Summary
Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil puissant qui peut être utilisé pour découvrir et identifier les différentes espèces chimiques dans les tissus intacts, en préservant les composés dans leur environnement naturel, qui peuvent fournir de nouvelles perspectives dans les processus biologiques. Ici un procédé MSI développé pour l'analyse de petites molécules est décrite.
Abstract
La plupart des techniques utilisées pour l'étude de petites molécules, telles que les produits pharmaceutiques ou les métabolites endogènes, utiliser les extraits de tissus qui nécessitent l'homogénéisation du tissu d'intérêt qui pourraient provoquer des changements dans les voies métaboliques étudiées 1. Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil d'analyse puissant qui peut fournir des informations spatiales d'analytes dans des tranches intactes d'échantillons de tissus biologiques 1-5. Cette technique a été largement utilisée pour étudier divers types de composés, y compris les protéines, les peptides, les lipides et les petites molécules telles que les métabolites endogènes. Avec laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI)-MSI, les distributions spatiales de plusieurs métabolites peuvent être détectés simultanément. Ici, une méthode développée spécifiquement pour la conduite non ciblées métabolomique expériences MSI sur les racines des légumineuses et des nodules racinaires est présenté qui pourrait révéler un aperçu des processus biologiques qui ont lieu. Laméthode présentée ici montre un flux de production typique MSI, à partir de la préparation des échantillons pour l'acquisition d'images, et met l'accent sur l'étape d'application de la matrice, ce qui montre plusieurs techniques d'application de matrice qui sont utiles pour la détection de petites molécules. Une fois les images MS sont générés, l'analyse et l'identification des métabolites d'intérêt sont discutés et démontrés. Le workflow standard présenté ici peut être facilement modifié pour différents types de tissus, des espèces moléculaires et de l'instrumentation.
Introduction
Le domaine en pleine croissance de la métabolomique a de nombreuses applications biologiques importants, notamment la découverte de biomarqueurs, déchiffrer les voies métaboliques des plantes et d'autres systèmes biologiques, et de la toxicologie profilage 4,6-10. Un défi technique majeur lors de l'étude des systèmes biologiques est d'étudier les voies métabolomique sans les perturber 11. MALDI-MSI permet une analyse directe de tissus intacts qui permet la détection sensible des analytes dans les organes simples 12,13 et même des cellules individuelles 14,15.
La préparation des échantillons est une étape cruciale dans la production d'images de spectrométrie de masse fiables et reproductibles. La qualité des images dépend grandement de facteurs tels que le tissu support d'enrobage, l'épaisseur de coupe, une matrice MALDI, et la technique d'application de la matrice. Pour des applications d'imagerie, de l'épaisseur de section idéal est la largeur d'une cellule (8-20 um en fonction du type d'échantillon). MALDI nécessite le dépôt d'une organique, cristalline composé de matrice, typiquement un acide faible, sur l'échantillon pour faciliter l'ablation analyte et de l'ionisation. Différentes matrices 16 fournissent différentes intensités de signal, des ions interférents et l'efficacité d'ionisation des différentes classes de composés.
La technique d'application de la matrice joue également un rôle dans la qualité des images spectrales de masse et de différentes techniques appropriées pour les différentes classes d'analytes. Trois méthodes d'application de la matrice sont présentés dans ce protocole: aérographe, pulvérisateur automatique, et la sublimation. Airbrush l'application de la matrice a été largement utilisé dans l'imagerie MALDI. L'avantage de l'application de la matrice aérographe est qu'il est relativement facile et rapide. Cependant, la qualité de l'application de la matrice de l'aérographe dépend fortement de la compétence de l'utilisateur et a tendance à être moins reproductible et provoquer la diffusion d'analytes, en particulier des petites molécules 17. Systèmes de pulvérisation automatiques ont mécaniciens similaires à l'aérographe demande de matrice, mais le VHAe été mis au point pour éliminer la variabilité observée avec l'application manuelle de l'aérographe, faisant de la pulvérisation plus reproductible. Cette méthode peut parfois être plus de temps que l'application traditionnelle de la matrice de l'aérographe. Les deux aérographe manuel et systèmes de pulvérisation automatiques sont les méthodes d'application de la matrice à base de solvants. La sublimation est une technique d'application de matrice sèche qui devient de plus en plus populaire pour l'imagerie par spectrométrie de masse des métabolites et des petites molécules, car il réduit la diffusion de l'analyte, mais il lui manque la nécessaire solvant pour extraire et observer composés de masse plus élevées 18.
Identification confiante de métabolites nécessite généralement des mesures de masse précises pour obtenir des identifications putatifs suivie par de masse en tandem (MS / MS) des expériences de validation, avec spectres MS / MS est comparé aux normes, la littérature, ou spectres théoriques. Dans ce protocole haute résolution (puissance de 60 000 à m / z 400 résoudre masse), la chromatographie liquide (LC)-MS est couplé à MALDI-MSI à obtenir à la fois l'information spatiale et identifications confiants de métabolites endogènes, en utilisant Medicago truncatula racines et nodosités des racines comme le système biologique. Expériences MS / MS peuvent être effectuées directement sur le tissu avec MALDI-MSI ou d'extraits de tissus avec LC-MS et utilisés pour la validation des identifications de métabolites.
Ce protocole fournit une méthode simple pour cartographier métabolites endogènes dans M. truncatula, qui peut être adapté et appliqué à MSI de petites molécules dans différents types de tissus et les systèmes biologiques.
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Protocol
Une. Instrumentation
- MALDI-TOF/TOF MSI. Utilisez un spectromètre de masse équipé d'une source MALDI pour l'analyse de petites molécules (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Effectuer des acquisitions en mode ion positif ou négatif selon les analytes d'intérêt. Spécifiez une plage de masse de l'intérêt et de recueillir 500 coups laser / spot à 50 um intervalles à la fois les dimensions x et y sur la surface de l'échantillon pour produire des images d'ions. La largeur de la trame et le nombre de tirs laser peuvent être ajustés pour obtenir une résolution spatiale plus élevée et une intensité de signal maximale, respectivement. Utilisation de la matrice DHB pics ou des étalons internes appliquées à la glissière ou directement au tissu de calibrer les spectres de masse.
- Résolution LC-MS haute. (Voir le tableau des Matériaux / Équipement) extraits d'échantillons Exécuter avec LC-MS en utilisant soit en phase inverse (RP) LC avec une colonne C-18, ou phase normale (NP) avec une colonne HILIC selon les analytes d'intérêt. Utilisez phases mobiles etgradients comme appropriés pour le type d'échantillon spécifique. Effectuer des acquisitions en modes d'ions positifs ou négatifs en fonction du type d'échantillon.
2. Préparation des tissus
- Coupez le nodule de racine de la plante, laissant 3-4 mm de racine attachés au nodule.
- Immédiatement après dissection, utiliser une pince pour placer le tissu dans une tasse de cryostat et couvrir avec de la gélatine (100 mg / ml dans de l'eau déminéralisée). Il est essentiel pour le tissu devant être collé au fond de la tasse, sans bulles d'air.
- Flash geler le tissu en plaçant la tasse dans un bain de glace carbonique / éthanol jusqu'à ce que la gélatine durcit et devient opaque. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Retirer les échantillons du congélateur à -80 ° C, couper la coupe du cryostat plastique et éliminer les excès de gélatine. Montez le tissu intégré à la pince de cryostat avec une quantité de taille dime de la température de coupe optimale (OCT) médias, tout en ne laissant pas les PTOM toucher le tissu. Placez dans cryostatboîte jusqu'à la solidification PTOM.
- Autoriser le mandrin et la gélatine de s'équilibrer dans la boîte de cryostat (de série à -20 ou -25 ° C) pendant environ 15 min.
- Utilisez le cryostat (voir le tableau des Matériaux / Équipement) de l'article tissu environ l'épaisseur d'une cellule (8-20 um selon le type de tissu) et dégel monter chaque tranche sur le verre revêtu d'ITO en chauffant le dos (non-ITO côté) d'une lame de verre revêtu d'ITO sur le dos de votre main-enduit. Placez le côté revêtu d'ITO de la glissière réchauffé à proximité de la tranche de tissu congelé et permettre à la tranche de coller sur la lame. Placer les sections rapprochées sur la diapositive fournira un meilleur alignement pendant MSI.
3. Matrice d'application
- Airbrush application de MALDI Matrice
- Toutes les procédures de l'aérographe doivent être effectuées dans une hotte.
- Bien nettoyer le récipient de solution à l'aérographe et la buse (voir le tableau des Matériaux / Équipement) avec du méthanol etremplir le récipient de la solution avec une solution de matrice DHB (150 mg / ml dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v).
- Maintenir l'aérographe environ 35 cm à partir de l'échantillon et d'appliquer de 10 à 15 couches de matrice sur la surface de la lame d'une durée de 10 sec 30 sec pulvérisation et le temps de séchage entre chaque couche.
- Bien nettoyer l'aérographe à nouveau avec du méthanol lorsque vous avez terminé pour éviter le colmatage de la solution de matrice.
- Demande pulvérisateur automatique de MALDI Matrice
- Suivez les instructions de démarrage fournis par les fabricants du système de pulvérisation automatique.
- Pour MSI de métabolites dans les nodules des racines à l'aide de 40 mg / ml (dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v) DHB comme matrice, régler la température à ~ 80 ° C, la vitesse de 1250 mm / min, le débit à 50 ul / min, et le nombre de passes à 24. Pour une meilleure protection, il est recommandé de faire pivoter la buse 90 ° et / ou de décalage de la buse de 1,5 mm entre chaque passe. Lancer méthode de pulvérisation.
Comme un SIde note, le système de pulvérisation particulière utilisée ici chauffe la buse pour l'évaporation rapide du solvant. Comme le solvant s'évapore, la concentration de la matrice augmente rapidement. La matrice appliquée à l'échantillon avec l'aérographe et le pulvérisateur automatique ont des concentrations comparables. - Suivez les instructions de mises à l'arrêt fournies par les fabricants du système de pulvérisation automatique.
- Application de sublimation matrice MALDI
- Peser 300 mg DHB dans le fond de la chambre de sublimation (voir le tableau des Matériaux / Équipement).
- Collez la lame de verre au doigt froid (partie supérieure de la chambre de sublimation) avec les sections de tissus vers le bas avec du ruban adhésif double-face conductrice. Couvrir l'ensemble du dos de la lame avec le ruban adhésif double face, même pour la conductivité, la production même dépôt de matrice.
- Serrer les moitiés supérieure et inférieure de la chambre de sublimation avec le serre-joint. Connectez le vide et annonced glace et l'eau froide dans le réservoir supérieur.
- Placer la chambre de sublimation dans une enveloppe chauffante qui est à la température ambiante.
- Mettre en marche la pompe à vide. Attendez 15 minutes et tourner sur le chauffe-ballon. Le chauffe-ballon doit atteindre 120 ° C au cours de 10 min.
- Après 10 minutes, éteindre le feu, fermer le robinet à vide (si l'intérieur de la chambre reste sous vide) et arrêter la pompe à vide.
- Laisser la chambre pour venir à la température ambiante, ouvrir la vanne en relâchant la pression à vide et retirer l'échantillon. La taille de la chambre de sublimation permettra de déterminer la quantité de matrice sublimé à la lame de verre. Les grandes sublimation chambres (la taille d'un bécher de 400 ml) utilisent environ 300 mg de DHB tandis que les chambres plus petites (de la taille d'un bécher de 150 ml) utilisent environ 100 mg de DHB et il faudra couper la lame de verre de sorte qu'il s'inscrit dans la chambre.
4. Acquisition de l'image
- <li> Marquer un modèle + à chaque coin de l'échantillon avec un stylo WiteOut de fluide de correction pour être utilisé comme "enseigner points". Placez la lame de verre dans la plaque de l'adaptateur de diapositives MALDI et prendre une image optique de l'échantillon à l'aide d'un scanner.
- Mettre en place un fichier d'acquisition d'image en utilisant le logiciel fourni par le fabricant de l'appareil avec une taille de pas de trame de 50 um et un diamètre de laser égale ou plus petite que la taille de pas de trame. Sur cet instrument particulier, le réglage du laser donne un diamètre minimum de laser d'environ 10 um et petit réglage de laser a un diamètre de 40 à 50 um.
- Chargez l'image optique dans le logiciel et aligner la plaque avec l'image optique.
- Étalonner l'instrument avant de commencer l'acquisition en utilisant des ions communs de la matrice de munitions, des normes internes, ou un mélange d'étalonnage.
- Spécifiez les zones de tissu à analyser avec MSI, y compris une place de matrice pure sur la diapositive pour être utilisé comme un «blanc».
- Commencez acquisition.
5. Génération de l'image
- Ouvrez le fichier d'image dans le logiciel disponible dans le commerce fournies par le vendeur et extraire les images d'ions. Autres logiciels open-source est disponible pour MSI traitement de données 19.
6. Identification des métabolite
- Sélectionner un spécifique m / z d'intérêt à partir du spectre de masse en utilisant le logiciel spécifique du fournisseur (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Un analyte peut être distingué d'un ion de matrice quand un pic de l'analyte est choisi dans le spectre de masse et des images d'ions sont générés spécifiquement localisée dans la section de tissu.
- Générer la liste des analytes d'intérêt et effectuer des expériences MS / MS. Voir le tableau 1 et tableau 2 résultats représentatifs pour les listes d'analytes de l'échantillon.
- Effectuer une analyse ciblée LC-MS sur un spectromètre de masse à haute résolution (ou haute résolution MALDI-MS si disponible) pour obtenir précismesures de la masse des analytes d'intérêt et aussi effectuer LC-MS/MS des analytes cibles pour obtenir des motifs de fragmentation caractéristiques.
- Effectuer base de données de recherche afin de déterminer les identifications putatifs pour les analytes ciblés. Exemples de bases de données sur les métabolites comprennent: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, et BDMH.
- Pour confirmer les identifications putatifs de précision recherche de base de données de masse, correspondre à la MS / MS des analytes ciblés de spectres MS / MS de normes, de la littérature, et / ou logiciels de prédiction de la fragmentation.
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Representative Results
Une vue d'ensemble de MSI expérimental est représenté sur la figure 1. Au tout début de l'expérience, la préparation des échantillons est une étape critique. Les nodules sont supprimés de la racine de la plante et intégrés dans de la gélatine. Le tissu doit être plaqué contre la coupe du cryostat, sans bulles, alors qu'il est gelé, ce qui permettra d'assurer un alignement plus facile et correcte du tissu pendant qu'il est sectionné. Lorsque le tissu est coupé, il est important de couper le tissu à la bonne épaisseur, trop mince de sections seront déchirer, ruiner l'intégrité des tissus, tandis que trop épaisse de sections permettront de réduire le nombre d'analytes extraits et détectés à partir du tissu. Sélection de la matrice et la technique d'application permettra de déterminer les types d'analytes détectés. En utilisant une combinaison de matrices pourrait fournir des résultats complémentaires. Trois techniques d'application de matrice sont présentés dans ce travail. La technique de l'aérographe est rapide, mais généralement pas adapté pour MSI de petites molécules êtrecause de la diffusion de l'analyte. Les systèmes de pulvérisation automatiques et sublimation fournissent les petits cristaux de matrice, une meilleure reproductibilité et une moindre diffusion de l'analyte. Figure 2 montre une image optique d'une partie des nodules des racines de Medicago truncatula. Figure 3 montre un exemple d'image optique de la couverture de la matrice et de cristaux de tailles à l'aide de l'aérographe, automatique pulvérisateur, et la sublimation respectivement.
Les matrices classiques, comme DHB, produisent de nombreux ions dans la gamme de masse inférieur (m / z 100-400) 20. Ces ions de matrice peuvent interférer avec la détection de métabolites de cette gamme. Figure 4 montre les spectres de MS juste matrice DHB par rapport au tissu de nodule de racine revêtu de matrice DHB. DHB matrice pics sont indiquées dans le tissu rouge et nodules racinaires recouvert de DHB est représentée en bleu. Novel matrices telles que des nanoparticules de TiO 2, 21 1,5-diaminonapthalene (DAN) 22, 2,3,4,5-tétrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) thiophène (DHPT) 23, et 1,8-bis (diméthyl-amino) naphtalène (DMAN) 24,25 ont été rapportées qui permettent de réduire l'interférence des ions de matrice dans la gamme de masse faible, et également d'améliorer la détection de certaines classes de métabolites 5. pics de matrice peuvent être distingués des vrais métabolites à partir des images de la SP. Quand une crête est cliqué, l'image d'ions est extrait et affiché recouvrant l'image optique. Ces pics qui génèrent des images avec une localisation distincte pour le tissu, et ne sont pas présents dans la matrice seule zone imagée, sont considérés comme des métabolites. Figure 5a montre plusieurs images d'ions représentatifs de métabolites présents dans les tissus des nodules racinaires, tandis que la figure 5b montre des exemples d'images MS correspondant à la matrice sommets connexes. Sur la figure 5a montre l'image distincte à la localisation tissulaire des nodules racinaires et de l'absence de signal dans la matrice seule zone qui est imagé. Dans la Figure 5b M. truncatula tissus des nodules racinaires est listé dans le tableau 1 (mode positif) et le tableau 2 (mode négatif) 4.
L'objectif final de l'expérimentation métabolomique non ciblées est d'identifier les composés qui ont été détectés. Lors de l'exécution MSI sur un instrument de moyenne résolution (en MRMS), comme une TOF / TOF, il est nécessaire d'obtenir des mesures de masse précises d'une manière différente. Cela peut être fait avec une approche à multiples facettes MS dont les résultats MALDI-MSI sont comparés à haute résolution des données LC-MS en utilisant des extraits de tissus. Il existe de nombreux protocoles possibles d'extraction de tissu à choisir en fonction des analytes d'intérêt. SM à haute résolution (HRMS) peut être effectuée dans le mois d'ionisation positive ou négativedes et LC en phase normale ou inversée selon les analytes d'intérêt. Une fois une masse précise est obtenue avec une grande résolution LC-MS, la masse résultante peut être recherchée avec plusieurs bases de données, énumérés précédemment, pour obtenir une identification putative. Données suivante MS / MS sont recueillies et le motif de fragmentation caractéristique de l'analyte d'intérêt peut être comparé à des normes, des spectres de la littérature ou des modèles de fragmentation théoriques. Figure 6 montre un exemple de l'un des métabolites détectés avec MSI et LC-MS. Ce métabolite a été identifié comme l'hème à partir du spectre MS / MS recueillies à haute résolution LC-MS. Ces données MS / MS a été comparé à des spectres MS / MS précédemment publié par Shimma et Setou 26. Les deux spectres MS / MS match donc l'identité de m / z 616,2 a été attribué en toute confiance que l'hème basée sur la recherche de base de données de masse des données exactes et MS / MS par rapport à la littérature de données MS / MS.
Figure 1. Vue d'ensemble des flux de travail. MSI nodules racinaires sont garnis de la plante, incorporé dans de la gélatine, coupe avec le cryostat et monté sur une lame de verre revêtu d'ITO. Matrice est appliquée sur le coulisseau avec l'une des trois techniques d'application de la matrice. MSI acquisition est réalisée avec un spectromètre de masse MALDI-TOF/TOF et spectres MS sont compilées en images avec le logiciel MSI.
Figure 2. échantillon de tissu image optique. d'image optique représentant d'une section de tissu des nodules racinaires Medicago truncatula.
Figure 3. déposition de la matrice de l'exemple. d'images représentatives montrant les différentes consistances de dépôt de matrice avec: a) l'aérographe, b) un pulvérisateur automatique, et c) des techniques de sublimation. La méthode d'application à l'aérographe génère de grandes et de petits cristaux alors que le procédé de pulvérisation automatique produit des petits cristaux de taille uniforme. Sublimation un produit même couche de matrice. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. MS spectre de l'APLdans la matrice DHB vs tissu des nodules racinaires recouvert de DHB. DHB matrice pics sont indiquées en rouge et tissus des nodules racinaires recouvert de DHB est en bleu. pics de matrice peuvent être distingués des vrais métabolites à partir des images de la SP. Quand une crête est cliqué, l'image d'ions est extrait et affiché recouvrant l'image optique. Ces pics qui génèrent des images avec une localisation distincte pour le tissu, et ne sont pas présents dans la matrice seule zone imagée, sont considérés comme des métabolites. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. MS images de M. truncatula nodules racinaires. a) des images d'ions représentatifs de métabolites fplaies dans le type sauvage M. truncatula nodules racinaires. b) des images d'ions représentatifs d'espèces de la matrice qui ne seraient pas considérés comme des métabolites. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Exemple données MS / MS pour l'identification des métabolites. MS / MS spectre de m / z 616,2, identifié comme l'hème [M +]. La structure chimique est représentée et structures de fragmentation sont affectés. Les données MS / MS expérimental est comparé au spectre de l'hème rapportés dans la littérature et par Shimma Setou 26 MS / MS.
Tableau 1. Analytes d'intérêt -. Mode positif liste de l'échantillon de l'anusytes d'intérêt de M. truncatula tissus des nodules racinaires en mode d'ions positifs 4.
| Nom du métabolite | Théorique [M + H] + | MRMS mesurées [M + H] + | HRMS mesurées [M + H] + | Δm (MDA) |
| γ-aminobutyrique une | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| une choline, * | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0,01 |
| proline | 116.0706 | 116.07 | 116.0706 | 0 |
| valine | 118.0863 | 118.09 | 118.0865 | 0,02 |
| leucine une | 132.1019 | 132.1 | 132.1022 | 0,03 |
| asparagine une | h: 79px; "> 133,0608133.06 | 133.0602 | -0,06 | |
| adénine une | 136.0618 | 136.07 | NA | NA |
| proling bétaïne une | 144.1019 | 144.1 | 144.1024 | 0,05 |
| glutamine une | 147.0764 | 147,09 | 147.0768 | 0,04 |
| 156.0768 | 156.06 | 156.0771 | 0,03 | |
| arginine un | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0,23 |
| saccharose + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0,03 |
| un hème, * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = le style "25" = "hauteur: 26px; largeur: 173px;"> NAD une | 664.1164 | 664.1 | NA | NA |
| formononetine une | 269.0808 | 269.08 | 269.0803 | 0,05 |
| chrysoseriol GlcA une | 477.1028 | 477.1 | 477.1008 | 0,2 |
| formononetine MalGlc une | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0,04|
| aformosin MalGlc une | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0,19 |
* [M +]
un MS / MS effectuée pour l'identification.
Tableau 2. Analytes d'intérêt - mode négatif liste des analytes d'intérêt de M. Sample. truncatula tissus des nodules racinaires en mode d'ions négatifs 4.
| Nom du métabolite | Théorique [MH] - | MRMS mesurées [MH] - < / Sup> | HRMS mesurées [MH] - | Δm (MDA) |
| l'acide pyruvique | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| alanine une | 88,0393 | 88.01 | 88,0374 | -0,19 |
| un acide lactique | 89,0233 | 89.01 | 89,0296 | 0,63 |
| l'acide phosphorique | 96,9685 | 96.96 | 96,9625 | -0,6 |
| L'acide 2-cétobutyrique | 101.0233 | 101.02 | 101.0191 | -0,42 |
| 102,055 | 102.04 | 102.0528 | -0,22 | |
| sérine | 104.0342 | 104.02 | 104.0228 | -1,14 |
| maléique / acide fumarique un | 115.0026 | 115,03 | 115 | -0,26 |
| un acide succinique | 117.0182 | 117.01 | 117.0125 | -0,57 |
| thréonine | 118.0499 | 118.04 | 118.0456 | -0,43 |
| acide oxalacétique | 130.9975 | 131.03 | 130,991 | -0,65 |
| un acide aspartique | 132.0291 | 132.03 | 132.0256 | -0,35 |
| l'acide malique une | 133.0132 | 133,02 | 133.0221 | 0,89 |
| l'acide salicylique | 137.0233 | 137,02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-cétoglutarique | 145.0132 | 145.02 | 145.0063 | -0,69 |
| un acide glutamique | 146.0448 | 146.01 | 146.0408 | -0,4 |
| pentoses | 149.0445 | 149.04 | 149.0414 | -0,31 | </ Tr>
| l'acide aconitique une | 173.0081 | 173.03 | 173.0057 | -0,24 |
| l'acide ascorbique un | 175.0237 | 175,05 | 175.0341 | 1.04 |
| hexose | 179,055 | 179,05 | 179.0484 | -0,66 |
| citrique / acide isocitrique une | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0,2 |
| l'acide palmitique | 255.2319 | 255,22 | 255.2246 | -0,73 |
| hexose-6-phosphate d'une | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0,73 |
| l'acide stéarique | 283.2632 | 283,26 | 283.2552 | -0,8 |
| saccharose une | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1,06 |
un MS / MS effectuée pour l'identification.
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Discussion
Comme discuté ci-dessus, la préparation de l'échantillon est l'étape la plus critique dans le flux de travail MSI. Intégrer le tissu inégalement fera sectionnement d'être difficile ou impossible dans certains cas. La taille de la section et le temps d'équilibrage adéquat sont essentiels au maintien de l'intégrité des tissus et d'éviter de pliage et de larmes. Sélection de la matrice et de la technique d'application va jouer un rôle dans la détermination des types de substances à analyser à détecter, la résolution spatiale, et la reproductibilité des résultats. En utilisant une combinaison de matrices ou des techniques d'application pourrait fournir des résultats complémentaires.
Cette méthode a été conçue spécifiquement pour les non ciblée MSI de métabolites endogènes dans M. truncatula tissus des nodules racinaires, mais peut facilement être adapté à d'autres types de tissus et les questions biologiques. Les méthodes d'application de la matrice recommandées pour petite molécule MSI sont sublimation et pulvérisateur automatique. L'augmentation de la quantité de solvant déposé sur le tissue, en ajustant le procédé de pulvérisation automatique, va augmenter l'extraction des analytes et permettre la détection de composés de masse supérieur devrait choisir d'effectuer une MSI de lipides, peptides, etc. Lors de l'utilisation d'autres types de tissus, l'ajustement principal sera l'épaisseur de coupe. Idéalement, le tissu doit être tranché à l'épaisseur d'une cellule et, par conséquent sections plus épaisses peut-être approprié pour le tissu végétal et des sections plus minces appropriés pour les tissus animaux. Si pliage ou déchirure se produit, généralement un temps d'équilibrage plus long est nécessaire avant la coupe ou la taille de section plus épaisse pourrait être nécessaire. Lors de l'exécution LC-MS pour obtenir des masses précises, le protocole d'extraction de tissus, des solvants de la phase mobile et de gradient, la colonne de phase stationnaire, et en mode d'ionisation MS peuvent tous être ajustés et optimisés pour les analytes d'intérêt.
Le principal avantage de MALDI-MSI est sa capacité à fournir non seulement l'information de masse, mais aussi l'information spatiale pour un échantillon donnésans la nécessité d'une connaissance préalable des analytes cibles. D'autres techniques d'imagerie nécessitent l'utilisation de dérivations ou des étiquettes 5. Comme discuté précédemment, une limitation de cette technique est l'abondance des pics d'interférence d'ions de matrice. Matrices nouveaux ont été signalés à combler cette lacune. Alternativement, la spectrométrie de masse d'ions (SIMS), MSI est une option gratuite matrice d'imagerie, mais il a moins de sensibilité que MALDI-MSI 3. Une autre limitation de cette technique est la résolution de masse inférieure des instruments MALDI-TOF/TOF. En raison de la puissance de la masse résolution faible, il est nécessaire d'effectuer également SM à haute résolution pour obtenir les masses précises pour l'identification des métabolites, ce qui signifie plus d'expériences et plus de temps. Ce problème pourrait être résolu en effectuant MALDI-MSI, sur une plate-forme de l'instrument à haute résolution tels que le MALDI-Orbitrap. La dernière limite de réaliser des expériences MSI est le manque d'outils logiciels disponibles pour l'analyse de données MSI, altien que certains Les avancées récentes dans le logiciel MSI ont été 27,28. Typiquement, le spectre pour chaque région de formation d'image de MS doit être analysée manuellement et images d'ions extrait à la main. Expériences MSI produisent une abondance de données et peuvent être incroyablement de temps à analyser. Dans l'ensemble, MALDI-MSI offre des avantages uniques pour obtenir des informations spatiales de nombreux composés simultanément à l'intérieur d'une seule expérience qui peut être extrêmement utile pour l'analyse non ciblée de petites molécules et autres composés à de nombreuses applications biologiques.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jean-Michel Ané dans le département d'agronomie à l'UW-Madison pour fournir des échantillons de Medicago truncatula. Ce travail a été financé en partie par un financement de la National Science Foundation (NSF) subvention CHE-0957784, l'Université du Wisconsin Graduate School et la Fondation Wisconsin Alumni Research (FRAO) et le programme de bourses de recherche Romnes Faculté (LL). EG reconnaît un diplômé de bourses de recherche NSF (DGE-1256259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
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