Summary
Segmentação células cerebrais residente linhagem-reprogramação direta oferece novas perspectivas de reparação do cérebro. Aqui nós descrevemos um protocolo de como preparar culturas enriquecido para pericitos cerebrais residente do córtex cerebral humano adulto e convertê-las em neurônios induzidos pela expressão mediada por retrovírus de fatores de transcrição Sox2 e Ascl1.
Abstract
Direto linhagem-reprogramação de células não-neuronais em neurônios induzidos (INS) pode fornecer insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a neurogênese e permitir novas estratégias de modelagem in vitro ou a reparar o cérebro doente. Identificar os tipos de células não-neuronais do cérebro residente passíveis de conversão direta em iNs pode permitir o lançamento de uma tal abordagem in situ, ou seja, dentro do tecido cerebral danificado. Aqui, descrevemos um protocolo desenvolvido na tentativa de identificar células derivadas de cérebro humano adulto que cumprir esta premissa. Este protocolo envolve: (1) a cultura de células humanas a partir do córtex cerebral obtido a partir de biópsias de cérebro humano adulto; (2) a expansão in vitro (aproximadamente exigindo 2-4 semanas) e a caracterização da cultura, por imunocitoquímica e citometria de fluxo; (3) o enriquecimento de células activadas por fluorescência (FACS) utilizando anticorpos anti-PDGF receptor β e os anticorpos anti-CD146;(4) a transdução mediada por retrovírus com a transcrição neurogénica factores sox2 e ascl1; (5) e, finalmente, a caracterização dos neurónios resultantes derivados de pericitos induzidas (PdiNs) por imunocitoquímica (14 dias a 8 semanas após a transdução retroviral). Nesta fase, ins podem ser sondado por suas propriedades elétricas por gravação patch-clamp. Este protocolo fornece um procedimento altamente reprodutível para a conversão linhagem in vitro de pericitos cerebrais residente em iNs humanos funcionais.
Introduction
Ao contrário de reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que por sua vez são dotados de uma infinidade de potenciais de diferenciação, reprogramação direta visa a conversão direta de um tipo específico de célula para outra. No que diz respeito à sua aplicação no contexto de modelagem de doenças e terapias baseadas em células potenciais, ambas as abordagens de reprogramação têm vantagens e desvantagens específicas. Reprogramação em iPSCs (i) fornece uma fonte virtualmente infinita de células; (Ii) permite a engenharia genética; (Iii) dota com um potencial de diferenciação quase ilimitada. No entanto, as principais desvantagens de iPSCs implicar o risco de tumorigenicidade das células indiferenciadas (formação de teratoma, in vivo) e a necessidade de cultivo ex vivo e subsequente transplante se estas células são para ser utilizadas para as terapias à base de células. Por outro lado, a linhagem-reprogramação directa é limitada pelo baixo rendimento das células desejadaso que se correlaciona directamente com o número de células alvo a partir da população, mas possui a vantagem de que as células da linhagem reprogramado parecem apresentar qualquer risco tumorigénico mediante transplante 1,2; Além disso, a reprogramação directa pode mesmo ser alcançado in situ, ou seja, dentro do órgão onde seriam necessários estas células, evitando assim a necessidade de transplante.
Com isto em mente, o nosso laboratório tem buscado a possibilidade de células cerebrais residente reprogramação de linhagem em iNs como uma nova abordagem para terapias à base de células de doenças neurodegenerativas. As células do cérebro residente que pode ser potencialmente considerados alvos celulares para linhagem-reprogramação compreendem diferentes tipos de macroglia (astrócitos, células NG2 e oligodendrócitos), microglia e células-associados microvasos (células endoteliais e pericitos). Temos estudado extensivamente o potencial de reprogramação in vitro de astroglia da cor cerebraltex de início de ratos pós-natal 3-5. Em busca de fontes de células semelhante adequados para linhagem-reprogramação direta no cérebro humano adulto, encontramos uma população de células que podem ser reprogramadas com sucesso em ins e marcas de exposição de pericitos. Aqui, descrevemos um protocolo de como a colheita destas células a partir de biópsias de cérebro de seres humanos adultos, para expandir e enriquecer as células, in vitro, e, finalmente, reprogramar com êxito uma fração substancial destas células in vitro expandido (no intervalo de 25-30%) em ins. A reprogramação pode ser alcançado por co-expressão simultânea mediada por retrovírus de dois factores de transcrição, e sox2 ascl1. Estes PdiNs foram encontrados para adquirir a capacidade de ação repetitiva potencial de queima e de servir como alvos sinápticas para outros neurônios, indicando a sua capacidade de integração em redes neurais. Nosso protocolo fornece um procedimento simples para a conversão de isolamento e linhagem de pericitos cerebrais humanas adultas em Ins.
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Protocol
1. Isolamento e cultura de células adultas do cérebro humano
Experimentos envolvendo tecido humano deve ser realizado em conformidade com todas as regulamentações governamentais e institucionais relevantes em relação ao uso de material humano para fins de pesquisa. O presente protocolo foi desenvolvido de acordo com a aprovação do comitê de ética da Faculdade de Medicina da LMU de Munique e consentimento informado por escrito de todos os pacientes.
Este protocolo de preparação de culturas do adulto córtex cerebral humano foi estabelecida utilizando amostras de pacientes de ambos os sexos que sofrem de epilepsia do lobo temporal ou outras lesões profundas não traumáticas, não-malignas. O tecido obtido a partir da sala de cirurgia, composto exclusivamente o canal de acesso à lesão cerebral e, portanto, é considerado saudável. A faixa etária dos pacientes foi de 19-70 anos.
- Preparar o meio de crescimento por adição de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor(FCS) para DMEM de alto teor de glucose com GlutaMAX para obter uma concentração final de 20% de FCS. Adicionar 5 mL de penicilina / estreptomicina a um total de 500 ml de meio de crescimento. Realize esta e todas as etapas subseqüentes que requerem condições de cultura estéreis em uma capela de fluxo laminar adequada.
- Manter a biópsia do cérebro humano adulto obtido a partir da sala de operações, em solução salina equilibrada de Hanks com CaCl 2 e MgCl 2 (HBSS) médio incluindo HEPES (10 mM, concentração final) em gelo, até que o processamento. Iniciar o processamento, logo que possível.
- Para iniciar a dissociação em células individuais, a transferência do tecido para dentro de uma placa de petri de 65 milímetros e mediu-se em pequenos pedaços, utilizando dois bisturis estéreis de uso único. Para a digestão enzimática usar 3-6 ml TrypLE em um tubo de 15 ml e incubar durante 15-30 minutos a 37 ° C em um banho de água.
- Adicionar 1 volume de meio de crescimento pré-aquecido para facilitar a dissociação e tritura-se suavemente a solução contendo pedaços de tecido para cima e para baixo usando primeiro5 uma pipeta descartável ml, seguido usando uma pipeta de Pasteur de vidro, até a homogeneização da suspensão de células. Tipicamente, alguns pedaços de tecido residual, que consistem principalmente de matéria branca, irá permanecer em suspensão.
- Girar a 157 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento na quantidade apropriada de meio de crescimento (10 ml por frasco de cultura T75 não revestido). Use uma garrafa de cultura T75 para uma biópsia de 5-10 mm de diâmetro em tamanho e extrapolar isso no caso de espécimes maiores.
- Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2.
- Substituir metade do meio em cada 3-4 dias até que as células atingiram a confluência. Isso normalmente leva até duas semanas (chamados de passagem 0 [P0]).
2. Expansão in vitro e caracterização de células adultas do cérebro humano
- Em expansão in vitro:
- Aspirar o meio de cultura e lava-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS), mantidas à temperatura temperature, antes de acrescentar 3 ml TrypLE.
- Incubar a 37 ° C, durante 5-10 min, até que a maioria das células independente. Bata levemente os frascos para facilitar o levantamento das células; após a adição de 3 volumes de meio de crescimento, a transferência das células para um tubo de 15 ml e girar a 157 xg durante 5 minutos e voltar a suspender as células na quantidade apropriada de meio de crescimento.
- Passagem das células a uma razão de 1:3 para o rendimento óptimo em novos frascos de cultura de células T75.
Nota: Nós passadas estas células até P5 sem quaisquer sinais de redução da eficiência de reprogramação. Enquanto no P0 a cultura contém uma fracção considerável de células endoteliais (como avaliado por expressão de CD34), em passagens subsequentes o seu número torna-se insignificante.
- Caracterização de culturas de cérebro de seres humanos adultos:
- Imunocitoquímica:
- Para caracterização das células, sementes ~ 60.000 células em poli D-revestido-lisina-tampa de vidro desliza em 500 mL fresco mediu o crescimentom em placas de 24 cavidades de cultura de tecidos e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2.
- Para análise imunocitoquímica das células cerebrais humanas cultivadas remover o meio e lava-3x com 1 ml de PBS.
- Fixar as células por adição de 500 uL de paraformaldeído a 4% em PBS durante 15 min à temperatura ambiente.
- Transferir a tampa de vidro desliza numa câmara humidificada a coloração adequada e bloquear com 80 ul de PBS contendo 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Adicionar anticorpos primários diluídos na mesma solução para os factores de diluição (ver tabela de reagentes e equipamentos específicos) e incubar durante a noite a 4 ° C ou 1 hora a temperatura ambiente.
Nota: Uma fração substancial mas variando de células na sua fase de cultivo são imunorreactivos para crescimento β receptor do factor derivado das plaquetas (PDGFRβ), aglomerado de diferenciação 146 (CD146), NG2 sulfato de condroitina proteoglicanos e actina de músculo liso (SMA), ou seja, marcadores característicos de pericitos associados-microvasos. Apenas uma minoria (<1%) expressam os marcadores astrogliais proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e S100β. Além disso, nesta fase, a cultura deve ser desprovida de quaisquer células que expressam o marcador neuronal βIII-tubulina. Use várias combinações de anticorpos primário para co-rotulagem de marcadores diferentes. Outra confirmação da expressão de marcadores gliais, neuronais, endoteliais e pericitos pode ser obtido por transcrição reversa e em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (não descritas neste protocolo). - Após a incubação com os anticorpos primários lavar três vezes com 1 ml de PBS e adicionar os anticorpos secundários correspondentes (em diluições apropriadas) para a solução de coloração e incubar 1 hora à temperatura ambiente no escuro. Lave as células 3x com PBS. Se necessário, antes da montagem incluir a coloração com DAPI, durante 5 min a salatemperatura.
- Use antifading meio de montagem e analisar as lamínulas usando um microscópio de epifluorescência ou um microscópio confocal.
- Citometria de fluxo:
- Para análise de expressão do marcador de superfície utilizando citometria de fluxo, as células crescer até à confluência em T25 T75 não revestidos ou frascos de cultura de células.
- Separar as células usando TrypLE como descrito antes e ressuspender em solução de coloração que consiste em PBS + BSA a 0,5%. Por reacção de coloração, ressuspender 100.000-200.000 células em 100 ul de solução de coloração. Prepare reações de coloração individuais por anticorpo utilizado (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, os anticorpos isotipo controle respectivas).
- Adicionar anticorpos fluorocromo-conjugados com cada solução de coloração (por diluições ver tabela de reagentes e equipamentos específicos) directamente para a suspensão de células e incubar a 4 ° C durante 30 minutos no escuro.
- Lave as células três vezes com 500 mL PBS e girar entre cadapasso de lavagem a 157 g durante 5 min.
- Ressuspender o sedimento celular em 0,5-1 ml de solução de coloração e de transferência de células através de um coador de células (70 mM) para tubos FACS. Proteger a amostra da exposição à luz.
- Amostras Vortex antes de colocá-los no instrumento FACS.
- Para analisar as células vivas e excluir detritos celulares e agregados, portão para FSC-A e SSC-A. Dupletos celulares são especificamente fechado pelo FSC-A e FSC-W. Para determinar as condições de propagação certas para os marcadores de superfície celular estabelecidos os portões com controle de anticorpo de isotipo conjugado com o respectivo fluorocromo. Em seguida, determinar a proporção de células ligadas a anticorpos.
- Imunocitoquímica:
3. Enriquecimento de células pericyte derivados por fluorescência celular ativado Classificando
- Purifica-se a população de células pericitos (ressuspensas em meio de crescimento), antes de transdução através de separação FACS usando um bico de 70 um. Use CD34-APC, em combinação com o CD140b-PE e CD146-FITC selecionar para pericitos. Classificar por, células-CD140b e CD146-CD34 positivo-negativo.
- Recolher as células seleccionadas em meio de crescimento e placa sobre poli-D-lisina-revestidas tampa de vidro desliza em placas de cultura de tecidos de 24 poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2.
- 48 h após triagem substituir o meio com meio de crescimento fresco e realizar a transdução, conforme descrito no Protocolo no 4.
4. Retroviral transdução de células pericyte derivados e Reprogramação em neurônios induzidos
Nota: Consulte as diretrizes de biossegurança locais ao manipular partículas retrovirais. Na Alemanha, o uso dos retrovírus empregadas aqui requerem nível de biossegurança 2. Para a produção de partículas retrovirais consulte protocolo 6. Para construções retrovirais utilizados para a reprogramação, referem-se a Karow et al. (2012). Os retrovírus foram pseudotipados com VSV-G (vírus da estomatite vesicular-glicoproteína) 5. Para a produção consulte Gavrilescu et al 6.
- 24 h antes da semente de transdução retroviral ~ 60.000 células nas poli-D-lisina-revestidas tampa de vidro desliza em 500 ul de meio de crescimento fresco, em placas de 24 poços de cultura de tecidos e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 e 5% de O2 .
- No dia seguinte, substituir o meio de crescimento com 500 mL fresco, meio de crescimento pré-aquecido e adicionar 1 ml dos respectivos sobrenadantes concentrados contendo partículas retrovirais (pCAG-IRES-DsRed para o controle, especialmente durante o estabelecimento do protocolo no laboratório), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-sox2-IRES-GFP.
- Um dia mais tarde, remover o meio, incluindo as partículas virais a partir das células e adicionar 1 ml de fresco, pré-aquecido de meio B27-diferenciação, composta por 49 ml de DMEM com alto teor de glucose GlutaMAX e 1 ml de suplemento de B27 isento de soro. Manter as células em cultura a 37 ° C em 5% De CO2 e 5% de O 2 durante 4-8 semanas, sem alterar o meio como as mudanças de meio repetitivas tornar prejudiciais como iNs amadurecer.
5. Caracterização de neurónios induzida por imunocitoquímica
- Para determinar a identidade celular das células transduzidas, em particular, para demonstrar a aquisição do fenótipo neuronal, realizar imunocitoquímica contra antigénios neuronais, tais como BIII-tubulina, MAP2, e NeuN (para os anticorpos e as respectivas diluições, ver tabela de reagentes específicos e Equipamento; seguem o mesmo procedimento como indicado em 2.2.1).
- Para melhorar a maturação de PdiNs, co-cultura destas células com os neurônios derivados de E14 rato córtex cerebral. Para este fim, dissecar o córtex cerebral e dissociar o tecido mecanicamente com uma pipeta Pasteur de vidro polido ao fogo. Adicionar 10,000-50,000 neurónios murino para as culturas de células derivadas de pericitos 2-3 semanas a seguir a transdução com SOX2 e ascl1 codificam retroviruses e continuar cultivo. As células transduzidas podem ser distinguidas a partir de neurónios de murino por sua repórter (GFP e dsRed) expressão, quer por epifluorescência vivo ou após a imunocitoquímica para GFP e dsRed.
- Para avaliar a formação de sinapses para PdiNs por neurônios murino, realizar imunocitoquímica contra receptores de neurotransmissores vesiculares, como glutamato vesicular transportador 1 (VGLUT1).
- Sonda células transduzidas para suas propriedades elétricas (ou seja, a capacidade de gerar potenciais de ação) eo estabelecimento de sinapses funcionais por patch-clamp eletrofisiologia. Para mais informações sobre o procedimento de ver Heinrich et al. (2011).
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Representative Results
O primeiro resultado deste protocolo após o estabelecimento com sucesso de uma cultura a partir de um espécime de adulto humano córtex cerebral consiste na identificação da composição da cultura celular. Imunocitoquímica para as proteínas específicas do tipo de célula, revela um elevado grau de heterogeneidade entre as culturas derivadas de uma amostra de pacientes diferentes (Figura 1A). Quantificada por citometria de fluxo, há sempre uma fracção substancial de células que expressam PDGFRβ (em média ~ 75%, variando de 30 a até 99%); outros marcadores de pericitos, tais como CD146, NG2 e CD13 são tipicamente expressos em uma gama mais baixa (Figura 1B). Da mesma forma SMA é expresso numa sub-população pequena de células em cultura, tal como determinado por imunocitoquímica (Figura 1A). Na passagem 0 (P0), há geralmente <10% de células endoteliais CD34-positivo, e o seu número diminui abaixo de detecção com mais passaging. Da mesma forma, astrocytes compreendem apenas uma contaminação insignificante em passagens anteriores. Além disso, geralmente, não há células que se coram de célula neural caule, neuronal, ou marcadores de oligodendrócitos. Imunocitoquímica e citometria de fluxo de dados são totalmente confirmada por RT-PCR quantitativo 7. Em suma, a maior fracção no interior da cultura expressa proteínas e os mRNAs característica de pericitos. Um posterior enriquecimento de células derivadas de pericitos pode ser conseguida por FACS nesta fase. Isto é particularmente relevante quando a pureza da cultura é, na extremidade inferior do espectro tal como reflectido pelo nível de expressão PDGFRβ. Assim, temos utilizado um anticorpo contra PDGFRβ (CD140b) sozinho ou em combinação com um anticorpo anti-CD146, enquanto excluindo quaisquer contaminantes CD34 positivas, para FAC-ordenação especificamente pericitos (Figura 1C).
Transdução destas culturas com os vírus de controlo que codificam apenas um gene repórter, não alteram o seu marcador de expressão profile (avaliado 3-4 semanas após a transdução), indicando que estas células permanecem na linhagem pericitos. Da mesma forma, a expressão mediada por retrovírus de Sox2 sozinho não resultar em quaisquer alterações evidentes na morfologia nem induz a expressão BIII-tubulina sugerindo que sozinho Sox2 não é suficiente para induzir a conversão destino. Em contraste, uma percentagem baixa (aproximadamente 10%) das células transduzidas com um retrovírus que codifica ascl1 sozinho exibem expressão βIII-tubulina, no entanto, sem adquirir uma morfologia neuronal. Surpreendentemente, quase 50% de todos os e-SOX2 células cotransduced-ascl1 mostrar expressão βIII-tubulina e ainda mais importante, um terço dessas células duplo-transduzidas (visualizadas pela sua expressão dupla repórter) também exibem processos neuronais (Figura 2). Juntamente com a aquisição de características neuronais, expressão de PDGFRβ é regulada para baixo 7. Com mais maturação na cultura, e-SOX2 células co-expressam ascl1 também tornar-se immunoreactive para os marcadores neuronais mais maduros MAP2 (coloração processos dendríticos) e NeuN (coloração corpos celulares predominantemente neuronais). Como se verá adiante essas mudanças na expressão do marcador também se correlacionam com a aquisição de marcas eletrofisiológicas de neurônios. Em suma, estes dados fornecem evidência para a conversão directa destino de células derivadas de pericitos em Ins, referido como PdiNs. Estes PdiNs possuem competência para estabelecer compartimentos funcionais pós-sinápticos, como revelado em experiências co-cultura com neurônios do córtex cerebral do rato embrionárias. Esta capacidade pode ser demonstrada electrofisiologicamente na aparência das entradas sinápticos (ver discussão abaixo), bem como a decoração dos processos dendríticos de PdiNs com terminais pré-sinápticos derivados de neurónios co-cultivadas (caracterizadas por conjuntos de transportadores de neurotransmissores, por exemplo vesiculares VGLUT1 imunorreactividade). Estes dados indicam ainda mais a capacidade de PdiNs para integrar neuronal circuits.
Figura 1. Expressão heterogénea de marcadores pericyte em culturas derivadas do córtex cerebral humano adulto. A) micrografias fluorescentes que ilustram a expressão heterogênea de marcadores pericyte (PDGFRB, SMA, CD146), como revelado por imunocitoquímica. Escala da barra = 50 m. B) O histograma resume os números relativos de células positivas para os marcadores pericyte PDGFRβ (CD140b), CD13, CD146 e tal como determinado por citometria de fluxo de diferentes culturas derivadas de pacientes. CD34 é um marcador de células endoteliais. Parcelas C) FACS ponto retratando células humanas CD146 / CD140b corados isotipo controle e para a classificação dos pericitos duplo-positivo (com destaque para a caixa vermelha) para a reprogramação subseqüente. Note-se a alta taxa de expressão e PDGFRβa heterogeneidade no que diz respeito à expressão de CD146 nesta cultura particular.
. Figura 2 Reprogramação de células derivadas de pericyte humanos adultos em iNs Top:. Experimental set-up. Abaixo: micrografias fluorescentes retratando células transduzidas com codificação retrovírus sox2-IRES-GFP e ascl1-IRES-DsRed. Note-se que apenas as células transduzidas duplo (setas) expressam BIII-tubulina (painel direito) e exibem morfologia neuronal.
| divisão celular [%] | morte celular [%] | BIII-tubulina + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Tabela 1. Comportamento de células derivadas de pericitos submetidos a conversão em PdiNs conforme avaliado por imagens ao vivo contínua. Note que Sox2-Ascl1 e co-expressando ciclo de células das células de saída. Além disso, observe a elevada taxa de morte celular após Ascl1 ou Sox2 e Ascl1-co-expressão. Tendo em conta estes eventos celulares distintas, aproximadamente 25% de todas as células co-transduzidas tornar ins.
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Discussion
O presente protocolo descreve a expansão in vitro e de enriquecimento de células derivadas de pericitos após isolamento a partir do córtex cerebral humano adulto e a posterior conversão em iNs por expressão mediada por retrovirus da transcrição neurogénica factores Sox2 e Ascl1. Tal proporciona um protocolo experimental de sistema in vitro para estudar a linhagem de conversão das células cerebrais residente em neurónios e células gliais, também, potencialmente, com o objectivo em mente que em última análise a traduzir essa abordagem conversão directa para o ambiente in vivo no cérebro de adulto.
Considerações Técnicas
Em nosso estudo utilizamos tecido de cérebro humano de pacientes com idade entre 19 e 70 anos, de ambos os sexos. Nós não notar uma diferença evidente na eficiência de reprogramação em função do sexo ou 7 anos de idade. É, no entanto, recomenda-se a documentar essas informações como as diferenças mais sutis podem, contudo, serobservaram que escapou nossa atenção.
Além disso, recomenda-se iniciar o processamento, o mais cedo possível após a transferência da amostra de tecido para o laboratório. Haverá necessariamente algumas incógnitas por quanto tempo o tecido permaneceu na sala cirúrgica antes da transferência para o experimentalista. Nós estimamos que no nosso estudo 7 o tempo entre a remoção do cérebro do paciente para o início do processo de cultura variou entre 2-6 h, com as amostras sendo mantido toda a hora em gelo. Nenhuma diferença evidente na facilidade de processamento posterior, nem qualquer resultado adverso foi notado dentro desta janela de tempo.
A avaliação crítica para qualquer protocolo diz respeito a sua simplicidade, reprodutibilidade e eficiência. O presente protocolo é simples, em que, durante uma primeira fase de células são expandidos em meio de baixo custo que pode ser facilmente obtida, seguido por uma segunda fase de reprogramação das células utilizando apenas duas fa transcriçãoctors e cultura em meio definido.
Quanto à reprodutibilidade, observou-se que a qualidade da preparação retrovírus é de extrema importância, com os preparativos baixos vírus título usado em diluições para coincidir com o número de partículas infecciosas de vírus de alto título, muitas vezes resultando em falha da reprogramação. De fato, observamos que a mesma cultura pericyte em que a reprogramação tinha falhado anteriormente poderiam ser convertidos com êxito em iNs ao utilizar vírus alto título.
Com relação à eficiência de conversão, avaliamos o número de células βIII-tubulina positivas derivadas de células-e SOX2 cotransduced-ascl1 usando imagens ao vivo contínua. Imagiologia vivo permite a avaliação do número de células que sofrem divisão celular ou a morte celular durante o processo de conversão, ao passo que tal informação é inexistente, quando o número de iNs gerado é determinado apenas no ponto final da experiência. Na verdade usando micros de vídeo time-lapsecópia (para o procedimento de se referir a Ortega e t al. 8), observou-se que as células transduzidas de fator não transduzidas e individuais continuam a proliferar, enquanto-e SOX2 células cotransduced-ascl1 sair rapidamente do ciclo celular. Além disso, uma fração significativa da população sofre segunda morte celular. Enquanto a toxicidade retrovírus não pode ser formalmente excluída a partir dos dados obtidos no nosso estudo 7, o facto de que o aumento da morte celular foi observada apenas quando ascl1 foi expressa (sozinho ou em combinação com sox2), que interpreta isso como uma evidência para um conflito catastrófica de destinos celulares . Tomando estes dois eventos em consideração, estima-se que 25% de todos e-SOX2 células cotransduced-ascl1 converter em iNs positivos BIII-tubulina (Tabela 1).
Como co-transdução é absolutamente necessária para a reprogramação, pode-se considerar que emprega um vector que codifica ambos os genes virais para optimizar a quantidade de células que expressam ambos os factores ao mesmotempo.
Recentemente, Ladewig et al. Desenvolvido um protocolo para a conversão eficiente dos fibroblastos em iNs obtenção de um rendimento de 200%, utilizando pequena inibição à base de molécula de glicogénio-sintase-quinase-3β e sinalização SMAD 9. Será interessante para determinar se estes add-ons para o nosso protocolo de melhorar o rendimento da produção PdiN.
Outro resultado interessante da imagem ao vivo do processo de reprogramação diz respeito ao facto de que a conversão de pericitos humanos adultos em iNs ocorre a um ritmo bastante lento comparado com os protocolos de reprogramação semelhantes em culturas de diferentes células somáticas de origem do rato 4. Isto é consistente com a maturação lenta característica de neurónios humanos 10.
Embora não tenhamos analisado sistematicamente o impacto da tensão de oxigênio no rendimento da produção PdiN, observamos que a incubação em condições de oxigênio baixos (5%) em geraldeu resultados superiores quando comparada com a cultura das células em condições de normóxia (21%). Recentemente, Davila et al. Descrito um efeito de reforço semelhante por tensão reduzida de oxigénio para a indução de iNs a partir de fibroblastos humanos 11.
Nosso protocolo é baseado na entrega retroviral de sox2 e ascl1 enquanto outros protocolos directos de conversão empregaram vetores induzíveis lentivirais 1, 12, 13. Mais recentemente, também foram aplicados com sucesso construções lentivirais doxiciclina indutível que codificam sox2 e ascl1, indicando que um impulso relativamente curto (10 dias) de Sox2 e Ascl1 expressão é suficiente para provocar a conversão pericyte para neurónio. Os retrovírus usados em nosso estudo 7 foram projetados para reduzir silenciando 5. Assim, não notamos o surgimento de neurônios desprovidas de expressão do gene repórter. No entanto, a possibilidade de que os níveis de expressão global de ambos os transgeness e repórter as alterações ao longo do tempo não pode ser excluída. Abordagens livre de Integração (utilizando vírus Sendai) foram recentemente empregados no caso da geração de progenitores neurais induzidas 14, mas atualmente não se sabe se este ou estratégias de reprogramação mesmo livre de vírus pode ser aplicado com sucesso em converter pericitos humanos. Finalmente, se os pericitos derivados de outros tecidos podem sofrer conversão em tipos de células neuronais induzidas continua a ser testado.
Considerações conceituais
Um resultado fundamental da reprogramação de células somáticas em iNs diz respeito à sua funcionalidade 15. Nós avaliamos as propriedades eletrofisiológicas de PdiNs em diferentes momentos após o início do processo de reprogramação. Na fase inicial, ou seja, 2 semanas após a transdução retroviral, PdiNs apresentam mal sinais de excitabilidade elétrica, apesar de expressão βIII-tubulina nesta fase. Assim, a maior parte doanálises eletrofisiológicas foram realizadas 4-8 semanas após transdução com sox2 e ascl1. Conforme descrito na Karow et al., PdiNs são caracterizados por imaturidade considerável como refletido por resistências elevadas de entrada e uma baixa freqüência de potencial de ação. Além disso a maturação pode ser promovida por PdiNs co-cultura com os neurónios derivados do rato E14 córtex cerebral. Sob essas condições, PdiNs apresentam maiores freqüências potenciais de ação e as correntes de sódio aumentou 7. Além disso, coculturing revela a competência do PdiNs para receber entrada sináptica funcional dos neurônios de rato. Em suma, PdiNs adquirir propriedades neuronais funcionais que pode ser reforçada mediante coculturing com outros neurônios. No entanto, ele continua a ser mostrado se PdiNs também pode estabelecer compartimentos pré-sinápticas funcionais. Mais estudos transplante PdiNs no cérebro são necessários para revelar o seu potencial para atingir a plena maturidade e funcionalidade.
Ucantar sox2 e ascl1 como fatores de reprogramação observamos que a PdiNs resultantes adquirir características de neurônios GABAérgicos 7. Interessantemente, outros grupos têm desenvolvido protocolos para converter os fibroblastos para iNs usando factor de transcrição diferente e / ou combinações de microRNA com o resultado que o desenvolvimento iNs adquirida especificação neurotransmissor distinta, tal como um glutamatérgico, dopaminérgico, e fenótipo colinérgico 1, 16-18. Mantém-se a ser testado se as combinações de factores utilizados em fibroblastos induzir a mesma identidade no transmissor PdiNs. Além disso, o trabalho recente ampliou o espectro de conversão para além neurogênese para gerar células-tronco neurais 19, 20 ou glia, em especial os oligodendrócitos 21, 22. Se esses protocolos reprogramação obter um resultado similar em células derivadas de pericyte cérebro humano adulto, isso aumentaria muito o panorama de aplicações deste importaçãotipo de célula do cérebro residente formiga.
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Disclosures
Autores têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos ao Dr. Magdalena Götz para ela de entrada durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos ao Dr. Marius Wernig (Universidade de Stanford) para generosamente nos fornecer a sequência codificante sox2. Estamos também muito gratos ao Dr. Alexandra Lepier para a produção de vírus. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) eo BMBF (01GN1009A) para BB, eo Estado Ministério de Ciências da Baviera, Investigação e das Artes para MK e BBCS recebeu financiamento da binacional SYSTHER- Instituto Virtual INREMOS (Ministérios Federal alemão e esloveno de Educação e Pesquisa) e da DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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