Summary
质谱成像（MSI）是一种强大的工具，可用于在完整组织中发现和鉴定各化学物种，保护化合物中的其天然环境中，它可以提供新的见解的生物过程。用于本发明的小分子的分析开发出一种MSI方法进行说明。
Abstract
用于研究小分子，如药物的药物或内源性代谢物，采用组织提取物需要所关注的组织的均匀化，可能潜在地会改变正在研究1中的代谢途径多数技术。质谱成像（MSI）是一种可以生物组织样品1-5的完整片内提供分析物的空间信息的强大的分析工具。这种技术已被广泛用于研究各种类型的化合物，包括蛋白，肽，脂质和小分子如内源性代谢物。用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）的MSI，多个代谢物的空间分布，可以同时检测到。在此，特别为豆科植物的根和根瘤中进行非靶向代谢物组的MSI实验开发了一种方法，提出这可能揭示见解发生的生物过程。该方法，这里介绍显示了一个典型的MSI的工作流程，从样品制备到图像采集，并集中于矩阵的应用步骤，表明是用于检测小分子的有用的几种基质应用技术。一旦生成了多光谱图像，感兴趣代谢物的分析鉴定，讨论和论证。标准工作流程这里介绍可以很容易地修改为不同的组织类型，分子种类，和仪器仪表。
Introduction
代谢组学领域的发展具有许多重要的生物学应用，包括生物标志物的发现，破译代谢途径在植物和其他生物系统，和毒理学分析4,6-10。研究生物系统时，一个主要的技术挑战是研究代谢途径，而不破坏它们11。 MALDI-MSI允许完整的组织的直接分析，使敏感的检测分析物的单一器官12,13，甚至单个细胞14,15。
样品制备是生产重现性好，质量可靠的光谱图像的关键一步。的图像的质量极大地依赖于因素，例如组织包埋剂，切片厚度，MALDI基质和基质的应用技术。用于成像应用中，理想的部分的厚度是1小区（8-20微米取决于样品类型）的宽度。 MALDI需要有机，晶体沉积Ë基复合材料，通常是弱酸，对样本，以协助分析消融和电离，16个不同的矩阵提供不同的信号强度，干扰离子，以及不同类别的化合物的离子化效率。
矩阵应用技术也起着质谱图像和不同的技术质量的作用适用于不同类的分析物。三个矩阵应用方法载于本协议：喷枪，自动喷雾器，和升华。喷枪矩阵应用程序已被广泛应用于MALDI成像。喷枪矩阵应用的优点在于它是相对快速和容易的。然而，喷枪矩阵应用的质量在很大程度上取决于用户的技能，而且往往是较少重现性，并导致被分析物的扩散，特别是小分子17。自动喷雾系统也有类似的机制，以喷枪矩阵的应用，但甲肝Ë已经发展到去除看到与手动喷枪应用程序的多变性，使得喷雾更具有可重复性。这种方法有时会耗费更多的时间比传统喷枪矩阵的应用。手动喷枪，自动喷雾系统是溶剂型矩阵的应用方法。升华是，正成为越来越流行的代谢物和小分子的质谱成像，因为它减少分析物扩散的干基质的应用技术，但它缺乏必要的溶剂提取，并观察更高质量的化合物18。
自信鉴定代谢物通常需要精确质量测量，以获得公认的鉴定其次是串联质谱（MS / MS）的实验进行验证，与MS / MS谱图相比，目前的标准，文学，或理论光谱。在这个协议中高分辨率（质量分辨60,000 m / z为400的电源），液相色谱（LC）-MS连接到MALDI-MSI同时获得空间信息和内源性代谢物鉴定信心，用苜蓿根系和根瘤的生物系统。 MS / MS实验，可直接执行的组织与MALDI-MSI或组织提取物的LC-MS和用于代谢物的鉴定的验证。
该协议提供了一种简单的方法来映射内源性代谢物M。苜蓿 ，这可适应和应用于在各种组织类型和生物系统的小分子的MSI。
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Protocol
1。仪器仪表
- MALDI-TOF/TOF微星。使用质谱仪配备了MALDI源小分子的分析（见表材料/设备）。在正或负离子模式取决于目标分析物进行收购。指定所关注的质量范围内，并在50微米的间隔在两个跨样本生成离子图像的表面的x和y维度收集500次激光发射/斑点。激光照射的光栅宽度和数量可以调节，分别得到更高的空间分辨率和最大信号强度。使用DHB基质峰或施加于滑动或直接向组织校准质谱内部标准。
- 高分辨率LC-MS。 （见表材料/设备）运行样品提取物使用任一反相（RP）的LC与C-18柱，或正相（NP）与HILIC柱根据相关分析物的LC-MS分析。用流动相和使之适用于特定样品类型梯度。在正或负的离子模式取决于样品类型进行采集。
2。组织准备
- 从修剪植物的根瘤，留下3-4毫米根部附着于结节。
- 立即解剖后，使用镊子将组织在低温恒温器杯和盖在明胶（100毫克/毫升的去离子水）。至关重要的是，所述组织被粘在杯的无气泡的底部。
- 闪光通过将杯子在干冰/乙醇浴中，直到明胶硬化并变得不透明冻结的组织。店内样品于-80℃直至使用。
- 从取出样品-80℃冰箱，剪去塑料低温恒温杯和修剪掉多余的明胶。安装包埋组织的低温恒温器与卡盘的最佳切割温度（OCT），媒体一角钱大小的量，而不是让华侨城触碰组织。放置在低温恒温器框，直到华侨城凝固。
- 允许所述卡盘和明胶在低温恒温器箱（设定为-20℃或-25℃）中平衡约15分钟。
- 使用低温恒温器（见表材料/设备），以部分组织1细胞的约的厚度（8-20微米取决于组织类型）和解冻温热的背面（非ITO装载每个片上ITO膜的玻璃涂在手上的背面涂有ITO的玻璃载片的一侧）。将冷冻组织切片靠近温热滑动的带ITO膜的一侧，并允许片粘到滑动。配售部分并拢的幻灯片将微星过程中提供更好的定位。
3。矩阵的应用
- MALDI基质的喷笔应用
- 所有的喷枪程序应在通风橱中进行。
- 彻底清洁喷枪液的容器和喷嘴（见表材料/设备），以甲醇和填充溶液的容器与DHB基质溶液（150毫克/毫升50％甲醇％TFA体积/体积）。
- 从样品约35厘米握住喷枪和应用10-15涂层基体的滑动表面上以10秒的喷射持续时间和在各涂层之间30秒的干燥时间。
- 彻底完成时，避免基质溶液堵塞用甲醇再次清洁喷枪。
- MALDI基质自动喷雾机的应用
- 遵循自动喷雾器系统的制造商提供的启动指令。
- 在使用40毫克/毫升的根瘤代谢物的MSI（在50％甲醇％TFA体积/体积）DHB作为基质，设定温度为〜80℃，速度到1250毫米/分钟，流速为50微升/分钟，并通到24的数。为了获得最佳覆盖，建议以旋转喷嘴90°和/或偏移每遍之间的喷嘴1.5毫米。启动喷雾器方法。
作为SI去说明，这里使用的特定的喷雾器系统，加热喷嘴的溶剂的蒸发速度更快。作为溶剂蒸发时，该矩阵的浓度迅速增加。施加到样品的喷枪和自动喷雾器中的矩阵具有可比的浓度。 - 遵循由自动喷雾器系统的制造商提供的关机指令。
- MALDI基质的升华应用
- 称出300毫克DHB进入升华室的底部（见表的材料/设备）。
- 粘在载玻片上的指形冷冻器（在升华室的顶部部分）与组织切片朝下用双面导电胶带。盖在所述双面胶带的滑动，即使导电性的整个背面，产生甚至基质沉积。
- 夹紧升华室的顶部和底部两半连同C形夹。连接真空和广告ð冰和冷水顶端水库。
- 放置升华室中的加热套是在室温下。
- 打开真空泵。等待15分钟，然后打开加热套。加热套应达到120℃以上10分钟的过程。
- 10分钟后，关闭加热，关闭阀门，以真空（这样所述腔室的内部保持在真空条件下），然后将真空泵关闭。
- 允许该腔室，以恢复到室温，打开阀门释放真空压力，取出样品。在升华室的尺寸将确定矩阵的升华到载玻片上的量。较大的升华室（400毫升烧杯中的尺寸）将使用大约300毫克DHB的，而较小的腔室（150毫升烧杯中的尺寸）将使用大约100毫克DHB的，并且需要切割的玻璃载玻片，以便它适合在该腔室。
4。图像采集
- <LI>标记样品的每一个角落+模式与WiteOut涂改液笔被用来作为“教点”。将载玻片放入MALDI滑接板，并用扫描仪取的样品的光学图像。
- 使用仪器公司为50μm的光栅的步长和激光直径等于或小于光栅的步长越小提供的软件设置的图像获取的文件。在这个特殊的仪器，最小激光设置给出的约10微米的和小的激光设置一个激光直径具有40-50微米的直径。
- 加载光学图像进入软件并与光学图像对准板。
- 使用常见的矩阵簇离子，内部标准，或校准组合开始收购前对仪器进行校准。
- 组织指定的区域与MSI进行分析，包括纯矩阵的投影片上的斑点被用来作为一个“空白”。
- 交流开始quisition。
5。图像生成
- 在由供应商提供的商业软件打开成像文件并提取离子图像。其他开源软件是供微星数据处理19。
6。代谢物鉴定
- 选择特定米/利息，自质谱使用供应商特定的软件Z（见表材料/设备）。分析物可以从一个矩阵离子进行区分时被分析物峰的质谱选择和产生离子的图像特异性定位于组织部分。
- 生成感兴趣的分析物的列表，并执行MS / MS实验。 见表1和表2中的分析物的样品清单代表性的成果。
- 进行有针对性的LC-MS分析在高分辨率质谱仪（或高分辨率MALDI-MS如果有的话），以获得准确感兴趣的分析物的质量测量，并进行目标分析物的LC-MS/MS得到的特征裂解方式。
- 搜索以确定假定的标识为目标分析物进行数据库。代谢物数据库的例子包括：METLIN，ChemSpider，PubChem数据库，KEGG和HMDB。
- 以确认从精确质量数据库检索推定的标识，匹配的MS / MS的目标分析物的标准文献，和/或碎裂预测软件MS / MS谱图。
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Representative Results
MSI的实验概述示于图1。在实验的开始，样品制备是关键的一步。结节是从植物根修剪和嵌入在明胶。该组织必须被压平的低温恒温器茶杯中，用无气泡，而它被冻结，这将确保组织更容易和正确对齐，而它被切开。当组织已经被切片，重要的是要切断的组织在适当的厚度;太薄部分撕裂，搞坏了组织的完整性，而过厚的部分会降低分析物提取的，并从组织检测到的数量。选择矩阵和应用技术将确定检测到的分析物的类型。使用矩阵的组合可以提供互补的结果。三个矩阵应用技术都在此工作。该喷枪技术是快速，但通常不适合用于小分子的微星是原因分析物的扩散。自动喷涂系统和升华提供更小的基质晶体，更好的重现性和更少的分析物的扩散， 图2示出了蒺藜苜蓿根瘤部分的光学图像， 图3示出了使用喷枪的基质覆盖和结晶尺寸的光学图像例如，自动喷雾器，和升华分别。
常规基质，像DHB，产生许多离子在低质量范围（M / Z 100-400）20。这些基质的离子可以在该范围内的代谢物的检测干涉图4示出了刚刚DHB基质的MS谱图相比根瘤组织涂上DHB基质。 DHB基质峰显示为红色和根瘤组织覆盖DHB以蓝色显示。新颖的基质诸如TiO 2的纳米颗粒21，1,5 - diaminonapthalene（DAN）22，2,3,4,5 -四（3'，4'-dihydroxylphenyl）噻吩（DHPT）23，和1,8 -双（二甲基氨基）萘（DMAN）24,25已被报道，减少在低质量范围基质离子的干扰，又提高了某些类的检测的代谢产物5。基质峰可以利用多光谱图像真正的代谢物区别开来。当一个峰值被点击时，离子图像被提取出来并显示重叠的光学图像。该具有独特定位到组织生成的图像，并且不存在于唯一的区域成像的矩阵的那些峰，被认为是代谢物。 图5a示出根瘤组织中发现的代谢物的几种有代表性的离子的图像，而图5b示出了MS的图像的示例对应于矩阵相关的山峰。在图5a中的图像示出了不同的本地化的根瘤组织和在被成像的矩阵只区域缺乏信号。在图5b中M.分析物的样品列表苜蓿根瘤组织列于表1（正离子模式）和表2（负模式）4。
无目标代谢组学实验的最终目标是确定检测到的化合物。当在中等分辨率仪（MRMS），如一个TOF / TOF执行MSI，有必要获得以不同的方式精确质量测量。这可以用一个多方面的MS的方法，其中MALDI-MSI的结果相比，使用组织提取物高分辨率LC-MS数据来完成。有许多可能的组织提取协议从根据感兴趣的分析物进行选择。高分辨率质谱（HRMS）可以在正或负电离莫来执行DES和与正相或反相LC取决于所感兴趣的分析物。一旦精确质量是与高分辨率LC-MS获得的，由此产生的质量可以搜索与多个数据库，前面列出的，得到的推定的鉴定。接下来的MS / MS数据采集和所关注分析物的特征碎片图案可以比标准文献光谱，或理论的碎片图案。 图6示出与MSI和LC-MS检测到的代谢物之一的一个例子。该代谢物被确定为基于与高分辨率LC-MS收集的MS / MS图谱的血红素。这样的MS / MS数据进行比较之前发表的由见撒母耳和Setou 26的MS / MS谱图。这两个MS / MS谱图匹配，因此M / Z 616.2的身份是自信地指定为基于比较文学MS / MS数据的精确质量数据库搜索和MS / MS数据血红素。
图1。的MSI的工作流程。根瘤概述是从植物，嵌入在明胶中，切片用低温恒温器修剪和安装在涂有ITO的玻璃载片上。矩阵是使用三个矩阵的应用技术之一，应用到幻灯片中。微星收购进行了MALDI-TOF/TOF质谱仪及质谱被编译成与微星软件映像。
图2。组织样品的光学图像。一个蒺藜苜蓿根瘤组织切片的代表性的光学图像。
图3。例如基质沉积。示出了 ）喷枪，b）自动喷雾器，和c）升华技术基质沉积的不同浓度的代表性图像。该喷枪应用方法生成大大小小的水晶而自动喷雾器方法产生均匀的小大小的晶体。升华产生一个均匀的一层基质。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。解放军质谱在DHB基质与根瘤组织覆盖DHB。DHB基质峰显示为红色和根瘤组织覆盖DHB以蓝色显示。基质峰可以利用多光谱图像真正的代谢物区别开来。当一个峰值被点击时，离子图像被提取出来并显示重叠的光学图像。与不同的本地化的组织生成图像，这些山峰中不存在唯一的区域成像矩阵，被认为是代谢产物。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图5。 米的多光谱图像蒺藜苜蓿根瘤。一 ）代谢物f代表离子图像OUND在野生型分枝蒺藜苜蓿根瘤。 二），将不被视为代谢基质种类的代表离子的图像。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6。例如MS / MS数据进行代谢物的鉴定。M / Z 616.2，确定为血红素[M +]的MS / MS图谱。的化学结构示和碎片结构分配。实验的MS / MS数据进行比较，血红素由见撒母耳和Setou 26与文献报道的MS / MS图谱。
表1中。感兴趣的分析物-肛门的积极模式样本名单从M.兴趣ytes 苜蓿根瘤组织正离子模式4。
| 代谢产物的名称 | 理论[M + H] | MRMS实测[M + H] + | 人力资源管理系统测得的[M + H] | ΔM（MDA） |
| γ-氨基丁酸的一 | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| 胆碱一，* | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0.01 |
| 脯氨酸 | 116.0706 | 116.07 | 116.0706 | 0 |
| 缬氨酸 | 118.0863 | 118.09 | 118.0865 | 0.02 |
| 亮氨酸 | 132.1019 | 132.1 | 132.1022 | 0.03 |
| 天冬酰胺一 | H：79px;“> 133.0608133.06 | 133.0602 | -0.06 | |
| 一个腺嘌呤 | 136.0618 | 136.07 | 不适用 | 不适用 |
| proling甜菜碱一 | 144.1019 | 144.1 | 144.1024 | 0.05 |
| 谷氨酰胺 | 147.0764 | 147.09 | 147.0768 | 0.04 |
| 156.0768 | 156.06 | 156.0771 | 0.03 | |
| 一精氨酸 | 175.1190 | 175.13 | 175.1167 | -0.23 |
| 蔗糖+ K | 381.0794 | 381.05 | 381.0791 | -0.03 |
| 血红素A，* | 616.1768 | 616.15 | 不适用 | 不适用 |
| HT =“25”的风格=“高度：26px;宽度：173px;”> NAD 一 | 664.1164 | 664.1 | 不适用 | 不适用 |
| 芒柄花素一 | 269.0808 | 269.08 | 269.0803 | 0.05 |
| chrysoseriol中，GlcA 一个 | 477.1028 | 477.1 | 477.1008 | 0.2 |
| 芒柄花素MalGlc 一个 | 517.1341 | 517.13 | 517.1337 | IDþ：64PX;“> 0.04|
| aformosin MalGlc 一个 | 547.1446 | 547.16 | 547.1427 | 0.19 |
* [M +]。
在 MS / MS进行鉴定。
表2。感兴趣的分析物-的兴趣M.分析物的消极模式样本名单苜蓿根瘤组织中负离子模式4。
| 代谢产物的名称 | 理论[MH] - | MRMS测量[MH] - < / SUP> | HRMS实测[MH] - | ΔM（MDA） |
| 丙酮酸 | 87.0077 | 87 | 不适用 | 不适用 |
| 丙氨酸 | 88.0393 | 88.01 | 88.0374 | -0.19 |
| 乳酸的 | 89.0233 | 89.01 | 89.0296 | 0.63 |
| 磷酸 | 96.9685 | 96.96 | 96.9625 | -0.6 |
| 2 - 氧代丁酸 | 101.0233 | 101.02 | 101.0191 | -0.42 |
| 10205.5 | 102.04 | 102.0528 | -0.22 | |
| 丝氨酸 | 104.0342 | 104.02 | 104.0228 | -1.14 |
| 马来酸/富马酸一 | 115.0026 | 115.03 | 115 | -0.26 |
| 琥珀酸一 | 117.0182 | 117.01 | 117.0125 | -0.57 |
| 苏氨酸 | 118.0499 | 118.04 | 118.0456 | -0.43 |
| 草酰乙酸 | 130.9975 | 131.03 | 130.991 | -0.65 |
| 天冬氨酸一 | 132.0291 | 132.03 | 132.0256 | -0.35 |
| 苹果酸一 | 133.0132 | 133.02 | 133.0221 | 0.89 |
| 水杨酸 | 137.0233 | 137.02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-酮戊二酸 | 145.0132 | 145.02 | 145.0063 | -0.69 |
| 谷氨酸一 | 146.0448 | 146.01 | 146.0408 | -0.4 |
| 戊糖 | 149.0445 | 149.04 | 149.0414 | -0.31 | </ TR>
| 乌头酸 | 173.0081 | 173.03 | 173.0057 | -0.24 |
| 抗坏血酸 | 175.0237 | 175.05 | 175.0341 | 1.04 |
| 己糖 | 179.055 | 179.05 | 179.0484 | -0.66 |
| 柠檬酸/异柠檬酸一 | 191.0186 | 191.02 | 191.0166 | -0.2 |
| 棕榈酸 | 255.2319 | 255.22 | 255.2246 | -0.73 |
| 己糖-6 -磷酸一 | 259.0213 | 259.04 | 259.014 | -0.73 |
| 硬脂酸 | 283.2632 | 283.26 | 283.2552 | -0.8 |
| 蔗糖 | 341.1078 | 341.07 | 341.0972 | -1.06 |
在 MS / MS进行鉴定。
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Discussion
如上所述，样品的准备是在MSI的工作流程中最关键的步骤。不均匀地嵌入组织将导致切片是在某些情况下难于或不可能的。截面尺寸和足够的平衡时间是至关重要的维持组织的完整性，避免折叠和泪水。选择矩阵和应用技术将在确定待检测的分析物的种类的作用，空间分辨率，其结果的再现性。使用矩阵或应用技术的组合可以提供互补的结果。
这个方法是专门为内源性代谢物在M不相关的微星设计苜蓿根瘤组织，但可以很容易地适应其它类型的组织和生物学问题。对于小分子微星推荐的矩阵应用方法是升华和自动喷雾器。增加溶剂沉积在布甲的量E，通过调整自动喷雾器方法，会增加分析物的提取和允许检测的更高质量的化合物1应该选择执行脂质，肽等的MSI。当使用其他类型的组织，主要调整将是截面厚度。理想情况下，组织应切成1电池的厚度，因此较厚的部分也许适合于植物组织和适当的动物组织较薄部分。如果折叠或撕裂时，通常较长的平衡时间，需要切片之前或较厚的截面尺寸可以是必要的。当进行LC-MS获得精确质量，组织提取协议，流动相溶剂和梯度，柱固定相，和MS电离模式都可以被调整为与所关注的分析物进行了优化。
MALDI-MSI的主要优点是它不仅提供海量信息的能力，同时也空间信息对于给定的样本而不需要对目标分析物的先验知识。其他成像技术需要使用衍生化或标签5。如前面所讨论的，这种技术的一个限制是干涉矩阵离子峰的丰度。新颖矩阵已报道解决了这一限制。或者，二次离子质谱（SIMS）-MSI是一个矩阵自由成像选项，但是，它具有比MALDI-MSI 3灵敏度更低。这种技术的另一个限制是MALDI-TOF/TOF仪器的下部的质量分辨率。因为低质量分辨能力，有必要也进行高分辨率MS获得精确质量为代谢物的鉴定，这意味着更多的实验和更多的时间。这个问题可以通过一个高分辨率的仪器平台，如MALDI-轨道阱上进行MALDI-MSI可以解决。执行微星实验的最终限制是缺乏软件工具可用于微星数据分析，ALT霍夫在微星软件的一些最新进展作了27,28。典型的MS谱为每个成像区域必须手动进行分析并提取用手离子的图像。微星实验产生的数据的丰富性和可令人难以置信的耗时分析。总体而言，MALDI-MSI提供了独特的优点，在单一实验中，可用于小分子和其它化合物具有许多生物学应用的无针对性的分析极为有用同时获得许多化合物的空间信息。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者要感谢让-米歇尔·ANE博士农艺学系威斯康星大学麦迪逊分校提供蒺藜苜蓿样品。这项工作是由美国国家科学基金会（NSF）提供资金支持部分补助CHE-0957784，威斯康星大学的研究生院和威斯康星校友研究基金会（WARF）和Romnes学院研究奖学金计划（以当地雇员）。 EG承认了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1256259）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
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