Summary
针对脑固有细胞直接谱系重编程提供了脑修复的新观点。在这里，我们描述了如何准备丰富的文化从成人大脑皮质脑居民周细胞，并通过转录逆转录病毒介导因子的表达Sox2的和ASCL1将这些转换引起的神经元的协议。
Abstract
直接谱系重编程非神经元细胞分化为神经元的诱导（INS）可以提供深入了解相关的神经发生的分子机制，使在体外模型或修复患病的大脑新策略。识别脑居民非神经元细胞类型适合于直接转换成文件可能允许开展这样的做法在原地，IE中的受损脑组织。在这里，我们描述了在确定从成人的大脑是满足这一前提源性干细胞的尝试开发的协议。这个协议包括：人体细胞（1）由从成人的脑活检得到的大脑皮质培养; （2） 体外扩增 （大约需要2-4周），并培养免疫细胞化学表征和流式细胞仪; （3）通过荧光激活细胞分选（FACS），使用抗PDGF受体-β和抗CD146抗体的富集;（4）逆转录病毒介导转导的神经源性转录因子SOX2和ASCL1; （5），最后将得到的周细胞源性诱导的神经元（PdiNs）通过免疫细胞化学的特性（14天至8周下述的逆转录病毒转导）。在这个阶段，INS可以通过膜片钳记录被探测其电气性能。该协议提供了一个高度可重复的程序，对大脑居民周细胞的体外血统转化为功能性人类INS。
Introduction
相对于体细胞成诱导多能干细胞（iPS细胞），这反过来又被赋予了过多的分化潜能的重新编程，直接重编程的目的是为一个特定的信元类型到另一个的直的转换。相对于它们在疾病建模和潜在的基于细胞的疗法的上下文中的应用程序，无论是重新编程的方法具有特殊的优点和缺点。重编程为iPS细胞（i）项规定的细胞几乎无限的来源; （二）允许基因工程; （三）赋予了几乎无限的分化潜能。然而，iPS细胞的主要缺点涉及在未分化的细胞（畸胎瘤形成体内 ）的致瘤性和需要进行离体培养和随后的移植的风险，如果这些细胞将被用于基于细胞的疗法。相反，直接谱系重编程是由所需的细胞的产量较低限制这直接关联与起始种群的靶细胞的数量，但具有该谱系重编程的细胞出现移植1,2时表现出无致瘤性风险的优点;此外，直接重新编程，甚至可以在原位实现， 即在其中将需要这些细胞，从而避免移植的必要性的器官。
考虑到这一点，我们的实验室一直奉行谱系重编程脑固有细胞的可能性为插件作为对神经退行性疾病的细胞疗法的一种新方法。这可能会潜在地视为谱系重编程细胞靶点脑固有细胞包括不同类型胶质细胞的（星形胶质细胞，NG2细胞和少突胶质细胞），小胶质细胞和微血管相关的细胞（内皮细胞和周细胞）。我们已经广泛地研究了大脑皮质的星形胶质细胞的体外重编程的潜力TEX出生后早期小鼠3-5。在寻找类似的合适的细胞来源，可直接谱系重编程在成人的大脑，我们遇到了一个细胞群，可以成功地重编程为INS和周的展览标志。这里，我们描述了如何从成人脑活检收获这些细胞中，以扩大和体外富集这些细胞，并最终成功地重新编程这些体外扩增的细胞的主要部分（在25-30％的范围内）到一个协议INS。重新编程可通过同时逆转录病毒介导的共表达两种转录因子，SOX2和ASCL1来实现。这些PdiNs被发现收购重复性动作电位射击的能力，并作为突触目标，其他神经元表明其整合到神经网络的能力。我们的协议提供了一个简单程序的隔离和传承转换成人的大脑周细胞成文件。
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Protocol
1，分离和成人的大脑细胞培养
涉及人体组织的实验应按照有关人类使用材料的研究目的，所有相关政府及机构规定进行。本协议是按照批准慕尼黑大学的医学院的伦理委员会，并从所有患者的书面知情同意开发。
使用的两性从颞叶性癫痫或其他深层次的非创伤性的，非恶性病变痛苦的患者标本已经建立的人成体大脑皮质制备培养物的该协议。从手术室内由专门的接入信道的脑损伤得到，因此，组织被认为是健康的。这些病人的年龄范围为19-70岁。
- 加入热灭活的胎牛血清的制备生长培养基（FCS），以高糖DMEM含有GlutaMAX，得到20％FCS的终浓度。加入5 ml青霉素/链霉素，以总500毫升生长培养基。执行此并要求无菌培养条件下，在适当的层流罩所有后续步骤。
- 保持从手术室在Hanks'用的CaCl 2和MgCl 2（HBSS）介质包括HEPES（10mM终浓度），于冰上，直到处理平衡盐溶液中得到的成年人脑活检。开始尽快处理。
- 要开始解离成单细胞，转移到组织为65mm培养皿和剁碎成小块，通过使用两个无菌一次性使用的手术刀。对于酶消化用3-6毫升的TrypLE在15毫升锥形管和水浴孵育15-30分钟，在37°C。
- 加入1倍体积预热的生长培养基中，以促进分解，并轻轻磨碎的溶液含有组织块向上和向下通过首先使用5毫升的一次性吸管，然后用玻璃巴氏吸管直至细胞悬浮液的均匀化。通常情况下，一些残留的组织片，大多是由白质，将保持在悬浮液中。
- 降速在157×g离心5分钟，沉淀重悬在培养基中适当的量（每未涂覆的T75培养瓶10ml）中。使用一个T75培养瓶中为5-10毫米直径大小的一个切片检查，并从这种情况下的较大的标本推断。
- 将细胞注入37℃培养箱中，5％的CO 2和5％O 2。
- 更换一半培养基每3-4天直到细胞达到汇合。这通常需要长达两周（被称为通道0 [P0]）。
2， 在体外扩增成人人脑细胞及表征
- 在体外扩增 ：
- 吸出培养基，洗涤用磷酸盐缓冲盐水（PBS），保持在室温吨emperature，加入3ml的TrypLE之前。
- 在37℃下进行5〜10分钟，直至大多数细胞分离。轻轻拍打瓶，方便细胞的吊装;以下加入3倍体积的生长培养基，转移细胞到15毫升锥形管中并离心以157×g离心5分钟，重悬细胞在生长培养基中的适当的量。
- 通道中的细胞以1:3为最佳产量成新的T75细胞培养瓶中的比率。
注：本报告并不降低重编程效率的任何迹象传这些细胞，直到小五。而在P0文化中包含了相当部分内皮细胞（作为评估CD34的表达），在随后的传代其数量可忽略不计。
- 成年人脑培养物的表征：
- 免疫组化：
- 对于细胞，种子〜60,000个细胞的表征到聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片于500μl新鲜的生长mediu米在24孔组织培养板中，孵育在37℃，5％CO 2和5％O 2。
- 对培养的人脑细胞的免疫细胞化学分析取出介质，并用1ml的PBS洗涤3次。
- 通过加入500μl的4％多聚甲醛的PBS中15分钟，在室温下固定细胞。
- 传输玻璃盖玻片到适当的加湿室染色并用含有80微升PBS中的3％牛血清白蛋白（BSA）和0.5％的Triton X-100的1小时在室温下阻断。
- 添加稀释在同一溶液中的一抗（稀释因子见表特定的试剂和设备），并孵育过夜，在室温下4℃或1小时。
注意：细胞在此阶段培养中的相当，但不同的部分是免疫血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ），分化146（CD146），NG2硫酸软骨素健体的集群聚糖，和平滑肌肌动蛋白（SMA），微血管相关的周细胞特征，即标记。只有少数（<1％）表达星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100β。此外，在这一阶段的文化应该是缺乏表达神经元标记βIII-微管蛋白的任何细胞。使用多个主要抗体组合不同的标记物的联合标识。可以通过反转录和定量实时聚合酶链反应（在本协议未描述）获得的神经胶质，神经元，内皮细胞和周细胞标记物的表达的进一步确认。 - 孵育后与初级抗体洗三次，用1ml的PBS和相应的二抗（在适当的稀释液）加入到染色溶液孵育1小时，在室温下在黑暗中。用PBS洗涤细胞3倍。如果需要的话，前安装包括染色用DAPI 5分钟，在室温温度。
- 使用抗衰落的安装中，使用萤光显微镜或共聚焦显微镜分析盖玻片。
- 流式细胞仪：
- 对于使用流式细胞仪检测表面标志物表达分析，细胞生长至汇合在无涂层的T25或T75细胞培养瓶中。
- 使用的TrypLE如在由PBS +0.5％BSA的染色液和之前描述的重悬细胞分离。每染色反应，重悬在100μl的染色溶液100,000-200,000细胞。准备使用（CD146-FITC，CD140b-PE，CD34-APC，CD13-FITC，各自同型对照抗体）每单抗体染色反应。
- 添加荧光标记的抗体对每个染色溶液（稀释度见表特定的试剂和设备）直接进入细胞悬液孵育在4℃下在黑暗中30分钟。
- 用500μlPBS洗细胞三次，自旋向下的各洗涤步骤在157×g离心5分钟。
- 通过细胞过滤器（70微米）至FACS管重悬细胞沉淀在0.5-1毫升的染色溶液和转移的细胞。从暴露于光保护样品。
- 涡样品放置在流式细胞仪的仪器前。
- 分析活细胞和排除碎片和细胞聚集，门对FSC-A和SSC-A。细胞小芯片是专门由FSC-A和FSC-W。要确定正确的门控条件设置与门同型匹配的抗体对照结合到各自的荧光的细胞表面标志物。然后确定抗体结合的细胞的比例。
- 免疫组化：
3，用于富集通过荧光激活细胞周细胞衍生的细胞分选
- 通过使用70微米的喷嘴流式细胞仪分选纯化的周细胞的细胞群（悬浮于生长培养基）之前转导。使用CD34-APC与C组合D140b-PE和CD146-FITC选择的周细胞。排序为CD34阴性，CD140b-和CD146阳性细胞。
- 收集的分选的细胞在生长培养基中和板到聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片在24孔组织培养板中，孵育在37℃，5％CO 2和5％O 2。
- 分选后的48小时用新鲜的生长培养基更换培养基，并在协议4所述的方法进行转导。
4，逆转录病毒周细胞衍生的细胞转导和重编程为诱导神经元
注：请参阅处理逆转录病毒颗粒时，当地的生物安全准则。在德国，使用这里所使用的逆转录病毒需要生物安全等级2。对于生产逆转录病毒颗粒是指协议6。对用于重编程的逆转录病毒构建体，参考的Karow 等人（2012）。逆转录病毒是假型的VSV-G（水泡性口炎病毒糖蛋白）5。对于生产请参阅GAVRILESCU 等[6]。
- 24小时前，逆转录病毒转导的种子〜60,000个细胞到聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片于500μl新鲜的生长培养基中的24孔组织培养板中，孵育在37℃，5％CO 2和5％O 2的。
- 第二天，用500μl新鲜预热的生长培养基更换生长培养基，并加入1微升含有逆转录病毒颗粒（pCAG-IRES-DsRed的控制，特别是在建立协议在实验室中），pCAG-ASCL1各自的浓缩上清液的-IRES-DsRed的，pCAG-SOX2-IRES-GFP。
- 一天后，除去包括从细胞中的病毒颗粒的介质，并加入1 ml新鲜，预热的B27-分化培养基中，49的10ml DMEM高糖含有GlutaMAX和1ml B27无血清的补充构成。在5保持培养中的细胞在37℃下％CO 2和5％O 2为4-8周不改变介质的重复介质的改变成为有害的，因为INS成熟。
诱导神经元5。通过免疫细胞化学鉴定
- 以确定转导细胞的细胞同一性，特别是展示了一个获得的神经元表型，进行免疫细胞化学的抗细胞抗原如BIII-微管蛋白，微管相关蛋白和神经元核抗原（抗体和它们各自的稀释液，见表特定试剂和设备;遵循相同的程序，在2.2.1所示）。
- 用于改善PdiNs，从E14小鼠大脑皮质衍生的神经元共培养这些细胞的成熟。为此，解剖大脑皮质，用火抛光的玻璃巴斯德移液管机械分离组织。添加10,000-50,000小鼠神经元周细胞源性细胞2-3周的培养下转导与SOX2和ASCL1编码重troviruses并继续培养。转导的细胞可从小鼠的神经元来区分他们的记者（GFP和DsRed）的表达，无论是现场或落射荧光免疫组化之后的GFP和DsRed。
- 为了评估突触的形成到PdiNs通过小鼠神经元，对水疱性神经递质受体，如囊泡膜谷氨酸转运体1（VGLUT1）进行免疫。
- 探测转导的细胞其电气特性（ 即产生动作电位的能力），并通过膜片钳电生理建立功能性突触。有关步骤的详情，请参阅海因里希等人 （2011）。
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Representative Results
这一协议后，成功地从人类成人大脑皮层的标本建立文化的第一个成果包括在文化的细胞组成的鉴定。免疫细胞化学细胞类型特异性的蛋白质揭示了相当程度不同的患者（ 图1A）的样本得出不同文化之间的异质性。作为定量用流式细胞仪总是有细胞表达PDGFRβ（平均〜75％，从30到最多99％）的主要组分;周细胞如CD146，NG2和CD13的其它标记物一般以较低的范围（ 图1B）。同样SMA表达在培养的细胞中的较小亚群，如通过免疫细胞化学（ 图1A）来确定。在通道0（P0），通常有<CD34阳性内皮细胞的10％，并且它们的数量下降至低于检测与进一步传代。同样，astrocytES只占一个微不足道的污染在前面的段落。此外，还有典型的无细胞染色为神经干细胞，神经元，少突胶质细胞或标记。免疫细胞化学和流式细胞仪数据通过定量RT-PCR 7得到充分证实。总之，在文化中最大的一部分表达的蛋白质和周细胞的mRNA的特征。进一步富集周细胞来源的细胞可通过FACS在这个阶段来实现。这是特别相关的，当培养物的纯度是在频谱的下端所反映PDGFRβ的表达水平。因此，我们已利用对PDGFRβ单独或与抗CD146抗体结合的抗体（CD140b），而不含任何CD34阳性的污染物，以FAC-排序具体地说周细胞（ 图1C）。
转导这些文化与对照病毒编码只有一个报告基因，并不会改变他们的标志表达式profile（评估3-4周后转），这表明这些细胞保持在周细胞谱系。同样，Sox2基因逆转录病毒介导表达本身并不会导致任何形态的明显变化，也引起BIII-微管蛋白的表达表明Sox2的本身不足以诱导的命运转换。与此相反，细胞的比例较低（约10％）转导与ASCL1编码逆转录病毒单独布展βIII-微管蛋白的表达，但没有获得一个神经元形态。引人注目的是，近50％的SOX2和ASCL1，共转导的细胞显示出βIII-微管蛋白的表达，更重要的是，这些双转导的细胞（通过他们的双报告基因表达可视化）的三分之一还显示神经元突起（ 图2）。随着收购的神经功能，PDGFRβ的表达是下调7。随着进一步成熟，在文化，SOX2和ASCL1 - 共表达的细胞也成为IMMUNoreactive为更成熟的神经元标志物微管相关蛋白（树突状染色过程）和的NeuN（主要是染色神经元胞体）。正如下面讨论的这些变化在标志物表达也与相关收购神经元的电生理特点之一。总之，这些数据对于周细胞来源的细胞的命运直接转换成插件，称为PdiNs提供证据。这些PdiNs具备的能力，建立功能性突触后车厢如发现共培养的实验用鼠胚胎大脑皮层神经元。这个能力可以电生理学中的突触输入的外观（见下面的讨论）以及PdiNs与从共培养的神经元（其特征在于，簇的囊泡神经递质转运蛋白， 例如 VGLUT1免疫反应）衍生的突触前末梢的树枝状突起的装饰来证明。这些数据进一步表明PdiNs的融入神经元c中的能力ircuits。
图1：从成人大脑皮层衍生的培养周细胞标志物异构的表达。 A）荧光显微照片说明所揭示的免疫细胞化学的周细胞标志物（PDGFRB，SMA，CD146）的异源表达。比例尺= 50微米B）直方图总结阳性细胞的周细胞标记PDGFRβ（CD140b），CD13，CD146和由不同的患者来源的文化流式细胞仪测定的相对数。 CD34是一个标记为内皮细胞。C）流式细胞仪散点图描绘同型对照和CD146 / CD140b染人类细胞为后续重新编程排序双阳性周细胞（以红色框突出显示）的。注PDGFRβ表达率高，异质性就在这个特殊的文化CD146的表达。
图2：重新编程成人周细胞衍生的细胞分化为INS的顶部。实验装置。下图：荧光显微照片描绘细胞转导逆转录病毒编码SOX2-IRES-GFP和ASCL1-IRES-DsRed的 。请注意，只有双转导的细胞（箭头）表示BIII-微管蛋白（右图），并表现出神经元形态。
| 细胞分裂[％] | 细胞死亡[％] | BIII-微管蛋白+ [％] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| SOX2 | 46 | 7 | 0 |
| ASCL1 | 26 | 33 | 7 |
| SOX2-ASCL1 | 3 | 36 | 25 |
表1。行为周细胞衍生的细胞发生转化为PdiNs所评定的连续实时成像的。请注意，Sox2的和ASCL1共同表达细胞退出细胞周期。此外，注意细胞死亡率高以下ASCL1或Sox2的和ASCL1，共表达。考虑到这些不同的细胞事件，所有合导的细胞约25％成为INS。
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Discussion
本协议描述了在体外扩增和富集周细胞来源的细胞从以下的成年人的大脑皮层分离和随后转化成INS由神经源性转录的逆转录病毒介导的表达Sox2的因素和ASCL1。这种协议提供了实验体外系统研究谱系转换的脑居民细胞向神经元可能还有神经胶质细胞，用共同的目标，最终把这种直接转换方法为成人大脑的体内环境。
技术考虑
在我们的研究中，我们利用人脑组织从19岁至70岁之间的患者，从男女双方。我们并没有注意到在重编程效率取决于性别，年龄7一个明显的区别。尽管如此，建议来记录这些信息更细微的差别却可能是观察到，逃过我们的注意。
委员会还建议，以开始处理尽早下面的组织样品转移到实验室。会有一定有些未知数多久组织一直保持在之前的手术室转移到实验者。我们估计，在我们从患者体内取出的大脑对培养过程的开始之间学习7的时间介于2-6小时之间，与样本被保存所有的时间在冰上。在便于后续处理也没有任何不利结果没有明显的差异这个时间窗口内被发现。
对于任何协议的关键评估涉及它的简单，重现性和效率。本协议是直接在该过程中的第一阶段的细胞中一种廉价的介质，其可以容易地获得，随后细胞重编程为只用两个转录发的第二相位被扩展构造函数和培养在一个确定的培养基中。
关于再现性，我们观察到逆转录病毒制剂的质量是最重要的，与用在稀释相匹配的高滴度的病毒常常导致重编程的失败的感染颗粒的数目低滴度的病毒制剂。事实上，我们注意到，在重编程以前没有同样的周细胞培养可以用高滴度的病毒时，可以成功地转换成文件。
关于转换的效率，我们已评估使用连续实时成像SOX2和ASCL1-共转导细胞的βIII-微管蛋白阳性细胞的数量。实时成像可以用于评估细胞，进行细胞分裂或细胞死亡在转换过程中，而当产生的INS的数量仅在实验结束点来确定这样的信息缺乏的数量。其实使用时间推移视频显微镜复制（用于过程请参见奥尔特加E T 人。8）有人认为，未转染和单因子转导的细胞增殖下去，而SOX2和ASCL1，共转导细胞迅速退出细胞周期。此外，后者的人口的显著馏分经历细胞死亡。而逆转录病毒毒性不能正式从我们的研究中7得到的数据排除在外，这增加了细胞死亡的事实被观察到，只有当ASCL1表达（单独或与SOX2组合），我们将此解释为证据对细胞命运的灾难性冲突。综合上述两个事件考虑在内，我们估计所有SOX2和ASCL1-共转导的细胞25％转换成BIII-微管蛋白阳性INS（ 表1）。
作为共转导是绝对必要的成功重新编程，可以考虑采用一种病毒载体编码两种基因，以优化细胞的量的同时表达两种因素时间。
最近，Ladewig 等人开发了一种协议，用于成纤维细胞的有效转化成INS获得200％的利用糖原合酶激酶-3β的小分子为基础的抑制和Smad信号9的收率。这将是有趣的，以确定这些加载项，以我们的协议是否提高PDIN生产的产量。
重编程过程的实时成像的另一个有趣的结果担心，成人人类周细胞转化为INS发生在一个相当缓慢的节奏相比，在小鼠源4不同体细胞的培养类似的重编程协议的事实。这是与人的神经元10的特性缓慢成熟一致。
虽然我们还没有系统地分析了PDIN生产良率的氧张力的影响，我们注意到，孵化在低氧条件下（5％）一般相比，在常氧条件下（21％）中培养细胞得到了优良的结果。最近，达维拉等人所描述的降低的氧张力的诱导INS的从人成纤维细胞11相似的增强效应。
我们的协议是基于逆转录病毒递送SOX2和ASCL1的，而其他直接转换协议已经采用诱导型慢病毒载体1，12，13。近来，我们还成功地应用多西环素诱导编码SOX2和ASCL1慢病毒结构，表明一个相对较短的Sox2的和ASCL1表达脉冲（10天）就足以引起周细胞对神经元的转换。在我们的研究7中使用的逆转录病毒被设计为减少沉默5。因此，我们没有注意到的神经元缺乏报告基因表达的外观。然而，这种可能性，这两个转基因的总体表达水平s和记者随时间的变化不能被排除。集成自由的方法（利用仙台病毒）已受聘近来的情况下诱导神经祖细胞14代，但目前尚不清楚这是否或什至无病毒重新编程策略可以成功地应用到人类的转换周细胞。最后，无论是来自其它组织来源的周细胞可以经历转化成诱导的神经细胞类型仍有待检验。
概念上的注意事项
体细胞成INS重新编程的一个重要成果涉及它们的功能15。我们已在不同时间点评估PdiNs的电生理特性如下重编程过程的发作。在非常早的阶段， 即 2周后逆转录病毒转导，PdiNs展览勉强标志电兴奋性的，尽管βIII-微管蛋白表达在这个阶段。因此，大部分的电分析进行4-8周后转导与SOX2和ASCL1。如的Karow 等人描述的，PdiNs的特征在于相当不成熟所反映的高输入阻抗和动作电位的烧成一个低频率。进一步成熟可以通过共培养PdiNs与来自小鼠E14大脑皮层神经元衍生得到提升。在这些条件下，PdiNs显示出更高的动作电位频率和增加钠电流7。此外，共培养发现PdiNs的能力，以接收来自小鼠的神经元功能的突触输入。总之，PdiNs获得功能性的神经元能够在与其他神经元共培养得到进一步加强。然而，还有待证明是否PdiNs也可以建立功能性突触前车厢。还需要进一步研究移植PdiNs进入大脑，以揭示其可能达到完全成熟和功能。
ü唱SOX2和ASCL1，因为我们注意到，导致PdiNs收购GABA能神经元7的功能重编程因子。有趣的是，其他小组已经开发协议，通过使用不同的转录因子和/或组合的microRNA与发展INS获得不同的神经递质规范，如谷氨酸，多巴胺和胆碱能型1，16-18，结果成纤维细胞转化成文件。这还有待测试中使用的成纤维细胞因子组合诱导是否在同一发射器的身份在PdiNs。此外，最近的工作已经超越神经发生转换的频谱，以产生神经干细胞19,20或神经胶质，尤其是少突胶质细胞21,22。如果这些重编程协议引起的成人大脑周细胞源性细胞类似的结果，这将极大地扩大这种进口的全景应用蚂蚁的大脑居民细胞类型。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们非常感谢马格达莱纳格茨博士对本协议的发展过程中她的投入。我们感谢马吕斯Wernig博士（斯坦福大学）慷慨地为我们提供了SOX2编码序列。我们也非常感谢亚历山大Lepier博士病毒的生产。这项工作是由德意志研究联合会（BE 4182/2-2）和BMBF（01GN1009A）至BB，和科学的巴伐利亚州部，研究和艺术，以MK和BBCS收到资金来自两个民族SYSTHER-的资金支持INREMOS虚拟学院（德国和斯洛文尼亚联邦部委教育及研究）及东风集团（SFB 824）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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