Summary
Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar.
Abstract
Uyarılan nöronların (INS) içine non-nöronal hücrelerin doğrudan soy-yeniden programlama nörogenezi altında yatan moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak ve in vitro modelleme veya hastalıklı beyin tamiri için yeni stratejiler etkinleştirebilirsiniz. Ins içine doğrudan dönüşüm için müsait belirlenmesi beyin-yerleşik olmayan nöronal hücre tipleri hasarlı beyin dokusu içinde, yani yerinde böyle bir yaklaşımı başlatılması için izin verebilir. İşte bu öncül yerine yetişkin insan beyninden türetilen hücrelerin teşhis etmek için bir girişimde gelişmiş bir protokol açıklar. Bu protokol şunları içerir:, yetişkin insan beyin biyopsileri elde serebral korteks, insan hücreleri (1) kültürlenmesini; (2) in vitro (yaklaşık 2-4 hafta gerektiren) genleşme ve immunositokimya ile kültür karakterizasyonu ve akış sitometrisi; (3) anti-PDGF reseptörü β-ve anti-CD146 antikorları kullanılarak (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile zenginleştirme;(4), nörojenik transkripsiyonuna retrovirüs aracılı iletim ve Sox2 ascl1 faktörleri; (5) ve son olarak, bağışıklık kimyası edilen perisit türetilmiş kaynaklı nöron (PdiNs) 'nin karakterizasyonu (8 hafta için 14 gün retroviral iletimini sonra). Bu aşamada, ins yama kelepçe kayıt kendi elektriksel özellikleri için tanınacak. Bu protokol, fonksiyonel insan ins içine beyin yerleşik perisitler in vitro soy dönüşüm için son derece tekrarlanabilir prosedürü sağlar.
Introduction
Da farklılaşma potansiyel bir bolluk ile donatılmış bulunmaktadır uyarılmış pluripotent kök hücreleri içine somatik hücreler (iPSCs), yeniden programlamayı aksine, doğrudan yeniden programlama başka içine belirli bir hücre tipi düz dönüşüm için amaçlanmıştır. Hastalık modelleme ve potansiyel hücre bazlı terapiler bağlamında kendi uygulama ile ilgili olarak, her ikisi de yeniden programlama yaklaşımlar belirli avantajları ve dezavantajları vardır. IPSCs (i) yeniden programlama hücrelerin neredeyse sonsuz bir kaynak içerir; (Ii) genetik mühendisliği için izin verir; (Iii) a, neredeyse sınırsız farklılaşma potansiyele sahip endows. Bu hücreler, hücre bazlı terapiler için kullanılacak olan, ancak, iPSCs önemli dezavantajları farklılaşmamış hücreleri (in vivo teratoma formasyonu) tümöre neden olması ve ex vivo yetiştirme ve müteakip transplantasyon için ihtiyaç risk taşımaktadır. Buna karşılık, direkt soy yeniden programlama arzu edilen hücrelerin düşük verim tarafından kısıtlanırBaşlangıç nüfusun hedef hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişkili, ancak soy programlanabilir hücre nakli 1,2 üzerinde herhangi bir tümör oluşturucu bir risk sergilemek için görünür avantajına sahiptir ki; ayrıca, doğrudan yeniden programlama da örneğin, bu hücrelerin bu şekilde nakli ihtiyacını ortadan kaldırmak, gerekli olacaktır organ içinde, in situ sağlanabilir.
Bu düşünceyle, bizim laboratuvar nörodejeneratif hastalıkların hücre bazlı terapiler yönelik yeni bir yaklaşım olarak ins içine soy-yeniden programlanması beyin yerleşik hücrelerinin olasılığını izlemiştir. Potansiyel olarak soy tekrar programlanması için, hücresel hedefler olarak kabul edilebilir Brain yerleşik hücreler farklı macroglia türleri (astrositler, NG2 hücreleri ve oligodendrosit), mikroglia ve mikrovasküler ilişkili hücrelerin (endotelyal hücreler ve perisitler) içerir. Biz kapsamlı serebral kor astroglial in vitro yeniden programlama potansiyel inceledikErken doğum sonrası farelerin 3-5, tex. Yetişkin insan beyninde doğrudan soy-yeniden programlama için benzer uygun hücre kaynakları arayışı içinde, başarıyla INS ve perisitlerin sergi işaretlerinden içine programlanabilir bir hücre popülasyonu karşılaştı. Burada genişletmek ve in vitro olarak bu hücreleri zenginleştirmek ve son olarak da başarılı bir şekilde içine (% 25-30 aralığında), bu in vitro genişletilmiş hücreleri önemli bir kısmını yeniden programlamak için, yetişkin insan beyni biyopsilerinden bu hücrelerin hasat için nasıl bir protokol açıklar INS. Tekrar-iki transkripsiyon faktörleri, Sox2 ve ascl1 eşzamanlı retrovirüs aracılı ko-ifade ile elde edilebilir. Bu PdiNs tekrarlayan aksiyon potansiyeli ateşleme yeteneğini kazanmak ve sinir ağları içine entegre kabiliyetlerini gösteren diğer nöronlar gibi sinaptik hedeflere hizmet bulundu. Bizim protokol ins içine yetişkin insan beyni perisitler izolasyon ve soy dönüşüm için basit bir prosedürü sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. İzolasyon ve Yetişkin İnsan Beyin Hücrelerinin ekimi
Insan dokusu ile ilgili deneyler araştırma amacıyla insan malzeme kullanımı ilgili tüm devlet ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. Mevcut protokol LMU Münih Tıp Fakültesi etik kurulu ve tüm hastalardan yazılı onam tarafından onayı doğrultusunda geliştirilmiştir.
Insan yetişkin beyin korteks hazırlanması kültürlerinin Bu protokol, temporal lob epilepsi ya da diğer derin non-travmatik, habis olmayan lezyonlardan muzdarip her iki cinsten hasta örneği kullanılarak kurulmuştur. Bu nedenle beyin lezyona erişim kanalı özel olarak oluşan cerrahi odadan elde edilen ve doku sağlıklı kabul edilir. Hastaların yaş aralığı 19-70 yıl idi.
- Isı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu büyütme ortamı ekleyerek hazırlamakGlutamax DMEM yüksek glikoz (FCS)% 20 FCS bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. 500 ml büyüme ortamı, toplam 5 ml penisilin / streptomisin ekleyin. Bu ve uygun bir laminer akış kaputu steril kültür koşulları gerektiren sonraki tüm adımları uygulayın.
- CaCI2 ve işleme kadar buz üzerinde HEPES (10 mM nihai konsantrasyon) de dahil olmak üzere MgCl2 (HBSS) ortamı ile Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde cerrahi odadan elde edilen yetişkin insan beyin biyopsisi tutun. Kısa sürede işleme başlayın.
- 65 mm petri içine doku transferi ve iki steril tek kullanımlık neşter kullanarak küçük parçalar halinde kıyma, tek hücre içine ayrışma başlatmak için. Enzimatik sindirme için, 15 ml konik bir tüp içinde 3-6 ml TrypLE kullanımı ve bir su banyosu içerisinde 37 ° C'de 15-30 dakika inkübe edilir.
- Ayrışmasını kolaylaştırmak için önceden ısıtılmış büyüme ortamı 1 hacim ekleyin ve hafifçe ilk kullanarak yukarı ve aşağı doku parçaları içeren çözüm çiğnemekHücre süspansiyonunun homojen olana dek, bir cam Pasteur pipet kullanılarak ve ardından, 5 ml kullanılıp atılabilir pipet. Tipik olarak, çoğunlukla beyaz madde aşağıdakilerden oluşan bir miktar doku parçaları, süspansiyon içinde kalır.
- 5 dakika boyunca 157 x g Spin ve büyüme ortamı içinde uygun miktarda (kaplanmamış T75 kültür şişesi başına 10 mL) 'de pelletini. Büyüklüğü 5-10 mm çaplı bir biyopsi için, bir T75 kültür şişesi kullanın ve daha büyük örneklerin durumunda, bu çıkarım.
- % 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C inkübatör içine hücreleri yerleştirin.
- Hücreler birleşik hale gelmiş kadar her 3-4 günde bir ortamın yarısı değiştirin. Bu genellikle (pasaj 0 [P0] olarak da adlandırılır), iki haftaya kadar sürer.
Yetişkin İnsan Beyin Hücreleri 2.. In vitro Genişleme ve Karakterizasyonu
- In vitro genişlemesi:
- Kültür ortamı aspire ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkamak, oda t tutulduemperature, 3 mi TrypLE eklemeden önce.
- Hücrelerin en müstakil kadar 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Yavaşça hücrelerin kaldırma kolaylaştırmak için şişeler dokunun; büyüme ortamının 3 hacimleri ilave edildikten sonra, 15 ml konik bir tüp içine aktarmak ve hücreler, 5 dakika boyunca 157 x g hızında aşağı spin ve büyüme ortamının uygun miktarda hücreler tekrar süspansiyon haline getirin.
- Geçiş yeni T75 hücre kültürü şişelerine uygun verim için 1:03 oranında hücreler.
Not: Biz azaltılmış yeniden programlama verimlilik herhangi bir belirti olmadan P5 kadar bu hücreler pasajlanır var. Kültür endotelyal hücrelerin önemli bir kısmını (CD34 ekspresyonu ile değerlendirilen) içeren P0 da, takip eden geçitler de bu sayı ihmal edilebilir hale gelir.
- Yetişkin insan beyin kültürleri karakterizasyonu:
- İmmünositokimya:
- Poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine hücreler, tohum ~ 60,000 hücre karakterizasyonu için, 500 ul taze büyüme mediu fişleri24 oyuklu doku kültür plakaları içinde m ve% 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Kültürlenmiş insan beyin hücreleri immünositokimyasal analizi için orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit 500 ul ekleyerek, hücreler.
- Cam kapak, uygun bir nemli bir boyama odası içine sığar aktarın ve 80 ul PBS ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 3 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.5 Triton X-100 içeren bloke eder.
- Aynı çözelti içinde seyreltilmiş primer antikorların (seyreltme faktörler spesifik reaktifler ve ekipman tablo bakınız) ilave edilir ve oda sıcaklığında, 4 ° C ya da 1 saat sonra bir gece boyunca inkübe edilir.
Not: kültür bu aşamada, hücrelerin önemli bir ama farklı fraksiyon (PDGFRβ) platelet türevli büyüme faktörü reseptörü β için immünoreaktif olan, farklılaşma 146 (CD146), kondroitin sülfat NG2 proteo kümeglukanıdır ve düz kas aktini (SMA), mikrovasküler ilişkili perisitlerden karakteristik yani belirteçleri. Yalnızca küçük bir bölümü (<% 1) astroglial belirteçleri glial fibriller asidik protein (GFAP) ve S100β ifade eder. Ayrıca, bu aşamada kültür nöronal işaretleyici βIII-tubulin ifade eden bir hücre yoksun olmalıdır. Farklı markerlerinin co-etiketlenmesi için çok sayıda birincil antikor kombinasyonları kullanılır. Glial, nöronal, endotel ve perisit markerlerinin sentezlenmesi başka bir onay da, ters transkripsiyon ve (bu protokol açıklanmayan) kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile elde edilebilir. - Ile inkübe edildikten sonra, birincil antikorlar, 1 ml PBS ile üç kez yıkama ve boyama çözeltisine (uygun seyreltiler olarak) karşılık gelen ikincil antikor ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. Hücreler 3x PBS ile yıkayın. Gerekirse, monte edilmeden önce oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DAPI ile boyama dahilsıcaklığı.
- Montaj orta solmaya kullanın ve Epifloresans bir mikroskop ya da bir konfokal mikroskop kullanılarak kapak fişleri analiz.
- Flow sitometri:
- Akış sitometrisi kullanılarak yüzey işaretleyici ifade analizi için, kaplanmamış T25 veya T75 hücre kültürü şişelerinde hücreleri konfluansa kadar büyür.
- PBS +% 0.5 BSA içeren boyama çözeltisi içinde tekrar süspansiyon ve daha önce tarif edildiği gibi TrypLE kullanarak hücreleri çıkarın. Renk reaksiyonu başına, boyama çözeltisinin 100 ul 100,000-200,000 hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, ilgili izotop kontrol antikorları) kullanılan antikor başına tek boyama reaksiyonları hazırlayın.
- Doğrudan hücre süspansiyonu içine (seyreltmeleri spesifik reaktifler ve ekipman için tabloya bakınız) her bir boyama çözeltisine florokrom-konjuge antikor ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 500 ul PBS ile hücreler üç defa yıkamak ve her arasında aşağı doğru döndürün5 dakika boyunca 157 x g yıkama aşaması.
- FACS tüplere bir hücre süzgecinden (70 um) üzerinden 0.5-1 mi boyama solüsyonu ve transfer hücrelerde hücre pelletini. Işığa maruz örnek koruyun.
- Önce FACS alet yerleştirerek için Vortex örnekleri.
- Canlı hücrelerin analiz ve enkaz ve hücre agrega, FSC-A kapısı ve SSC-A dışlamak için. Hücre duplets özellikle FSC-A ve FSC-W tarafından Geçitli. Ilgili florokroma konjüge eş izotipli antikor kontrolü ile kapıları belirlenen hücre yüzeyi işaretçileri için doğru yolluk koşullarını belirlemek. Daha sonra antikor-bağlı hücrelerin oranını belirler.
- İmmünositokimya:
Flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile perisit türetilen Hücreler 3. Zenginleştirme
- FACS 70 mikron meme kullanılarak sıralama ile önce transdüksiyonu ile (büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş) perisit hücre popülasyonu arındırın. C ile bir arada CD34-APC kullanınD140b-PE ve CD146-FITC perisitlerden seçmek için. CD34-negatif, CD140b-ve CD146 pozitif hücreler için sıralar.
- 24 oyuklu doku kültürü plakalarında kayma poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine büyüme ortamı ve plaka içindeki kriteri hücrelerini toplamak ve% 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Sıralama 48 saat sonra, taze büyüme ortamı ile orta yerine Protokol ve 4'te tarif edildiği gibi transdüksiyonunu gerçekleştirmek.
4. Retrovirütik perisit türetilmiş Hücrelerinin İletimi ve İsteyerek Nöronlar içine yeniden programlanması
Not: retroviral parçacıkları taşıma yerel biyogüvenlik kurallarına bakın. Almanya'da burada istihdam retrovirüslerde kullanımı biyogüvenlik düzeyi 2 gerektirir. Retroviral parçacıkların üretim protokolüne 6'ya bakın. Tekrar programlanması için kullanılan retroviral yapılar için Karow ve arkadaşlarına bakınız. (2012). Retrovirüsler, VSV-G (vesiküler stomatit virüsü-gliko psödotiplendirilmiş idiprotein) 5. Üretim için Gavrilescu ark 6 başvurun.
- Önce poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine retroviral transdüksiyon tohum ~ 60000 hücreleri 24 saat 24 oyuklu doku kültürü plakaları içinde 500 ul taze büyüme ortamı içinde kayar ve% 5 CO2 ve% 5 O2, 37 ° C'de inkübe .
- Ertesi gün, 500 ul taze, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı ile büyüme ortamının yerini ve retroviral parçacıklar (kontrol için pCAG-IRES-DsRed, özellikle de laboratuarda protokol kurulması esnasında), pCAG-ascl1 içeren ilgili konsantre edildi yüzer 1 ul ekle pCAG-Sox2 IRES-GFP, IRES-DsRed.
- Bir gün sonra, hücreler, viral partiküller dahil olmak üzere orta kaldırmak ve taze 1 ml eklemek Glutamax ile 49 ml DMEM yüksek glükoz ve 1 ml B27 serum içermeyen ek oluşan, B27-farklılaştırma ortamı önceden ısıtılmış. 5 37 ° C 'de kültür içinde hücreleri korumak% CO 2 ve ins olgun olarak tekrarlayan orta değişiklikler zararlı olmak gibi orta değiştirmeden 4-8 hafta boyunca% 5 O 2.
İmmünositokimya tarafından Kaynaklı Nöronlar 5. Karakterizasyonu
- Kalıt aktarımlı hücrelerin hücre kimliğini belirlemek için, nöronal bir fenotip elde edilmesini göstermek için, özellikle, belirli reaktiflerin tabloya bakınız, antikorlar ve bunların ilgili dilüsyonları için (örneğin, BIII-tubulin, MAP2 ve Neun gibi nöronal antijenlere karşı immünsitokimya gerçekleştirmek ve ekipmanlar; 2.2.1 belirtildiği gibi) aynı prosedürü uygulayın.
- E14 fare beyin kortekslerinden elde edilen nöronlarla PdiNs, ko-kültür, bu hücrelerin olgunlaşmasını geliştirmek için. Bu amaçla, serebral korteks incelemek ve bir ateş cilalı cam Pasteur pipeti ile mekanik olarak doku ayırmak. Sox2 ve ascl1 kodlayan yeniden iletimi ile aşağıdaki perisit türetilmiş hücreler, 2-3 hafta kültürlerine 10.000-50.000 sıçangil nöronlar eklemetroviruses ve kültürü devam etmektedir. Iletilmiş hücreler canlı epifluoresan veya GFP ve DsRed için İmmunositokimyayı şu ya da muhabir (GFP ve DsRed) ifadesi ile kemirgen nöronların ayırt edilebilir.
- , Kemirgen nöronlar tarafından PdiNs üzerine sinapsların oluşumunu değerlendirmek veziküler glutamat taşıyıcısı 1 (vGluT1) olarak veziküler nörotransmiter reseptörlerine karşı İmmunositokimyayı gerçekleştirmek için.
- Elektriksel özelliklerine (aksiyon potansiyelleri üreten yani yeteneği) ve patch-kelepçe elektrofizyoloji tarafından fonksiyonel sinapsların kurulması için transduced hücreleri inceleyin. Prosedürün ayrıntıları için bkz Heinrich ve ark. (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol sonra başarılı bir şekilde insan yetişkin beyin korteksi bir örnekten bir kültür oluşturulması ilk sonuç kültürün hücre bileşimin tanımlanması oluşur. Hücre tipi özel proteinler için İmmünositokimya farklı hastalar (Şekil 1A) numune türetilen kültürleri arasında heterojenite önemli derecede ortaya koymaktadır. Akış sitometrisi ile belirlenir olarak (ortalama olarak ~% 75, 30 ile en fazla% 99 kadar) PDGFRβ eksprese eden hücrelerin önemli bir kısmı her zaman vardır; Böyle CD146, NG2 ve CD13 gibi perisitlerden diğer belirteçleri tipik bir alt aralığında (Şekil 1B) olarak ifade edilmiştir. Immunositokimya (Şekil 1A) ile belirlenen Aynı şekilde SMA, kültürlenmiş hücrelerin küçük bir alt grubunda ifade edilir. Pasajda 0 (P0), <genellikle CD34-pozitif endotel hücrelerinin% 10 vardır, ve bunların sayısı daha ileri bir pasaj ile algılama aşağıda azalır. Aynı şekilde, astrocytes önce geçişleri sadece önemsiz bir kirlenmesini içermektedir. Ayrıca, nöral kök hücre, nöronal veya oligodendrocyte belirteçler için leke hiçbir hücreleri genellikle vardır. Immünositokimyasal ve veri akış sitometri tamamen kantitatif RT-PCR 7 tarafından doğrulanmaktadır. Sonuç olarak, kültür içinde en büyük kısmı proteinler ve perisitlerin mRNA'lar karakteristiği ifade eder. Perisit türetilmiş hücreler için başka bir zenginleştirme, bu aşamada, FACS ile elde edilebilir. PDGFRβ ekspresyon seviyesi ile yansıtılan kültür saflığı spektrumunun alt ucunda olduğunda, bu özellikle önemlidir. FAC-sıralama özellikle perisitlerin (Şekil 1C), herhangi bir CD34-pozitif kirletici maddelerin hariç Böylece, biz PDGFRβ karşı bir antikor (CD140b) tek başına ya da bir anti-CD146 antikor ile kombinasyon halinde kullanılmıştır var.
Sadece bir raportör genini kodlayan kontrol virüsleri ile bu kültürleri, iletici bunların markör ifade p değiştirmezrofile bu hücrelerin perisit soy kalmasını gösteren (transdüksiyon aşağıdaki 3-4 haftada bir değerlendirilmiştir.) Aynı şekilde, tek başına Sox2 of retrovirüs aracılı sentezleme morfolojisinde herhangi bir açık değişikliklere neden ne de tek başına Sox2 bir kader dönüşüm oluşturmak için yeterli olmadığını düşündürmektedir BIII-tubulin ifadesini indükler değildir. Bunun aksine, hücrelerin düşük bir oranı (yaklaşık% 10), ancak, bir nöronal morfoloji almadan, bir ascl1 kodlayan retrovirüs tek başına sergi βIII-tubulin ifade transdüksiyona. Çarpıcı bir şekilde, tüm Sox2 ve ascl1-cotransduced hücrelerin yaklaşık% 50 βIII-tubulin ekspresyonu gösterir ve daha da önemlisi, (bunların iki raportör ekspresyonu ile görselleştirildi) Bu çift kalıt aktarımlı hücrelerin bir üçüncüsü de (Şekil 2) nöronal işlemleri gösterir. Nöronal özellikleri alınmasıyla birlikte, PDGFRβ ifadesi 7 aşağı düzenlenir. Kültüründe de olgunlaşma ile, Sox2 ve ascl1-coexpressing hücreler de immun olmak(ağırlıklı olarak nöronal hücre gövdeleri boyanarak) daha olgun nöronal belirteçler (dendritik süreçleri boyama) MAP2'nin ve Neun için oreactive. Işaretleyici ifadede bu değişikliklerin altında tartışıldığı gibi, aynı zamanda nöronların elektrofizyolojik özelliklerinden alımı ile ilişkilidir. Sonuç olarak, bu veriler PdiNs olarak adlandırılır Ins içine perisit türetilen hücrelerin direkt dönüşüm kaderi, kanıtlarıdır. Bu PdiNs embriyonik fare serebral korteks nöronlar ile kokültürü deneylerde ortaya gibi fonksiyonel postsinaptik bölmeleri kurmak için yeterliliğe sahiptir. Bu yeterlilik sinaptik girdilerin görünümü (aşağıdaki tartışmaya bakınız) yanı sıra (vesiküler nörotransmiter taşıyıcılar, örneğin vGluT1 imünoreaktivite kümeleri ile karakterize edilir) birlikte kültürlenmiş nöronların türetilen presinaptik terminalleri ile PdiNs dendritik süreçlerinin dekorasyon elektrofizyolojik olarak kanıtlanabilir. Bu veriler ayrıca, nöronal c entegre PdiNs yeteneğini gösterirircuits.
Şekil 1. Yetişkin insan beyin korteksinden elde edilen kültürlerde perisit belirteçlerin heterojen ifadesi. A) immünsitokimya ortaya koyduğu gibi perisit belirteçleri (PDGFRb, SMA, CD146) ve heterojen ifadesini gösteren Floresan mikrograflan. Ölçü bar = 50 um. B) histogram farklı hasta türetilen kültürler akış sitometrisi ile belirlendiği gibi perisit belirteçleri PDGFRβ (CD140b), CD13 ve CD146 pozitif hücrelerin göreceli numaraları özetlemektedir. CD34 endotel hücreleri için bir belirteçtir. Sonraki yeniden programlama için kırmızı kutunun tarafından vurgulanan çift pozitif perisitlerden () sıralama için izotip kontrolü ve CD146 / CD140b-lekeli insan hücrelerini gösteren C) FACS nokta araziler. PDGFRβ yüksek ifade oranı ve NotBu özel kültür CD146 ekspresyonu ile ilgili olarak heterojen.
. Deneysel set-up:. Ins Top içine yetişkin insan perisit kökenli hücrelerin Şekil 2. yeniden programlanması. Aşağıda retrovirüs kodlayan Sox2-IRES-GFP ve ascl1-IRES-DsRed ile transduse hücreleri gösteren floresan mikroskop. Sadece çift transdüksiyona hücreler (ok başları) BIII-tübüline (sağ panel) ifade ve nöronal morfoloji unutmayın.
| Hücre bölünmesi [%] | hücre ölümü [%] | BIII-tubulin + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Sürekli canlı görüntüleme ile değerlendirilen PdiNs içine dönüşüm geçiren perisit kökenli hücrelerin Tablo 1.. Davranış. Sox2-ve Ascl1 hücreler çıkış hücre döngüsünü birlikte ifade unutmayın. Ayrıca, Ascl1 veya Sox2 ve Ascl1-ekspresyonuna aşağıdaki hücre ölümünün yüksek oranda dikkat edin. Dikkate bu farklı hücresel olayları alarak, tüm eş-transdük hücrelerin yaklaşık% 25 INS olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol in vitro genişlemesi ve zenginleştirme perisit türetilen hücrelerin yetişkin insan serebral korteksinden izole takip eden ve nörojenik transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından INS içine sonraki dönüşüm ve Sox2 Ascl1 faktörleri açıklamaktadır. Anılan protokol, sonuçta yetişkin beyninin in vivo ortam haline doğrudan dönüşüm yaklaşımı çevirmek için akılda hedefi ile, potansiyel olarak da glia nöronların içine beyin-yerleşik hücrelerinin soy-dönüşüm ve çalışma vitro sistemde bir deneysel sağlar.
Teknik Hususlar
Çalışmamızda her iki cinsten, 19 ve 70 yaşları arasındaki hastalarda insan beyin dokusu kullanılmaktadır. Biz cinsiyet veya yaş 7 bağlı olarak yeniden programlama verimliliğinde belirgin bir fark yoktu. Yine de daha ince farklar yine olabileceği gibi bu bilgileri belgelemek için tavsiye edilirBizim dikkat kaçtı görülmektedir.
Bundan başka, laboratuar için doku numunesi transferini aşağıdaki mümkün olduğu kadar erken işleme başlaması tavsiye edilir. Doku deneye aktarmak önce ameliyat odasında kalmıştır ne kadar süre için zorunlu olarak bir bilinmeyenler olacaktır. Bu kültürleme prosedürün başlangıcına kadar hastanın beyin çıkarıldıktan arasındaki süre 7 çalışmamızda Numuneler buz üzerinde her zaman tutulması ile, 2-6 saat arasında değişmektedir olduğunu tahmin ediyoruz. Sonraki işlem ne de herhangi bir olumsuz sonuca kolaylığı hiçbir belirgin fark, bu zaman aralığı içinde fark edildi.
Herhangi bir protokol için kritik bir değerlendirme sadeliği, tekrarlanabilirlik ve verimliliği ile ilgilidir. Bu protokol, birinci faz hücreleri sırasında olmasıyla basittir iki transkripsiyon fa sadece kullanılarak hücre yeniden programlama bir ikinci faz ve ardından kolayca elde edilebilir pahalı olmayan bir ortam içinde genişletilirtanımlı bir ortam içinde ctors ve kültür.
Tekrarlanabilirlik ile ilgili olarak, retrovirüs preparatın kalitesi genellikle yeniden programlama başarısızlıkla sonuçlanan yüksek titre virüslerin bulaşıcı taneciklerin eşleştirmek için seyreltmede kullanılan düşük titreli virüs preperatlan ile birlikte, son derece önemli olduğu görülmektedir. Aslında biz yüksek titre virüsleri kullanarak yeniden programlama önceden başarısız olmuştu ki aynı perisit kültür başarıyla INS dönüştürülmüş olabileceğini kaydetti.
Dönüşüm verimi ile ilgili olarak, sürekli canlı görüntüleme kullanılarak Sox2 ve ascl1-cotransduced hücrelerinden türetilen βIII-tubulin-pozitif hücrelerin sayısı değerlendirilmiştir. Canlı görüntüleme oluşturulan ins sayısı sadece deney uç noktasında tespit edildiğinde bu tür bilgiler eksik ise, dönüştürme işlemi sırasında, hücre bölünmesi ya da hücre ölümünü tabi hücrelerin sayısını değerlendirmek için izin verir. Aslında time-lapse video Micros kullanaraknüshası untransduced ve tek faktör transdüksiyonlu hücreleri Sox2-ve ascl1-cotransduced hücreler hızla hücre döngüsü çıkmak ise, çoğalan devam ettiği gözlenmiştir (prosedür için Ortega e t ark. 8'e bakınız). Ayrıca, ikinci nüfusunun önemli bir kısmı, hücre ölümüne maruz kalır. Retrovirüs toksisite resmen bizim çalışmamızda 7 elde verilerden ardı edilemez iken ascl1 (tek başına veya Sox2 ile birlikte) ifade edildi yalnızca, hücre ölümünü artan gerçeği gözlenmiştir, biz hücre kaderi bir felaket çatışma için delil olarak yorumlamak . Dikkate bu iki etkinlik alarak, hepimiz Sox2-ve ascl1-cotransduced hücrelerin% 25 BIII-tubulin pozitif INS (Tablo 1) dönüştürmek olduğunu tahmin ediyoruz.
Co-transdüksiyon kesinlikle başarılı tekrar programlanması için gerekli olduğu gibi, tek bir aynı anda her iki faktörü ifade eden hücrelerin miktarını optimize etmek için, bir viral vektör kodlayan her iki geni kullanılarak dikkate alabilirzamanı.
Son zamanlarda, Ladewig et al. Glikojen sentaz kinaz-3β küçük molekül bazlı inhibisyon kullanılarak ve SMAD 9, sinyal ile% 200 bir verim elde INS içine fibroblastlann verimli dönüşüm için bir protokol geliştirilmiştir. Bizim protokol bu eklenti PdiN üretimin verimini artırmak belirlemek için ilginç olacaktır.
Yeniden programlama işleminin canlı görüntüleme bir diğer ilginç sonucu INS içine yetişkin insan perisitlerin dönüşüm fare kökenli 4 farklı somatik hücre kültürleri içindeki yeniden programlama protokollerine göre oldukça yavaş bir tempoda meydana gerçeği ile ilgilidir. Bu, insan nöron 10 karakteristik yavaş olgunlaşması ile tutarlıdır.
Sistematik PdiN üretim verimi üzerine oksijen geriliminin etkisini analiz değil, biz kaydetti genellikle düşük oksijen koşullarında (% 5) inkübasyonnormoksik koşullar (% 21) 'de hücrelerin kültürlenmesi ile karşılaştırıldığında daha üstün sonuçlar verdi. Son zamanlarda, Davila et al. Insan fibroblastları 11 INS indüklenmesi için daha az oksijen gerginliği ile benzer bir etki arttırıcı tarif.
Diğer doğrudan dönüştürme protokolleri uyarılabilir lentiviral vektörleri 1, 12, 13, istihdam ederken Bizim protokol ve Sox2 ascl1 en retroviral teslim dayanmaktadır. Daha yakın zamanlarda biz de başarıyla Sox2 ve Ascl1 ifade nispeten kısa bir darbe (10 gün) perisit-to-nöron dönüşüm için yeterli bir sebep olduğunu gösteren, Sox2 ve ascl1 kodlayan doksisiklin-uyarılabilir lentiviral yapıları uyguladık. Çalışmamızda 7 kullanılan retrovirüsler, indirgenmiş 5 susturulması için tasarlanmıştır. Buna göre, raportör gen ekspresyonu yoksun nöronların görünümünü fark etmedi. Bununla birlikte, bu ihtimal transgen iki genel ekspresyon seviyelerizamanla s ve muhabir değişikliği ardı edilemez. (Sendai virüs kullanan) Entegrasyon-serbest yaklaşımlar son zamanlarda uyarılan sinir atalarıdır 14 kuşağının durumunda istihdam edilmiştir, ancak şu anda bu hatta virüssüz yeniden programlama stratejileri başarılı insan perisitleri dönüştürmek için uygulanabilir olup olmadığı bilinmemektedir. Son olarak, diğer dokulardan elde edilen perisitler neden olduğu sinir hücre tiplerine dönüştürme meydana olup olmadığını test edilmesi gerekmektedir.
Kavramsal Hususlar
Ins içine somatik hücre yeniden programlanması eleştirel bir sonucu işlevlerini 15. ilgilidir. Biz, yeniden programlama işleminin başlamasından sonra farklı zaman noktalarında PdiNs elektrofizyolojik özellikleri değerlendirilmiştir. Çok erken aşamalarda, retroviral transdüksiyon aşağıdaki yani 2 hafta, bu aşamada βIII-tubulin ifadesine rağmen elektrik uyarılabilirliğinin PdiNs sergi ancak işaretler. Bu nedenle, çoğuelektrofizyolojik analizleri ve Sox2 ascl1 transdüksiyon sonra 4-8 hafta yapılmıştır. Karow et al. De tarif edildiği gibi, yüksek giriş dirençleri ve hareket potansiyeli ateş, düşük bir frekans ile yansıtılan, PdiNs önemli olgunlaşmamış ile karakterize edilir. Dahası olgunlaşma fare E14 serebral korteks türetilen nöronlar ile birlikte kültür PdiNs tarafından teşvik edilebilir. Bu koşullar altında, daha yüksek bir hareket potansiyeli PdiNs frekansları ve artan sodyum akımları 7 sergiler. Ayrıca, coculturing fare nöronların fonksiyonel sinaptik giriş almak için PdiNs yetkinliğini ortaya koymaktadır. Özetle, PdiNs ayrıca diğer nöronlar ile coculturing üzerine geliştirilmiş olabilir fonksiyonel nöronal özelliklerini kazanır. Bununla birlikte, aynı zamanda işlevsel PdiNs presinaptik bölmeleri tesis olup olmadığını göstermiştir edilmesi gerekmektedir. Beyne PdiNs nakli ileri çalışmalar tam olgunluğa ve işlevsellik ulaşmak için kendi potansiyellerini ortaya çıkarmak için gereklidir.
UBiz çıkan PdiNs GABAerjik nöronların 7 özelliklerini kazanmak olduğunu kaydetti yeniden programlama faktörleri olarak Sox2 ve ascl1 şarkı. İlginç bir şekilde, diğer gruplar gelişmekte INS bir glutamaterjik, dopaminerjik ve kolinerjik fenotip 1, 16-18 gibi farklı nörotransmiter özellikleri elde edilen bu sonuç, farklı transkripsiyon faktörü ve / veya microRNA kombinasyonları kullanılarak INS içine fibroblastlar dönüştürme protokolleri geliştirmiştir. Bu fibroblast kullanılan etken kombinasyonları PdiNs aynı verici kimlik neden olup olmadığını test edilmesi gerekmektedir. Ayrıca, son zamanlardaki araştırmalar, nöral kök hücrelerini 19, 20 ya da glial, özellikle oligodendrositler 21, 22 oluşturmak için nöron ötesinde dönüşüm spektrumu genişlemiştir. Bu yeniden programlama protokoller yetişkin insan beyni perisit hücreleri üzerinde benzer bir sonuç ortaya çıkarmak, bu büyük ölçüde bu ithalat uygulamalarının panoramasını genişletmek istiyorumkarınca beyin-yerleşik hücre tipi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında onu girişi için Dr Magdalena Götz minnettarız. Biz cömertçe Sox2 kodlama dizisi ile bize sağlamak için Dr Marius WERNIG (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. Biz de virüs üretimi için Dr Alexandra Lepier için çok müteşekkiriz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE) ve BMBF (01GN1009A) BB, ve Bavyera Bilimler Devlet Bakanlığı, Araştırma ve MK ve BBCs için Sanatları uluslu SYSTHER-fon alınan hibe ile desteklenmiştir INREMOS Sanal Enstitüsü (Eğitim ve Araştırma Alman ve Sloven Federal Bakanlıklar) ve DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
