Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Published: May 12, 2014 doi: 10.3791/51433

Summary

Målretting hjerne-resident celler for direkte avstamning-omprogrammering gir nye perspektiver for hjernen reparasjon. Her beskriver vi en protokoll for hvordan du kan forberede kulturer beriket for hjerne-resident pericytes fra voksent menneske cerebral cortex og konvertere disse til induserte nevroner av retrovirus-mediert uttrykk for transkripsjonsfaktorene Sox2 og Ascl1.

Abstract

Direkte avstamning-omprogrammering av ikke-nevronale celler til indusert nevroner (INS) kan gi innsikt i de molekylære mekanismene bak neurogenesis og aktivere nye strategier for in vitro modellering eller reparere den syke hjernen. Identifisere hjerne-resident ikke-nevronale celletyper mottagelig for direkte konvertering til ins kan gi rom for å lansere en slik tilnærming i situ, dvs innen skadet hjernevev. Her beskriver vi en protokoll utviklet i forsøket på å identifisere celler avledet fra den voksne menneskehjernen som oppfyller denne forutsetningen. Denne protokoll omfatter: (1) dyrking av humane celler fra den cerebrale cortex erholdt fra voksne humane hjernebiopsi; (2) in vitro-ekspansjon (ca. kreve 2-4 uker) og karakterisering av kulturen ved immunocytokjemi og flowcytometri; (3) anrikning av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) under anvendelse av anti-PDGF-reseptor-β-og anti-CD146 antistoff;(4) retrovirus-mediert transduksjon med nevrogen transkripsjonsfaktorer Sox2 og ascl1; (5) og til slutt karakterisering av de resulterende pericyte-avledet indusert nevroner (PdiNs) etter immunocytokjemi (14 dager til 8 uker etter retroviral transduksjon). På dette stadiet, kan Ins bli analysert for deres elektriske egenskaper av patch-clamp opptak. Denne protokollen gir en svært reproduserbar prosedyre for in vitro avstamning konvertering av hjerne-resident pericytes i funksjonelle menneskelige ins.

Introduction

I motsetning til omprogrammering av somatiske celler i indusert pluripotente stamceller (iPSCs), som i sin tur er utstyrt med en mengde differensiering potensialer, sikter direkte reprogrammering for direkte omdannelse av en spesifikk celletype til en annen. Med hensyn til deres anvendelse i sammenheng med sykdommen modellering og eventuelle celle-baserte terapier, både omprogrammering tilnærminger har spesielle fordeler og ulemper. Omprogrammering inn iPSCs (i) gir en tilnærmet uendelig kilde av celler; (Ii) gir mulighet for genteknologi; (Iii) endows med en nesten ubegrenset differensiering potensial. Imidlertid store ulemper ved iPSCs medføre risiko for tumorgenisitet av udifferensierte celler (teratom dannelse in vivo), og behovet for ex vivo dyrking og påfølgende transplantasjon hvis disse celler skal anvendes for celle-baserte terapier. Omvendt, er direkte lineage-omprogrammering er begrenset av den nedre utbyttet av de ønskede cellenesom korrelerer direkte med antallet av de målrettede celler i utgangs befolkningen, men har den fordel at lineage-omprogrammeres cellene ser ut til å oppvise ingen tumorigen risiko ved transplantasjon 1,2; Videre kan direkte reprogrammering også bli oppnådd in situ, dvs. inne i organet hvor disse celler ville være nødvendig, for derved å unngå behovet for transplantasjon.

Med dette i bakhodet, har vår lab forfulgt muligheten for avstamning-omprogrammere hjernen-resident celler inn ins som en ny tilnærming mot celle-baserte terapier av nevrodegenerative sykdommer. Hjerne-resident celler som kan være potensielt anses som cellulære mål for avstamning-omprogrammering omfatter ulike typer macroglia (astrocytes, NG2 celler og oligodendrocytes), microglia, og microvessel-assosiert celler (endotelceller og pericytes). Vi har grundig studert in vitro omprogrammering potensialet astroglia av cerebral cortex av tidlig postnatal mus 3-5. På jakt etter tilsvarende egnede celle kilder for direkte avstamning-omprogrammering i den voksne menneskehjernen, møtte vi en cellepopulasjon som kan være vellykket omprogrammeres til ins og utstilling kjennetegnene ved pericytes. Her beskriver vi en protokoll for å høste slike celler fra voksne humane hjernebiopsi, for å utvide og berike disse cellene in vitro, og til slutt med hell omprogrammere en vesentlig del av disse in vitro-ekspanderte celler (i området fra 25 til 30%) i INS. Omprogrammering kan oppnås ved samtidig retrovirus-mediert co-uttrykk for to transkripsjonsfaktorer, Sox2 og ascl1. Disse PdiNs ble funnet å tilegne seg evnen av repeterende handling potensial avfyring og å tjene som synaptiske mål for andre nerveceller som indikerer deres evne til å integrere inn i nevrale nettverk. Vår protokollen gir en enkel prosedyre for isolering og avstamning konvertering av voksne menneskelige hjerne pericytes inn ins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Isolering og dyrking av voksent menneske hjerneceller

Forsøk med menneskelig vev skal utføres i samsvar med alle relevante statlige og institusjonelle regler om bruk av humant materiale for forskningsformål. Den nåværende protokollen ble utviklet i samsvar med godkjenning av etisk komité ved det medisinske fakultet ved LMU München og skriftlig informert samtykke fra alle pasienter.

Denne protokollen av forbereder kulturer av menneske voksen cerebral cortex er etablert ved hjelp eksemplar av pasienter av begge kjønn som lider av tinninglappen epilepsi eller andre dyptliggende ikke-traumatiske, non-maligne lesjoner. Den oppnådd fra kirurgisk rommet består utelukkende tilgangskanal til hjernen lesjon og derfor vev er sunt. Aldersspredningen av pasientene var 19-70 år.

  1. Forbered dyrkningsmedium ved tilsetning av varme-inaktivert føtalt kalveserum(FCS) i DMEM høy glukose med Glutamax for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 20% FCS. Tilsett 5 ml penicillin / streptomycin, til totalt 500 ml dyrkningsmedium. Utfør denne og alle påfølgende trinn som krever sterile kultur forhold på en hensiktsmessig laminær hette.
  2. Hold den voksne menneskehjernen biopsi erholdt fra operasjonsrommet i Hanks 'balanserte saltløsning med CaCl 2 og MgCl 2 (HBSS) medium med HEPES (10 mM endelig konsentrasjon) på is inntil behandling. Starte behandlingen så snart som mulig.
  3. For å starte dissosiasjon inn enkeltceller, overføre vev inn i en 65 mm petriskål og hakke i små biter ved hjelp av to sterile engangsskalpeller. For enzymatisk fordøyelse bruke 3-6 ml TrypLE i et 15 ml konisk rør og inkuberes i 15-30 minutter ved 37 ° C i et vannbad.
  4. Tilsett 1 volum av forvarmet vekstmedium for å lette dissosiasjon og Triturer forsiktig oppløsningen inneholdende vev stykker opp og ned ved først å brukeen 5 ml engangspipette, etterfulgt av å bruke et glass Pasteur pipette inntil homogenisering av cellesuspensjonen. Vanligvis er noen gjenværende vev stykker, for det meste består av hvit substans, vil forbli i suspensjon.
  5. Spinn ned ved 157 xg i 5 minutter og resuspender pelleten i passende mengde dyrkningsmedium (10 ml pr ubelagt T75 kulturflaske). Bruk en T75 kultur kolbe for en biopsi av mm diameter i størrelse 5-10 og ekstrapolere fra dette i tilfelle større prøver.
  6. Plasser-celler i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og 5% O2.
  7. Erstatt halvparten av mediet hver 3-4 dager før cellene har nådd konfluens. Dette tar vanligvis opptil to uker (også omtalt som passasje 0 [P0]).

2. In vitro Utvidelse og karakterisering av voksent menneske hjerneceller

  1. In vitro ekspansjon:
    1. Aspirer kulturmediet og vaskes med fosfat-bufret saltvann (PBS) ble holdt ved værelses temperature, før du legger 3 ml TrypLE.
    2. Inkuber ved 37 ° C i 5-10 min inntil det meste av cellene løsnet. Banke forsiktig på flaskene for å lette løfting av cellene; etter tilsetning av 3 volumer vekstmedium, overføres cellene til et 15 ml konisk rør og spinne ned ved 157 xg i 5 minutter og resuspender cellene i passende mengde vekstmedium.
    3. Passasje cellene ved et forhold på 1:03 for optimal ytelse i nye T75 cellekulturflasker.
      Merk: Vi har passaged disse cellene til P5 uten noen tegn til redusert omprogrammering effektivitet. Mens på P0 kulturen inneholder en betydelig andel av endotelceller (som vurdert av CD34 uttrykk), ved påfølgende steg antallet blir ubetydelig.
  2. Karakterisering av voksne menneskelige hjerne kulturer:
    1. Immunocytochemistry:
      1. For karakterisering av celler, frø ~ 60 000 celler på poly-D-lysin-belagt glassdeksel slips i 500 mL frisk vekst medium i 24-brønns vevskulturplater og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO 2 og 5% O2.
      2. For immunocytochemical analyse av dyrkede humane hjerneceller fjern mediet og vask 3 ganger med 1 ml PBS.
      3. Løser cellene ved tilsetning av 500 pl av 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min ved romtemperatur.
      4. Overfør glassplate glir inn i et passende fuktet farging kammeret og blokk med 80 pl PBS inneholdende 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% Triton X-100 i 1 time ved romtemperatur.
      5. Legg primære antistoffer fortynnet i den samme oppløsning (for fortynningsfaktorer se tabell av spesifikke reagenser og utstyr) og inkuberes over natten ved 4 ° C og 1 time ved romtemperatur.
        Merk: En betydelig, men varierende brøkdel av cellene på dette stadiet av dyrking er immunoreactive for platederivert vekstfaktor reseptor β (PDGFRβ), klynge av differensiering 146 (CD146), NG2 chondroitin sulfate proteoglykan, og glatt muskulatur aktin (SMA), dvs. markører karakteristisk for microvessel-assosiert pericytes. Bare et mindretall (<1%) uttrykker astroglial markører glial fibrillary surt protein (GFAP) og S100β. Videre på dette stadiet kulturen skal være blottet for celler som uttrykker neuronal markør SIII-tubulin. Bruk flere primære antistoffkombinasjoner for co-merking av ulike markører. Ytterligere bekreftelse av ekspresjonen av glial, neuronal, endotel-og pericyte markører kan fås ved revers transkripsjon og kvantitativ sanntid polymerase kjedereaksjon (ikke beskrevet i denne protokoll).
      6. Etter inkubasjon med de primære antistoffer vaskes tre ganger med 1 ml PBS og tilsett de tilsvarende sekundære antistoffer (i egnede fortynninger) i fargings løsning og inkuberes i 1 time ved romtemperatur i mørket. Vask cellene 3x med PBS. Hvis det er nødvendig, før montering omfatter farging med DAPI i 5 min ved værelsestemperatur.
      7. Bruk antifading montering medium og analysere dekkglass ved hjelp av en epifluorescence mikroskop eller en konfokalmikroskop.
    2. Flowcytometri:
      1. For analyse av overflaten markør uttrykk ved hjelp av flowcytometri, vokse celler til konfluens i ubestrøket T25 eller T75 cellekulturflasker.
      2. Trekk-celler ved hjelp av TrypLE som beskrevet før, og resuspender i fargings oppløsning bestående av PBS + 0,5% BSA. Per farvereaksjon, resuspender 100,000-200,000 celler i 100 ul av farvestoffoppløsningen. Forbered enkelt beisingsreaksjonene per antistoff som brukes (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, respektive isotype kontroll antistoffer).
      3. Legg fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer til hver farvebehandlingsoppløsning, (for fortynninger se tabell av spesifikke reagenser og utstyr) direkte inn i cellesuspensjonen og inkuberes ved 4 ° C i 30 min i mørket.
      4. Vask cellene tre ganger med 500 mL PBS og spinne ned mellom hvervasketrinn ved 157 x g i 5 min.
      5. Resuspender cellepelleten i 0,5-1 ml farvestoff oppløsning og overføre celler via en celle silen (70 mikrometer) til FACS rør. Beskytt prøven mot eksponering for lys.
      6. Vortex prøver før du legger dem i FACS instrument.
      7. For å analysere de levende cellene og inkluderer rusk og celle aggregater, gate for FSC-A og SSC-A. Cell duplets er spesielt gated ut av FSC-A og FSC-W. For å bestemme de riktige gating betingelser for celleoverflatemarkører satt portene med isotype-matchet antistoff kontroll konjugert til den respektive fluorokrom. Deretter bestemme andelen av antistoff-bundne celler.

Tre. Berikelse for Pericyte-deriverte celler ved fluorescens Aktivert celle sortering

  1. Rens pericyte cellepopulasjon (resuspendert i vekstmedium) før transduksjon via FACS sortering ved hjelp av en 70 mikrometer dyse. Bruk CD34-APC i kombinasjon med CD140b-PE og CD146-FITC å velge for pericytes. Sortering for CD34-negative, CD140b-og CD146-positive celler.
  2. Samle de sorterte cellene i vekstmedium og platen på poly-D-lysin-belagte glassplate glir i 24-brønns vevskulturplater og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO 2 og 5% O2.
  3. 48 h etter sortering erstatte mediet med ferskt vekstmedium og utføre transduksjon som beskrevet i protokoll 4.

4. Retrovirale transduksjon av Pericyte-deriverte celler og Reprogrammering inn Utførte Nerveceller

Merk: Se lokale biosikkerhet retningslinjer ved håndtering retrovirale partikler. I Tyskland bruken av retrovirus som anvendes her krever biosikkerhet nivå 2. For fremstilling av retrovirale partikler referere til protokollen 6.. For retrovirale konstruerer brukes for omprogrammering, se Karow et al. (2012). Retrovirus var pseudotyped med VSV-G (vesikulær stomatitt virus-glycoprotein) 5. For produksjon henvises til Gavrilescu et al seks.

  1. 24 timer forut for retroviral transduksjon frø ~ 60.000 celler bort på poly-D-lysin-belagte glassplate glir i 500 pl friskt vekstmedium i 24-brønns vevskulturplater og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO 2 og 5% O to .
  2. Den neste dag, erstatte vekstmedium med 500 mL frisk, prewarmed vekst medium og tilsett 1 mL av de respektive konsentrerte supernatants inneholder retrovirale partikler (pCAG-IRES-DsRed for kontroll, spesielt under etablering protokollen i laboratoriet), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
  3. En dag senere, fjerne mediet inkludert viruspartikler fra cellene og legge en ml frisk, forvarmet B27-differensiering medium, som består av 49 ml DMEM høy glukose med Glutamax og 1 ml B27 serum-free supplement. Opprettholde cellene i kultur ved 37 ° C i 5% CO 2 og 5% O 2 i 4-8 uker uten å endre medium som gjentatte mellom endringene blir skadelig som ins modne.

5. Karakterisering av Induced nevroner etter Immunocytochemistry

  1. For å bestemme den cellulære identiteten til de transduserte celler, særlig for å demonstrere oppkjøpet av en neuronal fenotype, utføre immunocytochemistry mot nevrale antigener som BIII-tubulin, MAP2, og Neun (for antistoffer og deres respektive fortynninger, se tabell over spesifikke reagenser og utstyr; følge samme prosedyre som angitt i 2.2.1).
  2. For å bedre modning av PdiNs, co-culture disse cellene med nevroner avledet fra E14 mus cerebral cortex. For dette formål, dissekere hjernebarken og distansere vevet mekanisk med en brann-polert glass Pasteur pipette. Legg 10,000-50,000 murine nevroner til kulturer av pericyte-avledet celler 2-3 uker etter transduksjon med Sox2-og ascl1-koding retroviruses og fortsette dyrking. Transduserte celler kan skilles fra murine nevroner ved deres reporter (GFP og DsRed) uttrykk, enten ved levende epifluorescence eller etter immunocytochemistry for GFP og DsRed.
  3. For å vurdere dannelsen av synapser på PdiNs av murine nevroner, utføre immunocytochemistry mot vesikulær nevrotransmitterreseptorer som vesikulært glutamat transporter 1 (vGluT1).
  4. Probe transduserte celler for deres elektriske egenskaper (dvs. evnen til å generere aksjonspotensialer) og etablering av funksjonelle synapser av patch-clamp elektrofysiologi. For detaljer om prosedyren se Heinrich et al. (2011).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første resultat av denne protokollen etter vellykket etablering av en kultur fra en prøve av human voksen hjerne cortex består i identifikasjon av den cellulære sammensetning av kulturen. Immunocytochemistry for celletypespesifikke proteiner som viser en betydelig grad av heterogenitet mellom kulturer avledet fra prøven med forskjellige pasienter (Figur 1a). Som kvantifisert ved strømningscytometri er det alltid en betydelig fraksjon av celler som uttrykker PDGFRβ (i gjennomsnitt ~ 75%, fra 30 til opptil 99%); andre markører av pericytes som CD146, NG2 og CD13 er vanligvis uttrykt i et lavere område (Figur 1B). Likeledes SMA er uttrykt i en mindre undergruppe av de dyrkede celler, som bestemt ved immunocytokjemi (figur 1A). Ved passasje 0 (P0), er det vanligvis <10% av CD34-positive endotelialceller, og under påvisnings deres antall avtar med ytterligere aging. Likeledes, astrocytes utgjør bare en ubetydelig forurensning ved tidligere passeringer. Videre er det vanligvis ingen celler som flekker for nevrale stamceller, nevrale, eller oligodendrocyte markører. Immunocytochemical og flowcytometri data er fullt bekreftet av kvantitativ RT-PCR 7. I sum er den største fraksjonen i kulturen uttrykker proteiner og mRNA karakteristisk for pericytes. En ytterligere anrikning for pericyte-avledede celler kan oppnås ved FACS på dette stadiet. Dette er særlig aktuelt når renheten av kulturen er ved den nedre enden av spekteret som reflekteres av nivået av PDGFRβ ekspresjon. Således har vi benyttet et antistoff mot PDGFRβ (CD140b) alene eller i kombinasjon med et anti-CD146 antistoff, mens unntatt eventuelle CD34-positive forurensninger, til FAC-sorterings spesifikt pericytes (figur 1C).

Transducing disse kulturene med kontroll virus som koder for en reporter gen bare, ikke endrer sin markør uttrykk profile (vurderes 3-4 uker etter transduksjon), noe som indikerer at disse cellene blir værende i pericyte avstamning. Likeledes gjør retrovirus-mediert ekspresjon av Sox2 alene resulterte ikke i noen åpenbare forandringer i morfologi eller induserer BIII-tubulin ekspresjon tyder på at Sox2 alene ikke er tilstrekkelig til å indusere en skjebne konvertering. I motsetning til dette en lav prosentandel (ca. 10%) av celler transduseres med et ascl1-kodende retrovirus alene utstillings SIII-tubulin ekspresjonssystemer, imidlertid uten å skaffe en neuronal morfologi. Påfallende, nesten 50% av alle Sox2-og ascl1-cotransduced cellene vise SIII-tubulin uttrykk og enda viktigere, en tredjedel av disse dobbelt-transduced celler (visualisert av deres dobbelt reporter uttrykk) også vise nevronale prosesser (figur 2). Sammen med oppkjøpet av nevrontrekk, er uttrykk for PDGFRβ nedregulert 7. Med ytterligere modning i kultur, Sox2-og ascl1-coexpressing celler også bli immunoreactive for de mer modne nevrale markører MAP2 (flekker dendrittiske prosesser) og Neun (flekker overveiende nevronale celle organer). Som omtalt under disse endringene i markør uttrykk også korrelerer med oppkjøpet av elektrofysiologiske kjennetegnene til nerveceller. I sum, disse dataene gir bevis for den direkte skjebne konvertering av pericyte-deriverte celler i Ins, referert til som PdiNs. Disse PdiNs besitter kompetanse til å etablere funksjonelle postsynaptiske avdelinger som åpenbart i coculture eksperimenter med nevroner av embryonale mus cerebral cortex. Denne kompetansen kan påvises elektrofysiologisk i utseendet av synaptiske innganger (se omtale nedenfor) samt innredning av dendrittiske prosesser av PdiNs med presynaptiske terminaler avledet fra co-kultiverte nevroner (preget av klynger av vesikulær neurotransmitter transportører, f.eks vGluT1 immunoreaktivitets). Disse dataene videre vise evne PdiNs å integrere i nevronale circuits.

Figur 1
Figur 1. Heterogene uttrykk for pericyte markører i kulturer som stammer fra den voksne menneske cerebral cortex. A) Fluorescent mikrografer illustrerer den heterogene uttrykk for pericyte markører (PDGFRb, SMA, CD146) som åpenbart av immunocytochemistry. Scale bar = 50 mikrometer. B) Histogrammet oppsummerer de relative antall celler positive for de pericyte markører PDGFRβ (CD140b), CD13, og CD146 som bestemmes av flowcytometri av ulike pasient-avledet kulturer. CD34 er en markør for endotelceller. C) FACS prikkplotter skildrer isotype kontroll-og CD146 / CD140b-farget menneskeceller for sortering av de doble-positive pericytes (markert med den røde boksen) for påfølgende omprogrammering. Legg merke til den høye frekvensen av PDGFRβ uttrykk ogheterogeniteten med hensyn til CD146 ekspresjon i denne spesielle kultur.

Fig. 2
. Figur 2 Omprogrammering av voksent menneske pericyte-deriverte celler i Ins Topp:. Eksperimentelle oppsett. Under: Fluorescent mikrografer som viser celler transduced med retrovirus koding Sox2-IRES-GFP og ascl1-IRES-DsRed. Merk at bare dobbelt transduserte celler (pilspisser) uttrykker BIII-tubulin (høyre panel) og viser neuronal morfologi.

celledeling [%] celledød [%] BIII-tubulin + [%]
36 3 0
Sox2 46 7 0
Ascl1 26 33 7
Sox2-Ascl1 3 36 25

Tabell 1. Behavior av pericyte-avledet celler under ombygging til PdiNs som vurderes av kontinuerlig direkte avbildning. Merk at Sox2-og Ascl1 co-uttrykke celler exit cellesyklus. Videre oppmerksom på den høye frekvensen av celledød etter Ascl1 eller Sox2 og Ascl1-coexpression. Tar disse forskjellige cellulære hendelser i betraktning, ca 25% av alle co-transduserte celler blir ins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nåværende protokollen beskriver in vitro utvidelse og berikelse av pericyte-avledet celler følgende isolasjon fra voksent menneske cerebral cortex og senere konvertering til moduler ved retrovirus-mediert uttrykk for nevrogen transkripsjonsfaktorene Sox2 og Ascl1. En slik protokoll gir en eksperimentell in vitro system for å studere avstamning-konvertering av hjerne-bosatt celler i nevroner og potensielt også gliaceller, med målet i tankene til slutt oversette dette direkte konvertering tilnærming til in vivo innstillingen av den voksne hjernen.

Tekniske hensyn

I vår studie benyttet vi menneskelige hjerne vev fra pasienter i alderen mellom 19 og 70 år, fra begge kjønn. Vi fikk ikke se en utilslørt forskjell i omprogrammering effektivitet avhengig av kjønn eller alder 7. Det er likevel anbefalt å dokumentere denne informasjonen som mer subtile forskjeller kan likevel væreobservert at rømt vår oppmerksomhet.

Det er videre anbefalt å starte behandlingen så tidlig som mulig etter overføring av vevsprøve til laboratoriet. Det vil være nødvendigvis noen ukjente for hvor lenge vevet har holdt seg i det kirurgiske rommet før overføring til experimentalist. Vi regner med at i vårt studium 7 tiden mellom fjerning fra pasientens hjerne til starten av dyrkingen fremgangsmåte lå mellom 2-6 timer, og prøvene ble holdt hele tiden på is. Ingen åpenbar forskjell i den enkle påfølgende behandling eller noen negative utfall ble lagt merke til i løpet av dette tidsvinduet.

En kritisk vurdering for enhver protokoll gjelder sin enkelhet, reproduserbarhet, og effektivitet. Denne protokoll er enkel ved at under en første fase celler blir ekspandert i et billig medium som lett kan skaffes, etterfulgt av en andre fase av celle omprogrammering ved hjelp av kun to transkripsjons factors og dyrking i et definert medium.

Når det gjelder reproduserbarhet, observerte vi at kvaliteten på retrovirus preparatet er av største betydning, med lav titer viruspreparater som benyttes ved fortynninger for å passe til antallet av infeksiøse partikler av høy titer virus ofte resulterer i svikt i omprogrammering. Faktisk bemerket vi at den samme pericyte kultur der omprogrammering hadde mislyktes tidligere kunne være vellykket konvertert til moduler ved bruk av høye titer virus.

Angående effektiviteten av konverteringen har vi vurdert antall SIII-tubulin-positive celler avledet fra Sox2-og ascl1-cotransduced celler ved hjelp av kontinuerlig direkte avbildning. Live-bildebehandling åpner for vurdering av antall celler som gjennomgår celledeling eller celledød under konverteringsprosessen, mens slik informasjon mangler når antall generert ins bestemmes bare ved endepunktet av forsøket. Faktisk bruker time-lapse video mikroerkopi (for prosedyren refererer til Ortega e t al. 8) ble det observert at untransduced og enkelt faktor-transduced celler fortsette voksende, mens Sox2-og ascl1-cotransduced celler raskt gå ut av cellesyklus. Videre er en vesentlig fraksjon av den sistnevnte populasjonen gjennomgår celledød. Mens retrovirus toksisitet ikke kan formelt ekskludert fra data innhentet i vår studie 7, ble det faktum at økt celledød kun observert når ascl1 ble uttrykt (alene eller i kombinasjon med Sox2), vi tolke dette som bevis for en katastrofal konflikt av celle skjebner . Tar disse to hendelsene i betraktning, anslår vi at 25% av alle Sox2-og ascl1-cotransduced celler konvertere til BIII-tubulin positive ins (Tabell 1).

Som co-transduksjon er absolutt nødvendig for en vellykket omprogrammering, kan man tenke seg anvendelse av en viral vektor som koder begge gener for å optimalisere mengden av celler som uttrykker begge faktorer samtidigtid.

Nylig, Ladewig et al. Utviklet en protokoll for effektiv konvertering av fibroblaster inn ins skaffe en yield på 200% ved hjelp av små molekyl-baserte hemming av glykogensyntasekinase-3β og SMAD signale ni. Det vil være interessant å finne ut om disse tilleggene til vår protokoll forbedre utbyttet av PdiN produksjon.

Et annet interessant resultat av direkte avbildning av omprogrammering prosessen vedrører det faktum at omdannelsen av voksne humane pericytes inn i moduler finner sted ved en relativt langsom tempo sammenlignet med lignende omprogrammering protokoller i kulturer av forskjellige somatiske celler fra mus opprinnelse 4.. Dette er konsistent med den karakteristiske langsom modning av menneske nevroner 10.

Mens vi ikke har systematisk analysert virkningen av oksygen spenning på utbyttet av PdiN produksjon, vi bemerket at inkubasjon i lavt oksygenforhold (5%) genereltga overlegne resultater sammenlignet med dyrking av cellene i normoksisk betingelser (21%). Nylig davila et al. Beskrevet en lignende forsterkende effekt av redusert oksygenspenning for induksjon av moduler fra humane fibroblaster 11.

Vår protokollen er basert på retroviral levering av Sox2 og ascl1 mens andre direkte konvertering protokoller har ansatt induserbare lentiviral vektorer 1, 12, 13. Mer nylig har vi også med hell brukt doxycycline-induserbar lentiviral konstruksjoner som koder Sox2 og ascl1, noe som indikerer at en relativt kort puls (10 dager) av Sox2 og Ascl1 uttrykk er tilstrekkelig til å forårsake pericyte-til-nevron konvertering. De retrovirus som brukes i vår studie 7 ble designet for redusert stanse fem. Følgelig fikk vi ikke se utseendet av nerveceller blottet for reporter genuttrykk. Imidlertid er muligheten for at den samlede uttrykket nivåer av både transgens og reporter endring over tid kan ikke utelukkes. Integrasjon frie tilnærminger (utnytte Sendai virus) har vært i det siste ansatt i tilfelle av den generasjonen av induserte nevrale stamceller 14, men det er foreløpig ikke kjent om dette eller virus-fri omprogrammering strategier kan med hell brukes til å konvertere menneskelige pericytes. Endelig, om pericytes avledet fra andre vev kan gjennomgå omdannelse til indusert nervecelletyper, gjenstår å bli testet.

Konseptuell Betraktninger

En kritisk utfallet av omprogrammering av somatiske celler i INS gjelder sin funksjonalitet 15. Vi har vurdert de elektrofysiologiske egenskaper PdiNs ved ulike tidspunkt etter utbruddet av omprogrammering prosessen. Ved svært tidlige stadier, dvs. to uker etter retrovirale transduksjon, PdiNs utstillingen knapt tegn til elektrisk oppstemthet, til tross SIII-tubulin uttrykk på dette stadiet. Således er de fleste av deelektrofysiologiske analyser ble gjennomført 4-8 uker etter transduksjon med Sox2 og ascl1. Som beskrevet i Karow et al. Blir PdiNs preget av stor umodenhet som reflekteres av høy inngangsmotstander og en lav frekvens på aksjonspotensial avfyring. Videre modning kan fremmes ved co-dyrking PdiNs med nerveceller som stammer fra mus E14 cerebral cortex. Under disse forholdene, PdiNs har høyere tiltaks potensielle frekvenser og økt natrium strømmer 7. Videre avslører coculturing kompetanse PdiNs å motta funksjonell synaptisk input fra mus nevroner. I sum, PdiNs skaffe funksjonelle nevrale egenskaper som kan bli ytterligere forbedret ved coculturing med andre nerveceller. Imidlertid gjenstår det å bli vist om PdiNs kan også etablere funksjonelle presynaptiske avdelinger. Videre studier transplantere PdiNs inn i hjernen for å avsløre sitt potensial til å nå full modenhet og funksjonalitet.

Usynge Sox2 og ascl1 som omprogrammering faktorer vi bemerket at de resulterende PdiNs skaffe funksjoner i gabaergic nevroner 7. Interessant, har andre grupper utviklet protokoller for å konvertere fibroblaster inn moduler ved hjelp av ulike transkripsjonsfaktor og / eller mikroRNA kombinasjoner med det resultat at utviklings ins ervervet distinkt nevrotransmitter-spesifikasjonen som en glutamatergic, dopaminerge og kolinerge fenotype 1, 16-18. Det gjenstår å bli testet om de faktorkombinasjoner som brukes i fibroblaster indusere samme senderen identitet i PdiNs. I tillegg har senere arbeid utvidet konverteringen spekteret utover neurogenesis å generere nevrale stamceller 19, 20 eller glial, særlig oligodendrocytter 21, 22. Hvis disse omprogrammering protokoller lokke fram en lignende utfall hos voksne menneskelige hjerne pericyte-avledet celler, vil dette i stor grad utvide panorama av anvendelser av denne importenmaur hjerne-resident celletype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Dr. Magdalena Götz for hennes innspill under utviklingen av denne protokollen. Vi takker Dr. Marius Wernig (Stanford University) for sjenerøst å gi oss med Sox2 koding sekvensen. Vi er også svært takknemlige til Dr. Alexandra Lepier for virusproduksjon. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) og BMBF (01GN1009A) til BB, og den bayerske stats Ministry of Sciences, forskning og kunst til MK og BBCS fått støtte fra binational SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (tysk og slovensk Federal Ministries Utdannings-og forskningsdepartementet) og DFG (SFB 824).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD140b-PE BD Biosciences 558821 use 1:100
anti-CD146-FITC AbD Serotec MCA2141FT use 1:100
anti-CD13-FITC AbD Serotec MVA1270A488T use 1:100
anti-CD34-APC BD Biosciences 560940 use 1:100
anti-PDGFRβ Cell Signaling 3169S use 1:200
anti-CD146 Abcam Ab75769 use 1:400
anti-NG2 Millipore AB5320 use 1:400
anti-SMA Sigma-Aldrich A2547 use 1:400
anti-βIII-tubulin Sigma-Aldrich T8660 use 1:400
anti-MAP2 Sigma-Aldrich M4403 use 1:200
anti-GFAP Sigma-Aldrich G3893 use 1:600
anti-GFP Aves Labs GFP 10-20 use 1:1,000
anti-RFP Chromotek 5F8 use 1:500
anti-S100β Sigma-Aldrich S2532 use 1:300
anti-NeuN Millipore MAB377 use 1:200
anti-GABA Sigma-Aldrich A2052 use 1:500
anti-Calretinin Millipore AB5054 use 1:500
anti-vGluT1 SYnaptic SYstems 135511 use 1:1,000
Rat IgG1 isotype control FITC AbD Serotec 11-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control PE AbD Serotec 12-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control APC AbD Serotec 17-4301-81 use 1:100
TrypLE Invitrogen 12605-010
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504044
fetal calf serum Invitrogen 10106-169 perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Invitrogen 24020-091
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Invitrogen 14190
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P0899
PFA (paraformaldehyde) Sigma-Aldrich P1648
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate Sigma-Aldrich 042M4005
Aqua-Poly/Mount Polysciences 18606-20
Polypropylene round-bottom tubes  BD Biosciences 352063
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
24-well plates Orange Scientific 5530305
75 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 658175
25 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 690175
Disposable pipettes 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Glass Pasteur pipettes (150 mm) Fisherbrand FB50251
Glass coverslips 12 mm diameter Menzel CB00120RA1
Surgical disposable scalpels  B. Braun 5518083
Tissue culture dishes  Greiner Bio-One 633180
Conical tubes 15 ml BD Biosciences 352095
Laminar flow hood
Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes Hettich Lab Technology 1406
Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software  BD Biosciences
Humified cell culture incubator Eppendorf Galaxy 170R
Wather bath at 37 °C
FACSFlow sheath fluid  BD Biosciences 342003
Epifluorescence microscope BX61 Olympus
Confocal microscope LSM710 Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).

Tags

Neuroscience pericytes avstamning-omprogrammering indusert nevroner cerebral cortex
Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karow, M., Schichor, C.,More

Karow, M., Schichor, C., Beckervordersandforth, R., Berninger, B. Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons. J. Vis. Exp. (87), e51433, doi:10.3791/51433 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter