Summary
蛋白质之间的相互作用是十分重要的所有细胞过程。使用生物发光共振能量转移，一对蛋白质之间的相互作用可以在活细胞中，并实时监测。此外，潜在的致病突变的效果进行评估。
Abstract
基于生物发光共振能量转移（BRET）测定提供一种灵敏和可靠的手段来监测蛋白质 - 蛋白质相互作用中的活细胞。 BRET是能量从一个“供体”萤光素酶的非辐射转移到一个“受体”荧光蛋白。在此测定法中最常用的结构中，供体是海肾reniformis荧光素酶和受体是黄色荧光蛋白（YFP）。因为能量转移的效率很大程度上距离相关，观察的BRET现象，要求供体和受体在靠近。为了测试两种蛋白质在培养的哺乳动物细胞的兴趣之间的相互作用，一种蛋白质被表达为融合与荧光素酶和第二作为融合与YFP。这两种蛋白的利益之间的相互作用可能使供体和受体充分接近能量转移发生。与其他技术相比在调查的蛋白 - 蛋白间相互作用的BRET分析是敏感的，只需要很少的操作时间和一些试剂，并且能够检测这是短暂而微弱的，或者依赖于活细胞内发现的生化环境的相互作用。因此，它是用于确认通过酵母双杂交或质谱蛋白质组学研究提示推定的相互作用的理想方法，此外它是非常适合用于映射相互作用区域，评估的翻译后修饰的蛋白 - 蛋白相互作用的影响，并评估在患者的DNA鉴定的突变的影响。
Introduction
既古典联动和下一代人类疾病的测序分析都透出参与了一系列生物途径的蛋白的临床意义。这是通常的情况是，之前，他们在这些研究中鉴定，一直存在的这些蛋白质的生物学作用很小或没有调查。一个卓有成效的途径，开始探索的兴趣蛋白质的生物学功能是识别哪些其他蛋白质它与它的生理范围内进行交互。表征分子网络以这种方式提供了深入了解人类表型相关的生物途径。
最常用的大规模筛选方法确定候选互动合作伙伴的利益蛋白酵母双杂交筛选1和质谱为基础的蛋白质组学2。这些方法可以是非常成功的提示潜在的相互作用的蛋白质，但ARË容易受到假阳性结果。因此，确认确定了酵母双杂交或质谱筛查的交互的需要的交互验证利用第二技术。典型的免疫共沉淀或下拉测定法用于这一目的3。使用这样的技术进行验证的一个缺点是对于细胞裂解，从而破坏了细胞内的条件，可能是维持一定的蛋白相互作用所必需的要求。第二个缺点是软弱或短暂蛋白相互作用可在洗涤步骤被打乱。此外，这些测定要求显著动手的时间，在可同时处理的样本的数目是有限的，并且通常需要试剂和方案的费时的优化。
克服某些与免疫共沉淀实验相关联的问题，有几个实验已经基于荧光和biolum开发inescent蛋白质，可以在活细胞中使用。第一个这样的测定法是基于荧光（或福斯特）共振能量转移（FRET），能量的两种荧光蛋白之间的非辐射转移具有重叠发射光谱和激发光谱4。能量转移的效率很大程度上距离相关，因此观察的FRET现象，要求供体和受体荧光基团是近在咫尺。为了测试两种蛋白质的利益之间的相互作用，一种蛋白质被表达为融合与供体荧光团（通常青色荧光蛋白; CFP）和第二作为融合与受体荧光团（通常黄色荧光蛋白; YFP）。这两种蛋白的利益之间的相互作用可能带来的供体和受体荧光基团足够接近的能量转移发生，这将导致光的发射从YFP的受体相对的CFP供体可衡量的增加。 FRET已经成功地检测蛋白质-蛋白质相互作用中的活细胞4。利用FRET用于检测蛋白质 - 蛋白质相互作用的主要缺点是需要外部照明的供体荧光团的激发。外部照明效果在高背景的发射信号，受不必要的激励和两个供体和受体荧光基团的光漂白。这些效应降低了测定，用于检测蛋白质 - 蛋白质相互作用的灵敏度。
从外部照明克服了高背景问题FRET化验的修改是生物发光共振能量转移（BRET）检测5,6。在BRET系统中的供体荧光团所取代的荧光素酶的酶。因此，能量的受体荧光团的激发在系统内生成的荧光素酶底物的氧化，使外部照明是不必要的。在最该测定的通用结构中，供体是海肾reniformis荧光素酶和受体是YFP（用于替代供体和受体蛋白的讨论见PFLEGER 等人5）。因此，在这种系统中，感兴趣的蛋白融合至萤光素酶和潜在的相互作用蛋白对YFP，或反之亦然。在BRET实验需要加入腔肠素作为底物为荧光素酶。由于腔肠素是细胞渗透性的，因此能够在活细胞中进行BRET分析。然而，本机腔肠素是在水溶液中不稳定，和腔肠素的酶无关的击穿既降低衬底可用于测定中的浓度，并产生自发光，从而降低了荧光素酶活性测量的灵敏度。在活细胞使用BRET已经促进了保护coelenterazines，这是在水溶液中稳定，但受细胞内酯酶裂解的发展穿过细胞膜扩散，以产生电池7内部有源腔肠素后第
下列添加底物对细胞表达荧光素酶和YFP融合蛋白，由蛋白质 - 蛋白质相互作用产生的能量转移是通过从荧光素酶和YFP监测排放量化。因为蛋白质的相互作用可直接在活细胞中的多孔板进行监测时，BRET分析构成一个简单的，可扩展的方法，用于检测推定的相互作用是成本和时间效益。
除了验证蛋白质组学筛选研究确定假定的干扰作用，在BRET系统也可以用来从感兴趣的蛋白质前生化和结构的研究而产生的测试候选干扰作用。一旦一个蛋白质 - 蛋白质相互作用的存在已经建立（或者通过使用BRET分析或通过其它技术），存在对于BRET分析为EMP是潜在loyed进一步表征的相互作用。例如，相互作用的区域可通过产生蛋白质的截短形式的映射值，并在特定的相互作用残基的参与可以通过创建点突变来证明。此外，在蛋白质-蛋白质相互作用的翻译后修饰，或小分子（如药物或配体）的调节作用可以调查8-10。
BRET的检测也有一个调查患者的DNA鉴定突变的巨大潜力。在情况下，一个突变的致病作用已经确立，学习使用BRET可以揭示更多关于11表型的分子病因学蛋白-蛋白相互作用的基因突变的影响。由于新一代测序方法的出现，人们越来越普遍的几个潜在损害性突变个体内被发现的，在这种情况下，目前还不清楚这是勒VANT的表型12。在这种情况下，BRET分析可能是在评价突变对蛋白功能的影响有价值的，因此它们对疾病的相关性。
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Protocol
质粒1。创作
- 亚克隆的cDNA为每个感兴趣的蛋白到两个pLuc和pYFP载体，用标准的分子生物学技术（ 图1）。有关详细方案见绿等[13]。
- 序列中的所有构造，以验证所感兴趣的蛋白质在帧与吕克/ YFP序列中间没有终止密码子。
- 如期望的，以确认该融合蛋白保留生物活性进行功能测定。在这里呈现的情况下YFP融合蛋白的亚细胞定位是确定通过荧光显微镜。
- 通过设计相关的目标信号进入pLuc和pYFP表达载体使表达质粒适当吕克和YFP控制蛋白质。在这里介绍的情况下，通过插入一个核定位信号转换成pLuc和pYFP向量生成核针对性吕克和YFP结构。
- 使其中卢克和YFP融合成单个多肽阳性对照构建体。在这里呈现的情况下，产生的阳性对照，其中，YFP编码序列被插入到pLuc矢量。
- 选择一个中性填料质粒被用于均衡的DNA的质量中的转染混合物。使用的质粒不具有真核启动子，因此，将无转录活性的哺乳动物细胞，如细菌克隆载体中。
2制备的DNA混合料
- 估计所有在第1基于260nm处的吸光度所描述的质粒的浓度（1吸光度单位相当于DNA的50微克/毫升）。通过由650沓乘以碱基对的数量确定每种质粒的分子量。使用浓度和分子量来计算每个质粒制备的摩尔浓度。稀释质粒DNA制备到36 Nm的浓度。这些都将是工作股将用于制备用于转染的DNA的混合物。
- 制备含20微升的水至终体积1800纳克填料质粒的对照DNA的组合。
- 制备含有5微升的pLuc控制结构的控制DNA混合物。添加填料质粒带来的总DNA质量1800纳克。加水使最终体积为20微升。
- 制备含有5微升pLuc控制结构和5μlpYFP控制结构的控制DNA混合物。添加填料质粒带来的总DNA质量1800纳克。加水使最终体积为20微升。
- 制备含有5微升阳性对照结构的控制DNA混合物。添加填料质粒带来的总DNA质量1800纳克。加水使最终体积为20微升。
- 准备以下的DNA混合，以测试对于感兴趣，X.蛋白质的同源二聚化对于每一个DNA结合结构5微升的相关pLuc构造和5μl的PY的FP构造。添加填料质粒带来的总DNA质量1800纳克。加水使最终体积为20微升。
A）pLuc控制和pYFP-X
B）pLuc-X和pYFP控制
C）pLuc-X和pYFP-X - 准备以下的DNA混合来测试一对感兴趣的蛋白质之间的相互作用，X和Y。对于每一个DNA结合结构5微升的相关pLuc构建和5微升的pYFP的构建。添加填料质粒带来的总DNA质量1800纳克。加水使最终体积为20微升。
A）pLuc控制和pYFP-X
B）pLuc-X和pYFP控制
C）pLuc控制和pYFP-Y
D）pLuc-Y和pYFP控制
E）pLuc-X和pYFP-Y
F）pLuc-Y和pYFP-X
3，转染
- 收获汇合从一个75 厘米烧瓶HEK293细胞。稀释的细胞总数的10％为13 ml培养介质中。免除130微升细胞悬浮液到一个白色的各孔中清澈见底的96孔培养板。培养细胞24小时。
- 计算由乘以3的DNA混合物的数量被转染井的数量。带来的无血清培养基中至室温。制备含6.3μL无血清培养基中，每孔0.18微升转染试剂预混液。涡旋混合并在室温下孵育5分钟。
- 通过加入2微升的DNA混合，以20微升无血清培养基/转染试剂主混合物的制备转染混合物。不要旋涡。在室温下孵育10分钟。
- 转染三口井，每个转染混合物分装6.5微升转染混合物，每孔。培养的细胞用于进一步的36-48小时。
BRET信号4。测量
- 溶解活细胞荧光素酶的底物在34毫克/毫升DMSO中通过涡旋。
- 在基材的稀释介质P稀重组活细胞荧光素酶底物在1:1,000重新加热到37℃。让50微升底物稀释介质，每孔。旋涡混匀。沉淀物可能形成，但不会影响检测干扰。
- 从96孔板中吸出培养基。免除加入50μl稀释的活细胞荧光素酶底物在每孔中。培养细胞至少2小时（最多24个小时）。
- 从96孔板中除去盖子，孵育板10分钟，在室温下的发光计内。
- 从吕克和YFP一个度量发射阱的时间。使用过滤器阻挡波长大于470纳米测量从吕克排放。使用500-600纳米的带通滤波器测量从YFP的发射。集成发射信号在10秒内。
5。数据分析
- 从3井只收填料质粒的平均吕克排放量读数。从所有其他吕克排放读数减去这个值来产生背景消减吕克排放值。
- 从3井只收填料质粒平均YFP的发射读数。从所有其他YFP的发射读数减去这个值来产生扣除背景的YFP的排放值。
- 对于每孔，通过扣除背景的吕克排放值除以扣除背景的YFP的排放值，让裸BRET比例。
- 平均从转染仅pLuc-对照质粒三个孔中的未校正的BRET比率。减去这个值从所有其他未校正的BRET比率，得到校正后的BRET比率。
- 对于每个校正BRET比例的剩余组，平均从3转染的孔中的值，以获得最终的BRET比率。
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Representative Results
在BRET实验的原理图示于图2。整个这里介绍的实验中所用的测定法，设置在图3中描绘。从转染的细胞的荧光素酶-YFP融合蛋白的强的BRET信号的检测证实了能量转移是可观察在本实验装置（ 图4）。
我们的研究主要集中在FOXP家庭在大脑发育的转录抑制的作用。影响FOXP2导致言语和语言障碍的一种罕见的，其中最突出的特点是发展语言运用障碍难度与生产所需的讲话14-16 orofocial肌肉运动的复杂的序列杂合突变。FOXP1突变的患者出现过自闭症和智力障碍严重者伴有言语和语言的问题17-20。 FOXPs与其他蛋白质的相互作用被调查来深入了解有关这些蛋白在脑发育中的作用的分子机制。
FOXP2是已知的形成同源或异源二聚体与其他FOXP家族成员21，因此FOXP2同源二聚化被用来验证BRET分析（ 图4）。以排除这种可能性，在该测定FOXP2融合蛋白的相互作用是由于仅仅是为了表达蛋白质，该相互作用的特异性证明了将突变引入FOXP2的亮氨酸拉链结构域的二聚化（在框内缺失残基E400），这是已知破坏均聚物和异源21（ 图5A）。当LUC-FOXP2.DE400和YFP-FOXP2融合蛋白共表达，在BRET信号的减少观察时相比，LUC-FOXP2和YFP-FOXP2共表达（ 图5B）。这SIGNAL减少不是由于一个改变的突变体蛋白（ 图5C）的亚细胞定位或以不同的表达水平差异的评估，蛋白质印迹（数据未显示）。也被观察到的信号还原时LUC-FOXP2表达与YFP-FOXP2.DE400（数据未显示）。因而BRET是有效地检测蛋白质同二聚化和蛋白质之间的相互作用保持特定时，这些蛋白质过度表达的荧光素酶和YFP-融合体。此外，与蛋白的靶向突变组合使用的BRET具有鉴定参与蛋白质 - 蛋白质相互作用个别残基的可能。
评估BRET分析的检测异型相互作用的有效性，FOXP2与FOXP1的相互作用进行了测试（ 图6）。甲BRET信号，观察在试验的两个可能的配置（ 即 FOXP2作为施主或受主FUSION蛋白）。因此，BRET分析能够检测两个均聚物和异型相互作用。此外，BRET分析的适宜性，用于检测FOXP2与非FOXP蛋白的相互作用通过检查相互作用与CtBP1，一个转录辅阻遏物和已知FOXP2相互作用伙伴21进行了测试。 CtBP1和FOXP2之间的相互作用最初是由酵母双杂交筛选，并建议通过免疫共沉淀实验21随后被验证。的FOXP2-CtBP1相互作用是由BRET法检测时FOXP2是施主融合蛋白和CtBP1是受体，但不能在相反的结构（ 图7A）。这样的结果是可以预期的BRET系统（见讨论部分）。观察FOXP2和CtBP1之间的相互作用，即使CtBP1只有一小部分被定位于细胞核（ 图7B），突出显示该测定的灵敏度。因此，BRET检测是通过酵母双杂交筛选鉴定推定的相互作用的验证是有用的。
最后，BRET测定法来研究致病突变的FOXP2的蛋白质 - 蛋白质相互作用的影响。在FOXP2两个点突变已报道引起一种罕见的常染色体显性遗传性疾病影响言语及语言（ 图8A）。该R553H错义突变是在一个大家庭中，一半以上的成员都受到了障碍14通过一个连杆的研究发现。该R328X无义突变是通过先证者中有发育口头运用障碍22诊断的FOXP2基因靶向测序发现。使用BRET分析的突变体蛋白的二聚化用野生型FOXP2的能力进行了评估。用野生型FOXP2作为供体和突变体FOXP2作为受体的结果示于图8B。相同的结果是用米观察utant FOXP2作为供体和野生型的受体（数据未显示）。将R553H突变，这是FOXP2的DNA结合结构域之内，并未影响该突变体蛋白的二聚化，与野生型的能力。因此，这种突变的致病机制可以包括从与正常蛋白23突变体的二聚化得到的显性失活效果。的R328X突变引入了一个提前终止密码子，其结果是所编码的蛋白质缺乏亮氨酸拉链二聚化结构域和DNA-结合结构域，并显示了一些细胞质错误定位（ 图8C）。一致的情况下二聚化结构域和错误定位到细胞质中，截短的蛋白显示出大大降低用野生型FOXP2相互作用。因此，这种突变可能是致病因单倍剂量不足。因此，BRET分析可以提供深入了解发现患者的突变的生物学效应。
图1载体的YFP-和萤光素酶融合蛋白的表达。一 ）pYFP和pLuc向量圈地图。该pLuc载体用于荧光素酶融合蛋白作为BRET捐助者的表达。该pYFP载体用于YFP融合蛋白的表达如BRET受体。矢量具有CMV启动子（P CMV）用于在哺乳动物细胞中高水平表达，多克隆位点（MCS），用于插入cDNA的对于感兴趣的蛋白质，和卡那霉素抗性基因（简r）和细菌复制起点的传播在细菌中的质粒B）的pLuc和pYFP矢量的多个克隆位点。 YFP的编码序列的末端以蓝色显示。选定的限制性酶切位点进行注释。注意，XbaI位点被阻断由奥雅纳rlapping坝甲基化在大肠杆菌中的标准菌株大肠杆菌 。的cDNA编码的感兴趣的蛋白质应在框内克隆与所示的氨基酸序列。在这里描述的实验中，插入物克隆到BamHI和XbaI位的限制性位点（下划线的）。终止密码子已经从荧光素酶的末端去除和YFP的编码序列，以提供一个开放的阅读框架，围绕这些萤光素酶/ YFP和感兴趣的cDNA亚克隆。终止密码子存在于多克隆位点在所有三个读码框（显示为红色）的端部，因此，它不是必需的，以包括在所插入的cDNA一个终止密码子。
在BRET系统的图2。原理。感兴趣的蛋白质，X和Y，稠合的供体荧光素酶（吕克，峰值发射475Ñ米）和受体荧光蛋白（YFP，峰值发射为530nm），分别为。融合蛋白的表达在培养的哺乳动物细胞，在加入一种细胞渗透性荧光素酶底物，发光从卢克的使用阻断波长大于从YFP 470 nm，发射滤波器使用500-600纳米的带通滤波器测量测定。从吕克X蛋白和蛋白之间的 ）不会发生蛋白质X和来自吕克蛋白质华能源转让给YFP之间没有互动。 二）互动Y.共振能量转移发生YFP的使用造成测量增加排放的比例在500-600 nm的带通滤波器相比，阻断波长大于470纳米的过滤器。
图3实验设置的实验设置来测试交互两种蛋白质的利益之间，X和利益Y.蛋白质被融合到荧光素酶（吕克）作为BRET供体和黄色荧光蛋白（YFP）作为BRET受体。在对照蛋白，卢克和YFP融合到包含在有关亚细胞区室（P）的靶向信号肽，如果合适，一种）控制被包括在每个板。 1）模拟转染的控制，建立发光和荧光光度计从噪声和衬底的酶无关的击穿造成的本底水平; 2）pLuc控制仅转染以建立其YFP的发射范围内的在不存在BRET受体的检测荧光素酶的发光的比例; 3）pLuc控制和pYFP控制，建立从吕克 - YFP的相互作用而产生的基线BRET信号的转染; 4）吕克-YFP融合转染为阳性对照，以确保BRET信号可以测得B）设置experim的威威廉斯条件来测试两种蛋白质的利益之间的相互作用，X和Y 1，2，4，5）控制对感兴趣和吕克/ YFP蛋白之间的非特异性相互作用; 3）与X作为供体和Y作为受测试条件; 6）与Y测试条件为供体和X作为受体。
图4。检测FOXP2二聚体的。 A）为了验证对FOXP2同源二聚体的检测在BRET实验中，转染HEK293细胞以构建荧光素酶（供体）或YFP（受体）融合至FOXP2（P2）或核定位信号的表达（ - ）。核靶向荧光素酶和YFP蛋白作为阴性对照。作为阳性对照，检测用的BRET信号，将细胞也转染的构建体的荧光素酶-YF的表达）或YFP融合到FOXP2（P2） -转染的细胞与YFP融合到一个核定位信号（号码融合蛋白（+）B）的荧光显微镜图像。
图5。使用的二聚化缺陷的FOXP2演示实验的特异性。的FOXP2蛋白显示DE400突变，扰乱二聚体的位置A）示意图。亮氨酸拉链结构域的二聚化中示出的绿色和黄色B）的DNA结合结构域要测试的蛋白质的过表达是否会导致在BRET检测的假阳性结果，测定的特异性使用FOXP2.DE400评估变体。细胞被转染的构建体用于荧光素酶（供体）或YFP（受体）融合到FOXP2（P2），FOXP2.DE400（DE）或成核表达Ř定位信号（ - ）。转染YFP融合到FOXP2（P2）或FOXP2.DE400（DE）的C）的荧光显微镜图像。
图6。检测FOXP1-FOXP2异二聚体。 A）为了验证该同源蛋白FOXP2和FOXP1之间的异的检测的BRET分析，将细胞转染了构建体对荧光素酶（供体）或YFP（受体）融合至FOXP2（P2）中的表达，FOXP1（P1），或核定位信号（ - ）。转染YFP融合到FOXP1（P1）或FOXP2（P2）中的B）的荧光显微镜图像。
图8。评价的致病FOXP2突变对蛋白-蛋白相互作用的影响。显示R553H和R328X突变引起一种罕见的FO的位置A）示意图的FOXP2蛋白图RM言语和语言障碍。亮氨酸拉链结构域的二聚化中示出的绿色和黄色。 乙的DNA结合结构域）评估在BRET实验的评价病理突变对蛋白-蛋白相互作用的影响的实用程序，该R553H和R328X突变上的效果突变FOXP2蛋白二聚化用正常FOXP2的能力进行了研究。细胞被转染的构建体用于荧光素酶（供体）或YFP（受体）融合到正常FOXP2（P2），FOXP2.R553H（553），FOXP2.R328X（328），或者一个核定位信号的表达（ - ）.13 C细胞）转染的YFP的荧光显微镜图像融合至FOXP2.R553H（R553H）或FOXP2.R328X（R328X）。在此图像中FOXP2.R328X主要是核电，但在群体内其他细胞显示了更多的细胞质分布。
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Discussion
融合蛋白表达结构的设计是建立在BRET分析的关键步骤。在这里介绍的实验中，感兴趣的蛋白被融合至萤光素酶或YFP的C-末端。它也是可能的，并且可能是必要的，融合蛋白的荧光素酶/ YFP的N-末端。对于某些蛋白，融合仅可在无论是N-或C-末端，以避免蛋白质结构和功能的破坏所接受。此外，对于跨膜蛋白，其中N和C末端位于不同亚细胞，荧光素酶/ YFP蛋白必须融合到这是在同一货舱的互动合作伙伴的终点站。例如，在跨膜G蛋白偶联受体和胞质β-抑制蛋白之间的相互作用的研究中，荧光素酶融合到跨膜受体8的胞内羧基尾巴。在其他情况下，蛋白质 - 蛋白质interacti的几何形状上可能会导致能量转移是更高效的使用的融合蛋白的两个可能的组合之一。偶尔能量转移可能无法检测所有，如果只使用一个组合，导致假阴性结果。
荧光素酶/ YFP和感兴趣的蛋白质之间的肽连接体的序列也可能会影响共振能量转移的效率。链接器应该足够长，以使荧光素酶/ YFP和感兴趣的蛋白质不受阻碍折。较长的连接器将给予更大的灵活性，以多肽荧光素酶/ YFP和感兴趣的蛋白质，这可能会增加BRET效率促进供体和受体偶极子的排列之间的交界处。然而，BRET效率可能会降低，如果有一个在连接器太多的灵活性。在此处的实验中，克隆感兴趣的蛋白质的入表达VEC的BamH I和XbaI位点器产生了23个氨基酸的连接体，如示于图1。该接头已成功用于检测多对蛋白质之间的相互作用。
在继续BRET实验应确保该融合蛋白保留了正常的生物活性。 YFP的功能可以通过直接可视化使用荧光显微镜进行评估。荧光素酶的功能可以用市售的试剂盒进行测定。融合在感兴趣蛋白质的亚细胞定位的影响可以通过免疫染色，或在YFP-融合物的情况下，通过直接观察进行评估。融合上感兴趣的蛋白质的功能的效果可以通过蛋白特异性测定法进行调查- 例如 ，对于一个转录因子可能是适当以测定DNA结合活性。注意：在实验过程中所做的发光测量提供了便利的实验证实振动性荧光素酶活性。
考虑适当的控制结构是什么你感兴趣的蛋白质是很重要的。 YFP和荧光素酶主要是细胞质，因此适当的控制，当感兴趣的蛋白质是在细胞质中。然而，当所关心的蛋白质，定位于其它亚细胞区室，可能希望修改的荧光素酶和YFP用肽信号，以指示其贩卖的相关隔室。这里所感兴趣的蛋白质分别被定位于细胞核，因此荧光素酶和YFP通过加入一个核定位信号的修饰的转录因子。具体地，肽包括SV40大T抗原（CGYGPKKKRKVGGLDN）的核定位信号被附加到荧光素酶和YFP的C-末端结扎BamHI和次的XbaI位点之间的合成的双链寡核苷酸ËpLuc和pYFP载体。除了 这个信号引起蛋白质的显著再分配到细胞核中（ 图4B）。
包括适当的控制是至关重要的BRET实验的解释。使用惰性填料质粒转化的模拟转染的控制必须建立发光和荧光光度计从噪声和衬底的酶无关击穿造成的本底水平。随着现代光度计和荧光素酶底物的背景发光水平通常很低。转染用适当控制的萤光素酶构建在没有YFP构建体是很重要的，以确定哪些是YFP的发射范围内的在不存在BRET受体的检测荧光素酶的发光的比例。转染与控制的荧光素酶和控制YFP的构建提供了从吕克 - YFP的相互作用而产生的基线BRET信号。对于前夕Ry的一对被测试的相互作用蛋白，单独转染每一个与相应的控制结构， 如图3B所示 ，为了控制对被测试的蛋白和荧光素酶/ YFP之间的任何非特异性相互作用是重要的。进行BRET实验首次特别是当，重要的是要包括一个LUC-YFP融合蛋白作为阳性对照，以确保一个BRET信号是观察在你的实验装置。这里YFP的编码序列克隆到pLuc的BamHI和XbaI位点以产生在其中YFP融合至萤光素酶的C-末端的融合蛋白。
在这里所描述的协议中，用于转染，计算与该吕克/ YFP融合蛋白表达的平均尺寸构造不大于7.5 kb的假设中的DNA的组合物混合。如果表达式营建TS是比这更大的显著，然后加入转染混合物各表达构建体的摩尔数，可能必须减少，从而使DNA在组合的总量不超过由转染试剂的量所允许的最大值。备选的转染试剂和DNA的量在所有的转染混合物的量可以增加按照制造商的指导方针。 96孔板的实验操作是通过使用多道移液器和吸气的加快。理想的是最小化添加DNA的无血清培养基/转染试剂混合后的样品之间的变异的转染混合物的温育时间的长短，因此开始加入转染混合物的细胞只要第一混合已将孵育10分钟。因为BRET受体蛋白质YFP融合体，能够通过荧光显微镜或通过测量荧光微板重新评估转染效率ADER。一个BRET实验的成功依赖于转染了良好的水平，因此是可取的，以确保转染是令人满意的进到另外的BRET信号的基板和测量之前。 YFP的标签还允许的受体蛋白表达水平的定量用酶标仪。受体蛋白水平的定量可能是优化和BRET实验故障排除非常有用。
细胞应孵育至少2小时，以测量的BRET信号，以确保一个稳定的信号，已经实现了前荧光素酶底物。另外，也可以对培养细胞与底物达24小时。在这种情况下，总的发光计数将降低，但BRET比率应该保持不变。较长的孵育与基板可能会更方便（ 例如过夜），并允许之前和之后的实验操作的BRET信号的测量，例如作为另外一种药物化合物。理想情况下，优化细胞接种密度，使细胞达到约测定时汇合。如果细胞密度高于最佳那么它可能是有利的测量BRET信号在较早的时间点，以避免细胞过度生长。如果使用比其他的HEK293细胞类型，一定要优化细胞培养和转染条件。 BRET实验也已成功地在HeLa细胞用此处描述的协议执行。
在这里描述的实验中，发光计数测定在室温下，这是最适宜的温度为海肾荧光素酶活性。如果在光度计进行时间过程实验，优选以设定温度为37℃。我们已经进行了同样的实验在室温下和在37℃下和在结果中没有显著差异进行了观察。如果进行实验在室温下，第e盘应该允许平衡10分钟内发光仪在测量之前，让海肾萤光素酶活性的稳定。这里，发光信号被整合在10秒内，其通常可提供高灵敏度，特别是对于具有低表达水平的蛋白质。然而，信号可以被集成在更短的时间内，如果该提供足够的灵敏度。由于通过活细胞的荧光素酶底物所产生的发光信号的稳定性，这是可以接受的在每个波长的测量范围为每孔最多持续10秒。
两种蛋白质的利益之间的相互作用是由BRET实验证实，当从测试条件的信号显著超过从有关控制条件的信号。由于没有一个BRET信号的不一定是确认的相互作用不会发生。中的一个意外的或否定的结果的情况下，总的发光和发出荧光NCE计数进行检查，以确保所有的孔都正确地转。
在BRET信号也受的蛋白表达水平的比例由孔转染的两种蛋白质（或发光计数从YFP融合体相比较的荧光计数以检查这两种蛋白的利益的相对表达水平，因此它是有用的孔转染的荧光素酶融合体）。当一个融合蛋白表达比其它更强烈，更好的结果是可能的，如果具有较低的表达水平的蛋白质融合至萤光素酶，这是的情况下与FOXP2和CtBP1在这里介绍的实验来得到。另外，也可以通过调节表达质粒的摩尔比在转染混合物来操作的蛋白质水平。某些成对融合蛋白之间的能量传递可能是非常低效的，由于该蛋白复合体的几何形状。在这种情况下，它可能是值得尝试融合感兴趣的蛋白质荧光素酶/ YFP的替代末端。
这是必要的，以确认该BRET信号表示生理蛋白质 - 蛋白质相互作用，而不是简单地由于蛋白质的过度表达。由于这个原因，以避免蛋白质的总表达是重要的。在BRET系统中的蛋白 - 蛋白相互作用的特异性可以进一步通过将突变引入已知会降低相互作用的亲和力，这表现在这里使用FOXP2的DE400变体的蛋白质被确认。该突变体蛋白可以进一步在竞争和饱和结合BRET分析来使用。在竞争测定中，供体和受体的融合蛋白的浓度保持恒定，同时提高的相互作用伙伴作为竞争对手之一的未标记的版本的浓度。未标记的野生型蛋白质应与标签v竞争版为结合到其相互作用伴侣，导致在BRET信号的减少，而该突变蛋白应具有竞争出来的相互作用能力降低。在饱和结合试验中，供体融合蛋白的浓度保持恒定，同时增加了受体的浓度。对于一个特定的相互作用的BRET信号最终应该高原所有供体分子成为与受体饱和。对于非特异性相互作用时，BRET信号将典型地显示出一个小的线性增加，由于供体和受体分子之间的增加随机碰撞。在实践中，对于水溶性蛋白质之间中度亲和力的相互作用，则可能难以实现足够高的受体：供体比例以观察饱和度，同时保持足够的水平的供体蛋白进行信号检测。
注意需要差别的解释行使BRET比之间上课。在BRET实验并没有提供一种蛋白质 - 蛋白质相互作用的亲和力的定量测量，因为能量转移的效率是由因素比蛋白质 - 蛋白质相互作用的强度等的影响。这些因素包括融合蛋白水平的细胞内的比例，相互作用的几何形状，以及协会和复杂的解离速率。用两对不同的蛋白质获得的比率，因此可以不必进行比较，但比较是可能的相同蛋白的不同变体，例如与野生型和FOXP2这里显示ΔE400变体之间。偶尔，稍负BRET比率可能被观察到。负比率可能导致在转染的细胞仅用pLuc-对照载体的基线比率的测量误差。非常高的比率通常是指示性的蛋白聚集，这可以通过观察转染ce的确认的LLS用荧光显微镜。如果聚合是生物学相关的或蛋白过表达的神器就应该被确定。
总之，这里所描述的BRET分析是一个功能强大的方法，调查蛋白质 - 蛋白质相互作用中的活细胞。 BRET的应用已被证明为从蛋白质组学筛选研究验证候选干扰作用，确定参与蛋白质 - 蛋白质相互作用的特定残基，并评估患者中发现的DNA突变的影响的目的。因为交互实时而不用于细胞裂解的要求检测到时，BRET信号可以之前和之后的处理，例如添加的药物化合物或配体7的测量。 BRET的实验结果显示用于功能基因组学研究，以评估通过新一代测序发现基因变异的生物相关性很大的希望。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由马普学会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanodrop 8000 | Nanodrop | Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes. | |
| 96-microwell plates, flat bottom, white | Greiner Bio One | 655098 | White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off. |
| Infinite F200Pro plate reader with control software | TECAN | Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. | |
| pLuc, pYFP, positive control plasmid | N/A | N/A | Plasmids available from the authors upon request. |
| pGEM-3Zf(+) | Promega | P2271 | Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable. |
| HEK293 cells | ECACC | 85120602 | Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable. |
| DMEM, high glucose, with phenol red | Gibco | 41966 | This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium. |
| DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) | Gibco | 21063 | This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use. |
| OptiMEM | Gibco | 31985 | OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v. |
| GeneJuice transfection reagent | Novagen | 70967 | If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions. |
| DMSO | Sigma | D2650 | Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. |
| EnduRen live-cell substrate | Promega | E6481 | Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium. |
References
- Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
- Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
- Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
- Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
- Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
- Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
- Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
- Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
- O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
- Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
- Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
- Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
- Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
- MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
- Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
