Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

doi: 10.3791/51438 Published: May 26, 2014
* These authors contributed equally

Summary

التفاعلات بين البروتينات الأساسية لجميع العمليات الخلوية. باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة، والتفاعل بين زوج من البروتينات يمكن رصدها في الخلايا الحية وفي الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، فإن آثار الطفرات المحرضة يمكن تقييمها.

Abstract

فحوصات على أساس نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) توفر وسيلة حساسة وموثوق بها لرصد تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا الحية. بريت هو نقل غير الإشعاعي للطاقة من 'المانحة' انزيم luciferase المراسل إلى "متقبل" بروتين فلوري. في التكوين الأكثر شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو بروتين فلوري أصفر (YFP). لأن كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، ومراقبة ظاهرة بريت يتطلب أن الجهات المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الأهمية في خلايا الثدييات مثقف، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع luciferase المراسل والثانية باعتبارها الانصهار مع YFP. التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل المانحين ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة تحدث. مقارنة مع تقنيات أخرى للتحقيق في البروتين البروتين فيteractions، مقايسة بريت حساس، يتطلب القليل التدريب العملي على الوقت وقليل من الكواشف، وغير قادرة على الكشف عن التفاعلات التي هي ضعيفة، عابرة، أو تعتمد على البيئة البيوكيميائية وجدت داخل الخلية الحية. ولذلك هو النهج المثالي لتأكيد التفاعلات المفترضة التي اقترحها الخميرة اثنين الهجين أو مطياف الكتلة البروتيوميات الدراسات، وبالإضافة إلى ذلك فمن مناسبة تماما لرسم الخرائط المناطق التفاعل، وتقييم تأثير التعديلات بعد متعدية على البروتين البروتين التفاعلات، و تقييم أثر الطفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كلا الربط الكلاسيكية والجيل المقبل من يحلل التسلسل من اضطرابات الإنسان والكشف عن أهميتها السريرية من البروتينات المشاركة في مجموعة من المسارات البيولوجية. غالبا ما يكون الحال أنه قبل التعرف عليهم في مثل هذه الدراسات، كان هناك تحقيق ضئيلة أو معدومة للدور البيولوجي لهذه البروتينات. واحد السبل المثمرة لبدء استكشاف الوظيفة البيولوجية للبروتين من الفائدة هو تحديد البروتينات الأخرى التي تتفاعل مع في سياقها الفسيولوجية. تميز الشبكات الجزيئية في هذا الشكل يوفر نظرة ثاقبة المسارات البيولوجية الكامنة وراء النمط الظاهري الإنسان.

النهج الأكثر استخداما فحص واسعة النطاق لتحديد الشركاء التفاعل مرشح للبروتينات ذات الاهتمام هي الخميرة فحص اثنين من الهجين 1 والبروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي 2. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون ناجحة جدا في اقتراح البروتينات التفاعل المحتملة، ولكن عالبريد عرضة لنتائج إيجابية كاذبة. لذلك، تأكيدا لتفاعل حددها الخميرة اثنين الهجين أو فحص قياس الطيف الكتلي يتطلب المصادقة على التفاعل باستخدام تقنية الثانية. وعادة ما يتم استخدام مناعي المشترك أو المنسدلة فحص لهذا الغرض 3. عيب واحد من استخدام هذه التقنيات من أجل التحقق هو شرط لتحلل الخلية، التي تقضي على الظروف داخل الخلايا التي قد تكون ضرورية للحفاظ على بعض التفاعلات البروتين. والعيب الثاني هو أن ضعف أو عابرة تفاعلات البروتين يمكن أن تتعطل أثناء الغسيل الخطوات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المقايسات مطالبة التدريب العملي على هامة الزمن، محدودة في عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد، وغالبا ما تتطلب وقتا طويلا الأمثل من الكواشف والبروتوكولات.

للتغلب على بعض المشاكل المرتبطة التجارب المشتركة مناعي، وقد وضعت عدة فحوصات على أساس الفلورسنت وbiolumالبروتينات inescent التي يمكن استخدامها في الخلايا الحية. استندت أول هذه المقايسات على الإسفار (أو فورستر) نقل الطاقة الرنين (الحنق)، ونقل غير الإشعاعي للطاقة بين اثنين من البروتينات الفلورية مع تداخل الانبعاثات والإثارة أطياف 4. كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، وبالتالي رصد ظاهرة الحنق يتطلب أن fluorophores المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات من الفائدة، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع fluorophore المانحة (بروتين فلوري سماوي عادة؛ CFP)، والثاني باعتباره الانصهار مع fluorophore متقبل (بروتين فلوري الصفراء عادة؛ YFP). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل fluorophores المانحة ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة لتحدث، الأمر الذي سيؤدي إلى زيادة يمكن قياسها في انبعاث الضوء من YFP متقبل بالنسبة إلى الجهات المانحة CFP. FRوقد ET الناجحة في الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية 4. العيب الرئيسي من استخدام الحنق للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات هو شرط لإضاءة في الهواء الطلق لالإثارة من fluorophore المانحة. النتائج إضاءة في الهواء الطلق في خلفية عالية في إشارة الانبعاثات، الإثارة غير المرغوب فيها من متقبل، وphotobleaching من كل من الجهات المانحة وfluorophores المتقبلة. هذه الآثار تقلل من حساسية من فحص للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات.

وهناك تعديل للمقايسة الحنق الذي يتغلب على مشكلة خلفية عالية من الإضاءة الخارجية هو ضوء بارد نقل الطاقة الرنين (بريت) مقايسة 5،6. في النظام بريت يتم استبدال fluorophore المانحة بواسطة انزيم luciferase المراسل. وبالتالي يتم إنشاء الطاقة من أجل الإثارة من fluorophore متقبل داخل النظام عن طريق أكسدة الركيزة luciferase المراسل، مما يجعل إضاءة في الهواء الطلق لا لزوم لها. في معظمالتكوين شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو YFP (لمناقشة المانحة البديلة والبروتينات المتقبلة نرى Pfleger آخرون 5). وفقا لذلك، في هذا النظام، وتنصهر بروتين من الفائدة لو luciferase بروتين التفاعل المحتمل لYFP، أو العكس بالعكس. مقايسة بريت يتطلب إضافة coelenterazine باعتبارها الركيزة لluciferase المراسل. لأن coelenterazine هي خلايا قابلة للاختراق، فمن الممكن لتنفيذ المقايسات بريت في الخلايا الحية. ومع ذلك، coelenterazine الأم غير مستقرة في محلول مائي، وانهيار انزيم مستقلة عن coelenterazine على حد سواء يقلل من تركيز الركيزة المتاحة للفحص ويولد autoluminescence، مما يقلل من حساسية قياسات luciferase النشاط. وقد تيسر استخدام بريت في الخلايا الحية من خلال تطوير coelenterazines المحمية، التي هي مستقرة في محلول مائي ولكن المشقوق بواسطة استريز عصاري خلويو بعد نشرها عبر غشاء الخلية لتوليد coelenterazine نشطة داخل الخلية 7.

بعد إضافة الركيزة لالخلايا معربا عن luciferase المراسل والبروتينات YFP الانصهار، وكميا نقل الطاقة الناتجة عن التفاعلات البروتين البروتين من خلال مراقبة الانبعاثات من luciferase المراسل وYFP. بسبب تفاعلات البروتين يمكن رصدها مباشرة في الخلايا الحية في لوحات متعددة جيدا، وفحص بريت يشكل، طريقة بسيطة قابلة للتحقق من صحة التفاعلات المفترضة التي هي من حيث التكلفة والوقت فعالة.

بالإضافة إلى التحقق من صحة interactors المفترضة المحددة في دراسات فرز البروتين، يمكن للنظام بريت أن تستخدم أيضا لinteractors مرشح اختبار الناشئة عن الدراسات البيوكيميائية والهيكلية السابقة على البروتين من الفائدة. مرة واحدة وقد تم تثبت وجود تفاعل البروتين البروتين (سواء باستخدام مقايسة بريت أو عن طريق تقنيات أخرى)، فإن هناك إمكانية لفحص BRET أن تكون خطة الإدارة البيئيةloyed أخرى لتوصيف التفاعل. على سبيل المثال، المناطق التفاعل يمكن تعيينها عن طريق توليد إصدارات اقتطاع من البروتينات، وإشراك بقايا محددة في التفاعل يمكن البرهنة من خلال خلق الطفرات نقطة. وعلاوة على ذلك، وأثر تغييري من تعديلات ما بعد النقل أو الجزيئات الصغيرة (مثل المخدرات أو بروابط) على تفاعلات البروتين البروتين يمكن التحقيق 8-10.

لديه فحص بريت أيضا إمكانات كبيرة للتحقيق طفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض. في الحالات التي تم فيها إنشاء دور المسبب للطفرة، ودراسة تأثير الطفرة على البروتين البروتين التفاعلات باستخدام BRET قد تكشف المزيد عن المسببات الجزيئية من النمط الظاهري 11. منذ ظهور منهجيات تسلسل الجيل المقبل، فإنه من الشائع على نحو متزايد لعدة طفرات الإضرار يحتمل الكشف عن هويته داخل الفرد، وفي هذه الحالة فإنه من غير الواضح التي هي RELEVANT إلى النمط الظاهري 12. في هذه الحالة قد يكون الفحص بريت قيمة في تقييم أثر الطفرات على وظيفة البروتين، وبالتالي أهميتها لهذا الاضطراب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إنشاء البلازميدات

  1. Subclone على cDNAs لكل بروتين من الفائدة في كل من pLuc وpYFP ناقلات، وذلك باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية (الشكل 1). لبروتوكولات مفصلة نرى الأخضر وآخرون 13.
  2. تسلسل كافة للتحقق من أن يبني البروتينات من الفائدة في الإطار مع تسلسل لوك / YFP مع عدم وجود التدخل الكودونات توقف.
  3. تنفيذ المقايسات الفنية كما تريد للتأكد من أن البروتينات الانصهار الاحتفاظ النشاط البيولوجي. في الحالة المعروضة هنا تم التأكد توطين التحت خلوية من البروتينات الانصهار YFP بواسطة المجهر مضان.
  4. جعل البلازميدات التعبير عن البروتينات المناسبة السيطرة لوك وYFP عن طريق الهندسة الإشارات الاستهداف ذات الصلة في pLuc وpYFP ناقلات التعبير. في الحالة المعروضة هنا، وتوليد لوك وYFP يبني استهدفت النووية عن طريق إدراج إشارة توطين النووية في pLuc وpYFP ناقلات.
  5. جعلوبناء السيطرة الإيجابية التي تنصهر لوك وYFP إلى ببتيد واحد. في الحالة المعروضة هنا، وتوليد تحكم إيجابية والتي يتم إدراج تسلسل الترميز YFP في ناقلات pLuc.
  6. اختيار البلازميد حشو محايدة لاستخدامها لتحقيق التعادل كتلة الحمض النووي في يمزج ترنسفكأيشن. استخدام البلازميد التي لا يوجد لديه المروج حقيقية النواة، وبالتالي سيكون غير فعال transcriptionally في خلايا الثدييات، مثل الاستنساخ ناقلات البكتيرية.

2. إعداد الحمض النووي خلطات

  1. تقدير تركيز كل البلازميدات وصفها في القسم 1 على أساس الامتصاصية في 260 نانومتر (1 وحدة امتصاص ما يعادل 50 ميكروغرام / مل من الحمض النووي). تحديد الكتلة الجزيئية لكل البلازميد عن طريق ضرب عدد من أزواج قاعدة 650 دا. استخدام التركيز والكتلة الجزيئية لحساب تركيز المولي لكل إعداد البلازميد. تمييع الاستعدادات الحمض النووي البلازميد إلى تركيز من 36 نانومتر. وستكون هذه الأسهم العملالتي سيتم استخدامها لإعداد يمزج الحمض النووي لترنسفكأيشن.
  2. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 1،800 نانوغرام من حشو البلازميد في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر من الماء.
  3. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من بناء pLuc السيطرة. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
  4. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من pLuc مراقبة بناء و 5 ميكرولتر من pYFP مراقبة بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
  5. إعداد مزيج الحمض النووي تحكم تحتوي على 5 ميكرولتر من بناء مراقبة إيجابية. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
  6. إعداد DNA التالية يمزج لاختبار homodimerization من البروتين من الفائدة، X. للحصول على كل مزيج الحمض النووي الجمع بين 5 ميكرولتر من pLuc ذات الصلة وبناء 5 ميكرولتر من السنة التحضيريةFP بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
    A) pLuc السيطرة وpYFP-X
    B) pLuc-X وpYFP السيطرة
    C) pLuc-X وpYFP-X
  7. إعداد DNA التالية يمزج لاختبار التفاعل بين زوج من البروتينات من الفائدة، X و Y. لكل مزيج الحمض النووي الجمع بين 5 ميكرولتر من pLuc ذات الصلة وبناء 5 ميكرولتر من pYFP بناء. إضافة حشو البلازميد ليصبح العدد الإجمالي الشامل الحمض النووي إلى 1،800 نانوغرام. إضافة الماء لجلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
    A) pLuc السيطرة وpYFP-X
    B) pLuc-X وpYFP السيطرة
    C) pLuc السيطرة وpYFP-Y
    D) pLuc-Y وpYFP السيطرة
    E) pLuc-X-Y وpYFP
    F) pLuc-Y وpYFP-X

3. ترنسفكأيشن

  1. الحصاد subconfluent الخلايا HEK293 من 75 سم 2 القارورة. تمييع 10٪ من مجموع الخلايا في 13 مل من مستنبت. الاستغناء 130 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من الأبيضواضح القاع 96 جيدا نسيج لوحة الثقافة. الخلايا الثقافة لمدة 24 ساعة.
  2. حساب عدد من الآبار لتكون transfected بضرب عدد من يمزج الحمض النووي عن طريق 3. إحضار المصل خالية مستنبت إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد مزيج الرئيسي تحتوي على 6.3 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة و 0.18 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن لكل بئر. مزيج من قبل vortexing واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. إعداد الخلائط ترنسفكأيشن عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة / كاشف ترنسفكأيشن مزيج الرئيسي. لا الدوامة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. بالنقل ثلاثة آبار مع كل مزيج ترنسفكأيشن الاستغناء 6.5 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن لكل بئر. ثقافة الخلايا ل36-48 ساعة أخرى.

4. قياس بريت الإشارة

  1. حل الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في 34 ملغ / مل في DMSO من قبل vortexing.
  2. تمييع المعاد الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في 1:1،000 في التخفيف المتوسطة الركيزة عإعادة تحسنت إلى 37 درجة مئوية. سماح 50 ميكرولتر من الركيزة التخفيف المتوسطة لكل بئر. دوامة لخلط. قد تشكل راسب، لكنها لن تتدخل في الفحص.
  3. نضح مستنبت من لوحة 96 جيدا. الاستغناء 50 ميكرولتر من المخفف الخلية الحية luciferase المراسل الركيزة في كل بئر. خلايا الثقافة لا يقل عن 2 ساعة (تصل إلى 24 ساعة).
  4. إزالة الغطاء عن لوحة 96 جيدا واحتضان لوحة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل luminometer.
  5. قياس الانبعاثات من لوك واحد YFP جيدا في كل مرة. قياس الانبعاثات من لوك باستخدام فلتر حجب الموجات الأطول من 470 نانومتر. قياس الانبعاثات من YFP باستخدام 500-600 نانومتر الفرقة تمرير التصفية. دمج إشارات الانبعاثات أكثر من 10 ثانية.

5. تحليل البيانات

  1. متوسط ​​قراءات الانبعاثات لوك من 3 الآبار التي لم تتلق سوى البلازميد حشو. طرح هذه القيمة من كل القراءات الأخرى الانبعاثات لوك لإنتاج القيم الانبعاثات لوك، طرح الخلفية.
  2. متوسط ​​قراءات الانبعاثات YFP من 3 الآبار التي لم تتلق سوى البلازميد حشو. طرح هذه القيمة من كل القراءات الأخرى الانبعاثات YFP لإنتاج القيم الانبعاثات YFP-تطرح الخلفية.
  3. لكل بئر، تقسيم YFP قيمة الانبعاثات طرح الخلفية من قبل لوك قيمة الانبعاثات طرح خلفية لإعطاء نسبة بريت غير المصححة.
  4. متوسط ​​نسب بريت غير المصححة من الآبار الثلاث التي تم transfected مع البلازميد فقط pLuc السيطرة. طرح هذه القيمة من سائر النسب بريت غير المصححة لإعطاء نسب بريت تصحيحها.
  5. لكل من مجموعات المتبقية من نسب تصحيح بريت، متوسط ​​القيم من الآبار الثلاثة transfected للحصول على نسبة بريت النهائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويتضح مبدأ مقايسة بريت في الشكل 2. ويصور الإعداد الفحص المستخدمة في جميع أنحاء التجارب المقدمة هنا في الشكل 3. أكد الكشف عن إشارة بريت قوية من خلايا transfected مع البروتين الانصهار luciferase المراسل-YFP أن نقل الطاقة كان يمكن ملاحظتها في هذا الإعداد التجريبية (الشكل 4).

تركز بحثنا على دور الأسرة FOXP من repressors النسخي في نمو الدماغ. الطفرات التي تؤثر متخالف FOXP2 يؤدي إلى شكل نادر من اضطراب الكلام واللغة، والتي من الميزة الأبرز هو خلل الأداء التنموي اللفظي، مع صعوبة إنتاج سلاسل معقدة من حركات العضلات orofocial اللازمة لخطاب 14-16. تم الإبلاغ عن الطفرات FOXP1 في المرضى الذين يعانون من اضطرابات طيف التوحد والإعاقة الذهنية يرافقه خطاب شديد ومشاكل اللغة 17-20. ويجري التحقيق تفاعل FOXPs مع بروتينات أخرى لاكتساب نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية ذات الصلة لدور هذه البروتينات في نمو الدماغ.

ومن المعروف FOXP2 لتشكيل-وطي أو heterodimers مع أفراد الأسرة الآخرين FOXP 21، لذلك تم استخدام FOXP2 homodimerization للتحقق من صحة مقايسة بريت (الشكل 4). لاستبعاد احتمال أن التفاعل البروتينات FOXP2 الانصهار في هذا الاختبار كان من المقرر ببساطة إلى البروتين من overexpression، وقد تجلى خصوصية التفاعل عن طريق إدخال طفرة في مجال يسين سحاب dimerization من FOXP2 (الحذف في إطار بقايا E400)، والتي ومن المعروف لتعطيل وطي وheterodimerization 21 (الشكل 5A). عندما كان لوك-FOXP2.DE400 وYFP-FOXP2 البروتينات الانصهار أعرب المشترك، لوحظ وجود انخفاض في إشارة بريت مقارنة عندما كان لوك-FOXP2 وYFP-FOXP2 أعرب المشارك (الشكل 5B). هذه الاشتراكيةوكان الحد gnal ليس بسبب تغيير في توطين التحت خلوية من البروتين متحولة (الشكل 5C) أو إلى الاختلاف في مستويات التعبير وفقا لتقييم النشاف الغربية (لا تظهر البيانات). ولوحظ انخفاض إشارة أيضا عندما أعرب لوك-FOXP2 مع YFP-FOXP2.DE400 (لا تظهر البيانات). وبالتالي بريت فعال في الكشف عن البروتين homodimerization، وتفاعل بروتينات معينة لا تزال عند بإفراط (overexpressed) هذه البروتينات كما luciferase المراسل وYFP بين الذوبان. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام بريت في تركيبة مع الطفرة التي تستهدف البروتينات لديه القدرة على تحديد المخلفات الفردية المشاركة في تفاعلات البروتين البروتين.

لتقييم فعالية الفحص في الكشف عن التفاعلات بريت غيروي، تم اختبار تفاعل مع FOXP2 FOXP1 (الشكل 6). ولوحظ وجود إشارة بريت في كل من التشكيلات الممكنة للمقايسة (أي مع FOXP2 بوصفه المانح أو كما fusio متقبلن البروتين). وبالتالي فإن فحص بريت قادر على كشف كل من هومو والتفاعلات غيروي. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار مدى ملاءمة مقايسة بريت للكشف عن تفاعل FOXP2 مع البروتينات غير FOXP-عن طريق فحص التفاعل مع CtBP1، وهو النسخي التعاون كاظمة والمعروف شريك التفاعل FOXP2 21. واقترح التفاعل بين CtBP1 وFOXP2 أصلا من قبل الخميرة شاشة يومين الهجين وتمت المصادقة في وقت لاحق من خلال التجارب المشتركة مناعي 21. تم الكشف عن التفاعل FOXP2-CtBP1 بواسطة الفحص بريت عندما كان FOXP2 البروتين الانصهار المانحة وكان CtBP1 متقبل، ولكن ليس في التكوين العكسي (الشكل 7A). مثل هذه النتائج وينتظر أن تتم مع نظام بريت (انظر القسم مناقشة). وقد لوحظ التفاعل بين FOXP2 وCtBP1 حتى ولو كان مترجم سوى نسبة ضئيلة من CtBP1 إلى النواة (الشكل 7B)، وتسليط الضوء على حساسية هذا الاختبار. وبالتالي فإن BRETالاختبار هو مفيد للتحقق من التفاعلات المفترضة المحددة من خلال فحص الخميرة اثنين الهجين.

أخيرا، كان يعمل مقايسة بريت لدراسة آثار الطفرات المسببة للأمراض في FOXP2 على البروتين البروتين التفاعلات. وقد تم الإبلاغ عن اثنين من الطفرات نقطة في FOXP2 أن يسبب اضطراب وراثي جسمي قاهر النادرة التي تؤثر على الكلام واللغة (الشكل 8A). تم اكتشاف طفرة مغلطة R553H من خلال دراسة الربط في عائلة كبيرة التي تأثرت نصف الأعضاء من قبل اضطراب 14. تم اكتشاف تحور هراء R328X من خلال التسلسل المستهدف في موضع FOXP2 في probands مع تشخيص خلل الأداء التنموي اللفظي 22. تم تقييم قدرة بروتينات متحولة إلى dimerize مع من النوع البري FOXP2 باستخدام مقايسة بريت. وأظهرت النتائج باستخدام البرية من نوع FOXP2 باعتبارها المانحة وFOXP2 متحولة كما متقبل في الشكل 8B. وقد لوحظت نفس النتائج باستخدام م FOXP2 utant بوصفه المانح والبرية من نوع باعتبارها متقبل (لا تظهر البيانات). الطفرة R553H، والتي هي ضمن مجال الحمض النووي ملزم من FOXP2، لم تؤثر على قدرة البروتين متحولة إلى dimerize مع من النوع البري. وبالتالي يمكن أن تشمل الآلية المسببة للأمراض من هذه الطفرة لها تأثير سلبي المهيمنة الناجمة عن dimerization من متحولة مع البروتين العادي 23. الطفرة R328X يدخل وقف كودون من السابق لأوانه، وكانت النتيجة أن البروتين المشفرة يفتقر إلى يسين سحاب مجال dimerization والمجال ملزم الحمض النووي، ويظهر بعض mislocalization هيولي (الشكل 8C). بما يتفق مع غياب المجال dimerization وmislocalization إلى السيتوبلازم، والبروتين اقتطاع معارض تقلص إلى حد كبير التفاعل مع من النوع البري FOXP2. ولهذا التحور من المرجح أن يكون المسببة للأمراض بسبب haploinsufficiency. وبالتالي فإن فحص بريت يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الآثار البيولوجية من الطفرات التي اكتشفت في المرضى.

ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. المتجهات للتعبير عن البروتينات YFP وluciferase المراسل الانصهار. أ) خرائط الدوار من pYFP وpLuc ناقلات. يتم استخدام ناقلات pLuc للتعبير عن البروتينات الانصهار luciferase المراسل عن الجهات المانحة بريت. يتم استخدام ناقلات pYFP للتعبير عن البروتينات الانصهار YFP كما يقبلون بريت. ناقلات لديها المروج CMV (P CMV) للتعبير رفيع المستوى في خلايا الثدييات، وهو موقع استنساخ متعددة (MCS) لإدخال cDNAs للبروتينات من الفائدة، والجينات المقاومة الكانامايسين (اساسه ص) والأصل تكرار البكتيرية للنشر البلازميد في البكتيريا. B) متعددة موقع الاستنساخ من pLuc وpYFP ناقلات. يظهر نهاية تسلسل الترميز YFP في الزرقاء. والمشروح مواقع التقييد المحدد. لاحظ أن الموقع Xba أنا تم حظره بواسطة اوفهrlapping السد مثيلة في سلالات قياسية من E. القولونية. وينبغي المستنسخة cDNAs الترميز للبروتينات المصلحة في الإطار مع تسلسل الأحماض الأمينية هو مبين. في التجارب وصفها هنا، تم إدراج المستنسخة في مواقع التقييد بام مرحبا وXba الأول (تحتها خط). قد أزيلت وقف كودونات من نهاية و luciferase YFP الترميز متواليات لتوفير إطار القراءة المفتوح يشمل luciferase المراسل / YFP وsubcloned كدنا] من الفائدة. وقف كودونات موجودة في نهاية موقع الاستنساخ متعددة في جميع الأطر الثلاثة القراءة (كما هو موضح باللون الأحمر)، وبالتالي فإنه ليس من الضروري أن تشمل رامزة توقف في [كدنا المدرجة.

الرقم 2
الشكل 2. مبدأ النظام بريت. البروتينات من الفائدة، X و Y، وتنصهر لانزيم luciferase المراسل المانحة (لوك، ذروة الانبعاثات 475 نم) وبروتين متقبل فلوري (YFP، ذروة الانبعاثات 530 نانومتر)، على التوالي. يتم التعبير عن البروتينات الانصهار في خلايا الثدييات مثقف ويقاس بالإضافة التالية لluciferase المراسل الركيزة خلايا قابلة للاختراق، من الانبعاثات لوك باستخدام فلتر حجب الموجات الأطول من 470 نانومتر، والانبعاثات من YFP يقاس باستخدام 500-600 نانومتر الفرقة تمرير التصفية. أ) لا يحدث أي تفاعل بين البروتينات والبروتين X Y. نقل الطاقة من لوك لYFP. ب) التفاعل بين البروتين والبروتين يحدث X نقل الطاقة Y. الرنين من لوك لYFP مما يسبب زيادة في نسبة الانبعاثات قياسها باستخدام و500-600 نانومتر الفرقة تمرير مرشح مقابل مرشح حجب الموجات الأطول من 470 نانومتر.

الرقم 3
الرقم 3. الإعداد الفحص. الإعداد لاختبار فحص لالتفاعل بين اثنين من البروتينات من الفائدة، وتنصهر X و Y. البروتينات التي تهم luciferase المراسل (لوك) بوصفه المانح بريت وبروتين فلوري الصفراء (YFP) كما متقبل بريت. في البروتينات السيطرة، وتنصهر لوك وYFP إلى الببتيد تحتوي على إشارة استهداف لمقصورة التحت خلوية ذات الصلة (P)، إذا كان ذلك مناسبا. أ) ضوابط ليتم تضمينها في كل لوحة. 1) سيطرة وهمية ترنسفكأيشن لتحديد مستويات خلفية التلألؤ ومضان الناجمة عن الضوضاء luminometer وانزيم مستقلة انهيار الركيزة؛ 2) pLuc السيطرة ترنسفكأيشن فقط لتحديد نسبة الانبعاثات luciferase المراسل التي تم الكشف عنها ضمن نطاق الانبعاثات من YFP في غياب بريت متقبل؛ 3) ترنسفكأيشن من pLuc التحكم والسيطرة pYFP لإنشاء إشارة بريت خط الأساس الناتجة عن التفاعل لوك-YFP؛ 4) ترنسفكأيشن من لوك-YFP الانصهار كعنصر تحكم إيجابية لضمان أن إشارة بريت يمكن قياسها. ب) مجموعة من experimشروط ental لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام، X و Y. 1، 2، 4، 5). ضوابط للتفاعل غير محددة بين البروتينات من الفائدة ولوك / YFP؛ 3) حالة اختبار مع X باعتبارها المانحة وY كما متقبل؛ 6) حالة اختبار مع Y بوصفه المانح وX كما متقبل.

الرقم 4
الشكل 4. الكشف عن FOXP2 homodimerization. أ) للتحقق من صحة مقايسة بريت للكشف عن homodimers FOXP2، و transfected الخلايا HEK293 مع بنيات للتعبير عن luciferase المراسل (المانحة) أو YFP (متقبل) تنصهر إما FOXP2 (P2) أو إشارة توطين النووية (-). وluciferase المراسل استهداف النووية والبروتينات YFP بمثابة الضوابط سلبية. كعنصر تحكم إيجابية للكشف عن إشارة بريت، و transfected الخلايا أيضا مع بناء للتعبير عن luciferase المراسل-YFالصور البروتين الانصهار P (+) B) مضان المجهري للخلايا transfected مع YFP تنصهر إلى إشارة توطين النووية (-) أو مع YFP تنصهر لFOXP2 (P2).

الرقم 5
الرقم 5. استخدام-dimerization نقص FOXP2 لإثبات مقايسة خصوصية. أ) رسم تخطيطي من البروتين FOXP2 تبين موقف طفرة DE400، مما يعطل dimerization. يظهر dimerization مجال يسين سحاب في الخضراء والمجال الحمض النووي ملزم باللون الأصفر. B) لاختبار ما إذا overexpression من البروتينات قد يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة في مقايسة بريت، وجرى تقييم لخصوصية الفحص باستخدام FOXP2.DE400 البديل. و transfected الخلايا مع ثوابت للتعبير عن luciferase المراسل (المانحة) أو YFP (متقبل) لتنصهر FOXP2 (P2)، FOXP2.DE400 (DE) أو nucleaالصور C) الإسفار المجهري للخلايا transfected مع YFP تنصهر لFOXP2 (P2) أو FOXP2.DE400 (DE) - إشارة ص التعريب ().

الرقم 6
الرقم 6. الكشف عن-FOXP1 FOXP2 heterodimerization. أ) للتحقق من صحة مقايسة بريت للكشف عن heterodimerization بين البروتينات مثلي FOXP2 وFOXP1، و transfected الخلايا مع ثوابت للتعبير عن luciferase المراسل (المانحة) أو YFP (متقبل) تنصهر إما FOXP2 (P2)، FOXP1 (P1) أو صور B) مضان المجهري للخلايا transfected مع YFP تنصهر لFOXP1 (P1) أو FOXP2 (P2) - إشارة توطين النووية ().

الرقم 7
B) وصور الإسفار المجهري للخلايا transfected مع YFP تنصهر لCtBP1 (CtBP) أو FOXP2 (P2).

الرقم 8
الرقم 8. تقييم آثار الطفرات المسببة للأمراض FOXP2 على البروتين البروتين التفاعلات. أ) رسم تخطيطي من البروتين FOXP2 تظهر مواقف الطفرات R553H وR328X التي تسبب لل النادرةجمهورية مقدونيا الكلام واضطراب اللغة. يظهر dimerization مجال يسين سحاب في الخضراء والمجال الحمض النووي ملزم باللون الأصفر. B) لتقييم جدوى الفحص بريت لتقييم تأثير الطفرات المرضية على البروتين البروتين التفاعلات، والآثار المترتبة على R553H وR328X الطفرات على تم فحص قدرة البروتينات FOXP2 متحولة إلى dimerize مع FOXP2 العادية. و transfected الخلايا مع ثوابت للتعبير عن luciferase المراسل (المانحة) أو YFP (متقبل) تنصهر إما FOXP2 العادي (P2)، FOXP2.R553H (553)، FOXP2.R328X (328)، أو إشارة توطين النووية (-). C ) الصور الإسفار المجهري للخلايا transfected مع YFP تنصهر لFOXP2.R553H (R553H) أو FOXP2.R328X (R328X). في هذه الصورة FOXP2.R328X هي في الغالب النووية، ولكن في خلايا أخرى داخل المجموعة السكانية يبين توزيع أكثر حشوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تصميم بنيات التعبير البروتين الانصهار هو خطوة حاسمة في إعداد مقايسة بريت. في التجارب المعروضة هنا، وتنصهر البروتينات التي تهم C-محطة من luciferase المراسل أو YFP. ومن الممكن أيضا، وربما يكون من الضروري، لتلتحم البروتينات إلى N-محطة من luciferase المراسل / YFP. بالنسبة لبعض البروتينات، ويجوز قبول اندماج فقط في إما N-أو C-محطة من أجل تجنب تعطيل بنية البروتين ووظيفته. وعلاوة على ذلك، على البروتينات عبر الغشاء الذي N و C تيرميني يقيمون في مقصورات التحت خلوية مختلفة، يجب أن تنصهر في luciferase المراسل / البروتين YFP إلى محطة والتي هي في نفس المكان الذي فيه شريك التفاعل. على سبيل المثال، في دراسة التفاعلات بين الغشاء مستقبلات البروتين G-جانب وحشوية β-arrestin، وتنصهر في luciferase المراسل إلى الذيل الكربوكسيل داخل الخلايا مستقبلات عبر الغشاء 8. في حالات أخرى هندسة وinteracti البروتين البروتينعلى قد يؤدي إلى نقل الطاقة كونها أكثر كفاءة باستخدام واحدة من اثنين من التوليفات الممكنة من البروتينات الانصهار. في بعض الأحيان قد لا يتم الكشف عن نقل الطاقة في كل حالة استخدام مجموعة واحدة فقط، مما يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة.

تسلسل رابط الببتيد بين luciferase المراسل / YFP والبروتين من الفائدة قد يؤثر أيضا على كفاءة نقل الطاقة الرنين. يجب أن يكون رابط طويلة بما يكفي للسماح luciferase المراسل / YFP والبروتين من الفائدة لأضعاف دون عائق. وهناك رابط يعد إضفاء مزيد من المرونة على ببتيد عند تقاطع بين luciferase المراسل / YFP والبروتين من الفائدة، والتي قد تزيد كفاءة بريت من خلال تسهيل المواءمة بين ثنائيات الاقطاب المانحة ومتقبل. ومع ذلك، قد يقلل كفاءة بريت إذا كان هناك الكثير من المرونة في رابط. في التجارب هنا، والاستنساخ من البروتينات ذات الاهتمام في مواقع BamH الأول وXba الأول من مركزنا التعبيرأدى الاختصاصات في رابط حمض أميني 23، كما هو مبين في الشكل 1. لقد كان هذا رابط ناجحة للكشف عن التفاعلات بين عدة أزواج من البروتينات.

قبل الانتقال إلى التجارب بريت يجب التأكد من أن البروتينات الانصهار الاحتفاظ النشاط البيولوجي الطبيعي. أداء YFP يمكن تقييمها من خلال رؤية مباشرة باستخدام المجهر مضان. أداء luciferase المراسل يمكن أن يعاير باستخدام مجموعات متاحة تجاريا. أثر الاندماج على توطين التحت خلوية من البروتينات ذات الاهتمام يمكن تقييمها من قبل المناعية، أو في حالة YFP بين الذوبان، من خلال رؤية مباشرة. أثر الاندماج على وظيفة البروتين من الفائدة يمكن التحقيق من قبل المقايسات البروتين محددة - على سبيل المثال، لعامل النسخ قد يكون من المناسب لفحص الحمض النووي ملزم النشاط. لاحظ أن القياسات التلألؤ التي قدمت خلال التجربة توفير مريحة تأكيد في مقايسةأوجه من luciferase النشاط.

من المهم أن تنظر ما هي بنيات التحكم المناسب للبروتين اهتمامك. YFP وluciferase المراسل في الغالب حشوية، وبالتالي فهي الضوابط المناسبة عندما البروتينات من الفائدة حشوية. ومع ذلك، عندما يتم ترجمة البروتينات التي تهم مقصورات التحت خلوية أخرى قد يكون من المرغوب فيه تعديل و luciferase YFP مع إشارات الببتيد لتوجيه الاتجار بهم إلى حجرة ذات الصلة. هنا كانت البروتينات التي تهم عوامل النسخ التي تكون مترجمة إلى النواة، لذلك و luciferase تم تعديل YFP بإضافة إشارة توطين النووية. على وجه التحديد، تم إلحاق الببتيد بما في ذلك إشارة توطين النووية من SV40 المستضد T كبيرة (CGYGPKKKRKVGGLDN) إلى C-محطة luciferase المراسل من وYFP بواسطة ligating أليغنوكليوتيد المزدوج تقطعت بهم السبل الاصطناعية بين بام مرحبا ومواقع Xba أنا من اله pLuc وpYFP ناقلات. إضافة هذه الإشارة تسبب في إعادة توزيع كبيرة من البروتين إلى النواة (الشكل 4B).

بما في ذلك الضوابط المناسبة أمر بالغ الأهمية لتفسير التجارب بريت. عنصر تحكم وهمية ترنسفكأيشن باستخدام حشو البلازميد الخاملة ضروري لتحديد مستويات خلفية التلألؤ ومضان الناجمة عن الضوضاء luminometer وانزيم مستقلة انهيار الركيزة. مع luminometers الحديثة وركائز luciferase المراسل مستويات التلألؤ الخلفية عادة ما تكون منخفضة جدا. ترنسفكأيشن مع luciferase المراسل التحكم المناسب بناء في ظل عدم وجود بناء YFP المهم وضع نسبة الانبعاثات luciferase المراسل التي تم الكشف عنها ضمن نطاق الانبعاثات من YFP في غياب متقبل بريت. ترنسفكأيشن مع luciferase المراسل التحكم والسيطرة YFP يبني يوفر إشارة بريت خط الأساس الناتجة عن التفاعل لوك-YFP. ليلةالزوج راي من البروتينات التي يتم اختبارها للتفاعل، من المهم أن بالنقل كل واحد منفردا بناء التحكم المناسب، كما هو موضح في الشكل 3B، للسيطرة على أي تفاعل غير محددة بين البروتينات التي يجري اختبارها وluciferase المراسل / YFP. ولا سيما عند إجراء التجربة بريت للمرة الأولى، من المهم أن تشمل البروتين الانصهار لوك-YFP كما تحكم إيجابية لضمان أن إشارة بريت يمكن ملاحظتها في الإعداد التجريبية. هنا تم استنساخ تسلسل الترميز من YFP في pLuc في مواقع بام مرحبا وأنا Xba لتوليد البروتين الانصهار في الذي تنصهر YFP إلى C-محطة من luciferase المراسل.

في بروتوكول الموصوفة هنا، وتكوين الحمض النووي لتختلط تم حساب ترنسفكأيشن مع افتراض أن متوسط ​​حجم لوك / YFP انصهار بروتين التعبير يبني ليس أكبر من 7.5 كيلو بايت. إذا كان التعبير الإنشاءاتنهاية الخبر هي أكبر بكثير من هذا، ثم عدد مولات كل بناء التعبير تضاف إلى مزيج ترنسفكأيشن قد يكون من الضروري خفض ذلك أن المبلغ الإجمالي من الحمض النووي في خليط لا يتجاوز الحد الأقصى المسموح به بمقدار ترنسفكأيشن الكاشف. بدلا من ذلك المبلغ من كاشف ترنسفكأيشن وكمية من الحمض النووي في جميع يمزج ترنسفكأيشن يمكن زيادة المبادئ التوجيهية التالية الشركة المصنعة. ومن المعجل التلاعب التجريبية من لوحات 96 جيدا عن طريق استخدام ماصات الأقنية والمضخات. فمن المستحسن لتقليل التباين بين العينات في طول الوقت ترنسفكأيشن مزيج الحضانة بعد إضافة الحمض النووي إلى متوسطة / ترنسفكأيشن مزيج كاشف خالية من المصل، وبالتالي البدء في إضافة ترنسفكأيشن يمزج إلى خلايا في أقرب وقت المزيج الأولى التي يتم فيها احتضان لمدة 10 دقيقة . لأن البروتينات المتقبلة بريت هي اندماج YFP، فمن الممكن لتقييم كفاءة ترنسفكأيشن بواسطة المجهر مضان أو عن طريق قياس مضان في إعادة صفيحة ميكروسكوبيةادير. نجاح تجربة بريت يعتمد على مستوى جيد من ترنسفكأيشن لذلك فإنه من المستحسن لضمان أن ترنسفكأيشن مرضية قبل الشروع في إضافة الركيزة وقياس إشارة بريت. تمكن العلامة YFP أيضا الكمي لمستويات التعبير بروتين متقبل باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. الكمي لمستويات البروتين متقبل قد يكون مفيدا لتحسين وإصلاح الأعطال من التجارب بريت.

وينبغي حضنت الخلايا لمدة 2 ساعة على الأقل مع luciferase المراسل الركيزة قبل قياس إشارة بريت لضمان ما تم إنجازه إشارة مستقرة. بل هو أيضا مقبولة لاحتضان الخلايا مع الركيزة لمدة تصل إلى 24 ساعة. في هذه الحالة سيكون مجموع التهم التلألؤ أقل، ولكن ينبغي أن تكون نسب بريت دون تغيير. حضانات لفترة أطول مع الركيزة قد تكون أكثر ملاءمة (على سبيل المثال، بين عشية وضحاها)، وكذلك السماح للقياس إشارات بريت قبل وبعد التلاعب التجريبية من هذا القبيلكما إضافة مركب الصيدلانية. من الناحية المثالية، وتحسين كثافة البذر الخلية بحيث تصل إلى الخلايا confluency في وقت قريب من القياس. إذا كثافة الخلية هو الأمثل أعلاه ثم قد يكون من المفيد لقياس إشارة بريت عند نقطة وقت سابق لتجنب فرط الخلية. إذا باستخدام نوع من الخلايا غير HEK293، ومن المؤكد أن تحسين ظروف خلية ثقافة وترنسفكأيشن. كما تم إجراء التجارب بريت بنجاح في خلايا هيلا باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا.

في التجارب وصفها هنا، تم قياس التهم التلألؤ في درجة حرارة الغرفة، والذي هو درجة الحرارة المثلى للRenilla luciferase النشاط. إذا إجراء تجربة قتا بالطبع في luminometer فمن الأفضل لضبط درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. قمنا بإجراء نفس التجارب في درجة حرارة الغرفة، وعند 37 درجة مئوية، وأنه لم يلاحظ أي اختلاف كبير في النتائج. إذا إجراء التجارب في درجة حرارة الغرفة، الوينبغي أن يسمح لوحة الإلكترونية لتتوازن 10 دقيقة داخل luminometer قبل القياس للسماح استقرار Renilla luciferase النشاط. هنا، تم دمج إشارات التلألؤ أكثر من 10 ثانية، والذي يوفر عادة حساسية عالية، وخاصة بالنسبة للبروتينات مع مستويات التعبير المنخفض. ومع ذلك، قد تكون متكاملة إشارات على مدى فترات زمنية أقصر إذا كان هذا يوفر حساسية كافية. ويرجع ذلك إلى استقرار إشارة التلألؤ التي تنتجها الخلايا الحية luciferase المراسل الركيزة، كان مقبولا لقياس لمدة تصل إلى 10 ثانية لكل بئر في كل الطول الموجي.

تأكيد التفاعل بين اثنين من البروتينات من الاهتمام من خلال الفحص بريت عندما تكون إشارة من شرط الاختبار يتجاوز بكثير الإشارات من ظروف الرقابة ذات الصلة. عدم وجود إشارة بريت ليس بالضرورة التأكيد على أن التفاعل لا يحدث. في حالة وجود نتيجة غير متوقعة أو سلبية، والتلألؤ الكلي ويتألقينبغي فحص التهم الامتحانات التنافسية الوطنية لضمان أن جميع الآبار و transfected بشكل صحيح.

يتأثر إشارة بريت أيضا نسبة مستويات بروتين تعبير لذا فمن المفيد لفحص مستويات التعبير النسبية لاثنين من البروتينات ذات الاهتمام بمقارنة التهم مضان من الآبار transfected مع YFP اندماج اثنين من البروتينات (أو التهم التلألؤ من آبار transfected مع لاندماج luciferase المراسل). عند واحد من البروتين الانصهار يعرب بقوة أكبر من الآخر، ومن المرجح أن يكون تم الحصول عليها إذا تم تنصهر البروتين مع انخفاض مستوى التعبير إلى luciferase المراسل، كما كان الحال مع FOXP2 وCtBP1 في التجارب المعروضة هنا نتائج أفضل. ومن الممكن أيضا للتلاعب مستويات البروتين عن طريق ضبط نسبة المولي من البلازميدات التعبير في مزيج ترنسفكأيشن. نقل الطاقة بين أزواج معينة من البروتينات الانصهار قد تكون غير فعالة للغاية نظرا لهندسة بروتين معقد. في مثل هذهالحالات قد يكون من المجدي محاولة التفجير البروتينات التي تهم تيرميني بديلة للluciferase المراسل / YFP.

فمن الضروري للتأكد من أن إشارة بريت يمثل الفسيولوجية التفاعل البروتين البروتين وليس ببساطة بسبب البروتين من overexpression. لهذا السبب من المهم تجنب الإجمالي من overexpression من البروتينات. يمكن أن يزيد من تأكيد خصوصية تفاعل البروتين البروتين في النظام عن طريق إدخال بريت الطفرات في البروتينات التي هي معروفة للحد من تقارب من التفاعل، كما هو موضح هنا باستخدام متغير DE400 من FOXP2. يمكن كذلك البروتينات متحولة استخدامها في المنافسة وتشبع ملزم المقايسات بريت. في مقايسة المنافسة، ويتم الاحتفاظ تركيزات المانحة والبروتينات المتقبلة الانصهار ثابتة مع زيادة تركيز إصدار معلم واحد من الشركاء التفاعل كمنافس. معلم البروتين من النوع البري يجب تتنافس مع الخامس الموسومةersion للربط إلى شريك تفاعلها، مما أدى إلى انخفاض في إشارة بريت، في حين أن البروتين متحولة ينبغي أن يحمل انخفاض القدرة على المنافسة من التفاعل. في مقايسة التشبع ملزمة، يتم الاحتفاظ تركيز البروتين الانصهار المانحين مستمر، في حين أن زيادة تركيز متقبل. للتفاعل إشارة محددة بريت يجب الهضبة في نهاية المطاف عن جميع جزيئات المانحة تصبح مشبعة مع متقبل. للتفاعل غير محددة، فإن إشارة بريت عادة ما تظهر زيادة خطية صغيرة بسبب زيادة في حوادث الاصطدام عشوائي بين جزيئات المانحة ومتقبل. في الممارسة العملية، لتفاعلات تقارب المعتدل بين البروتينات القابلة للذوبان، فإنه قد يكون من الصعب تحقيق ما يكفي من متقبل عالية: نسبة المانحة لمراقبة التشبع مع الحفاظ أيضا مستويات كافية من البروتين المانحة للكشف عن إشارة.

ينبغي توخي الحذر في تفسير differencوفاق بين نسب بريت. مقايسة بريت لا يوفر مقياس كمي للتقارب من التفاعل البروتين البروتين لأن يتأثر كفاءة نقل الطاقة من خلال عوامل أخرى غير قوة التفاعل البروتين البروتين. وتشمل هذه العوامل نسبة مستويات البروتينات الانصهار داخل الخلية، هندسة التفاعل، ومعدلات تكوين الجمعيات والتفكك من المجمع. النسب التي تم الحصول عليها مع اثنين من أزواج مختلفة من البروتينات وبالتالي لا يمكن بالضرورة أن تقارن، ولكن قد تكون المقارنات الممكنة بين متغيرات مختلفة من نفس البروتين، مثل مع من النوع البري وΔE400 المتغيرات من FOXP2 هو موضح هنا. في بعض الأحيان، يمكن ملاحظة نسب بريت سلبيا بصورة طفيفة. نسب سلبية قد تنجم عن خطأ في قياس نسبة خط الأساس في الخلايا transfected مع فقط متجه pLuc السيطرة. نسب عالية جدا وغالبا ما تكون مؤشرا على تجميع البروتين، والتي يمكن التأكد من خلال رصد م transfectedLLS مع المجهر مضان. ينبغي أن يحدد ما إذا كان التجميع هو ذات الصلة من الناحية البيولوجية أو قطعة أثرية من البروتين من overexpression.

في الختام، مقايسة بريت الموصوفة هنا هو نهج قوية لتحقيق تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا الحية. وقد تجلى تطبيق بريت لأغراض التحقق من صحة interactors مرشح من دراسات فرز البروتين، وتحديد بقايا محددة تشارك في البروتين البروتين التفاعلات، وتقييم آثار الطفرات وجدت في الحمض النووي للمريض. لأنه يتم الكشف عن التفاعلات في الوقت الحقيقي دون الحاجة للتحلل الخلية، ويمكن قياس إشارة بريت قبل وبعد العلاج، مثل إضافة مركب الصيدلانية أو يجند 7. يظهر الفحص بريت وعدا كبيرا لاستخدامها في البحوث الجينوميات الوظيفية لتقييم أهمية بيولوجية من المتغيرات الجينية المكتشفة من خلال الجيل القادم التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 8000 Nanodrop Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white Greiner Bio One 655098 White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software TECAN Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. 
pLuc, pYFP, positive control plasmid N/A N/A Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+) Promega P2271 Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells ECACC 85120602 Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red Gibco 41966 This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) Gibco 21063 This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM Gibco 31985 OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum Gibco 10270 For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent Novagen 70967 If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO Sigma D2650 Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. 
EnduRen live-cell substrate Promega E6481 Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
  3. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  4. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
  5. Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
  6. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
  7. Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
  8. Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
  9. Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
  10. Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
  11. Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
  12. Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
  13. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  14. Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
  15. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
  16. Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
  17. O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
  18. Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
  19. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
  20. Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
  21. Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
  22. MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
  23. Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).More

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter