Summary
Targeting hersen-ingezeten cellen voor directe afstamming-herprogrammering biedt nieuwe perspectieven voor de hersenen reparatie. Hier beschrijven we een protocol hoe culturen verrijkt voor hersen-ingezeten pericytes van de menselijke hersenschors volwassen opstellen en deze om te zetten naar geïnduceerde neuronen door-retrovirus gemedieerde expressie van de transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1.
Abstract
Directe lijn-herprogrammering van niet-neuronale cellen in geïnduceerde neuronen (INS) kan inzicht geven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen neurogenese en maken nieuwe strategieën voor in vitro modellen of repareren van de zieke hersenen. Het identificeren van de hersenen-ingezeten niet-neuronale celtypes vatbaar voor directe omzetting in iNs zou kunnen stellen voor de lancering van een dergelijke aanpak in situ, dat wil zeggen binnen het beschadigde hersenweefsel. Hier beschrijven we een protocol ontwikkeld in de poging identificeren cellen afkomstig van de volwassen menselijke hersenen die dit uitgangspunt voldoen. Dit protocol omvat: (1) het kweken van menselijke cellen uit de cerebrale cortex, verkregen uit volwassen menselijke hersenen biopten; (2) het in vitro expansie (ongeveer ter 2-4 weken) en karakterisatie van de cultuur door immunocytochemie en flowcytometrie; (3) de verrijking door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met anti-PDGF-receptor-β en anti-CD146 antilichamen;(4) de-retrovirus bemiddelde transductie met de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en ascl1; (5) en tenslotte de karakterisering van de verkregen pericyte-afgeleide neuronen geïnduceerde (PdiNs) met immunocytochemie (14 dagen tot 8 weken na retrovirale transductie). In dit stadium kan iNs worden gesondeerd voor hun elektrische eigenschappen van patch-clamp opname. Dit protocol verschaft een reproduceerbare werkwijze voor de in vitro lijn omzetting van hersen-resident pericyten in functionele menselijke iNs.
Introduction
In tegenstelling tot herprogrammering van somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die op hun beurt zijn begiftigd met een overvloed aan differentiatie potentieel, directe herprogrammering beoogt rechte omzetting van een specifiek celtype in een ander. Met betrekking tot hun toepassing in de context van ziektemodel en potentiële cellen gebaseerde therapieën, zowel herprogrammering benaderingen hebben specifieke voor-en nadelen. Herprogrammeren in iPSCs (i) biedt een vrijwel oneindige bron van cellen; (Ii) maakt genetische manipulatie; (Iii) schenkt met een bijna onbeperkt differentiatie potentieel. Echter grote nadelen van iPSCs brengen het risico van tumorgeniciteit van de ongedifferentieerde cellen (teratomavorming in vivo) en de noodzaak voor ex vivo kweken en worden verplant als deze cellen worden gebruikt voor cellen gebaseerde therapieën. Omgekeerd is direct afstammings-herprogrammering beperkt door de lagere opbrengst van de gewenste cellendie rechtstreeks correleert met het aantal van de doelcellen van de uitgangspopulatie, maar bezit het voordeel dat-lijn geherprogrammeerd cellen blijken geen tumorigene risico vertonen op transplantatie 1,2; bovendien kan direct herprogrammering ook worden bereikt in situ, dat wil zeggen binnen het orgaan waar deze cellen vereist zou zijn, waardoor de noodzaak van transplantatie voorkomen.
Met dit in het achterhoofd, heeft ons lab de mogelijkheid van-lijn herprogrammeren hersen-ingezeten cellen nagestreefd in iNs als nieuwe benadering in de richting van cel-gebaseerde therapieën van neurodegeneratieve ziekten. Brain gevestigde cellen die mogelijk kunnen worden beschouwd als cellulaire doelwitten voor afstammings-herprogrammering omvatten verschillende macroglia (astrocyten, NG2 cellen en oligodendrocyten), microglia, en microvaatje geassocieerde cellen (endotheelcellen en pericyten). Wij hebben uitgebreid bestudeerd in vitro potentie van astroglia herprogrammering van de cerebrale cortex van de vroege postnatale muizen 3-5. Op zoek evenzo geschikte cel bronnen voor directe afstamming-herprogrammering in het volwassen menselijk brein, we tegenkwamen een celpopulatie die met succes kan worden geprogrammeerd in de ins en vertonen kenmerken van pericytes. Hier een protocol hoe deze cellen oogsten van volwassen menselijke hersenen biopsieën, uitbreiden en verrijken deze cellen in vitro, en tenslotte succes herprogrammeren een aanzienlijke fractie van deze in vitro geëxpandeerde cellen (in het traject van 25-30%) in beschrijven we INS. Herprogrammering kan door gelijktijdige retrovirus-gemedieerde co-expressie van twee transcriptiefactoren, Sox2 en ascl1. Deze PdiNs bleken het vermogen van repetitieve actiepotentiaal afvuren verwerven en synaptische als doelwitten dienen voor andere neuronen vermelding van hun vermogen integreren in neurale netwerken. Het protocol biedt een eenvoudige procedure voor de isolatie en geslacht omzetting van volwassen menselijke hersenen pericyten in iNs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie en kweken van volwassen menselijke hersencellen
Experimenten met menselijk weefsel moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante overheids-en institutionele regelingen met betrekking tot het gebruik van menselijk materiaal voor onderzoeksdoeleinden. Het huidige protocol is ontwikkeld in overeenstemming met de goedkeuring door de ethische commissie van de Medische Faculteit van de LMU München en schriftelijke toestemming van alle patiënten.
Dit protocol voor het bereiden van culturen van de volwassen mens hersenschors is vastgesteld met behulp van specimen van de patiënten van beide geslachten die lijden aan temporaalkwab epilepsie of andere diepgewortelde niet-traumatische, niet-maligne afwijkingen. De resultaten van de chirurgische kamer uitsluitend uit de toegangsgeul naar de hersenen laesie en daarom weefsel wordt als gezond beschouwd. De leeftijd van de patiënten was 19-70 jaar.
- Bereid groeimedium door toevoeging van warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum(FCS) naar DMEM hoog glucose met GlutaMAX tot een uiteindelijke concentratie van 20% FCS te verkrijgen. Voeg 5 ml penicilline / streptomycine in totaal 500 ml groeimedium. Voer deze en alle volgende stappen die steriele kweekomstandigheden in een passende laminaire stroming kap.
- Houd het menselijk brein biopsie volwassen verkregen uit de operatiekamer in Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing met CaCl2 en MgCl2 (HBSS) medium dat HEPES (10 mM eindconcentratie) op ijs tot verwerking. Start verwerking zo spoedig mogelijk.
- Om de dissociatie te beginnen in enkele cellen, breng het weefsel in een 65 mm petrischaal en gehakt in kleine stukjes door twee steriele eenmalig gebruik scalpels. Voor enzymatische digestie gebruiken 3-6 ml TrypLE in een 15 ml conische buis en incubeer gedurende 15-30 min bij 37 ° C in een waterbad.
- Voeg 1 volume voorverwarmd groeimedium dissociatie vergemakkelijken en voorzichtig vermaal de oplossing die weefselstukken en neer door eersteen 5 ml wegwerp pipet, gevolgd door een glazen Pasteur pipet tot homogenisering van de celsuspensie. Typisch enkele resterende stukken weefsel, voornamelijk bestaande uit witte stof in de suspensie blijven.
- Spin neer op 157 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid groeimedium (10 ml per ongecoat T75 kolf). Gebruik een T75 kolf gedurende een biopsie van 5-10 mm in grootte en extrapolatie van deze bij grotere exemplaren.
- Plaats cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 en 5% O2.
- Vervang de helft van het medium elke 3-4 dagen tot cellen confluentie hebben bereikt. Dit duurt meestal tot twee weken (aangeduid als doorgang 0 [P0]).
2. In vitro Uitbreiding en karakterisering van de volwassen menselijke hersencellen
- In vitro expansie:
- Zuig het kweekmedium en was met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), op kamertemperatuur gehouden temperature, voor het toevoegen van 3 ml TrypLE.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 min tot de meeste cellen losgemaakt. Tik voorzichtig de kolven om opheffing van de cellen te vergemakkelijken; na toevoeging van 3 volumes kweekmedium, overdracht van de cellen in een 15 ml conische buis en spin neer bij 157 xg gedurende 5 minuten en suspendeer de cellen in de juiste hoeveelheid groeimedium.
- Passage de cellen bij een verhouding van 1:03 voor optimale opbrengst van nieuwe T75 celkweek flessen.
Let op: Wij hebben deze cellen gepasseerd totdat P5 zonder enig teken van verminderde efficiëntie herprogrammering. Terwijl op P0 de cultuur bevat een aanzienlijke fractie van endotheelcellen (zoals beoordeeld door CD34 expressie), op latere passages hun aantal verwaarloosbaar.
- Karakterisering van volwassen menselijk brein culturen:
- Immunocytochemie:
- Voor de karakterisering van de cellen, zaden ~ 60.000 cellen op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 500 ul vers groei medium in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
- Voor immunocytochemische analyse van de gekweekte humane hersencellen verwijdert het medium en was 3x met 1 ml PBS.
- Fix cellen door toevoeging van 500 ui 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de glazen dekglaasjes in een geschikte kleuring bevochtigde kamer en blok met 80 pl PBS dat 3% runderserumalbumine (BSA) en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Voeg primaire antilichamen verdund in dezelfde oplossing (voor verdunningsfactoren zie tabel specifieke reagentia en apparatuur) en incubeer overnacht bij 4 ° C of 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
Opmerking: Een aanzienlijk variëren maar fractie van de cellen in deze fase kweken zijn immunoreactief voor bloedplaatjes afkomstige groeifactor receptor β (PDGFRß), cluster van differentiatie 146 (CD146), NG2 chondroïtinesulfaat proteoglycan, en gladde spier actine (SMA), dwz markers kenmerkend microvaatje-geassocieerde pericyten. Slechts een minderheid (<1%) drukken de astroglial markers gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en S100β. Bovendien, in dit stadium de kweek zonder enige cellen die de neuronale merker βIII-tubuline moet zijn. Gebruik meerdere primaire antilichaam combinaties voor co-etikettering van verschillende markers. Verdere bevestiging van de expressie van gliale, neuronale, endotheliale en pericyte markers kan worden verkregen door reverse transcriptie en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (niet beschreven in dit protocol). - Na incubatie met de primaire antilichamen Was driemaal met 1 ml PBS en voeg de bijbehorende secundaire antilichamen (in de geschikte verdunningen) de kleuroplossing en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen 3x met PBS. Indien nodig voor montage onder kleuring met DAPI gedurende 5 minuten bij kamertemperatuurtemperatuur.
- Gebruik antifading montage medium en analyseren van de dekglaasjes met een epifluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop.
- Flowcytometrie:
- Voor de analyse van het oppervlaktewater marker expressie met behulp van flowcytometrie, groeien cellen tot confluentie in ongecoate T25 of T75 celkweekkolven.
- Trek cellen door TrypLE als hiervoor en resuspendeer beschreven kleuroplossing bestaande uit PBS + 0,5% BSA. Per kleurreactie, resuspendeer 100.000-200.000 cellen in 100 ul kleuroplossing. Bereid enkele vlekken reacties per antilichaam gebruikt (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, respectieve isotypecontrole antilichamen).
- Add fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen elk kleuroplossing (verdunningen zie tabel specifieke reagentia en apparatuur) direct in de celsuspensie en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min in het donker.
- Was de cellen drie keer met 500 pi PBS en spin down tussen elkewasstap bij 157 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cel pellet in 0,5-1 ml kleuroplossing en overdracht cellen door een cel zeef (70 micrometer) aan FACS buizen. Bescherm het monster van blootstelling aan licht.
- Vortex monsters voorafgaande aan het plaatsen van hen in de FACS instrument.
- Om de levende cellen te analyseren en uit te sluiten puin en celaggregaten, gate voor FSC-A en SSC-A. Cel duplets zijn speciaal uit gated door FSC-A en FSC-W. Om de juiste gating voorwaarden voor celoppervlak markeringen poorten met isotype-gematchte controle-antilichaam geconjugeerd aan de respectieve fluorochroom bepalen. Vervolgens bepalen de hoeveelheid antilichaam gebonden cellen.
- Immunocytochemie:
3. Verrijking voor pericyte-afgeleide cellen door Fluorescentie Activated Cell Sorting
- Zuiver het pericyte celpopulatie (geresuspendeerd in groeimedium) voor transductie via FACS sortering met een 70 urn mondstuk. Gebruik CD34-APC in combinatie met CD140b-PE en CD146-FITC te selecteren voor pericytes. Sort voor CD34-negatieve, CD140b-en CD146-positieve cellen.
- Verzamel de gesorteerde cellen in groeimedium en plaat op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
- 48 uur na het sorteren vervangen het medium met vers groeimedium en uitvoeren transductie zoals beschreven in protocol 4.
4. Retrovirale transductie van pericyte-afgeleide cellen en herprogrammeren in Induced Neuronen
Opmerking: Raadpleeg de lokale richtlijnen voor biologische veiligheid bij het hanteren van retrovirale deeltjes. In Duitsland is het gebruik van de retrovirussen hier werkzaam vereisen bioveiligheidsniveau 2. Voor de productie van retrovirale deeltjes verwijzen naar protocol 6. Voor retrovirale constructen gebruikt voor herprogrammering, zie Karow et al.. (2012). Retrovirussen waren pseudogetypeerde met VSV-G (vesiculaire stomatitis virus-glycoproteïne) 5. Voor de productie wordt verwezen naar Gavrilescu et al. 6.
- 24 uur voorafgaand aan retrovirale transductie zaad ~ 60.000 cellen op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 500 ul vers groeimedium in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2 .
- De volgende dag, vervang het groeimedium met 500 ul vers, voorverwarmd groeimedium en voeg 1 pl van de respectievelijke geconcentreerde supernatanten die retrovirale deeltjes (pCAG-IRES-DsRed voor de controle, vooral tijdens vaststelling van het protocol in het lab), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- Een dag later, verwijder het medium dat de virusdeeltjes uit de cellen en voeg 1 ml vers, voorverwarmd B27-differentiatiemedium, bestaande uit 49 ml DMEM hoog glucose met GlutaMAX en 1 ml B27 serumvrij supplement. Handhaaf de cellen in kweek bij 37 ° C in 5% CO2 en 5% O 2 4-8 weken zonder dat het medium repetitieve mediumveranderingen schadelijk worden als INS rijpen.
5. Karakterisering van Induced Neuronen door Immunocytochemie
- Om de cellulaire identiteit van de getransduceerde cellen te bepalen, in het bijzonder aan de verwerving van een neuronaal fenotype aan te tonen, uit te voeren immuuncytochemie tegen neuronale antigenen zoals BIII-tubuline, MAP2 en NeuN (voor antilichamen en hun respectievelijke verdunningen, zie tabel specifieke reagentia en apparatuur, volgt u dezelfde procedure als aangegeven in 2.2.1).
- Voor het verbeteren van de rijping van PdiNs, co-cultuur van deze cellen met neuronen afgeleid van E14 muis cerebrale cortex. Daartoe ontleden de cerebrale cortex en dissociëren het weefsel mechanisch met een vuur gepolijste glazen Pasteur pipet. Voeg 10,000-50,000 muizen neuronen aan culturen van-pericyte afgeleide cellen 2-3 weken na transductie met Sox2-en ascl1-codering retroviruses en verder kweken. Getransduceerde cellen kunnen worden onderscheiden van muizen neuronen hun reporter (GFP en DsRed) expressie, hetzij levend epifluorescentie of na immunocytochemie voor GFP en DsRed.
- Om de vorming van synapsen beoordelen op PdiNs door muizen neuronen, uit te voeren immuuncytochemie tegen vesiculaire neurotransmitter receptoren zoals vesiculaire glutamaat transporter 1 (vGluT1).
- Probe getransduceerde cellen voor hun elektrische eigenschappen (dwz het vermogen van het genereren van actiepotentialen) en de vaststelling van functionele synapsen door patch-clamp elektrofysiologie. Voor details van de procedure zie Heinrich et al.. (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste resultaten van dit protocol na succes een cultuur van een monster van humane volwassen hersenschors bestaat uit de identificatie van de cellulaire samenstelling van de cultuur. Immunocytochemie voor celtype specifieke eiwitten onthult een hoge mate van heterogeniteit tussen culturen afgeleid van specimen van verschillende patiënten (Figuur 1A). Zoals gekwantificeerd door flow cytometrie er altijd een aanzienlijke fractie van cellen die expressie PDGFRß (gemiddeld ~ 75%, van 30 tot maximaal 99%); andere markers van pericytes zoals CD146, NG2 en CD13 zijn meestal uitgedrukt in een lager bereik (Figuur 1B). Ook SMA wordt uitgedrukt in een kleine subpopulatie van de gekweekte cellen, zoals bepaald door immunocytochemie (figuur 1A). Bij passage 0 (P0), zijn er meestal <10% van de CD34-positieve endotheelcellen, en hun aantal daalt beneden de detectiegrens met verdere passage. Evenzo astrocytes vormen slechts een verwaarloosbare besmetting in eerdere passages. Verder zijn er meestal niet cellen die vlek voor neurale stamcellen, neuronale of oligodendrocyt markers. Immunocytochemische en flowcytometrie gegevens volledig bevestigd door kwantitatieve RT-PCR 7. Kortom, de grootste fractie binnen de cultuur uit proteïnen en mRNA's kenmerkend pericytes. Een verdere verrijking voor pericyte afgeleide cellen kan worden bereikt door FACS in dit stadium. Dit is bijzonder relevant wanneer de zuiverheid van de kweek aan de onderkant van het spectrum zoals blijkt uit het niveau van expressie PDGFRß. Zo hebben we een antilichaam tegen PDGFRß (CD140b) alleen of in combinatie met een anti-CD146 antilichaam gebruikt, terwijl uitsluiting CD34-positieve verontreinigingen FAC-sorteren specifiek pericyten (figuur 1C).
Transducing deze culturen met controle virussen coderen slechts een reporter gen, niet hun markerexpressie p veranderenrofiel (geëvalueerd 3-4 weken na transductie), wat aangeeft dat deze cellen blijven in de pericyte afkomst. Ook doet-retrovirus gemedieerde expressie van Sox2 alleen niet tot een openlijke veranderingen in morfologie noch induceert biii-tubuline expressie suggereert dat Sox2 alleen is niet voldoende om een lot conversie induceren. Daarentegen, een laag percentage (ongeveer 10%) van de cellen getransduceerd met een-ascl1 coderend retrovirus alleen vertonen βIII-tubuline expressie evenwel zonder dat zij een neuronale morfologie. Opvallend is dat bijna 50% van alle Sox2-en-ascl1 cotransduced cellen vertonen βIII-tubuline expressie en nog belangrijker, een derde van deze dubbel-getransduceerde cellen (gevisualiseerd door hun dubbele reporterexpressie) ook weergeven neuronale processen (figuur 2). Samen met de overname van neuronale functies, uitdrukking van PDGFRß is down-gereguleerd 7. Met verdere rijping in cultuur, Sox2-en-ascl1 co-expressie cellen ook immun gewordenoreactive voor de meer volwassen neuronale markers MAP2 (kleuring dendritische processen) en NeuN (kleuring voornamelijk neuronale cellichamen). Zoals hieronder deze veranderingen in markerexpressie besproken ook correleren met de overname van elektrofysiologische kenmerken van neuronen. Kortom, deze gegevens bewijs voor de directe omzetting van lot-pericyte afgeleide cellen in iNs, genoemd PdiNs. Deze PdiNs beschikken over de bevoegdheid tot het functionele postsynaptische compartimenten vestigen zoals geopenbaard in coculture experimenten met neuronen van de embryonale muis hersenschors. Deze bevoegdheid kan elektrofysiologisch worden aangetoond in de verschijning van synaptische ingangen (zie bespreking hieronder) en de inrichting van dendritische processen PdiNs met presynaptische terminals afgeleid van co-gekweekte neuronen (gekenmerkt door clusters van vesiculaire neurotransmitter transporters, bijv. vGluT1 immunoreactiviteit). Deze gegevens van het vermogen van PdiNs te integreren in neuronale c geven verder aanircuits.
Figuur 1. Heterogene expressie van pericyte merkers in kweken afgeleid van het menselijke cerebrale cortex volwassene. A) TL microfoto illustreert de heterogene expressie van pericyte markers (PDGFRb, SMA, CD146) zoals blijkt uit immunocytochemie. Schaal bar = 50 micrometer. B) Het histogram geeft een overzicht van het relatieve aantal cellen positief voor de pericyte markers PDGFRß (CD140b), CD13 en CD146 zoals bepaald door flowcytometrie van verschillende patiënt-afgeleide culturen. CD34 is een marker voor endotheelcellen. C) FACS puntdiagrammen beeltenis isotypecontrole-en CD146 / CD140b gebeitst menselijke cellen voor het sorteren van de dubbel-positieve pericytes (gemarkeerd door de rode doos) voor verdere herprogrammering. Let op de hoge mate van PDGFRß expressie ende heterogeniteit ten aanzien van CD146 expressie in deze specifieke cultuur.
. Figuur 2 herprogrammeren van volwassen mens-pericyte afgeleide cellen in iNs Top:. Experimentele opstelling. Onder: Fluorescent micrografen beeltenis cellen getransduceerd met retrovirus codering Sox2-IRES-GFP en ascl1-IRES-DsRed. Merk op dat alleen dubbel getransduceerde cellen (pijlpunten) uiten biii-tubuline (rechter paneel) en vertonen neuronale morfologie.
| celdeling [%] | celdood [%] | BIII-tubuline + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Tabel 1. Gedrag van-pericyte afgeleide cellen ondergaan omzetting in PdiNs zoals beoordeeld door een constante live weergave. Merk op dat Sox2-en Ascl1 co-expressie cellen afrit celcyclus. Bovendien, let op de hoge mate van celdood volgende Ascl1 of Sox2 en Ascl1-co-expressie. Rekening houdend met deze verschillende cellulaire gebeurtenissen, ongeveer 25% van alle co-getransduceerde cellen INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft de in vitro uitbreiding en verrijking van-pericyte afgeleide cellen na isolatie van de menselijke hersenschors volwassen en de daaropvolgende omzetting in iNs door-retrovirus gemedieerde expressie van de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1. Een dergelijk protocol voorziet in een experimenteel in vitro systeem om de lijn-omzetting van hersen-ingezeten cellen in neuronen en mogelijk ook glia bestuderen, met het doel voor ogen om uiteindelijk vertalen deze directe omzetting aanpak in de in vivo setting van de volwassen hersenen.
Technische overwegingen
In onze studie gebruikt we menselijk hersenweefsel van patiënten tussen 19 en 70 jaar, van beide geslachten. We hebben niet een openlijke verschil in het herprogrammeren efficiency afhankelijk van geslacht of leeftijd 7 opmerken. Aanbevolen wordt echter te documenteren deze informatie meer subtiele verschillen kunnen nietteminmerkte op dat onze aandacht ontsnapt.
Verder wordt aanbevolen om de verwerking beginnen zo vroeg mogelijk na de overdracht van het weefselmonster naar het laboratorium. Er zullen onvermijdelijk een aantal onbekenden voor hoe lang het weefsel is gebleven in de operatiekamer vóór de overdracht aan de experimentator. We schatten dat in onze studie 7 de tijd tussen verwijdering uit de hersenen van de patiënt voor het begin van het kweken procedure varieerde tussen 2-6 uur, waarbij de monsters die hele tijd op ijs gehouden. Er werden geen duidelijke verschillen in het gemak van verdere verwerking, noch enige negatieve uitkomst werden opgemerkt binnen dit tijdvenster.
Een kritische beoordeling voor elk protocol betreft zijn eenvoud, reproduceerbaarheid en efficiëntie. Het huidige protocol is eenvoudig, dat tijdens een eerste fase cellen geëxpandeerd in een goedkope medium dat gemakkelijk kan worden verkregen, gevolgd door een tweede fase van de cel herprogrammering slechts twee transcriptie factors en het kweken in een bepaald medium.
Wat reproduceerbaarheid waargenomen dat de kwaliteit van het retrovirus bereiding van het grootste belang, met lage titer virus preparaten gebruikt bij verdunningen van het aantal infectieuze deeltjes van hoge titer virus vaak tot falen van herprogrammering passen. In feite merkte we dat dezelfde pericyte cultuur waarin herprogrammering eerder had gefaald met succes kan worden omgezet in iNs bij gebruik van hoge titer virussen.
Wat omzettingsrendement, hebben we het aantal βIII-tubuline-positieve cellen uit Sox2-en-ascl1 cotransduced cellen middels continue levende beeldvorming beoordeeld. Live-imaging maakt het mogelijk voor de beoordeling van het aantal cellen die de celdeling of celdood te ondergaan tijdens het conversieproces, terwijl deze informatie ontbreekt, wanneer het aantal gegenereerde ins is bepaald op het eindpunt van het experiment. In feite met behulp van time-lapse video micro'skopiëren (voor de procedure zie Ortega e-Al. 8) werd waargenomen dat getransduceerde en single-factor getransduceerde cellen vermenigvuldigen, terwijl Sox2-en-ascl1 cotransduced cellen sneller de celcyclus verlaten. Bovendien is een aanzienlijk deel van deze populatie celdood ondergaat. Terwijl toxiciteit retrovirus niet formeel uit de verkregen in onze studie 7 data uitgesloten is dat celdood verhoogde waargenomen wanneer ascl1 werd uitgedrukt (alleen of in combinatie met Sox2) interpreteren we dit als bewijs voor een katastrofisch tegenstrijdig celtypes . Gelet op deze beide gebeurtenissen rekening schatten wij dat 25% van alle Sox2-en-ascl1 cotransduced cellen omzetten in BIII-tubuline positieve iNs (tabel 1).
Als co-transductie absoluut vereist voor een succesvolle herprogrammering, kan men overwegen het gebruik van een virale vector codeert voor beide genen voor de hoeveelheid cellen die zowel optimaliseren factoren tegelijktijd.
Onlangs, Ladewig et al.. Een protocol voor de efficiënte omzetting van fibroblasten ontwikkeld tot iNs verkrijgen van een rendement van 200% door het gebruik van kleine moleculen gebaseerde remming van glycogeen synthase kinase-3β en SMAD signalering 9. Het zal interessant zijn om te bepalen of deze add-ons aan ons protocol verbeteren van de opbrengst van PdiN productie.
Een ander interessant resultaat van de levende beeldvorming van het herprogrammeringsproces betreft het feit dat de omzetting van volwassen menselijke pericyten in iNs optreedt in een tamelijk laag tempo dan vergelijkbare herprogrammering protocollen culturen van verschillende somatische cellen van muizen oorsprong 4. Dit strookt met het kenmerk langzame rijping van humane neuronen 10.
Hoewel we niet systematisch onderzocht het effect van de zuurstofspanning op de opbrengst van PdiN productie noteerden we dat incubatie bij lage zuurstof (5%) algemeengaf superieure resultaten in vergelijking met het kweken van de cellen in normoxische omstandigheden (21%). Recentelijk Davila et al.. Beschreven eenzelfde versterkend effect door verminderde zuurstofspanning voor de inductie van iNs uit humane fibroblasten 11.
Het protocol is gebaseerd op de retrovirale levering van Sox2 en ascl1 terwijl andere directe omzetting protocollen induceerbare lentivirale vectoren 1, 12, 13 zijn toegepast. Meer recent hebben wij met succes toegepast doxycycline-induceerbaar lentivirale constructen die coderen Sox2 en ascl1, wat aangeeft dat een relatief korte puls (10 dagen) van Sox2 en Ascl1 expressie volstaat om pericyte naar neuron omzetting veroorzaken. De retrovirussen gebruikt in onze studie 7 werden ontworpen om de silencing 5. Daarom hebben we niet merken het uiterlijk van neuronen verstoken van reporter genexpressie. De mogelijkheid dat de totale expressieniveaus van beide transgens en reporter tijd veranderen kan niet worden uitgesloten. Integratie-free benaderingen (gebruik Sendaivirussen) zijn onlangs toegepast bij het genereren van geïnduceerde neurale voorlopercellen 14, maar is nog niet bekend of dit of zelfs virusvrij herprogrammering strategieën succesvol kan worden toegepast op menselijke pericyten zetten. Ten slotte, of pericytes afgeleid van andere weefsels kan omzetting in de geïnduceerde neurale celtypes nog worden getest.
Conceptuele overwegingen
Een kritische uitkomst van herprogrammering van somatische cellen in iNs betreft hun functionaliteit 15. We hebben de elektrofysiologische eigenschappen van PdiNs beoordeeld op verschillende tijdstippen na het begin van de herprogrammering proces. Bij zeer vroeg stadium, namelijk 2 weken na retrovirale transductie, PdiNs vertonen nauwelijks tekenen van elektrische prikkelbaarheid, ondanks βIII-tubuline expressie in dit stadium. Aldus meesteelektrofysiologische analyses werden uitgevoerd 4-8 weken na transductie met Sox2 en ascl1. Zoals beschreven in Karow et al.., Worden PdiNs gekenmerkt door aanzienlijke onvolwassenheid zoals weerspiegeld door hoge input weerstanden en een lage frequentie van actiepotentiaal afvuren. Verdere rijping kan worden bevorderd door co-kweken PdiNs met neuronen afkomstig uit de muis E14 cerebrale cortex. Onder deze omstandigheden PdiNs vertonen hogere actiepotentiaal frequenties en grotere natriumstromen 7. Bovendien coculturing onthult de bevoegdheid van PdiNs om functionele synaptische input van de muis neuronen. Kortom, PdiNs verwerven functionele neuronale eigenschappen die verder kan worden verbeterd bij coculturing met andere neuronen. Echter, het valt nog te bezien of PdiNs ook functioneel presynaptische compartimenten kunnen vestigen. Verdere studies transplanteren PdiNs in de hersenen nodig zijn om hun potentieel te onthullen tot volle wasdom en functionaliteit te bereiken.
Uzingen Sox2 en ascl1 als herprogrammering factoren hebben wij geconstateerd dat de resulterende PdiNs verwerven kenmerken van GABA-erge neuronen 7. Interessant is dat andere groepen protocollen ontwikkeld om fibroblasten te zetten in iNs door verschillende transcriptiefactor en / of microRNA combinaties zodat de ontwikkeling iNs verkregen afzonderlijke neurotransmitter specificatie zoals glutamaat, dopaminerge en cholinerge fenotype 1, 16-18. Moet nog worden getest of de factorcombinaties in fibroblasten induceren dezelfde zender identiteit PdiNs. Bovendien heeft recent werk de conversiespectrum dan neurogenese uitgebreid neurale stamcellen 19, 20 of gliale name oligodendrocyten 21, 22 genereren. Als deze herprogrammering protocollen ontlokken een vergelijkbaar resultaat bij volwassen menselijk brein-pericyte afgeleide cellen, maar dit zou enorm verbreden van het panorama van toepassingen van deze invoerant brain-resident celtype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar dat dr. Magdalena Götz voor haar inbreng tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Wij danken dr. Marius Wernig (Stanford University) voor royaal verstrekken van ons met de Sox2 coderende sequentie. We zijn ook zeer dankbaar Dr Alexandra Lepier voor virus productie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) en het BMBF (01GN1009A) naar BB, en het Beierse ministerie van Wetenschappen, Onderzoek en Kunst naar MK en BBCS ontving gelden van de binationale SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (Duitse en Sloveense federale ministeries van Onderwijs en Onderzoek) en de DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
