Summary
Cibler les cellules du cerveau-résident pour la lignée reprogrammation directe offre de nouvelles perspectives pour la réparation du cerveau. Nous décrivons ici un protocole de la façon de préparer les cultures enrichies en péricytes du cerveau-résident de l'adulte cortex cérébral humain et les convertir en neurones induits par l'expression de retrovirus de facteurs de transcription Sox2 et Ascl1.
Abstract
Direct lignage reprogrammation des cellules non-neuronales en neurones induits (INS) peut fournir des indications sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la neurogenèse et de nouvelles stratégies pour la modélisation in vitro ou la réparation du cerveau malade. Identifier les types de cellules cérébrales-résident non-neuronales qui se prêtent à la conversion directe dans INS pourraient permettre de lancer une telle approche in situ, c'est à dire dans le tissu cérébral endommagé. Nous décrivons ici un protocole mis au point pour tenter d'identifier des cellules dérivées du cerveau humain adulte qui remplissent cette hypothèse. Ce protocole consiste à: (1) la mise en culture de cellules humaines à partir du cortex cérébral obtenu à partir de biopsies du cerveau humain adulte; (2) l'expansion in vitro (ce qui nécessite environ 2-4 semaines) et la caractérisation de la culture par immunocytochimie et cytométrie de flux; (3) l'enrichissement en cellules activé par fluorescence (FACS) en utilisant des anti-récepteur de PDGF-β et d'anticorps anti-CD146;(4) la transduction rétrovirale médiée par la transcription des facteurs Sox2 neurogène et ASCL1; (5) et, enfin, la caractérisation des neurones résultantes de péricytes dérivé induits (PdiNs) par immunocytochimie (14 jours à huit semaines suivant transduction rétrovirale). A ce stade, l'INS peut être sondé pour leurs propriétés électriques par l'enregistrement de patch-clamp. Ce protocole prévoit une procédure hautement reproductible pour la conversion in vitro de la lignée des péricytes du cerveau-résident en ins humaines fonctionnelles.
Introduction
Par opposition à la reprogrammation des cellules somatiques dans des cellules souches pluripotentes induites (CISP), qui à leur tour sont équipés d'une multitude de potentiels de différenciation, une reprogrammation directe vise à conversion directe d'un type de cellule spécifique dans une autre. En ce qui concerne leur application dans le contexte de la modélisation des maladies et des thérapies à base de cellules potentiels, deux approches de reprogrammation ont des avantages et des inconvénients spécifiques. Reprogrammation en CSPi (i) fournit une source quasi infinie de cellules; (Ii) permet de génie génétique; (Iii) confère un potentiel de différenciation presque illimitée. Cependant, les inconvénients majeurs de iPSCs comportent le risque de tumorigénicité des cellules indifférenciées (formation de tératome in vivo) et la nécessité d'une culture ex vivo et la transplantation subséquente si ces cellules doivent être utilisées pour les thérapies à base de cellules. A l'inverse, la lignée-reprogrammation directe est limitée par le faible rendement des cellules désiréesqui est en corrélation directe avec le nombre de cellules ciblées de la population de départ, mais possède l'avantage que des cellules de la lignée-reprogrammé semblent présenter aucun risque lors de la transplantation tumorigène 1,2; en outre, la reprogrammation directe peut même être réalisée in situ, c'est à dire dans l'organe où ces cellules seraient nécessaires, ce qui évite le besoin d'une transplantation.
Dans cet esprit, notre laboratoire a poursuivi la possibilité des cellules du cerveau-résident lignagères reprogrammation en ins comme une nouvelle approche vers des thérapies à base de cellules de maladies neurodégénératives. Les cellules du cerveau-résident qui peuvent être potentiellement considérés comme des cibles cellulaires pour lignage reprogrammation comprennent différents types de macroglie (astrocytes, des cellules NG2 et oligodendrocytes), la microglie et les cellules microvasculaires associées (cellules endothéliales et péricytes). Nous avons beaucoup étudié le potentiel de reprogrammation in vitro de astroglia du cor cérébraletex de souris postnatale précoce 3-5. A la recherche de sources de cellules de la même lignée appropriés pour reprogrammation directe dans le cerveau humain adulte, nous avons rencontré une population de cellules qui peuvent être reprogrammé avec succès dans tenants et les caractéristiques d'exposition des péricytes. Nous décrivons ici un protocole de façon à récolter les cellules à partir de biopsies du cerveau humain adulte, d'élargir et d'enrichir ces cellules in vitro, et, enfin, de reprogrammer avec succès une fraction substantielle de ces cellules in vitro en expansées (dans la plage de 25 à 30%) dans Ins. La reprogrammation peut être obtenue par retrovirus co-expression simultanée de deux facteurs de transcription, et Sox2 ASCL1. Ces PdiNs ont été trouvés à acquérir la capacité d'action répétitive tir potentiel et de servir de cibles synaptiques d'autres neurones indiquant leur capacité d'intégration dans les réseaux de neurones. Notre protocole prévoit une procédure simple pour la conversion de l'isolement et de la lignée des péricytes adultes du cerveau humain dans Ins.
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Protocol
1. Isolement et culture des cellules cerveau humain adulte
Les expériences impliquant des tissus humains doivent être effectués en conformité avec toutes les réglementations gouvernementales et institutionnelles pertinentes concernant l'utilisation de matériel humain à des fins de recherche. Le présent protocole a été élaboré en conformité avec l'approbation par le comité d'éthique de la Faculté de médecine de la LMU Munich et le consentement éclairé de tous les patients.
Ce protocole de préparation des cultures de l'adulte cortex cérébral humain a été créé à l'aide de l'échantillon des patients des deux sexes atteints d'épilepsie du lobe temporal ou d'autres lésions profondes non-traumatiques, non malignes. Le tissu obtenu à partir de la salle d'opération constituée exclusivement le canal d'accès à la lésion cérébrale et donc est considérée comme saine. La tranche d'âge des patients était de 19-70 ans.
- Préparer un milieu de croissance par addition de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur(FCS) de DMEM riche en glucose avec GlutaMAX pour obtenir une concentration finale de 20% de FCS. Ajouter 5 ml de pénicilline / streptomycine à un total de 500 ml de milieu de croissance. Effectuez cette et toutes les étapes ultérieures nécessitant des conditions de culture stériles sous une hotte à flux laminaire approprié.
- Maintenir l'adulte biopsie du cerveau humain obtenu à partir de la salle d'opération dans une solution saline équilibrée de Hanks avec CaCl 2 et MgCl 2 (HBSS) moyen compris HEPES (10 mM de concentration finale) sur de la glace jusqu'à transformation. Commencer le traitement dès que possible.
- Pour démarrer la dissociation dans des cellules individuelles, transférer le tissu dans une boîte de Pétri de 65 mm et émincer en petits morceaux à l'aide de deux à usage unique scalpels stériles. Pour la digestion enzymatique en utilisant 6.3 ml TrypLE dans un tube conique de 15 ml et incuber pendant 15 à 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Ajouter 1 volume de milieu de culture préchauffé afin de faciliter la dissociation et triturer doucement la solution contenant les morceaux de tissu vers le haut et vers le bas en utilisant d'abordune pipette jetable de 5 ml, puis à l'aide d'une pipette Pasteur en verre jusqu'à ce que l'homogénéisation de la suspension cellulaire. Typiquement, des morceaux de tissus résiduels, principalement constitués de la matière blanche, resteront dans la suspension.
- Centrifuger à 157 g pendant 5 min et remettre en suspension le culot dans la quantité appropriée de milieu de croissance (10 ml par flacon de culture non revêtue T75). Utilisez un flacon de culture T75 pour une biopsie de 5-10 mm de diamètre en taille et en extrapoler en cas de plus gros spécimens.
- Placer les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 5% d'O 2.
- Remplacer la moitié du milieu tous les 3-4 jours jusqu'à ce que les cellules ont atteint la confluence. Cela prend habituellement de deux semaines (dénommé passage 0 [P0]).
Expansion 2. In vitro et caractérisation des cellules cerveau humain adulte
- Dans l'expansion in vitro:
- Aspirer le milieu de culture et laver avec tampon phosphate salin (PBS), conserver à température ambiante temperature, avant d'ajouter 3 ml TrypLE.
- Incuber à 37 ° C pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que la plupart des cellules détachées. Tapoter doucement les flacons pour faciliter le levage des cellules; après addition de 3 volumes de milieu de croissance, transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 157 g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules dans la quantité appropriée de milieu de croissance.
- Passage des cellules à un rapport de 1:3 pour un rendement optimal dans de nouveaux flacons de culture de cellules T75.
Note: Nous avons repiquées ces cellules jusqu'à P5 sans aucun signe de réduction de l'efficacité de la reprogrammation. Bien au P0 la culture contient une fraction considérable de cellules endothéliales (évaluée par l'expression de CD34), à des passages ultérieurs de leur nombre devient négligeable.
- Caractérisation des cultures adultes du cerveau humain:
- Immunocytochimie:
- Pour la caractérisation des cellules, semences ~ 60 000 cellules sur la poly-D-lysine couvercle en verre glisse dans 500 pi mediu de croissance fraism dans des plaques à 24 puits pour culture de tissus et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 5% d'O 2.
- Pour une analyse immunocytochimique des cellules cultivées du cerveau humain éliminer le milieu et laver 3 fois avec 1 ml de PBS.
- Fixer les cellules en ajoutant 500 ul de paraformaldehyde à 4% dans du PBS pendant 15 min à température ambiante.
- Transférer le couvercle de verre se glisse dans une chambre de coloration approprié humidifié et bloquer avec 80 ul de PBS contenant 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,5% de Triton X-100 pendant 1 heure à température ambiante.
- Ajouter des anticorps primaires dilués dans la même solution (pour les facteurs de dilution, voir le tableau des réactifs et du matériel spécifiques) et incuber une nuit à 4 ° C ou 1 h à température ambiante.
Remarque: Une fraction substantielle mais en faisant varier des cellules à ce stade de la culture sont immunoréactives pour la croissance β du récepteur du facteur dérivé des plaquettes (PDGFRß), groupe de différenciation 146 (CD146), NG2 chondroïtine sulfate protéoglycane, et l'actine musculaire lisse (SMA), c'est à dire des marqueurs caractéristiques des péricytes microvasculaires associées. Seule une minorité (<1%) expriment les marqueurs astroglials protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et S100β. En outre, à ce stade, la culture doit être dépourvu de toutes les cellules exprimant le marqueur neuronal ßlll-tubuline. Utilisez plusieurs combinaisons d'anticorps primaire pour co-étiquetage des différents marqueurs. Une autre confirmation de l'expression de marqueurs gliaux, neuronaux, endothéliales et péricytes peut être obtenue par transcription inverse et réaction en temps réel en chaîne par polymérase quantitative (qui n'est pas décrit dans ce protocole). - Après l'incubation avec les anticorps primaires laver trois fois avec 1 ml de PBS et ajouter les anticorps secondaires correspondants (dans les dilutions appropriées) à la solution de coloration et incuber 1 h à température ambiante dans l'obscurité. Laver les cellules avec du PBS 3X. Si nécessaire, avant montage inclure coloration avec DAPI pendant 5 min à mangertempérature.
- Utilisation antifading milieu de montage et d'analyser les lamelles en utilisant un microscope à épifluorescence ou un microscope confocal.
- Cytométrie en flux:
- Pour l'analyse de l'expression des marqueurs de surface en utilisant la cytométrie en flux, les cellules se développer jusqu'à confluence en T25 ou T75 non revêtue des flacons de culture cellulaire.
- Détacher les cellules en utilisant TrypLE comme décrit précédemment et remettre en suspension dans une solution de coloration constitué de PBS + 0,5% de BSA. Par réaction de coloration, remettre en suspension 100,000-200,000 cellules dans 100 ul de solution de coloration. Préparer les réactions de coloration uniques par anticorps utilisés (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, des anticorps témoins d'isotype respectifs).
- Ajouter les anticorps conjugués à un fluorochrome pour chaque solution de coloration (voir le tableau pour les dilutions des réactifs et des équipements spécifiques) directement dans la suspension de cellules et incuber à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
- Laver les cellules trois fois avec 500 ul de PBS et centrifuger entre chaqueétape de lavage à 157 xg pendant 5 min.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 à 1 ml de solution de coloration et les cellules de transfert à travers un tamis cellulaire (70 um) dans des tubes FACS. Le protéger de l'exposition à la lumière.
- Vortex échantillons avant de les placer dans l'instrument FACS.
- Pour analyser les cellules vivantes et exclure les débris cellulaires et les agrégats, porte de FSC-A et SSC-A. doublets de cellules sont spécifiquement déclenchés par FSC-A et FSC-W. Pour déterminer les conditions de déclenchement correct pour les marqueurs de surface cellulaire fixées les portes avec un anticorps de contrôle d'isotype correspondant conjugué à du fluorochrome respectif. Ensuite, déterminer la proportion de cellules liées à l'anticorps.
- Immunocytochimie:
3. D'enrichissement pour les cellules dérivées de péricytes par cellulaire activé par fluorescence de tri
- Purifier la population de cellules des péricytes (remises en suspension dans du milieu de croissance) avant la transduction via tri par FACS en utilisant une buse de 70 um. Utilisez CD34-APC en combinaison avec CD140b-PE et CD146-FITC pour sélectionner des péricytes. Trier pour, les cellules CD140b-et-CD146 positives CD34 négatif.
- Recueillir les cellules triées dans un milieu de croissance et de la plaque sur la poly-D-lysine couvercle en verre glisse dans des plaques à 24 puits pour culture de tissus et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 5% d'O 2.
- 48 h après le tri remplacer le milieu avec un milieu de croissance frais et d'effectuer la transduction tel que décrit dans le protocole 4.
4. Rétrovirale transduction des cellules dérivées de péricytes et Reprogrammation en neurones induits
Remarque: Se référer aux lignes directrices en matière de biosécurité locales lors de la manipulation des particules rétrovirales. En Allemagne, l'utilisation des rétrovirus utilisés ici nécessitent de biosécurité de niveau 2. Pour la production de particules rétrovirales, se référer au protocole 6. Pour les constructions rétrovirales utilisées pour la reprogrammation, reportez-vous à Karow et al. (2012). Les rétrovirus sont pseudotypée avec la VSV-G (virus de la stomatite vésiculeuse-glycoprotéine) 5. Pour la production s'il vous plaît se référer à Gavrilescu et al 6.
- 24 heures avant la semence de transduction rétrovirale ~ 60 000 cellules sur la poly-D-lysine couvercle en verre glisse dans 500 pi de milieu de croissance frais dans des plaques à 24 puits de culture de tissu et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 et 5% d'O 2 .
- Le lendemain, remplacer le milieu de croissance avec 500 pi de milieu de croissance frais, préchauffé et ajouter 1 pl des surnageants concentrés respectifs contenant des particules rétrovirales (pCAG-IRES-dsRED pour le contrôle, en particulier lors de l'établissement du protocole dans le laboratoire), pCAG-ASCL1 -IRES-dsRED, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- Un jour plus tard, retirez le support, y compris les particules virales à partir des cellules et ajouter 1 ml fraîches, préchauffé moyen B27-différenciation, composé de 49 ml de DMEM riche en glucose avec GlutaMAX et 1 supplément sans sérum B27 ml. Maintenir les cellules en culture à 37 ° C dans 5% De CO 2 et 5% O 2 pour 4-8 semaines sans changer le milieu que les changements de moyennes répétitives deviennent nuisibles comme ins maturité.
5. Caractérisation des neurones induite par immunocytochimie
- Pour déterminer l'identité cellulaire des cellules transduites, en particulier pour démontrer l'acquisition d'un phénotype neuronal, effectuer immunocytochimie contre des antigènes neuronaux tels que bIII-tubuline, MAP2, et NeuN (pour les anticorps et leurs dilutions respectives, voir le tableau des réactifs spécifiques et équipements; suivre la même procédure comme indiqué au point 2.2.1).
- Pour améliorer la maturation des PdiNs, de co-culture de ces cellules avec les neurones issus de cortex cérébral de souris E14. A cette fin, disséquer le cortex cérébral et les tissus dissocier mécaniquement avec une pipette Pasteur en verre poli au feu. Ajouter 10,000-50,000 neurones murins à des cultures de cellules dérivées de péricytes 2-3 semaines suivant la transduction de re-Sox2 et ASCL1-codagetroviruses et continuer la culture. Les cellules transduites peuvent être distingués des neurones murins par leur rapporteur (GFP et DsRed) expression, soit par épifluorescence en direct ou à la suite immunocytochimie pour la GFP et DsRed.
- Pour évaluer la formation des synapses sur PdiNs par les neurones de souris, effectuer immunocytochimie contre les récepteurs de neurotransmetteurs vésiculaires tels que vésiculaire transporteur du glutamate 1 (VGLUT1).
- Sonder les cellules transduites pour leurs propriétés électriques (c. capacité de générer des potentiels d'action) et la mise en place des synapses fonctionnelles par patch-clamp électrophysiologie. Pour plus de détails de la procédure voir Heinrich et al. (2011).
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Representative Results
Le premier résultat de ce protocole après avoir réussi à établir une culture d'un spécimen de l'homme adulte cortex cérébral consiste à l'identification de la composition cellulaire de la culture. Immunocytochimie pour des protéines spécifiques de type cellulaire révèle un degré élevé d'hétérogénéité entre les cultures dérivées de l'échantillon de différents patients (Figure 1A). Telle que quantifiée par cytométrie de flux, il ya toujours une fraction substantielle des cellules qui expriment PDGFRß (en moyenne ~ 75%, allant de 30 à jusqu'à 99%); d'autres marqueurs tels que des péricytes CD146, CD13 et NG2 sont typiquement exprimés dans une gamme inférieure (figure 1B). De même SMA est exprimé dans une sous-population mineure de cellules en culture, telle que déterminée par immunocytochimie (Figure 1A). Au passage 0 (P0), il ya généralement <10% des cellules endothéliales CD34-positif, et leur nombre diminue en dessous de détection avec un autre passage. De même, astrocytes ne constituent qu'une contamination négligeable aux passages précédents. En outre, il ya généralement pas de cellules qui se colorent de cellule souche neurale, neuronale, ou marqueurs d'oligodendrocytes. Immunocytochimique et cytométrie de flux de données sont entièrement corroborée par RT-PCR quantitative 7. En somme, la fraction la plus importante dans la culture exprime des protéines et ARNm caractéristique de péricytes. Un autre enrichissement pour les cellules dérivées de péricytes peut être obtenue par FACS à ce stade. Ceci est particulièrement pertinent lorsque la pureté de la culture est à l'extrémité inférieure du spectre réfléchi par le niveau d'expression PDGFRß. Ainsi, nous avons utilisé un anticorps contre le récepteur PDGFRß (CD140b) seul ou en combinaison avec un anticorps anti-CD146, tout en excluant tous les contaminants de CD34-positives, de tri FAC-péricytes spécifiquement (figure 1C).
Transduction ces cultures avec des virus de contrôle codant pour un gène rapporteur que, ne modifie pas leur marqueur expression profil (évalués 3-4 semaines après la transduction), ce qui indique que ces cellules restent dans la lignée des péricytes. De même, l'expression de retrovirus de Sox2 seul n'entraîne pas des changements manifestes dans la morphologie, ni induit l'expression bIII-tubuline suggère que Sox2 seule n'est pas suffisante pour induire une conversion de sort. A l'inverse, un faible pourcentage (environ 10%) des cellules transduites avec un retrovirus codant pour des Ascl1 seule pièce expression ßlll-tubuline, mais sans acquérir une morphologie neuronale. Étonnamment, près de 50% de tous et-Sox2 cellules ASCL1-cotransduced montrer expression ßlll-tubuline et plus important encore, un tiers de ces cellules doubles-transduction (visualisées par leur double expression rapporteur) présentent également des processus neuronaux (Figure 2). En plus de l'acquisition de fonctions neuronales, l'expression de PDGFRß est régulée à la baisse 7. Avec davantage de maturation dans la culture, et Sox2 cellules de ASCL1-coexprimant deviennent aussi immunitéoreactive pour les plus matures marqueurs neuronaux MAP2 (coloration processus dendritiques) et NeuN (coloration des corps cellulaires neuronaux principalement). Comme on le verra ci-après ces modifications de l'expression de marqueurs également en corrélation avec l'acquisition de caractéristiques électrophysiologiques de neurones. En somme, ces données fournissent la preuve pour la conversion de sort directe des cellules péricytes dérivés en ins, dénommé PdiNs. Ces PdiNs possèdent la compétence pour établir des compartiments post-synaptiques fonctionnelles comme l'a révélé dans les expériences de co-culture avec les neurones du cortex cérébral embryonnaire de souris. Cette compétence peut être démontrée électrophysiologique dans l'apparition des entrées synaptiques (voir ci-dessous) ainsi que la décoration des processus dendritiques de PdiNs avec terminaisons présynaptiques dérivés de neurones co-culture (caractérisés par des groupes de transporteurs de neurotransmetteurs vésiculaires, par exemple VGLUT1 immunoréactivité). Ces données indiquent en outre la capacité de s'intégrer dans PdiNs c neuronaleircuits.
Figure 1. D'expression hétérogène de marqueurs de péricytes dans les cultures dérivées de l'adulte cortex cérébral humain. A) micrographies fluorescentes illustrant l'expression hétérogène de marqueurs de péricytes (PDGFRB, SMA, CD146) comme révélé par immunocytochimie. Barre d'échelle = 50 um. B) L'histogramme résume le nombre relatif de cellules positives pour les marqueurs de péricytes PDGFRß (CD140b), CD13, CD146 et tel que déterminé par cytométrie de flux de différentes cultures provenant de patients. CD34 est un marqueur des cellules endothéliales. Parcelles C) FACS de points représentant le contrôle et isotype des cellules humaines CD146 / CD140b colorées pour le tri des péricytes doubles positifs (mis en évidence par la boîte rouge) pour une reprogrammation ultérieure. Notez le taux élevé d'expression et PDGFRßl'hétérogénéité en ce qui concerne l'expression CD146 dans cette culture particulière.
. Figure 2 reprogrammation de cellules adultes humaines en péricytes dérivés dans Ins Top:. Expérimental. Ci-dessous: micrographies fluorescentes représentant cellules transduites avec le codage de rétrovirus Sox2-IRES-GFP et ASCL1-IRES-DsRed. Notez que seules les cellules à double transduction (pointes de flèche) expriment bIII-tubuline (panneau de droite) et présentent une morphologie neuronale.
| division cellulaire [%] | la mort cellulaire [%] | bIII-tubuline + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Tableau 1. Comportement des cellules dérivées de péricytes subissant une transformation en PdiNs comme évalué par imagerie en temps réel continu. Notez que Sox2 Ascl1-et co-exprimant le cycle cellulaire des cellules de sortie. En outre, noter le taux élevé de mort cellulaire suivant Ascl1 ou Sox2 et Ascl1-co-expression. Compte tenu de ces événements cellulaires distincts, environ 25% de toutes les cellules co-transduction devenir ins.
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Discussion
Le présent protocole décrit l'expansion in vitro et l'enrichissement des cellules péricytes dérivé après l'isolement de l'adulte cortex cérébral humain et la conversion ultérieure en ins par l'expression de retrovirus de la transcription neurogène facteurs Sox2 et Ascl1. Ce protocole prévoit une expérimentation dans le système in vitro pour étudier la lignée de conversion des cellules du cerveau résident dans les neurones et potentiellement les cellules gliales, avec l'objectif à l'esprit pour traduire en fin de compte cette approche de la conversion directe dans la mise en vivo du cerveau adulte.
Considérations techniques
Dans notre étude, nous avons utilisé le tissu cérébral humain de patients âgés entre 19 et 70 ans, des deux sexes. Nous n'avons pas remarqué une différence manifeste de l'efficacité de reprogrammation en fonction du sexe ou de l'âge de 7. Il est néanmoins recommandé de documenter cette information différences plus subtiles peuvent néanmoins êtreobservé qui a échappé à notre attention.
Il est en outre recommandé de débuter le traitement le plus tôt possible après le transfert de l'échantillon de tissu au laboratoire. Il y aura forcément des inconnues pour combien de temps le tissu est resté dans la salle d'opération avant le transfert à l'expérimentateur. Nous estimons que, dans notre étude 7, le temps entre le prélèvement de cerveau du patient au début de la procédure de culture variait entre 2-6 heures, avec les échantillons gardés de tous les temps sur la glace. Aucune différence manifeste dans la facilité de traitement ultérieur, ni aucune issue défavorable ont été remarqués dans ce laps de temps.
Une évaluation critique de tout protocole concerne sa simplicité, la reproductibilité et l'efficacité. Le présent protocole est très simple en ce que lors d'une première des cellules de phase sont développés dans un milieu peu coûteux qui peut être facilement obtenue, suivie par une seconde phase de reprogrammation cellulaire en utilisant seulement deux fa de transcriptionctors et mise en culture dans un milieu défini.
En ce qui concerne la reproductibilité, on a observé que la qualité de la préparation de rétrovirus est de la plus haute importance, avec des préparations de virus à faible titre utilisés à des dilutions de faire correspondre le nombre de particules infectieuses de virus à titre élevé se traduit souvent par un échec de la reprogrammation. En fait, nous avons constaté que la même culture de péricytes dans lequel reprogrammation avait déjà échoué pourrait être converti avec succès en ins lors de l'utilisation de virus à titre élevé.
En ce qui concerne l'efficacité de la conversion, nous avons évalué le nombre de ßlll-tubuline positif des cellules dérivées de cellules-et Sox2 de ASCL1-cotransduced utilisant l'imagerie en direct en continu. Imagerie en temps réel permet d'évaluer le nombre de cellules qui subissent une division cellulaire ou la mort cellulaire pendant le processus de conversion, alors que cette information est absente lorsque le nombre d'ins générée est déterminée seulement à l'endroit de l'expérience d'extrémité. En fait en utilisant time-lapse vidéo microscopie (pour la procédure voir Ortega e t al. 8), il a été observé que les cellules de facteurs transduction untransduced et simples continuent de proliférer, alors que-et Sox2 cellules ASCL1-cotransduced quitter rapidement le cycle cellulaire. En outre, une fraction significative de la population ci subit une mort cellulaire. Bien que la toxicité de rétrovirus ne peut être formellement exclue des données obtenues dans notre étude 7, le fait que l'augmentation de la mort cellulaire a été observé que lorsque ASCL1 a été exprimé (seul ou en combinaison avec Sox2), nous interprétons cela comme la preuve d'un conflit catastrophique de destin des cellules . Compte tenu de ces deux événements en compte, nous estimons que 25% de tous et-Sox2 cellules ASCL1-cotransduced convertir en ins positifs bIII-tubuline (tableau 1).
En tant que co-transduction est absolument nécessaire pour la reprogrammation de succès, on peut envisager d'employer un vecteur viral codant pour les deux gènes d'optimiser la quantité de cellules exprimant les deux facteurs en mêmetemps.
Récemment, Ladewig et al. Ont développé un protocole pour la conversion efficace de fibroblastes en ins obtenant un rendement de 200% en utilisant de petits inhibition par molécule de glycogène synthase kinase-3β et SMAD signalisation 9. Il sera intéressant de déterminer si ces add-ons à notre protocole d'améliorer le rendement de la production PdIn.
Un autre résultat intéressant de l'imagerie en temps réel du processus de reprogrammation concerne le fait que la conversion des péricytes humains adultes en ins se produit à un rythme plutôt lent par rapport aux protocoles de reprogrammation similaires dans des cultures de différentes cellules somatiques d'origine de la souris 4. Ceci est cohérent avec la maturation lente caractéristique de neurones humains 10.
Alors que nous n'avons pas systématiquement analysé l'impact de la pression d'oxygène sur le rendement de la production PdIn, nous avons constaté que l'incubation dans des conditions de faible teneur en oxygène (5%) en générala donné des résultats supérieurs par rapport à la culture des cellules dans des conditions normoxiques (21%). Récemment, Davila et al. Décrit un effet amplificateur similaire par la pression d'oxygène réduite pour l'induction de l'INS à partir de fibroblastes humains 11.
Notre protocole est basé sur l'administration rétroviral de Sox2 et ASCL1 tandis que d'autres protocoles de transformation directes ont employé des vecteurs lentiviraux inductibles 1, 12, 13. Plus récemment, nous avons également appliqué avec succès constructions lentiviraux doxycycline inductible codant Sox2 et ASCL1, indiquant qu'une relativement courte impulsion (10 jours) de Sox2 et Ascl1 expression est suffisante pour provoquer la conversion pericyte-à-neurone. Les rétrovirus utilisés dans notre étude 7 ont été conçus pour réduire au silence 5. En conséquence, nous n'avons pas remarqué l'apparition de neurones dépourvus d'expression du gène rapporteur. Cependant, la possibilité que les niveaux d'expression de l'ensemble des deux transgèness et reporter les changements au fil du temps ne peut être exclue. Approches gratuit rapprochement (en utilisant des virus Sendai) ont été récemment utilisé dans le cas de la génération de progéniteurs neuronaux induits 14, mais il n'est actuellement pas connu si ce ou stratégies de reprogrammation même virus libre peut être appliquée avec succès à convertir péricytes humains. Enfin, si les péricytes dérivées d'autres tissus peuvent subir une conversion en types de cellules neurales induites reste à tester.
Considérations conceptuelles
Un résultat essentiel de la reprogrammation de cellules somatiques dans Ins concerne leur fonctionnalité 15. Nous avons évalué les propriétés électrophysiologiques de PdiNs à différents points de temps après le début du processus de reprogrammation. À un stade très précoce, soit 2 semaines après transduction rétrovirale, PdiNs présentent à peine des signes de l'excitabilité électrique, malgré l'expression ßlll-tubuline à ce stade. Ainsi, la majeure partie de l'analyses électrophysiologiques ont été menées 4-8 semaines après transduction avec Sox2 et ASCL1. Comme décrit dans Karow et al. PdiNs sont caractérisés par une immaturité considérable comme le montre par des résistances d'entrée élevés et une faible fréquence de mise à feu potentiel d'action. En outre maturation peut être favorisée par PdiNs co-culture avec des neurones dérivés de la souris E14 cortex cérébral. Dans ces conditions, PdiNs présentent plus élevés d'action fréquences potentiels et l'augmentation des courants de sodium 7. En outre, co-culture révèle la compétence de PdiNs pour recevoir une entrée synaptique fonctionnelle des neurones de souris. Somme toute, PdiNs acquérir des propriétés fonctionnelles neuronales qui peut être encore améliorée à co-culture avec des autres neurones. Cependant, il reste à démontrer si PdiNs peuvent également établir des compartiments synaptiques fonctionnelles. D'autres études de transplantation PdiNs dans le cerveau sont nécessaires pour révéler leur potentiel pour atteindre sa pleine maturité et de fonctionnalité.
Uchanter Sox2 et ASCL1 comme facteurs de reprogrammation Nous avons constaté que les PdiNs résultant acquérir caractéristiques de neurones GABAergiques 7. Fait intéressant, d'autres groupes ont élaboré des protocoles pour convertir des fibroblastes en ins à l'aide de différents facteurs de transcription et / ou des combinaisons de microARN avec le résultat que les tenants de développement acquis spécification de neurotransmetteur distincte comme un glutamatergique, dopaminergique et cholinergique phénotype 1, 16-18. Il reste à vérifier si les combinaisons de facteurs utilisés dans les fibroblastes induisent la même identité de l'émetteur dans PdiNs. Par ailleurs, des travaux récents ont élargi le spectre de conversion au-delà de la neurogenèse de générer des cellules souches neurales 19, 20 ou gliales, dans les oligodendrocytes particuliers 21, 22. Si ces protocoles de reprogrammation suscitent un résultat similaire dans les cellules péricytes dérivé du cerveau humain adulte, ce serait grandement élargir le panorama des applications de cette importationfourmi type de cellule cerveau-résident.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants envers le Dr Magdalena Götz pour sa contribution au cours de l'élaboration de ce protocole. Nous remercions le Dr Marius Wernig (Stanford University) pour généreusement nous fournir la séquence codante de Sox2. Nous sommes également très reconnaissants envers le Dr Alexandra Lepier pour la production de virus. Ce travail a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) et le BMBF (01GN1009A) à BB, et le ministère bavarois des Sciences, de la Recherche et des Arts à MK et BBCS reçu des fonds du SYSTHER binational INREMOS Institut virtuel (ministères fédéral allemand et slovène de l'éducation et de la recherche) et la DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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