Summary
直接の系譜 - 再プログラミングのための脳常駐細胞を標的とすることは、脳の修復のための新たな視点を提供しています。ここでは、成人の大脳皮質から脳常駐周皮細胞について濃縮文化を準備し、転写因子Sox2のとASCL1のレトロウイルス媒介発現によって誘導神経細胞にこれらを変換する方法のプロトコルについて説明します。
Abstract
誘導された神経細胞（INS）への非神経細胞の直接系譜再プログラミングは、神経発生の基礎となる分子メカニズムへの洞察を提供し、in vitroでのモデル化や病気の脳を修復するための新たな戦略を可能にすることができる。 INSへの直接変換の影響を受けやすい脳常駐非神経細胞型、 すなわち損傷した脳組織の中に、 その場でこのようなアプローチを起動可能にするかもしれません識別する。ここでは、この前提を満たすヒト成人脳由来の細胞を同定する試みで開発されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、含まれます。成人の脳生検から得た大脳皮質からのヒト細胞の（1）を培養し; （2）in vitroでの拡大（約2〜4週間を要する）と、免疫細胞による文化の特性評価およびフローサイトメトリー; （3）（FACS）を蛍光活性化細胞ソーティングによる濃縮を、抗PDGF受容体-βおよび抗CD146抗体を用いた;（4）神経原性転写因子SOX2とASCL1とレトロウイルス媒介形質導入を。 （5）、最後に免疫細胞化学（レトロウイルス形質導入後8週間〜14日間）による結果の周皮細胞由来の誘発性神経細胞（PdiNs）の特徴付けを。この段階では、INSは、パッチクランプ記録により、その電気的特性のためにプローブすることができる。このプロトコルは、機能的なヒトINSに脳常駐周皮細胞のin vitro系統の変換のため、再現性の高い手順を説明します。
Introduction
次に、分化能の過多に恵まれている人工多能性幹細胞（iPS細胞）中に体細胞の再プログラミングとは対照的に、直接再プログラミングは、他に一つの特定の細胞型の直変換を目指す。疾患モデリングおよび電位細胞ベースの治療の文脈におけるそれらの適用に関しては、両方の再プログラミングのアプローチは、特定の利点及び欠点を有する。 iPS細胞に再プログラミング（i）は、細胞の事実上無限の源を提供する; （II）遺伝子工学を可能にし; （III）は、ほぼ無限の分化能を賦与。これらの細胞は細胞ベースの治療のために使用される場合は、iPS細胞の主要な欠点は、未分化細胞（ インビボでのテラトーマ形成）の腫瘍形成性および ex vivo培養およびその後の移植の必要性の危険性を伴う。逆に、直接の系譜再プログラミングは、所望の細胞の低収量によって制限されている出発集団の標的とされた細胞の数と直接相関するが、系統再プログラムされた細胞は、移植の1,2に何ら腫瘍形成のリスクを示さないように見える利点を有している。さらに、直接の再プログラミングにも従って、移植の必要性を回避する、 すなわち、これらの細胞が必要とされる器官内の、 その場で達成することができる。
これを念頭において、私たちの研究室では、神経変性疾患の細胞ベースの治療に向けた新たなアプローチとして、INSに、系統再プログラミング脳常駐細胞の可能性を追求してきた。脳常駐系統再プログラミングのための細胞標的は大膠細胞（アストロサイト、NG2細胞およびオリゴデンドロサイト）の異なるタイプを含むように、潜在的に考慮することができる細胞、小膠細胞、および微小血管に関連する細胞（内皮細胞および周皮細胞）。私たちは、脳CORのアストログリアのin vitro再プログラミングの可能性を徹底的に研究している生後初期のマウス3-5の TEX。成人の脳内での直接の系統再プログラミングについても同様に適切な細胞源を求めて、我々が正常にインと周皮細胞の展示ホールマークに再プログラムすることができる細胞集団を検出しました。ここでは、拡張し、in vitroでこれらの細胞を豊かにし、最終的に成功してに（25から30パーセントの範囲）これらのin vitro増殖した細胞のかなりの割合を再プログラムするために、成人の脳生検から、これらの細胞を採取する方法のプロトコルを記述INS。再プログラミングは、2つの転写因子、およびSOX2 ASCL1の同時レトロウイルス媒介性の同時発現によって達成することができる。これらPdiNs、反復活動電位発火の能力を獲得するためにニューラルネットワークへの統合の彼らの能力を示す他のニューロンのためのシナプス標的として役立つことが分かった。我々のプロトコルは、INSに成人のヒト脳ペリサイトを単離および系統変換のための簡単な手順を説明します。
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Protocol
1。単離と成人の脳細胞の培養
ヒト組織を含む実験は、研究目的のためにヒトの材料の使用に関するすべての関連する政府や機関の規制に従って行われるべきである。この議定書は、LMUミュンヘンの医学部の倫理委員会とすべての患者から書面によるインフォームドコンセントの承認に基づいて開発されました。
成人の大脳皮質の準備文化のこのプロトコルは、側頭葉てんかんや他の根深い非外傷性、非悪性病変に苦しんで雌雄の患者の標本を使用して確立されています。外科室から得られた組織は、排他的に脳病変へのアクセスチャネルを構成されるため、健康的と考えられている。患者の年齢範囲は19から70歳であった。
- 熱不活性化ウシ胎児血清を添加して増殖培地を調製グルタを有するDMEM高グルコースから（FCS）、20％FCSの最終濃度を得た。 500ミリリットルの成長培地の合計に5ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシンを追加します。この、適切な層流フード内で無菌培養条件を必要とするすべての後続の手順を実行します。
- 処理まで氷上でHEPES（10mMの最終濃度）を含む塩化カルシウムとのハンクス溶液中の手術室から得た成人の脳生検及びMgCl 2（HBSS）メディアを保管してください。できるだけ速やかに処理を開始する。
- 単一細胞に解離を開始するには、2の滅菌使い捨てメスを使って、小さな断片に65ミリメートルペトリ皿とミンチに組織を移す。酵素消化のために15ミリリットルの円錐管中で3〜6ミリリットルのTrypLEを使用し、水浴中で37℃で15〜30分間インキュベートする。
- 解離を促進するために温めておいた増殖培地の1容量を加え、穏やかに最初の使用して上下に組織片を含む溶液を粉砕する細胞懸濁液の均質化するまで、ガラスパスツールピペットを用いて、続いて5ミリリットル使い捨てピペット。一般的には、主に白質からなるいくつかの残存組織片は、サスペンションのままになります。
- 5分間157×gでスピンダウンし、成長培地の適切な量（コーティングされていないT75培養フラスコ当たり10ミリリットル）でペレットを再懸濁します。サイズが5〜10mmの直径の生検に対して1つのT75培養フラスコを使用し、より大きな標本の場合には、このから外挿する。
- 5％CO 2および5％O 2、37℃のインキュベーター内に細胞を置く。
- 細胞がコンフルエントに達するまで3〜4日ごとに培地の半分を交換してください。これは通常、二週間（継代0 [P0]と呼ぶ）まで行われる。
成人の脳細胞の2。 インビトロ増殖および特性評価
- インビトロ増殖中 。
- 培養培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、室温tに保っemperature、3ミリリットルののTrypLEを追加する前に。
- ほとんどの細胞が分離するまで5〜10分間37℃でインキュベートする。優しく細胞の持ち上げを容易にするために、フラスコをタップ。成長培地の3倍量の添加後に15mlのコニカルチューブに細胞を移し、5分間、157×gでスピンダウンし、成長培地の適切な量で細胞を再懸濁する。
- 流路新しいT75細胞培養フラスコに最適な歩留まりのための1:3の割合の細胞。
注意：我々は、削減、再プログラミング効率の兆候なしに、P5まで、これらの細胞を継代しています。 P0での培養は、内皮細胞（CD34発現により評価される）のかなりの部分を含んでいるが、その後の継代ではその数は無視できるようになる。
- 成人の脳の文化の特徴付け：
- 免疫細胞化学：
- ポリ-D-リジンコートガラスカバーの上に細胞、種子〜60,000細胞の特徴のために、500μlの新鮮な増殖mediuでスリップ24ウェル組織培養プレート中mおよび5％CO 2および5％O 2、37℃でインキュベートする。
- 培養ヒト脳細胞の免疫細胞化学的分析のために培地を除去し、1mlのPBSで3回洗浄する。
- 室温で15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド500μlの添加によって細胞を固定する。
- ガラスカバーは、適切な染色加湿チャンバーに移し、スリップ80μlのPBSを室温で1時間3％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5％トリトンX-100を含有するブロック。
- 同じ溶液で希釈した一次抗体を追加する（希釈因子は、特定の試薬および装置の表を参照）と4℃または室温で1時間で一晩インキュベートする。
注：培養のこの段階で細胞の実質的な画分は変化させることなく、血小板由来増殖因子受容体β（PDGFRβ）、分化146（CD146）のクラスター、NG2コンドロイチン硫酸プロテオのために免疫反応性であるグリカン、および平滑筋アクチン（SMA）、微小血管関連周皮細胞の特性すなわちマーカー。少数のみ（<1％）のアストログリアマーカーグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）およびS100βを発現する。さらに、この段階では文化が神経マーカーβIII-チューブリンを発現する任意の細胞を欠いている必要があります。異なるマーカーの同時標識のために複数の一次抗体の組み合わせを使用してください。グリア細胞、神経細胞、内皮細胞および周皮細胞マーカーの発現のさらなる確認は、逆転写および（このプロトコールに記載されていない）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により得ることができる。 - 一次抗体とのインキュベーション後、1mlのPBSで3回洗浄し、染色溶液（適切な希釈において）対応する二次抗体を添加し、暗所で室温で1時間インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄します。必要に応じて、取り付け前には部屋で5分間DAPIで染色を含める温度。
- 封入剤を使用し、退色防止エピ蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を用いてカバースリップを分析。
- フローサイトメトリー：
- フローサイトメトリーによる表面マーカー発現の分析のために、コーティングされていないT25又はT75細胞培養フラスコ中でコンフルエントになるまで細胞を増殖させる。
- PBS + 0.5％BSAからなる染色溶液に再懸濁する前に記載したようのTrypLEを用いて細胞を剥離。染色反応あたり、染色液100μlに10〜20万細胞を再懸濁。使用した抗体ごとに単一の染色反応（CD146-FITC、抗CD140b-PE、CD34-APC、CD13-FITC、それぞれのアイソタイプコントロール抗体）を準備します。
- 直接細胞懸濁液に（希釈は特定の試薬や機器の表を参照）、各染色液に蛍光色素標識抗体を加え、暗所で30分間、4℃でインキュベートする。
- 500μlのPBSで細胞を3回洗浄し、それぞれの間にスピンダウン5分間157×gで洗浄工程。
- FACSチューブにセルストレーナー（70ミクロン）を介して0.5〜1ミリリットル染色溶液および転送細胞で細胞ペレットを再懸濁する。光への暴露からサンプルを保護します。
- 前FACS装置に置くことに渦のサンプル。
- 生きた細胞を分析し、破片や細胞集合体、FSC-AおよびSSC-Aのゲートを除外します。細胞デュプレットは、特にFSC-AとFSC-Wでゲートアウトされています。それぞれの蛍光色素に結合させアイソタイプ一致抗体コントロールでゲートを設定する細胞表面マーカーのための右のゲート条件を決定する。その後、抗体結合細胞の割合を決定する。
- 免疫細胞化学：
3。蛍光による周皮細胞由来細胞の濃縮には、活性化細胞選別
- FACSは、70μmのノズルを用いてソーティングを介して形質導入前に（増殖培地中に再懸濁させ）、周皮細胞集団を精製する。 C言語との組み合わせで、CD34-APCを使用D140b-PEおよびCD146-FITCは、周皮細胞を選択した。 CD34陰性、抗CD140b-、およびCD146陽性細胞のソート。
- 24ウェル組織培養プレート中にスリップポリ-D-リジンコートカバーガラス上に増殖培地プレートで選別された細胞を収集し、5％CO 2および5％O 2、37℃でインキュベートする。
- ソート後の48時間は、新鮮な増殖培地で培地を交換し、プロトコル4で説明したように伝達を行う。
4。レトロ周皮細胞由来細胞の形質導入およびリプログラミング誘導された神経細胞に
注意：レトロウイルス粒子を扱う地元のバイオセーフティのガイドラインを参照してください。ドイツでは、ここで使用されるレトロウイルスの使用は、生物学的安全性レベル2を必要とする。レトロウイルス粒子の産生がプロトコル6を参照してください。再プログラミングのために使用されるレトロウイルス構築物について、Karow らを参照してください。（2012年）。レトロウイルスは、VSV-G（水疱性口内炎ウイルス糖で偽だったタンパク質）5。生産のためにGavrilescu ら 6を参照してください。
- 従来のポリ-D-リジンコーティングガラスカバー上にレトロウイルス形質導入種子〜60,000細胞に24時間、24ウェル組織培養プレートに500μlの新鮮な増殖培地中にスリップし、5％CO 2および5％O 2、37℃でインキュベートする。 。
- 翌日、500μLの新鮮な、あらかじめ温めておいた増殖培地で増殖培地を交換し、レトロウイルス粒子を含むそれぞれの集中上清を1μlを追加します（特に、研究室でのプロトコルを確立する時に、制御のためのpCAG-IRES-DsRedを ）のpCAG-ASCL1のpCAG-SOX2-IRES-GFP-IRES-DsRedを 。
- 1日後、細胞からのウイルス粒子を含む培地を除去し、新鮮な1ミリリットルを加え、グルタマックス49ミリリットルDMEM高グルコースと1ミリリットルのB27の無血清サプリメントで構成される、B27-分化培地を予め温め。 5中、37℃で培養中の細胞を維持する％のCO 2とINSが成熟するにつれて、繰り返しの媒体の変化が有害になる等の媒体を変更することなく、4〜8週間で5％のO 2。
免疫細胞により誘導された神経細胞の5。キャラ
- （抗体およびそれぞれの希釈のために、特定の試薬の表を参照して、形質導入細胞の細胞同一性を決定するために、特定の神経表現型の獲得を実証するために、このようなBIII-チューブリン、MAP2およびNeuNのような神経抗原に対する免疫細胞化学を実施し、機器、2.2.1で示したのと同じ手順に従ってください）。
- E14マウス大脳皮質から派生したニューロンとPdiNs、共培養これらの細胞の成熟を向上させるため。そのためには、大脳皮質を解剖し、火研磨されたガラスパスツールピペットを用いて機械的に組織を解離する。 SOX2とASCL1再エンコードした形質導入後周皮由来細胞2〜3週間の培養に10,000-50,000ネズミの神経細胞を追加troviruses培養を続ける。形質導入された細胞は、ライブエピ蛍光によってまたはGFPとDsRedのための免疫細胞を、次のいずれか、そのレポーター（GFPとDsRedの）式でネズミの神経細胞と区別することができる。
- マウスの神経細胞でPdiNs上にシナプスの形成を評価するために、このような小胞グルタミン酸輸送体1（VGLUT1）などの小胞の神経伝達物質受容体に対する免疫細胞化学を行う。
- その電気的特性（活動電位を発生させるすなわち能力）およびパッチクランプ電気生理学による機能シナプスの確立のための形質導入した細胞を探る。手順の詳細については、ハインリッヒら （2011）を参照してください。
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Representative Results
首尾成人の大脳皮質の標本からの培養を確立した後、このプロトコルの最初の成果は、文化の細胞組成を同定することにある。細胞型特異的なタンパク質のための免疫細胞化学は、異なる患者（ 図1A）の検体から派生文化間の異質性のかなりの程度を明らかにしている。フローサイトメトリーによって定量化したよう（平均で約75％、30から99％までの範囲）PDGFRβを発現する細胞のかなりの割合が常にある。このようなCD146、NG2およびCD13などの周皮細胞の他のマーカーは、一般的に低い範囲（ 図1B）で表されます。免疫細胞化学（ 図1A）によって決定されるように、同様に、SMAは、培養細胞の小亜集団において発現される。継代0（P0）で、CD34陽性内皮細胞の10％が<通常存在し、その数をさらに継代による検出の下方に低下する。同様に、astrocytESは早いパッセージでは軽微の汚染を含む。さらに、神経幹細胞、神経細胞、またはオリゴデンドロサイトマーカーについて染色ない細胞は、典型的には存在しない。免疫細胞化学およびフローサイトメトリーデータは、完全に定量的RT-PCR 7によって裏付けされています。要するに、文化の中で最大の割合は、タンパク質および周皮細胞に特徴的なmRNAを表現しています。周皮細胞由来細胞をさらに富化は、この段階でFACSによって達成することができる。 PDGFRβ発現のレベルによって反映されるように培養物の純度は、スペクトルの下端にある場合に特に適切である。 FACソート特に周皮細胞（ 図1C）に、任意のCD34陽性の汚染物質を排除しつつ、我々は、PDGFRβに対する抗体（抗CD140b）単独で、または抗CD146抗体と組み合わせて利用してきた。
唯一のレポーター遺伝子をコードするコントロールウイルスでこれらの培養物を形質導入、それらのマーカー発現pを変化させないrofileこれらの細胞は周皮細胞系統に残っていることを示す、（形質導入後3〜4週間で評価）。同様に、一人でSox2ののレトロウイルス媒介式は形態の明白な変化をもたらすだけではなく、Sox2の運命転換を誘導するのに十分ではないことを示唆しBIII-チューブリン発現を誘導していません。これとは対照的に、細胞の低い割合（約10％）は、しかし、神経形態を取得せずに、ASCL1をコードするレトロウイルス単独の展示βIII-チューブリン発現を用いて形質導入。驚くべきことに、すべてのSOX2とASCL1-同時形質導入細胞の50％近くは、βIII-チューブリン発現を示し、さらに重要なのは、（彼らの二重レポーター発現により可視化）これらの二重形質導入細胞の3分の1はまた、神経突起（ 図2）を表示します。神経細胞の機能の買収に伴い、PDGFRβの発現は7下方制御される。文化のさらなる成熟に、SOX2、及びASCL1-共発現細胞もIMMUNなるより成熟したニューロンマーカーMAP2（樹状突起を染色）とのNeuN（主に神経細胞体を染色する）ためのoreactive。マーカー発現におけるこれらの変化後述するように、また神経細胞の電気生理学的特徴の獲得と相関する。要するに、これらのデータは、INSへの周皮細胞由来細胞の運命直接変換のための証拠を提供する、PdiNsと称する。これらPdiNsはマウス胎児の大脳皮質の神経細胞との共培養実験で明らかにされたように、機能性シナプス後コンパートメントを確立する能力を持っている。この能力は、シナプス入力の外観（下の説明を参照）だけでなく、（水疱性神経伝達物質輸送体、 例えば VGLUT1免疫反応のクラスターを特徴とする）共培養したニューロンに由来し、シナプス前終末とPdiNsの樹状突起の装飾に電気生理学的に証明することができる。これらのデータは、神経細胞Cに統合するPdiNsの能力を示しているircuits。
図1。成人ヒトの大脳皮質に由来し培養における周皮細胞マーカーのヘテロジニアス式。 A）免疫細胞化学によって明らかにされた周皮細胞マーカー（PDGFRB、SMA、CD146）の不均一な表現を示す蛍光顕微鏡写真。スケールバー=50μmである。B）ヒストグラムは、異なる患者由来の培養物のフローサイトメトリーによって決定された周皮細胞マーカーPDGFRβ（抗CD140b）、CD13、およびCD146陽性の細胞の相対数をまとめたものである。 CD34は、内皮細胞のマーカーである。アイソタイプコントロールとその後の再プログラミングのために赤いボックスで強調表示二重陽性周皮細胞（）のソートのためのCD146 /抗CD140b染色されたヒト細胞を描いC）FACSドットプロット。 PDGFRβ式の高率を記録し、この特定の文化の中でCD146発現に関して異質。
図2 INS上部に成人の周皮由来細胞のリプログラミング：実験の設定。下：コードするレトロウイルスSOX2-IRES-GFPおよびASCL1-IRES-DsRedを形質導入した細胞を描いた蛍光顕微鏡写真。唯一の二重形質導入細胞（矢頭）はBIII-チューブリン（右パネル）を発現し、神経細胞の形態を示すことに注意してください。
| 細胞分裂[％] | 細胞死[％] | BIII-チューブリン+ [％] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| SOX2 | 46 | 7 | 0 |
| ASCL1 | 26 | 33 | 7 |
| SOX2、ASCL1 | 3 | 36 | 25 |
連続ライブイメージングによって評価されるPdiNsに変換中の周皮細胞由来細胞の表1。挙動。Sox2のアンドASCL1細胞出口細胞周期を共発現することに注意してください。また、ASCL1またはSox2のとASCL1-共発現後の細胞死率の高さに注意してください。考慮にこれらの異なる細胞事象を考慮して、すべての共同形質導入した細胞の約25％がインになる。
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Discussion
この議定書は、成人の大脳皮質からの分離と神経性転写因子Sox2のとASCL1のレトロウイルス媒介発現によるINSへのその後の変換次の周皮由来細胞のin vitroでの拡大と充実を説明しています。このようなプロトコルは、最終的には成人の脳のin vivoの設定に、この直接変換方式を変換する念頭に置いて目標に、神経細胞に脳常駐細胞の系譜変換を研究し、潜在的にグリアするin vitro系での実験を提供しています。
技術的な考慮事項
私たちの研究では、男女ともに、19〜70歳の患者からのヒト脳組織を利用した。私たちは、性別や年齢に応じて、7リプログラミング効率の明白な違いに気付かなかった。それにもかかわらず、より多くの微妙な違いは、それにもかかわらずであるとして、この情報を文書化することをお勧めします我々の注意を脱出したことを観察した。
それは、さらに研究室に組織サンプルの転送以下の可能な限り早期に処理を開始することをお勧めします。組織が実験者に転送する前に、手術室に残っている時間の長さには必ずしもいくつかの未知数があるでしょう。我々は、培養過程の開始まで、患者の脳から取り出しまでの時間7我々の研究でサンプルが氷の上にすべての時間を保ちながら、2月6日の間に時間の範囲であったと推定している。その後の処理のしやすさも、いずれか不利な結果には明白な違いは、この時間枠内で認められなかった。
任意のプロトコルのための重要な評価は、そのシンプルさ、再現性、および効率に関係する。本プロトコルは、第1の相の間にそのセルに簡単であるが、2つの転写ファのみを用いた細胞の再プログラミングの第二段階に続いて容易に得ることができる安価な培地で増殖さ定義された培地中のctors培養。
再現性に関して、我々は、レトロウイルス調製物の品質は、しばしば、再プログラミングの障害の原因となる高力価のウイルスの感染性粒子の数と一致するように希釈で用いられる低力価のウイルス調製物を用いて、最も重要であることを観察した。実際、我々は、高力価のウイルスを使用する際に再プログラミングが以前に失敗したのと同じ周皮細胞培養が成功して、INSに変換することができたと指摘した。
変換効率については、我々は継続的なライブイメージングを使用してSOX2とASCL1-同時形質導入細胞由来のβIII-チューブリン陽性細胞の数を評価している。ライブイメージングは、生成されたインの数だけ、実験の終点で決定された場合、そのような情報が不足しているとき、変換処理中に細胞分裂または細胞死を受ける細胞の数を評価することを可能にする。実際、タイムラプスビデオMICROSを使用してコピー（手順については、オルテガのE のTらを参照してください。8）SOX2とASCL1-同時形質導入細胞が急速に細胞周期を出ながら、それは、非形質導入および単一因子形質導入細胞が増殖し続けていることが観察された。また、後者の人口のかなりの割合は、細胞死を受ける。レトロウイルスの毒性が正式に我々の研究7で得られたデータから除外することはできないがASCL1は（単独で、またはSOX2と組み合わせて）を発現させた場合にのみ、細胞死の増加という事実が観察された、我々は、細胞運命の壊滅的な競合のための証拠として解釈。考慮にこれらの2つのイベントを取って、我々はすべてのSOX2とASCL1-同時形質導入細胞の25％がBIII-チューブリン陽性のINS（ 表1）に変換することを推定している。
同時形質導入は、絶対的に成功した再プログラミングに必要とされるように、一方が同じで両方の因子を発現する細胞の量を最適化するために、両方の遺伝子をコードするウイルスベクターを用いて検討すること時間。
最近、Ladewig らは 9シグナリンググリコーゲンシンターゼキナーゼ-3βおよびSMADの小分子ベースの阻害を用いて、200％の収率を得たINSへの線維芽細胞の効率的な変換のためのプロトコルを開発した。それは、我々のプロトコルにこれらのアドオンは、PDIN生産の歩留まりを向上させるかどうかを判断するために興味深いものになる。
リプログラミング過程のライブイメージングのもう一つの興味深い結果は、INSに成人の周皮細胞の変換は、マウス由来4の異なる体細胞の培養において、同様の再プログラミングプロトコルに比べてかなり遅いテンポで発生しているという事実に関係する。これは、人間の神経細胞10の特性の遅い成熟と一致している。
我々は体系的PDIN生産の歩留まりに酸素分圧の影響を分析していないが、我々は指摘することが一般的に低酸素条件（5％）中でのインキュベーション酸素正常状態（21％）で細胞を培養と比較して優れた結果を与えた。最近、ダビラらは、ヒト線維芽細胞からのINS 11の誘導のための低減された酸素張力によって同様の増強効果を記載した。
他の直接変換プロトコルは、誘導性レンチウイルスベクター1、12、13を採用しているが我々のプロトコルは、SOX2及びASCL1のレトロ配信に基づいています。最近になって我々はまた、成功しSox2のとASCL1式の比較的短いパルス（10日）は、周皮細胞への神経細胞の変換を引き起こすのに十分であることを示し、SOX2及びASCL1をコードするドキシサイクリン誘導性レンチウイルスの構造を適用している。我々の研究7で使用されるレトロウイルスは減少が5をサイレンシングするために設計されています。したがって、我々は、レポーター遺伝子発現を欠いニューロンの出現に気付かなかった。しかし、可能性は、その導入遺伝子の両方の全体的な発現レベル時間をかけてSとレポーターの変更は除外することはできません。 （センダイウイルスを用いて）積分フリーのアプローチは、最近誘導性神経前駆体14を生成する場合に用いられているが、現在でも、このまたはウイルスを含まない再プログラミング戦略は成功し、ヒト周皮細胞を変換するために適用できるかどうかは知られていない。最後に、他の組織由来の周皮細胞が誘導された神経細胞型への変換を受けることができるかどうかは、試験されるべきままである。
概念的な検討事項
INSへの体細胞の再プログラミングの重要な成果は、その機能15に関するものである。私たちは、再プログラミング·プロセスの開始を次の様々な時点でPdiNsの電気生理学的特性を評価している。非常に早い段階で、 つまりこの段階で、βIII-チューブリン発現のにもかかわらず、レトロウイルス形質導入後2週間、PdiNs展示電気的興奮のほとんど兆候。のこのようにして、最も電気生理学的解析は、SOX2及びASCL1に形質導入後4〜8週間実施した。 Karow らに記載されているように、高い入力抵抗、活動電位発火の低周波数に反映されるように、PdiNsはかなりの未熟によって特徴付けられる。さらに成熟マウスE14大脳皮質由来の神経細胞との共培養PdiNsによって促進することができる。これらの条件下で、PdiNsは、より高い活動電位の周波数の増加ナトリウム電流7を示す。さらに、共培養は、マウスの神経細胞からの機能的シナプス入力を受け取るようにPdiNsの能力を明らかにする。要するに、PdiNsは、他の神経細胞と共培養する際に向上させることができる機能的な神経細胞の特性を獲得。しかしながら、PdiNsは、機能シナプス前の区画を確立することができるかどうかを示すことが残っている。脳にPdiNsを移植するさらなる研究が完全な成熟と機能性に到達する可能性を明らかにすることが必要である。
U我々は結果PdiNsはGABA作動性ニューロン7の特徴を獲得することに注意初期化因子としてSOX2とASCL1を歌う。面白いことに、他のグループは、途上INSは、グルタミン酸、ドーパミン作動性、コリン作動性の表現型1、16〜18のように明確な神経伝達物質の指定を取得し、その結果、様々な転写因子および/ またはマイクロRNAの組み合わせを使用することによって、INSに線維芽細胞を変換するためのプロトコルを開発した。それは線維芽細胞で使用される要因の組み合わせがPdiNs、同じ送信機識別を誘導するかどうかを試験されていない。さらに、最近の研究は、特定のオリゴデンドロサイト21、22に、神経幹細胞19、20またはグリアを生成する神経新生を超えて変換スペクトルを拡大してきました。これらの再プログラミングプロトコルが成体ヒト脳由来の周皮細胞において同様の結果を引き出す場合、これは大いにこのインポートのアプリケーションのパノラマを広げるであろうANT脳常駐セルタイプ。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、このプロトコルの開発中に、彼女の入力のための博士マグダレナゲッツに感謝しています。我々は寛大にSOX2コード配列を我々に提供するために博士マリウスWernig（スタンフォード大学）に感謝。また、ウイルス産生のための博士アレクサンドラLepierに非常に感謝しています。この作品は、ドイツ学術振興（4182/2-2 BE）とBMBF（01GN1009A）BBに、科学のバイエルン州立省、研究、MKとBBCSへの芸術が二国SYSTHER-から資金提供を受けたの補助金によって支えられてINREMOS仮想研究所（ドイツ語、スロベニア語、連邦教育研究省）およびDFG（SFB 824）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
