Summary
De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para descubrir e identificar varias especies químicas en los tejidos intactos, la preservación de los compuestos en sus ambientes nativos, que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos. En la presente memoria un método de MSI desarrollado para el análisis de moléculas pequeñas se describe.
Abstract
La mayoría de las técnicas que se utilizan para estudiar las moléculas pequeñas, tales como fármacos o metabolitos endógenos, emplean extractos de tejidos que requieren la homogeneización del tejido de interés que podrían causar cambios en las rutas metabólicas en estudio 1. De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una poderosa herramienta analítica que puede proporcionar información espacial de analitos dentro de rebanadas intactas de muestras de tejidos biológicos 1-5. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de compuestos, incluyendo proteínas, péptidos, lípidos, y moléculas pequeñas tales como metabolitos endógenos. Con láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI)-MSI, distribuciones espaciales de múltiples metabolitos pueden ser detectados simultáneamente. En esto, un método desarrollado específicamente para la realización de experimentos no orientados metabolómica MSI en las raíces de leguminosas y nódulos de las raíces se presenta lo que podría revelar una visión de los procesos biológicos que tienen lugar. Lamétodo presentado aquí muestra un típico flujo de trabajo de MSI, de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes, y se centra en la etapa de aplicación de la matriz, lo que demuestra diversas técnicas de aplicación de la matriz que son útiles para la detección de moléculas pequeñas. Una vez que las imágenes son generadas con EM, se discutieron y demostraron el análisis y la identificación de los metabolitos de interés. El flujo de trabajo estándar que aquí se presenta se puede modificar fácilmente para diferentes tipos de tejidos, especies moleculares, y la instrumentación.
Introduction
El creciente campo de la metabolómica tiene muchas aplicaciones biológicas importantes, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, descifrando las vías metabólicas en plantas y otros sistemas biológicos, y la toxicología de perfiles 4,6-10. Un reto técnico importante en el estudio de los sistemas biológicos es el estudio de las vías de metabolómica sin interrumpir los 11. MALDI-MSI permite el análisis directo de los tejidos intactos que permite la detección sensible de analitos en órganos individuales 12,13 e incluso células individuales 14,15.
Preparación de la muestra es un paso crucial en la producción de imágenes espectrales de masa reproducibles y fiables. La calidad de las imágenes depende en gran medida de factores tales como el tejido medio de incrustación, grosor de corte, matriz de MALDI, y la técnica de aplicación de la matriz. Para aplicaciones de formación de imágenes, espesor de corte ideal es la anchura de una celda (8-20 micras dependiendo del tipo de muestra). MALDI requiere el depósito de una orgánica, cristalinacompuesto matriz E, típicamente un ácido débil, en la muestra para ayudar a la ablación analito y la ionización. 16 Diferentes matrices de proporcionar diferentes intensidades de señal, iones interferentes, y la eficiencia de ionización de diferentes clases de compuestos.
La técnica de aplicación de la matriz también juega un papel en la calidad de las imágenes espectrales de masa y diferentes técnicas son apropiadas para diferentes clases de analitos. Tres métodos de aplicación de la matriz se presentan en este protocolo: aerógrafo, rociador automático, y la sublimación. Aplicación de la matriz del aerógrafo ha sido ampliamente utilizado en la formación de imágenes de MALDI. La ventaja de la aplicación de la matriz del aerógrafo es que es relativamente rápido y fácil. Sin embargo, la calidad de la aplicación de la matriz aerógrafo depende en gran medida de la habilidad del usuario y tiende a ser menos reproducible y causar la difusión de analitos, especialmente moléculas pequeñas 17. Los sistemas automáticos de rociadores tienen los mecánicos similares a aerógrafo aplicación de la matriz, pero have sido desarrollado para eliminar la variabilidad observada con la aplicación manual de aerógrafo, haciendo que la pulverización más reproducible. Este método puede ser a veces más tiempo que la aplicación de la matriz aerógrafo tradicional. Tanto los sistemas de rociadores automáticos aerógrafo manual y son los métodos de aplicación de la matriz a base de solventes. La sublimación es una técnica de aplicación matriz seca que se está volviendo más y más popular para la formación de imágenes de espectro de masas de los metabolitos y moléculas pequeñas, ya que reduce la difusión del analito, sin embargo, carece de la necesaria disolvente para extraer y observar compuestos de masas superiores 18.
Identificación Confiado de metabolitos normalmente requiere mediciones precisas de masa para obtener identificaciones putativos seguido de masas en tándem (MS / MS) experimentos de validación, con MS / MS espectros que se comparan con los estándares, la literatura, o espectros teóricos. En este protocolo de alta resolución (masa poder de resolución de 60.000 a m / z 400), cromatografía líquida (LC)-MS está acoplado a MALDI-MSI para obtener tanto la información espacial y las identificaciones seguras de metabolitos endógenos, utilizando Medicago truncatula raíces y nódulos de las raíces como el sistema biológico. Experimentos MS / MS se pueden realizar directamente en el tejido con MALDI-MSI o en extractos de tejidos con LC-MS y utilizados para la validación de la identificación de metabolitos.
Este protocolo proporciona un método simple para mapear metabolitos endógenos en M. truncatula, que puede ser adaptada y aplicada a MSI de pequeñas moléculas en diversos tipos de tejidos y los sistemas biológicos.
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Protocol
1. Instrumentación
- MALDI-TOF/TOF MSI. Utilice un espectrómetro de masas equipados con una fuente MALDI para el análisis de pequeñas moléculas (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Lleve a cabo adquisiciones en modo de iones positivos o negativos en función de los analitos de interés. Especificar un intervalo de masa de interés y recoger 500 disparos de láser / lugar en intervalos de 50 micras, tanto en la dimensiones X e Y a través de la superficie de la muestra para generar imágenes de iones. La anchura de trama y el número de disparos de láser se pueden ajustar para obtener una mayor resolución espacial y la intensidad máxima de la señal, respectivamente. Utilice picos de matriz de DHB o normas internas aplicadas a la diapositiva o directamente al tejido para calibrar los espectros de masas.
- Alta Resolución LC-MS. (Véase la Tabla de Materiales / Equipos) extractos de muestras correr con LC-MS usando ya sea en fase inversa (RP) LC con una columna C-18, o fase normal (NP) con una columna HILIC dependiendo de los analitos de interés. Utilice fases móviles ygradientes como apropiadas para el tipo de muestra específica. Realizar adquisiciones en modo de iones positivos o negativos dependiendo del tipo de muestra.
2. Preparación de Tejido
- Recorte el nódulo de la raíz de la planta, dejando 3-4 mm de raíz unidos al nódulo.
- Inmediatamente después de la disección, el uso de fórceps para colocar el tejido en una taza criostato y cubrir con gelatina (100 mg / ml en agua desionizada). Es esencial para el tejido que se va pegado a la parte inferior de la copa sin burbujas de aire.
- Flash congelar el tejido mediante la colocación de la copa en un baño de hielo seco / etanol hasta que la gelatina se endurece y se vuelve opaca. Almacene las muestras a -80 ° C hasta su uso.
- Retire muestras del -80 ° C congelador, cortar la copa criostato de plástico y retirar el exceso de gelatina. Monte el tejido embebido al mandril criostato con una cantidad tamaño de una moneda de la temperatura óptima de corte (OCT) medios, aunque no soltar el octubre tocar el tejido. Colocar en criostatoboxear hasta que solidifica octubre.
- Permita que el mandril y la gelatina se equilibren en el cuadro de criostato (ajustado a -20 o -25 ° C) durante aproximadamente 15 min.
- Utilice el criostato (véase la Tabla de Materiales / Equipos) a la sección de tejido de aproximadamente el grosor de una celda (8-20 micras dependiendo del tipo de tejido) y descongelación montar cada rebanada sobre el vidrio revestido con ITO por el calentamiento de la parte posterior (no ITO lado) de un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO en la parte posterior de su mano-revestido. Coloque el lado recubierto de ITO de la diapositiva calentado cerca de la lámina de tejido congelado y permita que el segmento se pegue en la diapositiva. La colocación de las secciones juntas en la diapositiva proporcionará una mejor alineación durante el MSI.
3. Aplicación Matrix
- Aplicación del aerógrafo de Matrix MALDI
- Todos los procedimientos de aerógrafo se debe realizar en una campana de humos.
- Limpiar a fondo el depósito de solución aerógrafo y la boquilla (véase la Tabla de Materiales / Equipos) con metanol yllenar el envase de la solución con una solución de matriz de DHB (150 mg / ml en 50% methanol/0.1% de TFA v / v).
- Mantenga el aerógrafo aproximadamente 35 cm de la muestra y aplicar 10-15 capas de matriz en la superficie de la corredera con una duración de 10 segundos de pulverización y 30 seg tiempo de secado entre cada capa.
- Limpiar a fondo el aerógrafo de nuevo con metanol cuando haya terminado para evitar la obstrucción de la solución matriz.
- Automático Aplicación pulverizador de Matrix MALDI
- Siga las instrucciones de puesta en marcha proporcionados por los fabricantes del sistema de rociador automático.
- Para MSI de metabolitos en nódulos de las raíces utilizando 40 mg / ml (en el 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB como la matriz, ajustar la temperatura de ~ 80 ° C, la velocidad de 1250 mm / min, velocidad de flujo de 50 l / min, y el número de pasadas a 24. Para una mejor cobertura, se recomienda para rotar la boquilla de 90 ° y / o desplazamiento de la boquilla de 1,5 mm entre cada pasada. Inicie método pulverizador.
Como una SIde nota, el sistema pulverizador particular usado aquí se calienta la boquilla para acelerar la evaporación del disolvente. Como el disolvente se evapora, la concentración de la matriz aumenta rápidamente. La matriz aplicada a la muestra con el aerógrafo y el pulverizador automático tiene concentraciones comparables. - Siga las instrucciones de apagado proporcionadas por los fabricantes del sistema de rociador automático.
- Aplicación de la sublimación de la matriz de MALDI
- Pesar 300 mg de DHB en la parte inferior de la cámara de sublimación (véase la Tabla de Materiales / Equipos).
- Pegar el portaobjetos de vidrio para el dedo frío (parte superior de la cámara de sublimación) con las secciones de tejido hacia abajo con cinta de doble cara, conductora. Cubrir toda la parte de atrás de la corredera con la cinta de doble cara, incluso para conductividad, la producción de incluso la deposición de matriz.
- Fije las mitades superior e inferior de la cámara de la sublimación, junto con el C-clamp. Conecte el vacío y add hielo y agua fría al depósito superior.
- Coloque cámara de sublimación en una manta de calentamiento que está a temperatura ambiente.
- Encienda la bomba de vacío. Espere 15 minutos y encienda la manta calefactora. El manto de calentamiento debe alcanzar 120 º C en el transcurso de 10 min.
- Después de 10 minutos, se apaga el fuego, cierre la válvula de vacío (por lo que el interior de la cámara se mantiene al vacío) y apague la bomba de vacío.
- Deje que la cámara alcance la temperatura ambiente, abra la válvula de liberación de la presión de vacío y retire la muestra. El tamaño de la cámara de sublimación determinará la cantidad de matriz sublimado a la lámina de vidrio. Las cámaras de sublimación más grandes (del tamaño de un vaso de 400 ml) utilizarán aproximadamente 300 mg de DHB mientras que las cámaras más pequeñas (del tamaño de un vaso de 150 ml) utilizarán aproximadamente 100 mg de DHB y requerirán el corte de la lámina de vidrio de forma que encaja en la cámara.
4. Adquisición de imágenes
- <li> Marcar un patrón + en cada esquina de la muestra con un lápiz corrector líquido WiteOut para ser utilizado como "enseñar a los puntos". Coloque la placa de vidrio en la placa de adaptador de diapositivas MALDI y tomar una imagen óptica de la muestra utilizando un escáner.
- Crear un archivo de adquisición de imágenes mediante el software proporcionado por el fabricante del aparato, con un tamaño de paso de trama de 50 my un diámetro de láser igual o más pequeño que el tamaño de paso de la trama. En este instrumento en particular, el ajuste mínimo láser da un diámetro de láser de ajuste de láser de aproximadamente 10 micras y pequeño tiene un diámetro de 40-50 micras.
- Cargar la imagen óptica en el software y alinear la placa con la imagen óptica.
- Calibre el instrumento antes de iniciar la adquisición utilizando iones comunes de la matriz de racimo, las normas internas, o una mezcla de calibración.
- Especifique las áreas de tejido para ser analizados con MSI, incluyendo un punto de la matriz pura en la diapositiva para ser utilizado como un "espacio en blanco".
- Comience acadquisición.
5. Generación de Imagen
- Abra el archivo de imágenes en el software disponible en el mercado proporcionado por el vendedor y extraer las imágenes de iones. Otro software de código abierto está disponible para el procesamiento de datos MSI 19.
6. Identificación de metabolitos
- Seleccionar un m / z de interés específico del espectro de masas mediante el software específico del proveedor (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Un analito puede ser distinguido de un ión matriz cuando un pico del analito se selecciona entre el espectro de masas de iones y las imágenes se generan localiza específicamente a la sección de tejido.
- Generar una lista de los analitos de interés y llevar a cabo experimentos de MS / MS. Ver Tabla 1 y Tabla 2 en Resultados representante para las listas de muestra de analitos.
- Realizar análisis LC-MS específica en un espectrómetro de masas de alta resolución (o alta resolución MALDI-MS, si está disponible) para obtener información precisamediciones de la masa de los analitos de interés y también realizar LC-MS/MS de los analitos de interés para obtener patrones de fragmentación característicos.
- Realice la búsqueda de base de datos para determinar las identificaciones putativos para los analitos específicos. Ejemplos de bases de datos de metabolitos incluyen: METLIN, Propiedades físicas, PubChem, KEGG, y HMDB.
- Para confirmar las identificaciones putativos de búsqueda de base de datos precisa de masas, que coincida con la MS / MS de los analitos dirigidos a MS / MS espectros de las normas, la literatura, y / o software de predicción de la fragmentación.
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Representative Results
Una visión general experimental de MSI se muestra en la Figura 1. Al principio del experimento, la preparación de la muestra es un paso crítico. Los nódulos se recortan de la raíz de la planta y embebidos en gelatina. El tejido debe ser presionada plana contra la copa criostato, sin burbujas, mientras se está congelado, ya que asegura una alineación más fácil y adecuada del tejido mientras se está seccionado. Cuando se está en rodajas el tejido, es importante para cortar el tejido en el espesor adecuado; demasiado delgada de secciones rasgar, arruinar la integridad de los tejidos, mientras que demasiado grueso de secciones reducirá el número de analitos extraídos y detectados a partir del tejido. La selección de la matriz y la técnica de aplicación determinará los tipos de analitos detectados. Usando una combinación de las matrices podría proporcionar resultados complementarios. Tres técnicas de aplicación de la matriz se presentan en este trabajo. La técnica del aerógrafo es rápido, pero por lo general no es adecuado para MSI de pequeñas moléculas quecausa de la difusión de analito. Sistemas automáticos de pulverización y sublimación proporcionan cristales más pequeños de la matriz, una mejor reproducibilidad, y menos de difusión del analito. Figura 2 muestra una imagen óptica de una sección nódulo de la raíz de Medicago truncatula. La figura 3 muestra un ejemplo de imagen óptica de los tamaños de cobertura de la matriz y de cristal utilizando aerógrafo, automática pulverizador, y la sublimación, respectivamente.
Matrices convencionales, como DHB, producen muchos iones en el rango de masa inferior (m / z 100-400) 20. Estos iones de la matriz pueden interferir con la detección de metabolitos en este rango. Figura 4 muestra espectros de MS de sólo matriz de DHB en comparación con el tejido de nódulos de raíz recubierto con matriz de DHB. Picos de matriz DHB se indican en el tejido rojo y nódulo de la raíz cubierta con DHB se muestra en azul. Matrices novedosas tales como TiO 2 nanopartículas 21, 1,5-diaminonaftaleno (DAN) 22, 2,3,4,5-tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) tiofeno (DHPT) 23, y el 1,8-bis (dimetilamino) naftaleno (DMAN) 24,25 se ha informado de que reducir la interferencia de los iones de la matriz en el rango de masa baja, y también mejorar la detección de ciertas clases de metabolitos 5. Picos de matriz se pueden distinguir de los metabolitos reales utilizando las imágenes de EM. Cuando un pico se hace clic en, la imagen de iones se extrae y se muestra la superposición de la imagen óptica. Estos picos que generan imágenes con distinta localización en el tejido, y no están presentes en la matriz sólo área de la imagen, se consideran metabolitos. Figura 5a muestra varias imágenes de iones representativos de metabolitos que se encuentran en el tejido de nódulos de la raíz, mientras que la figura 5b muestra ejemplos de imágenes MS correspondiente a la matriz picos relacionados. En la Figura 5a muestra la imagen distinta de localización para el tejido de nódulos de la raíz y la falta de señal en la matriz única área que fue fotografiada. En la Figura 5b M. truncatula tejido nódulo de la raíz se muestra en la Tabla 1 (modo positivo) y en la Tabla 2 (modo negativo) 4.
El objetivo final de los experimentos metabolómica no focalizados es identificar los compuestos que se han detectado. Cuando la realización de MSI en un instrumento de resolución media (MRMS), tales como un TOF / TOF, es necesario para obtener mediciones precisas de masa de una manera diferente. Esto se puede hacer con un enfoque múltiple de MS en la que los resultados de MALDI-MSI se comparan con los datos de alta resolución LC-MS utilizando extractos de tejido. Existen muchos protocolos de extracción de tejido posibles para elegir en función de los analitos de interés. EM de alta resolución (HRMS) se puede realizar en el MO ionización positiva o negativades y con LC normal o invertida de fase dependiendo de los analitos de interés. Una vez que se obtiene una masa precisa con alta resolución LC-MS, la masa resultante puede ser buscado con varias bases de datos, que se enumeran anteriormente, para obtener una identificación putativa. Siguiente datos de MS / MS se recoge y el patrón de fragmentación característico del analito de interés se puede comparar con las normas, los espectros de la literatura, o patrones de fragmentación teóricos. Figura 6 muestra un ejemplo de uno de los metabolitos detectados con MSI y LC-MS. Este metabolito se identificó como hemo basado en el espectro de MS / MS con recogida de alta resolución LC-MS. Estos datos de MS / MS se comparó con la espectros MS / MS previamente publicado por Shimma y Setou 26. El partido dos espectros MS / MS, por lo tanto, la identidad de m / z 616.2 fue asignado con confianza como hemo basado en la masa exacta de búsqueda de base de datos y los datos de MS / MS en comparación con la literatura datos de MS / MS.
Figura 1. Descripción general de MSI flujo de trabajo. Nódulos radiculares se recortan de la planta, incrustado en gelatina, seccionado con el criostato y montado sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO. Matriz se aplica a la lámina usando una de tres técnicas de aplicación de la matriz. MSI adquisición se lleva a cabo con un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF y los espectros de MS se compilan en las imágenes con el software de MSI.
Figura 2. Muestra de tejido óptico de imagen. Imagen óptica Representante de una sección de tejido del nódulo de la raíz Medicago truncatula.
Figura 3. Deposiciones de matriz. Ejemplo imágenes representativas que muestran los diferentes consistencias de la deposición de matriz con una) aerógrafo, b) pulverizador automático, y c) técnicas de sublimación. El método de aplicación del aerógrafo genera cristales grandes y pequeñas, mientras que el método pulverizador automático produce pequeños cristales de tamaño uniforme. Sublimación produce una capa uniforme de la matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. MS espectro de plaen la matriz DHB vs tejido del nódulo de la raíz cubierta de DHB. picos de matriz DHB se indican en rojo y el tejido del nódulo de la raíz cubierta con DHB se muestra en azul. Picos de matriz se pueden distinguir de los metabolitos reales utilizando las imágenes de EM. Cuando un pico se hace clic en, la imagen de iones se extrae y se muestra la superposición de la imagen óptica. Esos picos que generan imágenes con distinta localización en el tejido, y no están presentes en la matriz única área fotografiada, son considerados metabolitos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. EM imágenes de M. nódulos de las raíces truncatula. a) imágenes iones representativos de metabolitos found de tipo salvaje M. nódulos de las raíces truncatula. b) imágenes de iones representativos de especies de la matriz que no se considerarían metabolitos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Ejemplo de datos de MS / MS para la identificación de metabolitos. Espectro MS / MS de m / z 616,2, identificado como hemo [M +]. La estructura química se muestra y las estructuras de fragmentación son asignados. Los datos experimentales de MS / MS se compara con el espectro MS / MS de hemo reportado en la literatura por Shimma y Setou 26.
Tabla 1. Los analitos de interés -. Modo positivo lista de muestra de analytes de interés por parte de M. truncatula tejido del nódulo de la raíz en el modo 4 iones positivos.
| Nombre del metabolito | Teórica [M + H] + | MRMS medidos [M + H] + | HRMS medidos [M + H] + | Delta M (MDA) |
| γ-aminobutírico un | 104.0706 | 104.1 | 104.0706 | 0 |
| colina una, * | 104.1070 > | 104.1 | 104.1071 | 0.01 |
| prolina | 116.0706 | 116.07 | 116.0706 | 0 |
| valina | 118.0863 | 118.09 | 118.0865 | 0.02 |
| leucina un | 132.1019 | 132.1 | 132.1022 | 0.03 |
| asparagina un | h: 79px; "> 133.0608133.06 | 133.0602 | -0.06 | |
| adenina un | 136.0618 | 136.07 | NA | NA |
| proling betaína un | 144.1019 | 144.1 | 144.1024 | 0.05 |
| glutamina un | 147.0764 | 147.09 | 147.0768 | 0.04 |
| 156.0768 | 156.06 | 156.0771 | 0.03 | |
| arginina un | 175.1190 | 175.13 | 175.1167 | -0.23 |
| sacarosa + K | 381.0794 | 381.05 | 381.0791 | -0.03 |
| heme un * | 616.1768 | 616.15 | NA | NA |
| ht = estilo "25" = "altura: 26px; ancho: 173px;"> NAD una | 664.1164 | 664.1 | NA | NA |
| formononetina un | 269.0808 | 269,08 | 269.0803 | 0.05 |
| chrysoseriol GlcA un | 477.1028 | 477.1 | 477.1008 | 0.2 |
| formononetina MalGlc un | 517.1341 | 517.13 | 517.1337 | UR A: 64px; "> 0.04|
| aformosin MalGlc un | 547.1446 | 547.16 | 547.1427 | 0.19 |
* [M +]
un MS / MS lleva a cabo para la identificación.
Tabla 2. Los analitos de interés -. Modo negativo lista de muestra de analitos de interés de M. truncatula tejido del nódulo de la raíz en el modo de 4 iones negativos.
| Nombre del metabolito | Teórica [MH] - | MRMS medidos [MH] - < / Sup> | HRMS Medido [MH] - | Delta M (MDA) |
| ácido pirúvico | 87.0077 | 87 | NA | NA |
| alanina una | 88.0393 | 88.01 | 88.0374 | -0.19 |
| ácido láctico un | 89.0233 | 89.01 | 89.0296 | 0.63 |
| ácido fosfórico | 96.9685 | 96.96 | 96.9625 | -0,6 |
| Ácido 2-cetobutírico | 101.0233 | 101.02 | 101.0191 | -0.42 |
| 102.055 | 102.04 | 102.0528 | -0.22 | |
| serina | 104.0342 | 104.02 | 104.0228 | -1.14 |
| ácido maleico un / fumárico | 115.0026 | 115.03 | 115 | -0.26 |
| ácido succínico un | 117.0182 | 117.01 | 117.0125 | -0.57 |
| treonina | 118.0499 | 118.04 | 118.0456 | -0.43 |
| ácido oxalacetic | 130.9975 | 131.03 | 130.991 | -0.65 |
| ácido aspártico un | 132.0291 | 132.03 | 132.0256 | -0.35 |
| ácido málico una | 133.0132 | 133.02 | 133.0221 | 0.89 |
| ácido salicílico | 137.0233 | 137.02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-cetoglutárico | 145.0132 | 145.02 | 145.0063 | -0.69 |
| ácido glutámico un | 146.0448 | 146.01 | 146.0408 | -0,4 |
| pentosa | 149.0445 | 149.04 | 149.0414 | -0.31 | </ Tr>
| ácido un aconítico | 173.0081 | 173.03 | 173.0057 | -0.24 |
| ácido ascórbico un | 175.0237 | 175.05 | 175.0341 | 1.04 |
| hexosa | 179.055 | 179.05 | 179.0484 | -0.66 |
| cítrico / ácido un isocítrico | 191.0186 | 191.02 | 191.0166 | -0,2 |
| ácido palmítico | 255.2319 | 255.22 | 255.2246 | -0.73 |
| hexosa-6-fosfato de un | 259.0213 | 259.04 | 259.014 | -0.73 |
| ácido esteárico | 283.2632 | 283.26 | 283.2552 | -0,8 |
| sacarosa un | 341.1078 | 341.07 | 341.0972 | -1.06 |
un MS / MS lleva a cabo para la identificación.
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Discussion
Como se comentó anteriormente, la preparación de la muestra es el paso más crítico en el flujo de trabajo de MSI. Incorporación de los tejidos de manera desigual hará que el corte a ser difícil o imposible en algunos casos. El tamaño de la sección y el tiempo de equilibrio adecuado son cruciales para el mantenimiento de la integridad del tejido y evitar el plegado y lágrimas. La selección de la matriz y la técnica de aplicación tendrá un papel en la determinación de los tipos de analitos que se detecten, la resolución espacial, y la reproducibilidad de los resultados. Usando una combinación de matrices o técnicas de aplicación podría proporcionar resultados complementarios.
Este método ha sido diseñado específicamente para no directo MSI de metabolitos endógenos en M. truncatula tejido nódulo de la raíz, pero se puede adaptar fácilmente a otros tipos de tejidos y cuestiones biológicas. Los métodos de aplicación de la matriz recomendadas para la pequeña molécula de MSI son la sublimación y pulverizador automático. El aumento de la cantidad de disolvente depositado sobre la tissuE, ajustando el método pulverizador automático, aumentará la extracción de analitos y permitir la detección de compuestos de masas más altas se tiene que escoger para realizar MSI de lípidos, péptidos, etc. Cuando se utilizan otros tipos de tejido, el ajuste principal será el espesor de la sección. Idealmente, el tejido debe ser cortado al espesor de una célula, por lo que las secciones más gruesas tal vez adecuado para tejido de la planta y secciones más delgadas adecuadas para el tejido animal. Si se produce el plegado o el desgarro, por lo general se necesita un tiempo de equilibrio más tiempo antes de seccionar o un tamaño de sección más gruesa podría ser necesario. Al realizar LC-MS para obtener masas precisas, el protocolo de extracción de tejidos, disolventes de la fase móvil y gradiente, fase estacionaria columna, y el modo de ionización MS se pueden ajustar y optimizado para los analitos de interés.
La principal ventaja de MALDI-MSI es su capacidad para proporcionar no sólo información de masas, sino también la información espacial para una muestra dadasin necesidad de conocimiento previo de los analitos de interés. Otras técnicas de imagen requieren el uso de derivaciones o etiquetas 5. Como se discutió anteriormente, una limitación de esta técnica es la abundancia de interferir picos de iones de la matriz. Matrices de Novel han sido reportados para abordar esta limitación. Alternativamente, la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)-MSI es una opción de formación de imágenes de matriz libre, sin embargo, tiene menos sensibilidad que la MALDI-MSI 3. Otra limitación de esta técnica es la resolución de masa inferior de instrumentos MALDI-TOF/TOF. Debido a la potencia de baja masa resolver, es necesario también realizar MS de alta resolución para obtener las masas precisos para la identificación de metabolitos, lo que significa más experimentos y más tiempo. Este problema podría resolverse mediante la realización de MALDI-MSI en una plataforma de instrumento de alta resolución como el MALDI-Orbitrap. La última limitación de la realización de experimentos de MSI es la falta de herramientas de software disponibles para el análisis de los datos de MSI, altunque algunos avances recientes en el software de MSI han realizado 27,28. Típicamente, el espectro MS para cada región de formación de imágenes debe ser analizada manualmente y las imágenes de iones extrae a mano. Experimentos MSI producen una abundancia de datos y pueden ser increíblemente requiere mucho tiempo para analizar. En general, MALDI-MSI ofrece ventajas únicas para la obtención de la información espacial de muchos compuestos simultáneamente dentro de un único experimento que puede ser extremadamente útil para el análisis no directo de pequeñas moléculas y otros compuestos con muchas aplicaciones biológicas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Jean-Michel Ané en el Departamento de Agronomía de la Universidad de Wisconsin-Madison para proporcionar muestras de Medicago truncatula. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de subvención CHE-0957784, de la Universidad de Wisconsin Escuela de Postgrado y la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) y el programa Romnes Facultad de Becas de Investigación (para SD). EG reconoce un Graduate Research Fellowship NSF (DGE-1256259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
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