Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

التصوير MALDI الكتلة الطيفي للتحقيق في المستقلبات في Published: March 5, 2014 doi: 10.3791/51434

Summary

الكتلة الطيفي التصوير (MSI) هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لاكتشاف وتحديد الأنواع الكيميائية المختلفة في أنسجة سليمة، والحفاظ على المركبات في بيئاتها المحلية، والتي يمكن أن توفر رؤى جديدة في العمليات البيولوجية. هنا يتم وصف أسلوب MSI وضعت لتحليل جزيئات صغيرة.

Abstract

معظم التقنيات المستخدمة لدراسة الجزيئات الصغيرة، مثل العقاقير الدوائية او نواتج الذاتية، وتوظيف مقتطفات الأنسجة التي تتطلب تجانس الأنسجة من الاهتمام التي يمكن أن تسبب تغيرات في المسارات الأيضية التي تجري دراستها 1. الكتلة الطيفي التصوير (MSI) هو أداة تحليلية قوية التي يمكن أن توفر المعلومات المكانية من analytes داخل شرائح سليمة من عينات الأنسجة البيولوجية 1-5. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة أنواع مختلفة من المركبات بما في ذلك البروتينات والببتيدات، والدهون، والجزيئات الصغيرة مثل الأيض الذاتية. مع بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) MSI، التوزيعات المكانية من نواتج متعددة في وقت واحد يمكن اكتشافه. هنا، يتم تقديم وسيلة وضعت خصيصا لإجراء التجارب غير مستهدفة الايض MSI على جذور البقوليات والعقد الجذرية التي يمكن أن تكشف عن نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية التي تحدث. الالطريقة المعروضة هنا يبين سير العمل MSI نموذجي، من إعداد العينات إلى الحصول على الصور، ويركز على خطوة تطبيق المصفوفة، مما يدل على تطبيق عدة تقنيات المصفوفة التي هي مفيدة للكشف عن جزيئات صغيرة. مرة واحدة يتم إنشاء الصور MS، ويناقش تحليل وتحديد نواتج الأيض من الاهتمام وبرهن. سير العمل القياسية المعروضة هنا يمكن تعديلها بسهولة لأنواع مختلفة الأنسجة، والأنواع الجزيئية، والأجهزة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مجال متزايد من الايض العديد من التطبيقات البيولوجية الهامة بما في ذلك اكتشاف العلامات البيولوجية، فك رموز المسارات الأيضية في النباتات وغيرها من النظم البيولوجية، وعلم السموم التنميط 4،6-10. ويتمثل أحد التحديات التقنية الكبرى عند دراسة النظم البيولوجية هو دراسة مسارات metabolomic دون تعطيل لهم 11. MALDI-MSI يسمح للتحليل المباشر للأنسجة سليمة تمكن من analytes كشف حساسة في أجهزة احد 12،13 وحتى 14،15 الخلايا واحد.

إعداد نموذج هو خطوة حاسمة في إنتاج الصور الطيفية الشامل استنساخه وموثوق بها. جودة الصور تعتمد إلى حد كبير على عوامل مثل الأنسجة التضمين المتوسطة، شريحة سمك، MALDI مصفوفة، وتقنية تطبيق المصفوفة. لتطبيقات التصوير، قسم مثالية سمك هو العرض من خلية واحدة (8-20 ميكرون اعتمادا على نوع العينة). يتطلب MALDI ترسب عضوي، غلوبولين العدسةه مصفوفة مركب، وعادة حمض ضعيف، على عينة لتحليلها ومساعدة الاجتثاث التأين. توفير 16 مصفوفات مختلفة كثافات مختلفة إشارة، أيونات التدخل، والكفاءة التأين من فئات مختلفة من المركبات.

تقنية تطبيق مصفوفة يلعب أيضا دورا في نوعية الصور الطيفية الشامل والتقنيات المختلفة المناسبة لفئات مختلفة من التحاليل. يتم عرض ثلاثة أساليب تطبيق المصفوفة في هذا البروتوكول: البخاخة، بخاخ التلقائي، والتسامي. وقد استخدم على نطاق واسع البخاخة تطبيق مصفوفة في مجال التصوير MALDI. ميزة البخاخة تطبيق مصفوفة هو أنه سريع نسبيا وسهلة. ومع ذلك، فإن نوعية تطبيق مصفوفة البخاخة يعتمد إلى حد كبير على مهارة المستخدم ويميل إلى أن يكون أقل استنساخه وتسبب نشر التحاليل، خصوصا جزيئات صغيرة 17. نظم الرش التلقائي ديك ميكانيكا مماثلة لالبخاخة تطبيق مصفوفة، ولكن هفه تم تطويرها لإزالة التباين ينظر مع دليل تطبيق البخاخة، مما يجعل من رذاذ أكثر استنساخه. هذا الأسلوب يمكن أن يكون في بعض الأحيان أكثر تستغرق وقتا طويلا من التقليدية البخاخة تطبيق المصفوفة. كلا البخاخة اليدوية وأنظمة الرش التلقائي وسائل تطبيق مصفوفة المذيبات. التسامي هو جاف مصفوفة تقنية التطبيقات التي أصبحت أكثر وأكثر شعبية للتصوير الطيفي الشامل من المركبات والجزيئات الصغيرة لأنها تقلل الحليلة نشرها، إلا أنها تفتقر إلى ما يلزم من المذيبات لاستخراج ومراقبة المركبات الشامل أعلى 18.

تحديد واثق من المركبات عادة ما يتطلب قياسات دقيقة الشامل للحصول على هويات المفترضة تليها جنبا إلى جنب الشامل (MS / MS) للتحقق من صحة التجارب، مع MS / MS الأطياف يجري مقارنة للمعايير والأدب، أو أطياف النظرية. في هذا البروتوكول عالية الدقة (حل شامل قوة 60،000 في م / ض 400)، اللوني السائل (ويقترن LC)-MS لMALDI-MSI إلى الحصول على كل المعلومات المكانية والتعرف على ثقة من نواتج الأيض الذاتية، وذلك باستخدام Medicago truncatula الجذور والعقد الجذرية مثل النظام البيولوجي. تجارب MS / MS يمكن القيام بها مباشرة على النسيج مع MALDI-MSI أو على مقتطفات الأنسجة مع LC-MS وتستخدم للتحقق من هويات الأيض.

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لرسم خريطة نواتج الأيض الذاتية في M. truncatula، والتي يمكن تكييفها وتطبيقها على MSI من الجزيئات الصغيرة في مختلف أنواع الأنسجة والنظم البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. الأجهزة

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. استخدام مطياف الكتلة مجهزة مصدر MALDI لتحليل الجزيئات الصغيرة (انظر جدول المواد / المعدات). أداء عمليات الاستحواذ في وضع أيون إيجابية أو سلبية اعتمادا على التحاليل من الفائدة. تحديد نطاق شامل من الفائدة وجمع 500 طلقات الليزر / بقعة في 50 ميكرومتر فترات في كل من x و أبعاد ذ عبر سطح العينة لتوليد الصور أيون. ويمكن تعديل العرض النقطية وعدد من الطلقات ليزر للحصول على القرار المكانية أعلى وأقصى كثافة إشارة على التوالي. استخدام DHB قمم مصفوفة أو المعايير الداخلية المطبقة على الشريحة أو مباشرة إلى الأنسجة لمعايرة الأطياف الشامل.
  2. ارتفاع القرار LC-MS. (انظر جدول المواد / المعدات) مقتطفات عينة تشغيل مع LC-MS باستخدام إما المرحلة عكسها (RP) LC مع عمود C-18، أو مرحلة طبيعية (NP) مع عمود HILIC اعتمادا على التحاليل من الفائدة. استخدام المحمول ومراحلالتدرجات بما يتناسب مع نوع عينة محددة. تنفيذ عمليات استحواذ في وسائط أيون إيجابية أو سلبية تبعا لنوع العينة.

2. إعداد الأنسجة

  1. تقليم العقيدات الجذرية من النبات، وترك 3-4 ملم من الجذر تعلق على العقيدات.
  2. مباشرة بعد تشريح، واستخدام ملقط لوضع الأنسجة في كوب ناظم البرد، وتغطي مع الجيلاتين (100 ملغ / مل في الماء منزوع الأيونات). فمن الضروري لأنسجة ليكون عالقا في قاع الكأس مع عدم وجود فقاعات الهواء.
  3. فلاش تجميد الأنسجة عن طريق وضع كوب في حمام الثلج الجاف / الإيثانول حتى يصلب الجيلاتين ويصبح غير شفاف. مخزن العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. إزالة عينات من الفريزر -80 درجة مئوية، وقطع بعيدا ناظم البرد كوب من البلاستيك وتقليم بعيدا الجيلاتين الزائدة. تركيب الأنسجة جزءا لا يتجزأ من لتشاك ناظم البرد مع كمية سنتات الحجم من درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) وسائل الإعلام، في حين أن عدم السماح للأكتوبر تلمس الأنسجة. وضع في ناظم البردمربع حتى يتصلب أكتوبر.
  5. السماح للتشوك والجيلاتين لكي تتوازن في مربع ناظم البرد (مجموعة إلى -20 أو -25 درجة مئوية) لمدة حوالي 15 دقيقة.
  6. استخدام ناظم البرد (انظر جدول المواد / المعدات) إلى قسم الأنسجة تقريبا سمك خلية واحدة (8-20 ميكرون تبعا لنوع الأنسجة) وذوبان الجليد جبل كل شريحة على الزجاج ايتو المغلفة من قبل ارتفاع درجة حرارة الظهر (غير ايتو- المغلفة الجانب) من شريحة زجاجية ايتو المغلفة على الجزء الخلفي من يدك. وضع الجانب ايتو المغلفة من الشريحة تحسنت بالقرب من شريحة الأنسجة المجمدة والسماح للشريحة التمسك على الشريحة. ووضع المقاطع قريبة من بعضها البعض على الشريحة توفير المحاذاة أفضل أثناء MSI.

3. مصفوفة التطبيق

  1. البخاخة تطبيق مصفوفة MALDI
    1. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات البخاخة في غطاء الدخان.
    2. تماما تنظيف الحاويات الحل البخاخة وفوهة (انظر جدول المواد / المعدات) مع الميثانول وملء حاوية الحل مع حل DHB مصفوفة (150 ملغ / مل في 50٪ methanol/0.1٪ TFA ت / ت).
    3. عقد البخاخة حوالي 35 سم من العينة وتطبيق 10-15 المعاطف من المصفوفة على سطح الشريحة مع مدة 10 ثانية رذاذ و 30 ثانية في وقت التجفيف بين كل طبقة.
    4. تماما تنظيف البخاخة مرة أخرى مع الميثانول عند الانتهاء لتجنب انسداد من حل المصفوفة.
  2. التلقائي تطبيق البخاخ من MALDI مصفوفة
    1. اتبع الإرشادات بدء المقدمة من قبل الشركات المصنعة لنظام الرش التلقائي.
    2. لMSI من نواتج الأيض في العقد الجذرية باستخدام 40 ملغ / مل (في 50٪ methanol/0.1٪ TFA ت / ت) DHB مثل المصفوفة، ضبط درجة الحرارة إلى 80 درجة مئوية ~، والسرعة إلى 1،250 ملم / دقيقة، ومعدل التدفق الى 50 ميكرولتر / دقيقة، وعدد من يمر إلى 24. لأفضل تغطية، فمن المستحسن لتدوير فوهة 90 ° و / أو تعويض فوهة 1.5 ملم بين كل تمريرة. بدء طريقة الرش.
      كما الاشتراكيةدي علما، ونظام الرش خاصة مع ارتفاع درجات الحرارة المستخدمة هنا فوهة للتبخر أسرع من المذيبات. كما يتبخر المذيب، وتركيز مصفوفة يزيد بسرعة. مصفوفة تطبيقها على عينة مع البخاخة والرش التلقائي لديها تركيزات قابلة للمقارنة.
    3. اتبع الإرشادات اغلاق القناة التي تقدمها الشركات المصنعة لنظام الرش التلقائي.
  3. التسامي تطبيق مصفوفة MALDI
    1. تزن من 300 ملغ DHB في الجزء السفلي من الغرفة التسامي (انظر جدول المواد / المعدات).
    2. عصا شريحة زجاجية لالاصبع الباردة (الجزء العلوي من غرفة التسامي) مع أقسام الأنسجة أسفل مع الوجهين، والشريط موصل. تغطية الجزء الخلفي بأكمله من الشريحة مع الشريط مزدوجة من جانب لحتى الموصلية، وتنتج حتى ترسب مصفوفة.
    3. المشبك نصفي العلوي والسفلي من الغرفة التسامي جنبا إلى جنب مع C-المشبك. ربط الفراغ والإعلاند الجليد والماء البارد إلى الخزان العلوي.
    4. وضع غرفة التسامي في عباءة التدفئة التي هي في درجة حرارة الغرفة.
    5. بدوره على مضخة فراغ. انتظر 15 دقيقة وتشغيل عباءة التدفئة. عباءة التدفئة يجب أن تصل إلى 120 درجة مئوية على مدار 10 دقيقة.
    6. بعد 10 دقيقة، وإيقاف الحرارة، وصمام مقربة من فراغ (حتى داخل غرفة لا يزال تحت فراغ) وإيقاف مضخة فراغ.
    7. السماح للغرفة أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة، افتح صمام تحرير الضغط فراغ وإزالة العينة. فإن حجم الغرفة التسامي تحديد مقدار مصفوفة المتسامي إلى شريحة زجاجية. فإن أكبر غرف التسامي (حجم 400 مل دورق) استخدام حوالي 300 ملغ من DHB في حين أن غرف أصغر (حجم مل دورق 150) سيتم استخدام ما يقرب من 100 ملغ من DHB وسوف تتطلب قطع شريحة زجاجية بحيث تناسبها في الغرفة.

4. الحصول على الصور

    <لى> الأقسام نمط + على كل ركن من أركان عينة مع القلم WiteOut تصحيح السوائل لاستخدامها "تعليم نقاط". وضع شريحة زجاجية في MALDI لوحة محول الشريحة وتأخذ الصورة البصرية من العينة باستخدام الماسح الضوئي.
  1. إعداد ملف الحصول على الصور باستخدام البرامج المقدمة من قبل الشركة الصك مع النقطية حجم الخطوة من 50 ميكرون ويبلغ قطرها الليزر مساوية أو أصغر من حجم الخطوة النقطية. على هذا الصك وجه الخصوص، يعطي الإعداد ليزر الحد الأدنى يبلغ قطرها الليزر حوالي 10 ميكرون والصغيرة إعداد الليزر التي يبلغ قطرها 40-50 ميكرون.
  2. تحميل الصورة البصرية في البرنامج ومحاذاة اللوحة مع الصورة البصرية.
  3. معايرة أداة قبل البدء في اقتناء باستخدام أيونات مشتركة المصفوفة العنقودية، والمعايير الداخلية، أو مزيج المعايرة.
  4. تحديد مجالات الأنسجة لتحليلها مع MSI، بما في ذلك بقعة من مصفوفة نقية على الشريحة ليتم استخدامها ك "فارغة".
  5. يبدأ ميلانquisition.

5. انشاء صورة

  1. فتح الملف في برنامج التصوير المتاحة تجاريا التي يقدمها البائع واستخراج الصور أيون. غيرها من البرامج مفتوحة المصدر متاحة لمعالجة البيانات MSI 19.

6. تحديد المستقلب

  1. اختيار محددة م / ض من الاهتمام من الطيف الشامل باستخدام برامج معينة بائع (انظر جدول المواد / المعدات). وتحليلها يمكن تمييزها عن أيون مصفوفة عند تحديد ذروة الحليلة من الطيف الشامل ويتم إنشاء الصور أيون المترجمة تحديدا إلى قسم الأنسجة.
  2. إنشاء قائمة من analytes من الاهتمام وإجراء تجارب MS / MS. انظر الجدول 1 والجدول 2 في ممثل النتائج للقوائم عينة من التحاليل.
  3. أداء المستهدفة تحليل LC-MS في مطياف الكتلة عالية الدقة (أو عالية الدقة MALDI-MS إذا كان متوفرا) للحصول دقيقةقياسات كتلة التحاليل من الاهتمام وأيضا تنفيذ LC-MS/MS من التحاليل المستهدفة للحصول على أنماط تجزئة مميزة.
  4. أداء قاعدة بيانات البحث لتحديد هويات المفترضة للالتحاليل المستهدفة. أمثلة على قواعد البيانات المستقلب تشمل: METLIN، ChemSpider، بوب كيم، KEGG، وHMDB.
  5. للتأكد من هويات المفترضة من دقيقة قاعدة بيانات البحث الشامل، تتناسب مع MS / MS من التحاليل التي تستهدف MS / MS أطياف المعايير، والأدب، و/ أو برامج التنبؤ تجزئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم عرض لمحة عامة التجريبية من MSI في الشكل 1. في بداية التجربة، وإعداد العينات هو خطوة حاسمة. يتم قطع العقيدات من جذور النباتات وجزءا لا يتجزأ من الجيلاتين. يجب الضغط على الأنسجة شقة ضد الكأس ناظم البرد، مع عدم وجود فقاعات، بينما يتم تجميده، وهذا سوف ضمان المواءمة أسهل والسليم للأنسجة أثناء مقطوع به. عندما يتم شرائح الأنسجة، فمن المهم لقطع الأنسجة في سمك السليم؛ رقيقة جدا من المقاطع سوف المسيل للدموع، وتدمير سلامة الأنسجة، في حين سميكة جدا من المقاطع سوف يقلل من عدد من analytes استخراج والكشف عن من الأنسجة. واختيار مصفوفة وتقنية التطبيق تحديد أنواع التحاليل الكشف عنها. يمكن استخدام مزيج من المصفوفات تقديم نتائج التكميلية. يتم عرض ثلاث تقنيات تطبيق المصفوفة في هذا العمل. تقنية البخاخة سريع، ولكن عادة لا تصلح للMSI من جزيئات صغيرة تكونسبب الحليلة نشرها. نظم الرش التلقائي والتسامي توفير بلورات أصغر مصفوفة، أفضل استنساخ، وأقل الحليلة نشرها. يبين الشكل 2 صورة ضوئية من Medicago truncatula قسم العقيدات الجذرية. الشكل 3 مثالا يوضح الصورة البصرية للتغطية مصفوفة الكريستال والأحجام باستخدام البخاخة، تلقائي البخاخ، والتسامي على التوالي.

المصفوفات التقليدية، مثل DHB، تنتج العديد من الأيونات في نطاق أقل الشامل (م / ض 100-400) 20. ويمكن لهذه الأيونات مصفوفة تتداخل مع الكشف عن نواتج الأيض في هذا النطاق. الشكل 4 يوضح MS أطياف فقط DHB مصفوفة مقارنة مع الأنسجة العقيدات الجذرية المغلفة مع DHB المصفوفة. يشار إلى DHB قمم مصفوفة باللون الأحمر والعقيدات الجذرية الأنسجة مغطاة DHB يظهر باللون الأزرق. مصفوفات رواية مثل تيو 2 النانوية 21، 1،5-diaminonapthalene (DAN) 22، 2،3،4،5-Tetrakis (3 '، 4'-dihydroxylphenyl) ثيوفين (DHPT) 23، و1،8 مكرر (ثنائي ميثيل الأمينية) النفتالين (DMAN) تم الإبلاغ 24،25 التي تقلل من تدخل أيونات مصفوفة في نطاق كتلة منخفضة، وأيضا تعزيز الكشف عن فئات معينة الأيض 5. قمم مصفوفة يمكن تمييزها عن الأيض الحقيقي باستخدام الصور MS. عند النقر على ذروة، يتم استخراج صورة أيون وعرضها تداخل الصورة البصرية. وتعتبر تلك القمم التي تولد الصور مع التعريب متميزة للأنسجة، وغير موجودة في المصفوفة المنطقة الوحيدة المصورة، الأيض. ويبين الشكل 5A عدة صور ايون ممثل المستقلبات وجدت في الأنسجة العقيدات الجذرية، في حين يبين الشكل 5B أمثلة من الصور MS المقابلة لمصفوفة القمم ذات الصلة. في الشكل 5A يظهر صورة واضحة لتوطين الأنسجة العقيدات الجذرية وعدم وجود إشارة في المصفوفة المنطقة الوحيدة التي تم تصويرها. في الشكل 5B M. يتم سرد truncatula الأنسجة العقيدات الجذرية في الجدول 1 (الوضع الإيجابي) والجدول 2 (الوضع السلبي) 4.

الهدف النهائي من التجارب الايض تشتته هو التعرف على المركبات التي تم الكشف عنها. عند تنفيذ MSI على قرار صك المتوسطة (MRMS)، مثل TOF / TOF، فمن الضروري للحصول على قياسات دقيقة الشامل بطريقة مختلفة. ويمكن أن يتم هذا مع نهج متعدد الأوجه MS التي تتم مقارنة النتائج MALDI-MSI إلى بيانات عالية الدقة LC-MS باستخدام مقتطفات الأنسجة. هناك العديد من البروتوكولات استخراج الأنسجة ممكن للاختيار من بينها اعتمادا على التحاليل من الفائدة. عالية الدقة MS (HRMS) لا يمكن أن يؤديها في إيجابية أو سلبية مو التأين قصر ومع العادي أو عكس المرحلة LC يتوقف على التحاليل من الفائدة. مرة واحدة يتم الحصول على كتلة دقيقة مع ارتفاع القرار LC-MS، يمكن البحث الكتلة الناتجة مع العديد من قواعد البيانات، المذكورة سابقا، للحصول على الهوية المفترضة. يظهر يتم جمعها المقبل MS / MS البيانات ونمط التشظي سمة من تحليلها من الفائدة يمكن مقارنة المعايير والأدب الأطياف، أو أنماط تجزئة النظرية. الشكل 6 مثال واحد من الكشف عن مستقلبات مع MSI وLC-MS. وقد تم تحديد هذا المستقلب كما الهيم على أساس الطيف MS / MS جمعها مع ارتفاع القرار LC-MS. وتمت مقارنة هذه البيانات MS / MS إلى أطياف MS / MS نشرت سابقا من قبل Shimma وSetou 26. المباراة MS / MS الأطياف اثنين، وبالتالي فإن هوية م / ض 616.2 كلف بثقة كما الهيم على أساس دقيق الشامل البحث قاعدة البيانات والبيانات MS / MS مقارنة الأدب البيانات MS / MS.

ther.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على MSI سير العمل. العقيدات يتم قطع الجذر من النبات، جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين، مقطوع مع ناظم البرد وشنت على شريحة زجاجية ايتو المغلفة. يتم تطبيق مصفوفة إلى الشريحة باستخدام واحدة من ثلاث تقنيات تطبيق المصفوفة. يتم تنفيذ الاستحواذ MSI مع مطياف الكتلة MALDI-TOF/TOF ويتم تجميع أطياف MS في الصور مع برنامج MSI.

الرقم 2
الشكل 2. عينة الأنسجة الصورة البصرية. الصورة البصرية الممثل من truncatula العقيدات الجذرية قسم الأنسجة Medicago.

الرقم 3
الرقم 3. ترسبات سبيل المثال مصفوفة. صور الممثل تبين الاتساق مختلفة من ترسب مصفوفة مع) البخاخة، ب) الرش التلقائي، وج) تقنيات التسامي. طريقة تطبيق البخاخة يولد بلورات كبيرة وصغيرة في حين تنتج طريقة الرش التلقائي بلورات صغيرة الحجم بالتساوي. التسامي تنتج واحدة حتى طبقة من المصفوفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. MS الطيف من جيش التحرير الشعبى الصينىفي DHB مصفوفة مقابل العقيدات الجذرية الأنسجة مغطاة DHB. يشار DHB قمم مصفوفة باللون الأحمر وتظهر العقيدات الجذرية الأنسجة مغطاة DHB باللون الأزرق. قمم مصفوفة يمكن تمييزها عن الأيض الحقيقي باستخدام الصور MS. عند النقر على ذروة، يتم استخراج صورة أيون وعرضها تداخل الصورة البصرية. تلك القمم التي تولد الصور مع التعريب متميزة للأنسجة، وغير موجودة في المصفوفة المنطقة الوحيدة المصورة، وتعتبر نواتج الأيض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. صور من MS M. العقد الجذرية truncatula. أ) الصور أيون ممثل الأيض وس اوند في البرية من نوع M. العقد الجذرية truncatula. ب) الصور أيون الممثل الأنواع المصفوفة التي لن تعتبر نواتج الأيض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. بيانات المثال MS / MS لتحديد الأيض. MS / MS الطيف من م / ض 616.2، حدد كما الهيم [M +]. يظهر التركيب الكيميائي ويتم تعيين الهياكل تجزئة. تتم مقارنة البيانات التجريبية MS / MS لطيف MS / MS من الهيم ذكرت في الأدب من قبل Shimma وSetou 26.

الجدول 1. التحاليل من الفائدة - وضع قائمة إيجابية عينة من الشرجytes من الاهتمام من M. truncatula العقيدات الجذرية الأنسجة في وضع ايون ايجابية 4.

ح: 79px؛ "> 133.0608 73px؛ "> على الحامض الاميني idth: 64px؛ "> 0.04
اسم المستقلب النظرية [M + H] + MRMS قياس [M + H] + نظام إدارة الموارد البشرية تقاس [M + H] + Δm (MDA)
γ-الغاما على حمض 104.0706 104.1 104.0706 0
والكولين، * 104.1070 > 104.1 104.1071 0.01
البرولين 116.0706 116.07 116.0706 0
فالين 118.0863 118.09 118.0865 0.02
يسين و 132.1019 132.1 132.1022 0.03
أسباراجين ل 133.06 133.0602 -0.06
الأدينين و 136.0618 136.07 NA NA
proling البيتين ل 144.1019 144.1 144.1024 0.05
الجلوتامين ل 147.0764 147.09 147.0768 0.04
156.0768 156.06 156.0771 0.03
أرجينين ل 175.1190 175.13 175.1167 -0.23
السكروز + K 381.0794 381.05 381.0791 -0.03
والهيم، * 616.1768 616.15 NA NA
حزب التحرير = "25" على غرار = "الارتفاع: 26px؛ العرض: 173px؛"> NAD ل 664.1164 664.1 NA NA
formononetin ل 269.0808 269.08 269.0803 0.05
chrysoseriol GlcA ل 477.1028 477.1 477.1008 0.2
formononetin MalGlc ل 517.1341 517.13 517.1337
aformosin MalGlc ل 547.1446 547.16 547.1427 0.19

* [M +]
إجراء MS / MS لتحديد الهوية.

الجدول 2. التحاليل من الفائدة - وضع قائمة سلبية عينة من analytes من الاهتمام من M. truncatula العقيدات الجذرية الأنسجة في وضع الأيونات السالبة 4.

حزب التحرير: 26px؛ ">-γ حمض الغاما ل </ آر>
اسم المستقلب النظرية [MH] - MRMS قياس [MH] - < / سوب> نظام إدارة الموارد البشرية تقاس [MH] - Δm (MDA)
حمض البيروفيك 87،0077 87 NA NA
ألانين و 88،0393 88.01 88،0374 -0.19
حامض اللبنيك و 89،0233 89.01 89،0296 0.63
حمض الفوسفوريك 96،9685 96.96 96،9625 -0.6
حمض 2-ketobutyric 101.0233 101.02 101.0191 -0.42
102،055 102.04 102.0528 -0.22
سيرين 104.0342 104.02 104.0228 -1.14
المالئيك / الفيوماريك حمض ل 115.0026 115.03 115 -0.26
حمض السكسينيك ل 117.0182 117.01 117.0125 -0.57
ثريونين 118.0499 118.04 118.0456 -0.43
حمض oxalacetic 130.9975 131.03 130،991 -0.65
حمض الأسبارتيك و 132.0291 132.03 132.0256 -0.35
حمض الماليك و 133.0132 133.02 133.0221 0.89
حمض salicyclic 137.0233 137.02 137.0349 1.16
α-ketoglutaric حمض 145.0132 145.02 145.0063 -0.69
حمض الجلوتاميك و 146.0448 146.01 146.0408 -0.4
البنتوز 149.0445 149.04 149.0414 -0.31
حمض aconitic ل 173.0081 173.03 173.0057 -0.24
حمض الاسكوربيك و 175.0237 175.05 175.0341 1.04
هيكسوز 179،055 179.05 179.0484 -0.66
الستريك / حمض الإيزوسيتريك ل 191.0186 191.02 191.0166 -0.2
حمض البالمتيك 255.2319 255.22 255.2246 -0.73
هيكسوز 6 فوسفات و 259.0213 259.04 259،014 -0.73
حامض دهني 283.2632 283.26 283.2552 -0.8
السكروز و 341.1078 341.07 341.0972 -1.06

إجراء MS / MS لتحديد الهوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كما نوقش أعلاه، وإعداد العينات هي الخطوة الأكثر أهمية في سير العمل MSI. سوف تضمين الأنسجة بشكل غير متساو تسبب باجتزاء ليكون من الصعب أو غير الممكن في بعض الحالات. حجم القسم والوقت الكافي موازنة ضرورية للحفاظ على سلامة الأنسجة وتجنب للطي والدموع. واختيار مصفوفة وتقنية تطبيق تلعب دورا في تحديد أنواع التحاليل ليتم الكشف عن والقرار المكانية، واستنساخ النتائج. يمكن استخدام مزيج من المصفوفات أو تقنيات التطبيق تقديم نتائج التكميلية.

وقد تم تصميم هذا الأسلوب خصيصا لMSI غير مستهدفة من نواتج الأيض الذاتية في M. truncatula الأنسجة العقيدات الجذرية، ولكن يمكن بسهولة أن تتكيف مع أنواع الأنسجة الأخرى والأسئلة البيولوجية. أساليب تطبيق مصفوفة أوصت لجزيء صغير MSI هي التسامي والرش التلقائي. زيادة كمية المذيب تترسب على TISSUه، من خلال تعديل أسلوب الرش التلقائي، وزيادة استخراج التحاليل والسماح للكشف عن المركبات الشامل أعلى ينبغي للمرء أن يختار لأداء MSI من الدهون، والببتيدات وغيرها. عند استخدام أنواع أخرى من الأنسجة، وسوف يكون التعديل الرئيسي القسم سمك. من الناحية المثالية ينبغي أن شرائح الأنسجة لسمك خلية واحدة، وبالتالي أقسام سمكا ربما المناسبة لالأنسجة النباتية وأقسام أرق المناسبة لأنسجة الحيوان. في حالة حدوث تمزق أو قابلة للطي، وعادة ما يحتاج وقتا أطول موازنة قبل باجتزاء أو سمكا قسم حجم يمكن أن تكون ضرورية. عند تنفيذ LC-MS للحصول على الجماهير دقيقة، وبروتوكول استخراج الأنسجة، والمذيبات الطور المتحرك والانحدار، العمود مرحلة ثابتة، ووضع التأين MS يمكن لجميع تعديلها والأمثل للالتحاليل من الفائدة.

والميزة الرئيسية لMALDI-MSI هو قدرته على توفير المعلومات الشامل فحسب، ولكن أيضا معلومات المكانية لعينة معينةدون الحاجة إلى معرفة مسبقة من التحاليل الهدف. تقنيات التصوير الأخرى تتطلب استخدام derivatizations أو العلامات 5. كما نوقش سابقا، واحدة من قيود هذا الأسلوب هو وفرة من التدخل مصفوفة القمم أيون. وقد تم الإبلاغ عن المصفوفات رواية لمعالجة هذا القيد. بدلا من ذلك، الثانوية مطياف الكتلة ايون (سيمز) MSI هو خيار التصوير خالية من المصفوفة، ولكن كان لديه حساسية أقل من MALDI-MSI 3. قيود أخرى من هذه التقنية هو القرار الجماعي أقل من الصكوك MALDI-TOF/TOF. بسبب انخفاض كتلة حل السلطة، فمن الضروري أيضا لأداء عالية الدقة MS للحصول على الجماهير دقيقة لتحديد الأيض، مما يعني المزيد من التجارب والمزيد من الوقت. ويمكن حل هذه المشكلة عن طريق إجراء MALDI-MSI على منصة أداة عالية الدقة مثل MALDI-Orbitrap. الحد النهائي لإجراء التجارب MSI هو عدم وجود أدوات البرمجيات المتاحة لتحليل البيانات MSI، بديلهوغ بعض التطورات الحديثة في مجال البرمجيات MSI بذلت 27،28. عادة الطيف MS لكل منطقة التصوير يجب تحليل يدويا والصور المستخرجة أيون باليد. تجارب MSI تنتج وفرة من البيانات ويمكن أن يكون بشكل لا يصدق وقتا طويلا لتحليل. عموما، MALDI-MSI يوفر مزايا فريدة من نوعها للحصول على المعلومات المكانية من العديد من المركبات في وقت واحد خلال تجربة واحدة يمكن أن تكون مفيدة للغاية لتحليل غير مستهدفة من جزيئات صغيرة ومركبات أخرى مع العديد من التطبيقات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه الدكتور جان ميشيل مرة في قسم الهندسة الزراعية في جامعة ويسكونس ماديسون لتقديم عينات truncatula Medicago. وأيد هذا العمل في جزء من التمويل من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) منحة CHE-0957784، ومدرسة جامعة ويسكونسن العليا ومؤسسة ولاية ويسكونسن الخريجين بحوث (وارف) وبرنامج زمالة Romnes بحوث كلية (ليرة لبنانية). يقر EG زمالة أبحاث الدراسات العليا NSF (DGE-1256259).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Difco 214340 heat to dissolve
Cryostat- HM 550 Thermo Scientific 956564A
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides  Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix  ICN Biomedicals PI90033
Airbrush Paasche Airbrush Company TG-100D coupled with 75 ml steel container
Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer HTX Technologies, LLC HTX.TMSP.H021-U Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed
Sublimation apparatus  Chemglass Life Science CG-3038-01
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics 276601
FlexImaging Bruker Daltonics 269841 One example of "vender specific software"
MALDI LTQ Orbitrap Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMASZ High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements
Q Exactive Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
  2. van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
  3. Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
  4. Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
  5. Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
  6. Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
  7. Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
  8. West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
  9. Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
  10. Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
  11. Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
  12. Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
  13. Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
  14. Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
  15. Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
  16. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  17. Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
  18. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
  19. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
  20. Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
  21. Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
  22. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
  23. Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
  24. Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
  25. Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
  26. Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
  27. Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
  28. Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
التصوير MALDI الكتلة الطيفي للتحقيق في المستقلبات في<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; الجذر العقيدات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gemperline, E., Li, L. MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules. J. Vis. Exp. (85), e51434, doi:10.3791/51434 (2014).More

Gemperline, E., Li, L. MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules. J. Vis. Exp. (85), e51434, doi:10.3791/51434 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter