia premendo delicatamente le dita dei piedi dell'animale o tramite un pizzico di pelle.
- Per evitare essiccosi, iniettare 0,5 ml di soluzione salina fisiologica sottocute all'inizio dell'operazione.
4. escissione della pelle
- Mettere l'animale in posizione prona e segnare la linea mediana della schiena del mouse con una punta fine penna permanente (Figura 1A).
- Definire l'area di escissione. Mettere i difetti nell'area mostrata in Figuri 1C. Si noti che se i difetti siano troppo caudalmente, gli animali sono più inclini a rimuovere le medicazioni ed i ponteggi.
- Crea rotondo difetti bilaterali utilizzando una biopsia del punzone 10 mm (Figura 1B). Il punzone deve essere attentamente forzato contro la pelle e non deve essere usato per tagliare completamente attraverso la pelle, ma per delineare l'area di escissione (Figure 1C e 1E).
- Sollevare delicatamente la pelle sensibile con una pinza e incidere lungo il cerchio marcato con le forbici chirurgiche sottili (Figura 1F). In caso di sanguinamento, comprimere delicatamente con una garza sterile. Una descrizione passo-passo della escissione è mostrato in Figura 1.
NOTA: Il difetto viene creato con un punzone inferiore a quello per la generazione dei ponteggi, per compensare l'allargamento del difetto dovuto alla elasticità della pelle.
5. Scaffold impianto
- Al fine di rendere lo spazio per il titasciuta maglia, estendere la separazione della pelle e dei tessuti sottostanti alle frontiere ferita per 2-4 mm (Figura 2A).
- Posizionare il titanized maglia nel difetto direttamente sul letto della ferita e sotto i bordi della ferita (Figure 2A e B).
- Luogo Ponteggi direttamente sulla maglia.
- Suturare i ponteggi ai bordi della ferita adiacenti con 4 a 6 singoli nodi, lasciando i bordi leggermente sopra il patibolo (Figura 2C).
NOTA: Evitare l'uso di suture biodegradabili. - Suturare una ferita medicazione trasparente sopra i difetti di proteggere il ponteggio pur consentendo il monitoraggio della ferita (Figura 2D).
6. postoperatoria Cura
- Mantenere un mouse per gabbia per evitare la manipolazione reciproca della medicazione e ponteggi.
- Valutare lo stato generale dell'animale su una base quotidiana per attività osservando motore, il peso corporeo, segni di dolore, tolleranzaper la medicazione e auto-mutilazione. Monitorare anche la zona della ferita di sanguinamento, locale e segni sistemici di infezione e la posizione della medicazione.
- Per ridurre al minimo il dolore dell'animale, iniettare buprenorfina ogni giorno alla dose di 0,05-0,1 mg / kg di peso corporeo o farmaci analgesici equivalente.
- Se il mouse rimuove o danneggia la medicazione della ferita, sostituire o ricollegare sotto anestesia.
7 Eutanasia e Espianto dell'impalcatura
- A intervalli di tempo desiderati, sacrificare gli animali da overdose di pentobarbital (150 mg / kg).
- Segnare il sito di escissione pelle con un pennarello indelebile, che dovrebbe includere i ponteggi e quanto del mouse schiena pelle possibile (Figura 3A).
- Incidere la pelle lungo le linee segnate con un paio di forbici o un bisturi. Staccare tutta la pelle, compresi i ponteggi e la rete titanized, dal tessuto sottostante attraverso la preparazione smussato (Fifigura 3B).
- Posizionare il tessuto espiantato sdraiati su una piastra di Petri (Figura 3C e D)
8 Visualizzazione e quantificazione della rete vascolare
- La transilluminazione:
- Configurare un dispositivo transilluminazione, montando una piastra di Petri di sopra di una forte sorgente di luce bianca (100 Watt lampadina standard).
- Fissare una fotocamera digitale sopra il transilluminatore per ottenere immagini digitali.
- Posizionare i campioni a testa in giù sulla piastra di Petri sul dispositivo transilluminazione.
- Scattare foto dei ponteggi completi in modalità macro, nonché delle aree di uguali dimensioni di pelle normale. Conservare le immagini in formato TIFF per ulteriori analisi digitale.
- Salvare il tessuto per ulteriori analisi biochimica o istologica.
- Segmentazione digitale e quantificazione:
- Scaricare e installare il software VesSeg-Tool, che può essere ottenuto free di carica a: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
- Apri l'immagine con il software VesSeg-Tool.
- Selezionare l'area dell'immagine oggetto del ponteggio per l'analisi digitale (Immagine → Seleziona).
- Per aumentare il contrasto delle navi usare l'opzione "Isteresi soglia" (Immagine → valorizzazione Vaso filtro → Isteresi soglia → Top-Hat trasformazione → Calcolare la valorizzazione nave).
- Procedere con la segmentazione della mappa imbarcazione (confini Immagine → valorizzazione Vaso filtro → Isteresi soglia → Threshold). Selezionare la prima soglia ("copertura Vessel"), così ogni pixel, che è anche lontanamente nave simile, sarà etichettato come nave. Selezionare la seconda soglia ("copertura Background"), in modo che solo i pixel che sono particolarmente nave-come saranno etichettati come i vasi.
- Controllare la proposta automatica di segmentazione manualmente per aggiungere le navi non catturati e per eliminare i falsi positivi strutture comuni, che di solito sono strutture lunghe e sottili vasi simili, come peli o suture.
- Calcolare la lunghezza dei vasi e la superficie totale coperta da navi (statistiche Immagine → Immagine → statistiche immagine binaria).
NOTA: Per il calcolo della nave lunghezze, navi in risultante cartina nave sono assottigliate a linee con una larghezza di un pixel 20.
- Analizzare l'area pelle nativo sotto gli stessi parametri i ponteggi, assegnando un valore di 100% per il tessuto nativo e riguardano il patibolo a quel valore. Per esempio, se la percentuale di pixel bianchi è del 60% nel tessuto normale e il 30% nel ponteggio, rappresenterebbe una vascolarizzazione 50% del ponteggio. Nota: La copertura vasi bianco viene assegnato l'area di un quadrato attorno al patibolo. Regolare il numero di pixel bianchi consi coperturadering che l'area del cerchio è significativamente più piccolo (π x R 2) del quadrato (4 x R 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un difetto pelle piena bilaterale affidabile può essere creato nel topo (Figura 1) in cui la pelle può essere sostituito da un biomateriale in studio (Figura 2). Qui, senza grandi complicazioni si osservano durante o dopo la procedura operativa, né segni macroscopici di infezione o reazione da corpo estraneo. In rari casi, una impalcatura si perde quando un mouse rimuove. Contrazione della ferita non è mai stato osservato (Figura 3). Tissue transilluminazione permesso chiara visualizzazione delle strutture vascolari fino a 30 micron di larghezza, in un campione di tessuto intero che includeva sia, tessuto nativo e scaffold impiantati (Figura 4). Dopo la segmentazione digitale, le navi possono essere facilmente quantificati a volte desiderate inviare impianto. Ad esempio, due settimane dopo l'impianto, sono stati osservati livelli di vascolarizzazione di 62.28 ± 8,6% (media ± errore standard della media, n = 8) 21. Complessivamente, circa 25 min &# 160; per animale (2 ponteggi) sono necessari per l'impianto, 5 min per la raccolta dei tessuti e raffigurazione e 10 min per l'analisi digitale di un campione. Come punto finale, questo metodo non influisce sulla qualità del tessuto espiantato per ulteriori analisi. Per esempio, le proteine ed estratti di RNA possono essere facilmente ottenuti dal campione mediante metodi standard.
Figura 1 Difetto completa della pelle. La linea mediana della schiena del mouse è contrassegnato con una penna a punta fine e un pugno biopsia è usato per indicare l'area erano verrà creato il difetto (A, B, C e D). Una volta che le aree sono definite, piena pelle viene rimosso con le forbici chirurgiche standard, come si è visto nel primo piano della preparazione (E e F). A frisultato inale del difetto è mostrato in (D) e ingrandita nella (G). Barre di scala rappresentano 1 cm di ABCD e 5 mm di EFG. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Impianto del ponteggio. Prima della impianto del ponteggio, una maglia viene posizionato nel difetto direttamente sul letto della ferita e sotto i bordi della ferita (A e B). Successiva ponteggi sono disposti sopra la maglia e suturati ai bordi della ferita (C). Infine, una medicazione trasparente è posto e suturato alla pelle (D). Barra di scala rappresenta 5 mm (A, B, e C) di und 1 cm (D). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Tissue espianto. Per l'analisi dei tessuti piena pelle dalla parte posteriore dell'animale viene rimosso chirurgicamente (A e B) e distesa su una piastra di Petri (C). Per transilluminazione la pelle è capovolto e una foto digitale è presa (D). La rimozione della pelle accanto ai ponteggi è necessaria per la normalizzazione dei dati vascolarizzazione. Barre di scala rappresentano 1 cm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 transilluminazione, segmentazione digitale e la quantificazione. Tessuto cutaneo è stato asportato e la rete vascolare all'interno è stato visualizzato da transilluminazione (immagini superiori) pelle pieno della schiena (A) e aree di dettaglio della pelle nativo (B) e il patibolo (C sono mostrate). Le frecce indicano le aree ingranditi in (B) e (C). Ciascuna delle immagini inferiore mostra i risultati del processo di segmentazione digitale per l'immagine si trova direttamente sopra. Barre di scala rappresentano di 5 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi è la necessità di stabilire approcci di successo nel migliorare la perfusione sanguigna in ingegneria tessutale costrutti, che richiede lo sviluppo di nuovi metodi affidabili per studiare i processi di vascolarizzazione all'interno dei biomateriali. Metodi comuni per la preparazione di scaffold vascolarizzazione ex vivo visibile includono l'uso della microscopia, che fornisce uno strumento ad alta risoluzione. Nella maggior parte dei casi, però, questo metodo è limitato all'analisi di piccole aree di tessuto e tende ad essere costoso e richiede tempo. Inoltre, include spesso l'etichettatura elaborato e metodi di colorazione, in cui i vasi sanguigni perfuso non possono essere distinte da quelle non funzionali 22. I metodi in uso per valutare la funzionalità dei vasi sono la tomografia computerizzata, la risonanza magnetica e positroni tomografia elettronica. Questi metodi hanno gli inconvenienti di apparecchiature estremamente costose e bassa risoluzione potenza 23. Un'altra strategia comunemente usato per visualizzare vascolarizzazione rappresenta l'uso di calchi vascolare seguita da corrosione chimica del tessuto 24. Questo metodo consente di ottenere una struttura rappresentativa 3D della rete vascolare, ma i risultati variano fortemente a seconda del livello di perfusione e tessuti artificiali non può essere utilizzato per ulteriori studi biochimici, quali proteine o RNA analisi. La membrana corioallantoidea pollo (CAM), il modello 25 e il modello di camera di skinfold nei roditori 26,27 hanno dimostrato di essere efficaci metodi per analizzare l'angiogenesi, perfusione capillare e il flusso di sangue. Recentemente, il modello di camera di plica è stato utilizzato anche per applicazioni di ingegneria tissutale valutazione delle strategie basate vascolarizzazione-MSC in poliuretano scaffold porosi 28. Questi metodi presentano vantaggi importanti per l'imaging in vivo e rappresentano un bersaglio attraente per il metodo descritto qui.
Il modello qui presentato è stato sviluppato per superare le carenze del metodo mentioned sopra. Approfittando delle caratteristiche intrinseche uniche della pelle, difetti completi vengono creati e utilizzati per valutare la vascolarizzazione dei biomateriali. La pelle è un organo esterno, che consente la visualizzazione facile e manipolazione del tessuto. A causa della sua grande struttura superficiale e omogenea, difetti multipli possono essere creati che rendono possibile comparazioni interne, riducendo il numero di animali necessari per lo studio. A causa della simmetria antero-posteriore dell'animale, difetti bilaterali sono suggeriti, tuttavia; l'influenza di effetti sistemici dovrebbe essere considerato quando entrambe le parti sono confrontate tra di loro. Infine, la pelle è un tessuto abbastanza trasparente che rappresenta un organo ottimale di scelta per transilluminazione. Anche se il metodo qui descritto è adatto per molti diversi tessuti nativi e diversi biomateriali, questo protocollo è stato originariamente creato per essere utilizzato con un doppio strato a base di collagene patibolo che è approvato dalla FDA e clinicamente utilizzato per deriparazione RMAL. Un presupposto importante per l'attuazione di questo metodo è che il ponteggio deve essere parzialmente trasparente. A seconda del materiale ponteggio scelto, qualche adattamento del protocollo potrebbe essere necessaria. In precedenza, il nostro gruppo ha utilizzato il modello per mostrare come l'applicazione di cellule mesenchimali umane per ponteggi aumenta la loro vascolarizzazione 29.
Una fotocamera digitale standard e una sorgente di luce sono sufficienti per la visualizzazione della rete vascolare, che può essere quantificata mediante software libero. La segmentazione semiautomatica delle immagini da parte del VesSeg-strumento si compone di due fasi. Nella prima fase, l'immagine presa dalla rete vascolare è mdc portando ad una mappa vaso. Quindi, l'algoritmo di segmentazione seleziona le aree della nave e, infine, la proposta di segmentazione è presentata come immagine (Figura 4) 30. In una seconda fase di lavorazione, utilizzando il fatto che le navi sono collegati structures (il che significa che i pixel dei vasi appesi insieme spazialmente), una seconda segmentazione viene utilizzata per selezionare dalla prima solo i veri vasi pixel e tutti i veri vasi pixel. Pertanto, l'etichetta finale di "uno" viene assegnato solo a quegli bassa fiducia dei vasi pixel dalla prima immagine che sono collegati su una catena di vicini di casa per un high-fiducia nave pixel nella seconda immagine.
Poiché non sono necessari additivi chimici, questo metodo è anche conveniente. Analisi digitale mostra una buona riproducibilità a determinare le dimensioni del vaso, distanze intravascolari, numero di punti di ramificazione, zona vascolarizzata e la lunghezza totale della rete vascolare. Abbiamo precedentemente dimostrato che la rete dei vasi sanguigni può essere meglio visualizzata con transilluminazione che attraverso studi radiofonici-angiografico 31. La presenza della rete titanio ha una doppia funzione. Da una parte, impedisce la contrazione della ferita, che è un inconveniente comune dell'uso di topo models; d'altra parte, essa fornisce un confine fisico tra il ponteggio e il letto della ferita. Poiché la maggior parte delle impalcature sono biodegradabili, quest'ultima funzione è fondamentale per delimitare fisicamente il confine tra il patibolo e il letto della ferita durante la raccolta dei ponteggi. Tra i principali svantaggi di questo metodo è la necessità di espianto scaffold e quindi l'frenare dell'analisi di un punto singolo tempo; così l'osservazione dinamica di vascolarizzazione non è possibile con l'impostazione corrente. Un altro problema è che questo metodo è limitato a biomateriali semitrasparenti che permettono transilluminazione. Infine, anche se la procedura di funzionamento non richiede particolari abilità chirurgiche, una curva di apprendimento di circa 6 - 12 animali operati devono essere considerati di dominare il metodo appropriato.
Introduciamo un tempo e costi approccio efficace che permette la visualizzazione ad alta risoluzione e la quantificazione delle strutture vascolari, representing un metodo ideale per confrontare vascolarizzazione in diversi biomateriali o diverse strategie patibolo-bioattivazione. Questo metodo è facile stabilire e non richiede particolari attrezzature. Una caratteristica fondamentale di questo modello è che, dopo la visualizzazione nave, i tessuti possono essere ulteriormente utilizzati per studi come istologica o l'analisi molecolare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Conflitto di interesse:
Tutti gli autori: Nessuno
Informativa finanziari:
Nessuno degli autori ha un interesse finanziario in uno qualsiasi dei prodotti, dispositivi, o farmaci citati in questo manoscritto.
Acknowledgments
Integra modello di rigenerazione dermica è stato gentilmente fornito da Integra LifeSciences Corporation. Fonti di fondi a sostegno del lavoro: Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal CIRM-BMBF precoce II Premio traslazionale e il Centro FONDAP per la regolazione del genoma sia per JTE (Nr 15.090.007.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
References
- Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
- Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
- Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
- Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
- Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
- Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
- Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
- Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
- Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
- Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
- des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
- Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
- Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
- Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
- Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
- Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
- Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
- Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
- Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
- Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
- Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
- Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
- Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
- Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
- Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
- Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
- Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
