Summary
タンパク質間の相互作用は、すべての細胞プロセスの基本である。生物発光共鳴エネルギー転移を用いて、タンパク質の対の間の相互作用は、生細胞におけるリアルタイムでモニターすることができる。さらに、潜在的に病原性の変異の効果を評価することができる。
Abstract
生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）に基づくアッセイは、生細胞におけるタンパク質 - タンパク質相互作用をモニターするための高感度で信頼性の高い手段を提供する。 BRETは「アクセプター」蛍光タンパク質への「ドナー」ルシフェラーゼ酵素からのエネルギーの非放射伝達である。このアッセイの最も一般的な構成では、ドナーはウミレニフォルミスルシフェラーゼであるとアクセプターは、黄色蛍光タンパク質（YFP）である。エネルギー移動の効率を強く距離依存なので、BRET現象の観察は、ドナーとアクセプターが近接にあることを必要とする。培養哺乳動物細胞中の目的の2つのタンパク質間の相互作用をテストするために、一つのタンパク質をルシフェラーゼとの融合とYFPとの融合としての第2のように表現されている。関心のある2つのタンパク質間の相互作用は、エネルギー移動が起こるのに十分に近いドナーおよびアクセプターをもたらすことができる。タンパク質 - タンパク質を調査するための他の技術と比較してteractionsは、BRETアッセイは敏感であり、少しのハンズオン時間といくつかの試薬を必要とし、弱い一過性の、または、生細胞内で見つかった生化学的環境に依存している相互作用を検出することができます。従って、酵母ツーハイブリッドまたは質量分析プロテオミクス研究によって示唆され、推定上の相互作用を確認するための理想的なアプローチであり、加えて、タンパク質 - タンパク質相互作用に対する翻訳後修飾の効果を評価する、マッピング相互作用する領域に適していて、患者のDNAで同定された変異の影響を評価する。
Introduction
ヒトの疾患の両方の古典的な結合および次世代シーケンス解析は、生物学的経路の範囲に関与するタンパク質の臨床的関連性を明らかにしている。なお、従来、このような研究におけるそれらの同定のために、これらのタンパク質の生物学的役割のほとんど又は全く検討があったことがよくある。目的のタンパク質の生物学的機能を探索を開始する一つの実りアベニューは、その生理的な文脈でと対話する他のどのタンパク質を特定することです。このように、分子ネットワークを特徴づけることは、人間の表現型の根底にある生物学的経路への洞察を提供しています。
最も頻繁に使用される大規模スクリーニングは、目的のタンパク質のための候補相互作用パートナーを同定するためのアプローチは、酵母ツーハイブリッドスクリーニング1及び質量分析に基づくプロテオミクス2である。これらのメソッドは、潜在的な相互作用するタンパク質を示唆している中で、非常に成功したが、arはでき偽陽性の結果を受けやすいE。従って、酵母ツーハイブリッドまたは質量分析スクリーニングによって同定相互作用の確認は、第二の技術を用いて相互作用の検証を必要とする。典型的には、共免疫沈降、またはプルダウンアッセイは、この目的のために使用される3。検証のためにそのような技術を使用する1つの欠点は、特定のタンパク質相互作用を維持するために必須であり得る細胞内条件を破壊し、細胞溶解のための要件である。第2の欠点は、弱いかまたは一過性のタンパク質相互作用は、洗浄工程中に破壊され得ることである。さらに、これらのアッセイは、重要な実践的な時間を要求を同時に処理することができるサンプルの数が制限され、多くの場合、試薬およびプロトコルの時間のかかる最適化を必要とする。
共免疫沈降実験に関連する問題のいくつかを克服するために、いくつかのアッセイは、蛍光及びbiolumに基づいて開発されている生細胞において使用することができるinescentタンパク質。最初のそのようなアッセイは、蛍光（又はフェルスター）共鳴エネルギー移動（FRET）、重複する発光および励起スペクトルを持つ4つの蛍光タンパク質間のエネルギーの非放射伝達に基づいた。エネルギー移動の効率は、従って、FRET現象の観察は、ドナーとアクセプターフルオロフォアが近接している必要があり、強く、距離依存性である。とアクセプター蛍光（一般的に黄色蛍光タンパク質、YFP）との融合のような第2、関心のある2つのタンパク質間の相互作用をテストするために、一つのタンパク質は、ドナー·フルオロ（CFP一般シアン蛍光タンパク質）との融合体として発現されている。関心のある2つのタンパク質間の相互作用は、CFPドナーにYFPアクセプターの位置からの発光の測定可能な増加をもたらすであろう、エネルギー移動が起こるのに十分に近いドナーおよびアクセプターフルオロフォアをもたらすことができる。 FRETは、生きた細胞中4タンパク質-タンパク質相互作用を検出することに成功している。タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するためにFRETを使用することの主な欠点は、ドナーフルオロフォアの励起に外部照明のための要件である。発光信号、アクセプターの不必要な励起、およびドナーとアクセプターフルオロフォアの両方の光退色の高いバックグラウンドで外部照明の結果。これらの効果は、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するためのアッセイの感度を低下させる。
外部照明から高バックグラウンドの問題を克服するFRETアッセイの修飾は、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）アッセイ5,6である。 BRETシステムにおいて、ドナーフルオロフォアは、ルシフェラーゼ酵素により置換されている。こうして、アクセプターフルオロフォアの励起にエネルギーが不要な外部照明をレンダリングする、ルシフェラーゼ基質を酸化することにより、システム内で生成される。ほとんどのこのアッセイの一般的な構成は、ドナーはウミがルシフェラーゼウミとアクセプターが（代替供与体および受容体タンパク質の議論のためにフレら 5参照 ）YFPである。したがって、このシステムでは、目的のタンパク質は、ルシフェラーゼおよび潜在的に相互作用タンパク質YFPへ、またはその逆に融合される。 BRETアッセイは、ルシフェラーゼの基質としてセレンテラジンを追加する必要があります。セレンテラジンは細胞透過性であるため、生細胞におけるBRETアッセイを行うことができる。しかしながら、天然のセレンテラジンは、水溶液中で不安定であり、セレンテラジン両方の酵素非依存性分解アッセイのために利用可能な基質の濃度を減少させ、自己発光を生成し、ルシフェラーゼ活性の測定の感度を減少させる。生細胞におけるBRETの使用は、水溶液中で安定である保護されたセレンテラジンの開発によって促進されたが、細胞質ゾルエステラーゼによって切断されるセル7内活性セレンテラジンを生成するために、細胞膜を横切って拡散後sである。
ルシフェラーゼおよびYFP融合タンパク質を発現する細胞への基質の添加後、タンパク質 - タンパク質相互作用から生じるエネルギー移動をルシフェラーゼおよびYFPからの発光をモニターすることにより定量化される。タンパク質相互作用は、マルチウェルプレート中の生細胞内で直接監視することができるので、BRETアッセイ法は、費用及び時間効率的である推定上の相互作用を検証するための簡単な、スケーラブルな方法を構成する。
プロテオームスクリーニング研究で同定された推定インタラクターを検証することに加えて、BRETシステムはまた、目的のタンパク質上の従来の生化学的および構造的研究から生じる相互作用物質候補を試験するために使用することができる。タンパク質 - タンパク質相互作用の存在は（BRETアッセイを使用して、または他の技術のいずれかによって）確立されると、emp表であるとBRETアッセイの可能性がある相互作用を特徴づけるために、さらにloyed。例えば、相互作用領域はタンパク質の切断型を生成することによってマッピングすることができ、相互作用における特定の残基の関与は、点突然変異を作成することによって実証することができる。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用に対する翻訳後修飾、または（例えば、薬物またはリガンドなど）の小分子調節効果は8-10を調査することができる。
BRETアッセイはまた、患者のDNAで同定された変異を調査するための大きな可能性を秘めている。突然変異の原因の役割がBRETを用いたタンパク質-タンパク質相互作用に対する変異の効果を研究、確立されているケースでは、表現型11の分子病因についての詳細を公開してもよい。次世代シークエンシング方法の登場以来、それがRELEある不明確である場合には、個体内で識別することには、いくつかの潜在的に損傷を与える変異は、ますます一般的である表現型〜12 vant。この状況では、BRETアッセイは、タンパク質の機能およびその障害のゆえの関連性に対する変異の影響を評価する上で貴重であり得る。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
プラスミドの1。作成
- （ 図1）標準的な分子生物学技術を使用して、両方をpLucおよびpYFPベクターに関心対象の各タンパク質のためのcDNAをサブクローニングする。詳細なプロトコルのためにGreen ら 13を参照してください。
- シーケンスは、すべての目的のタンパク質が介在終止コドンとリュック/ YFPの配列とインフレームであることを確認するために構築します。
- 所望の融合タンパク質は、生物学的活性を保持することを確認するための機能的アッセイを行う。ここに提示された場合にYFP融合タンパク質の細胞内局在を、蛍光顕微鏡により確認した。
- pLucをとpYFP発現ベクターに関連する標的化シグナルを操作することによって、適切なリュックとYFP制御タンパク質の発現プラスミドを作成します。ここで紹介する場合、pLucをしてpYFPベクターに核移行シグナルを挿入することにより、核標的リュックとYFPの構造を生成します。
- 作るLucおよびYFPは、単一のポリペプチドに融合された陽性対照構築物。ここに提示された場合に、YFPをコードする配列はpLucをベクターに挿入された陽性対照を生成する。
- トランスフェクション混合物にDNAの質量を等しくするために使用される中性フィラープラスミドを選択する。全く真核生物プロモーターを持っていないため、このような細菌のクローニングベクターのような哺乳動物細胞における転写的に不活性になるプラスミドを使用してください。
DNAミックスの2。準備
- 260 nmの吸光度に基づいて、セクション1に記載されている全てのプラスミドの濃度を推定（1吸光度単位は、50μgのDNA / mlのと同じです）。 650ダによって塩基対の数を乗じて各プラスミドの分子量を決定します。各プラスミド調製物のモル濃度を計算するために濃度および分子量を使用する。 36 nMでの濃度のプラスミドDNA調製物を希釈する。これらは、ワーキングストックになりますすなわち、トランスフェクションのためのDNAミックスを調製するために使用される。
- 水20μlの最終体積中に、フィラープラスミドの1800 NGを含むコントロールDNAミックスを調製する。
- pLucを制御コンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
- pLucを制御コンストラクトの5μLとpYFP制御コンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
- ポジティブコントロールコンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
- 以下のDNAは、目的のタンパク質のホモ二量体化をテストするためにミックスの準備、各DNAミックスXを、関連pLucを5μlの構築Pyとの5μLを組み合わせるFPは構築。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
A）pLucを制御し、pYFP-X
B）をpLuc-XおよびpYFP制御
C）をpLuc-XおよびpYFP-X - 以下のDNAは、目的のタンパク質のペアの間の相互作用をテストするためにミックスの準備、XおよびYは、それぞれのDNA混合物に関連しpLucをコンストラクトの5μLを組み合わせ、pYFP5μlを構築する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。
A）pLucを制御し、pYFP-X
B）をpLuc-XおよびpYFP制御
C）をpLuc制御とpYFP-Y
D）をpLuc-YとpYFP制御
E）をpLuc-XおよびpYFP-Y
F）をpLuc-YとpYFP-X
3。トランスフェクション
- 収穫は75cm 2のフラスコからのHEK293細胞をサブコンフルエント。培地13mlの中に全細胞の10％に希釈する。白の各ウェルに細胞懸濁液130μLを分注透明な96ウェル組織培養プレート底。 24時間培養細胞。
- 3によりDNAミックスの数を乗算することによってトランスフェクトするウェルの数を計算する。室温まで無血清培地をもたらす。無血清培地の6.3μLおよびウェルあたり0.18μlのトランスフェクション試薬を含むマスターミックスを調製する。ボルテックスで混合し、5分間室温でインキュベートする。
- 無血清培地/トランスフェクション試薬マスターミックス20μlにDNA混合物の2液を添加することにより、トランスフェクションミックスを準備します。ボルテックスを行います。 10分間室温でインキュベートする。
- ウェルあたりトランスフェクション混合物の6.5μLを分注、各トランスフェクション混合物を3つのウェルをトランスフェクト。さらに36〜48時間の培養細胞。
BRET信号の4。測定
- ボルテックスによりDMSO中34 mg / mlので生細胞のルシフェラーゼ基質を溶解。
- 基質希釈媒体pで1:1,000に再構成された生細胞のルシフェラーゼ基質を希釈37℃まで再加温しウェル当たり基質希釈50μlの培地を許可します。ミックスする渦。沈殿物が生じることがありますが、アッセイを妨害しません。
- 96ウェルプレートから培地を吸引する。各ウェルに希釈した生細胞のルシフェラーゼ基質を50μlを分注する。少なくとも2時間培養細胞（24時間まで）。
- 96ウェルプレートからリッドを外し、内部照度計、室温で10分間、プレートをインキュベートする。
- よく一度にリュックとYFP 1からの発光を測定します。長い470ナノメートル未満の波長を遮断するフィルタを用いて、リュックからの発光を測定します。 500〜600nmのバンドパスフィルタを用いてYFPから発光を測定する。 10秒かけて発光信号を統合します。
5。データ解析
- 唯一のフィラープラスミドを受けた3つのウェルからリュックエミッションの測定値を平均。バックグラウンドを差し引いたリュック放射値を生成するために、他のすべてのリュック発光読み取り値からこの値を差し引く。
- 唯一のフィラープラスミドを受けた3つのウェルからYFP発光測定値を平均する。バックグラウンドを差し引いたYFP発光の値を生成するために、他のすべてのYFP発光測定値からこの値を差し引く。
- 各ウェルには、補正前のBRET比を与えるためにバックグラウンドを差し引いたリュックエミッション値によりバックグラウンドを差し引いたYFP発光値を分割します。
- 唯一pLucを、対照プラスミドでトランスフェクトされた3つのウェルからの未補正BRET比を平均する。修正さBRET比を与えるために、他のすべての未修正のBRET比から、この値を引きます。
- 補正されたBRET比の残りの組のそれぞれについて、最終的なBRET比を得るために3つのトランスフェクトされたウェルからの値を平均する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BRETアッセイの原理は、 図2に示されている。ここに提示される実験の全体にわたって使用されるアッセイのセットアップを図3に示されている。ルシフェラーゼ-YFP融合タンパク質をトランスフェクトした細胞からの強いBRET信号の検出は、エネルギー移動が観測できたことが確認されこの実験において（ 図4）。
我々の研究は、脳の発達における転写抑制因子のFOXPファミリーの役割に焦点を当てています。最も顕著な特徴は、音声14〜16に必要なorofocial筋肉の動きの複雑なシーケンスを生成するとともに、発達口頭統合運動障害、困難となっている音声言語障害のまれな形態にFOXP2リードに影響を与えるヘテロ接合変異は。FOXP1変異は患者で報告されている重度の会話と言語の問題17〜20を伴う自閉症スペクトラム障害と知的障害を持つ。他のタンパク質とのFOXPsの相互作用は、脳の発達におけるこれらのタンパク質の役割に関連する分子機構への洞察を得るために調査されている。
したがって、FOXP2 FOXP2ホモ二量体化がBRETアッセイ（ 図4）を検証するために使用された、他のFOXPファミリーメンバー21とホモまたはヘテロダイマーを形成することが知られている。このアッセイにおけるFOXP2融合タンパク質の相互作用が単にタンパク質の過剰発現によるものである可能性を除外するために、相互作用の特異性は、（残基E400のインフレーム欠失）FOXP2のロイシンジッパー二量体化ドメインに変異を導入することによって実証されたホモおよびヘテロ二量21（ 図5A）を破壊することが知られている。 LUC-FOXP2.DE400とYFP-FOXP2融合タンパク質が共発現させた場合に、BRET信号の減少は、（ 図5B）LUC-FOXP2とYFP-FOXP2、共発現させた場合と比較して観察された。このSiのウェスタンブロッティング（データは示さず）によって評価しgnal減少は、変異タンパク質（ 図5C）の細胞内局在または発現レベルの差の変化によるものではなかった。リュック-FOXP2がYFP-FOXP2.DE400（データは示していない）で発現させたときに、信号の減少も観察された。従ってBRETは、タンパク質のホモ二量体化を検出するのに有効であり、これらのタンパク質は、ルシフェラーゼおよびYFP-融合物として過剰発現される場合にタンパク質の相互作用は、特定のままである。また、タンパク質の標的変異と組み合わせたBRETの使用は、タンパク質 - タンパク質相互作用に関与する個々の残基を同定する可能性を有する。
ヘテロタイプの相互作用を検出するBRETアッセイの有効性を評価するために、FOXP1とFOXP2の相互作用（ 図6）を試験した。 BRETシグナルは、ドナーまたはアクセプターFUSIOとしてFOXP2でのIE（アッセイの両方の可能な構成で観察されたNタンパク質）。したがってBRETアッセイは、ホモおよびヘテロ型の相互作用の両方を検出することができる。さらに、非FOXP FOXP2タンパク質との相互作用を検出するためのBRETアッセイの適合性は、CtBP1、転写コリプレッサーと既知FOXP2の相互作用パートナー21との相互作用を調べることにより試験した。 CtBP1とFOXP2の間の相互作用は、当初、酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって提案され、その後、免疫共沈降実験21によって検証された。 FOXP2は、ドナーの融合タンパク質であったとCtBP1はなく、逆の構成（ 図7A）において、アクセプターのときFOXP2-CtBP1の相互作用は、BRETアッセイにより検出された。このような成果は、BRETシステム（ディスカッションのセクションを参照）と予想される。 FOXP2とCtBP1間の相互作用はCtBP1のわずかな割合は、このアッセイの感度を強調し、核（ 図7B）に局在していても観察された。したがってBRETアッセイは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって同定された推定の相互作用の検証のために有用である。
最後に、BRETアッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用にFOXP2における病原性突然変異の効果を調べるために用いた。 FOXP2の二つの点変異は、音声言語（ 図8A）に影響を与える稀な常染色体優性疾患を引き起こすことが報告されている。 R553Hのミスセンス変異は、半分のメンバーが障害14の影響を受けされた大家族の中で連鎖研究を通して発見された。 R328Xナンセンス変異が発達口頭統合運動障害22と診断された発端者におけるFOXP2遺伝子座を標的塩基配列決定によって発見されました。野生型FOXP2と二量体化するための変異タンパク質の能力は、BRETアッセイを用いて評価した。受容体としてドナーおよび変異FOXP2として野生型FOXP2を用いた結果を図8（b）に示されている。同様の結果がm個で観察した受容体としてドナーおよび野生型としてutant FOXP2（データは示さず）。 FOXP2のDNA結合ドメイン内にあるR553H変異は、野生型と二量体化するために、変異タンパク質の能力に影響を与えなかった。この突然変異の発症メカニズムは、したがって、正常なタンパク質23と変異体の二量体化に起因するドミナントネガティブ効果を挙げることができる。 R328X変異は、コードされたタンパク質は、ロイシンジッパー二量体化ドメインおよびDNA結合ドメインを欠いている、といくつかの細胞質誤局在（ 図8C）を示し、その結果、未成熟終止コドンを導入しています。細胞質への二量化ドメインと誤局在の欠如と一致して、切断されたタンパク質は、野生型FOXP2と大幅に減少の相互作用を示しています。この変異は、それゆえによりハプロ不全に対して病原性である可能性が高い。従ってBRETアッセイは、患者において発見された変異の生物学的作用への洞察を提供することができる。
図1及びYFP-ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現のためのベクター。 A）pYFPとpLucをベクトルのサークルマップ。 pLucをベクターはBRET供与体としてルシフェラーゼ融合タンパク質の発現のために使用される。 BRETは、アクセプターとしてpYFPベクトルはYFP融合タンパク質の発現のために使用される。ベクターは、哺乳動物細胞における高レベル発現のためのCMVプロモーター（P CMV）、関心対象のタンパク質のためのcDNAの挿入のための多重クローニング部位（MCS）、およびカナマイシン耐性遺伝子（Kan rの ）および増殖のための細菌の複製起点を有する細菌中のプラスミド。B）をpLucとpYFPベクトルのマルチクローニングサイト。 YFPコーディング配列の末端は青色で示されている。選択した制限部位が注釈されている。 XbaI部位はオベによってブロックされていることに注意してくださいEの標準株でダムメチル化をrlapping 大腸菌 。関心対象のタンパク質をコードするcDNAを示すアミノ酸配列とインフレームでクローニングされるべきである。ここに記載した実験において、インサートは（下線） のBam HIおよびXba I制限部位にクローニングした。停止コドンは、ルシフェラーゼの端から除去されており、YFP、ルシフェラーゼ/ YFPおよび関心対象のcDNAのサブクローニングを包含するオープンリーディングフレームを提供するためにコード配列。停止コドンは、従って、それが挿入されたcDNA中の停止コドンを含むことが必須ではないが、（赤色で示す）3つ全てのリーディングフレーム内の複数のクローニング部位の末端に存在する。
BRETシステムの図2。原理。関心対象のタンパク質は、XおよびYは、ドナールシフェラーゼ酵素（リュック、発光ピーク475 nに融合さm）とアクセプター蛍光タンパク質（YFP、ピーク発光波長530nm）であった。融合タンパク質は、培養哺乳動物細胞において発現され、細胞透過性ルシフェラーゼ基質の添加後、リュックからの発光は、より長いYFPから430 nmおよび発光未満の波長を遮断するフィルターを用いて測定される500〜600nmのバンドパスフィルターを用いて測定される。 A）YFPのリュックからタンパク質Xとタンパク質Yのエネルギー移動の間に相互作用が発生しません。タンパク質Xとタンパク質Yの共鳴エネルギー移動の間、B）の相互作用は、使用して測定し、発光の割合の増加を引き起こすYFPにリュックから発生する500〜600nmのバンドパスフィルターは、470 nmより長い波長を遮断するフィルタと比較して。
図3。アッセイ設定。をテストするためのアッセイのセットアップ目的の2つのタンパク質が、関心のあるX及びYのタンパク質間の相互作用は、BRET受容体としてBRET供与体および黄色蛍光タンパク質（YFP）などのルシフェラーゼ（Lucの）に融合される。 。A）は、各プレートに含まれるように制御し、適切な場合、制御タンパク質において、LucおよびYFPは、関連する細胞内区画（P）のためのターゲティングシグナルを含有するペプチドに融合される。基板のルミノノイズおよび酵素非依存性破壊から生じるルミネセンス、蛍光のバックグラウンドレベルを確立するために、1）モックトランスフェクション対照; 2）BRETアクセプターが存在しない場合にYFPの放射範囲内で検出されたルシフェラーゼの発光の比率を確立するためのpLucを制御のみトランスフェクション; 3）pLucを制御し、LUC-YFPの相互作用から生じるベースラインBRETシグナルを確立するpYFPコントロールのトランスフェクション; 4）陽性対照としてのLuc-YFP融合体のトランスフェクションは、BRET信号を測定することができることを確実にする。B）experimのセット関心のある2つのタンパク質間の相互作用を試験するental条件、XとY 1、2、4、5）関心とリュック/ YFPのタンパク質間の非特異的な相互作用のためのコントロール;受容体としてのドナーとYとXが付いた3）試験条件;受容体としてのドナーとXとYとの6）試験条件。
図4。FOXP2のホモ二量体の検出。 A）FOXP2ホモ二量体の検出のためのBRETアッセイを検証するために、HEK293細胞を、ルシフェラーゼ（ドナー）又はFOXP2（P2）または核局在化シグナルのいずれかに融合したYFP（アクセプター）の発現のための構築物でトランスフェクトした（ - ）。核標的ルシフェラーゼとYFPタンパク質は陰性対照として。 BRETシグナルの検出のための陽性対照として、細胞はまた、ルシフェラーゼ - YFの発現のための構築物でトランスフェクトしたP融合タンパク質（+）B）YFPをトランスフェクトした細胞の蛍光顕微鏡画像は、核局在化シグナル（に融合- FOXP2（P2）に融合）またはYFPを有する。
図5。アッセイ特異性を実証するために、二量体化欠損FOXP2の使用。二量化を破壊するDE400変異の位置を示すFOXP2タンパク質のA）概略図。ロイシンジッパー二量体化ドメインは、緑色で示されており、タンパク質の過剰発現はBRETアッセイにおいて偽陽性の結果をもたらし得るかどうかを試験するためにイエローB）におけるDNA-結合ドメインは、アッセイの特異性は、FOXP2.DE400を用いて評価した変種。細胞はFOXP2（P2）、FOXP2.DE400（DE）又はnucleaに融合したルシフェラーゼの発現のための構築物（ドナー）又はYFP（アクセプター）でトランスフェクトしたRの局在化シグナル（ - ）。FOXP2（P2）に、またはFOXP2.DE400（DE）に融合YFPをトランスフェクトした細胞のC）の蛍光顕微鏡画像。
図6。FOXP1-FOXP2ヘテロ二の検出。 A）相同タンパク質FOXP2 FOXP1との間のヘテロ二量体の検出のためBRETアッセイを確認するために、細胞をFOXP2（P2）、FOXP1（P1）またはいずれかに融合したルシフェラーゼの発現のための構築物（ドナー）又はYFP（アクセプター）でトランスフェクトした核局在化シグナル（ - ）。FOXP1（P1）またはFOXP2（P2）に融合したYFPをトランスフェクトした細胞のB）の蛍光顕微鏡画像。
図8：タンパク質-タンパク質相互作用に対する病原性FOXP2の変異の効果を評価する。希土類のfoを引き起こすR553H及びR328X突然変異の位置を示すFOXP2タンパク質のA）概略図会話と言語障害のRM。タンパク質-タンパク質相互作用に関する病理学的突然変異の影響を評価するためのBRETアッセイの有用性を評価するためにロイシンジッパー二量体化ドメインは、緑色と黄色でDNA結合ドメインに示されているB）にR553H及びR328X突然変異の効果通常のFOXP2と二量体化する突然変異FOXP2タンパク質の能力を調べた。 （ - ）細胞は、正常なFOXP2（P2）、FOXP2.R553H（553）、FOXP2.R328X（328）、または核局在化シグナルのいずれかに融合したルシフェラーゼの発現のための構築物（ドナー）又はYFP（アクセプター）でトランスフェクトした。C ）YFPをトランスフェクトした細胞の蛍光顕微鏡画像はFOXP2.R553H（R553H）またはFOXP2.R328X（R328X）に融合した。この画像ではFOXP2.R328Xは主に核であるが、集団内の他の細胞中でより多くの細胞質分布を示している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
融合タンパク質発現構築物の設計は、BRETアッセイをセットアップする際の重要なステップである。ここに提示される実験では、目的のタンパク質は、ルシフェラーゼまたはYFPのC末端に融合させた。それは、ルシフェラーゼ/ YFPのN末端にタンパク質を融合させることも可能であるし、必要であり得る。いくつかのタンパク質は、融合物は、タンパク質の構造および機能の破壊を回避するためにN-またはC-末端のいずれかに受け入れられてもよい。さらに、N末端およびC末端が別の細胞内コンパートメント内に存在する膜貫通型タンパク質については、ルシフェラーゼ/ YFPタンパク質が相互作用パートナーと同じ区画内にある末端に融合されている必要があります。例えば、膜貫通Gタンパク質共役受容体および細胞質β-アレスチンの間の相互作用の研究において、ルシフェラーゼは、膜貫通型受容体8の細胞内カルボキシルテールに融合した。他の場合ではタンパク質の形状interacti上では、融合タンパク質の二つの可能な組み合わせのいずれかを使用して、より効率的なエネルギー伝達をもたらし得る。時折エネルギー移動は、偽陰性の結果をもたらし、一つだけの組み合わせを使用している場合は全く検出されない場合があります。
ルシフェラーゼ/ YFPおよび目的のタンパク質の間のペプチドリンカーの配列はまた、共鳴エネルギー移動の効率に影響を及ぼし得る。リンカは、ルシフェラーゼ/ YFPおよび目的のタンパク質が支障なく折り畳むことができるように十分に長くなければならない。より長いリンカーは、ルシフェラーゼ/ YFPおよびドナーとアクセプター双極子の配向を促進することによってBRET効率を高めることができる関心対象のタンパク質、ポリペプチドとの間の接合部に大きな柔軟性を付与する。リンカー中のあまり柔軟性がある場合は、BRET効率が低下することがある。ここでの実験では、式ののBamHIおよびXbaI部位への目的のタンパク質のクローニングVEC図1に示すように、役には、23 -アミノ酸リンカーをもたらした。このリンカーは、タンパク質のいくつかの対の間の相互作用を検出するために成功している。
実験BRETに進む前に、それは、融合タンパク質が正常な生物学的活性を保持することを確実にすべきである。 YFPの機能は、蛍光顕微鏡を用いて直接可視化により評価することができる。ルシフェラーゼの機能は、市販のキットを用いてアッセイすることができる。目的のタンパク質の細胞内局在化に対する融合の効果は、免疫染色によって、またはYFP-融合の場合には、直接可視化によって評価することができる。目的のタンパク質の機能に対する融合タンパク質の効果は特異的アッセイによって調べることができる- 例えば 、転写因子のために、それはDNA結合活性をアッセイするために適切であり得る。実験中に作った発光測定に便利におけるアッセイの確認を提供する注意ルシフェラーゼ活性のATION。
これは、適切な制御構造が目的タンパク質のためのものかを考えることが重要です。 YFPおよびルシフェラーゼは、主に細胞質であり、目的のタンパク質が細胞質であるしたがって、適切なコントロールです。関心対象のタンパク質が他の細胞内コンパートメントに局在化されたときしかし、関連するコンパートメントへの輸送を指示するためにペプチドシグナルとルシフェラーゼおよびYFPを変更することが望ましい場合がある。ここで、目的のタンパク質は、したがって、ルシフェラーゼおよびYFP核に局在している転写因子は、核局在化シグナルの付加により修飾した。具体的には、SV40ラージT抗原（CGYGPKKKRKVGGLDN）の核局在化シグナルを含むペプチドは、番目のをBamHIおよびXbaI部位の間の合成二本鎖オリゴヌクレオチドを連結することによって、ルシフェラーゼとYFPのC末端に付加されたE pLucをしてpYFPベクトル。この信号の追加は、核（ 図4B）へのタンパク質の重要な再分配を引き起こした。
適切なコントロールを含めると、BRET実験の解釈に非常に重要です。不活性充填剤プラスミドを用いてモックトランスフェクション制御はルミノノイズと基板の酵素非依存性破壊から生じるルミネセンス、蛍光のバックグラウンドレベルを確立することが必須である。現代のルミノメーターおよびルシフェラーゼ基質と背景発光レベルは、典型的には非常に低い。 YFP構築物の非存在下で適切な制御ルシフェラーゼ構築物でのトランスフェクションは、BRETアクセプターの不在下でのYFP発光範囲内で検出されたルシフェラーゼの発光の比率を確立することが重要である。 YFPを構築制御ルシフェラーゼおよび制御でのトランスフェクションは、LUC-YFPの相互作用から生じるベースラインBRET信号を提供する。イブのため相互作用について試験されるタンパク質のリュー対は、それが試験されるタンパク質およびルシフェラーゼ/ YFPの間の任意の非特異的な相互作用のために制御するために、 図3（b）に示すように、適切な制御構築物で単独でそれぞれをトランスフェクトすることが重要である。初めてBRET実験を行う際に特に、BRET信号は、実験セットアップで観察可能であることを確認するための陽性対照としてのLuc-YFP融合タンパク質を含むことが重要である。ここで、YFPのコード配列は、YFP、ルシフェラーゼのC末端に融合された融合タンパク質を生成するためのBam HIおよびXba I部位でpLucを中にクローニングした。
ここで説明するプロトコルでは、DNAの組成物は、トランスフェクションのためにミックスを、リュック/ YFP融合タンパク質発現構築物の平均サイズが7.5kbのより大きくないと仮定して計算した。 if式の建設tsはこれよりもかなり大きい、次いでトランスフェクション混合物に添加し、各発現構築物のモル数は、混合物中のDNAの総量は、トランスフェクション試薬の量によって許容される最大値を超えないように低減されなければならない。代替的に、すべてのトランスフェクションミックス中にトランスフェクション試薬の量およびDNAの量は、製造業者のガイドラインに従って増加することができる。 96ウェルプレートの実験的操作は、マルチチャンネルピペット及び吸引器の使用によって促進される。従って、すぐに第一混合物を10分間インキュベートしたように、細胞にトランスフェクションミックスを添加開始し、無血清培地/トランスフェクション試薬混合物にDNAを添加した後、トランスフェクション混合物のインキュベーション時間の長さはサンプル間のばらつきを最小限にすることが望ましいことである。 BRET受容体タンパク質は、YFP融合体であるので、蛍光顕微鏡により、またはマイクロプレートの再で蛍光を測定することによってトランスフェクション効率を評価することが可能であるADER。それはそのトランスフェクションはBRETシグナルの基板と測定のほかに進む前に、満足のいくものであることを確認することをお勧めしますので、BRET実験の成功は、トランスフェクションの良いレベルに依存します。 YFPタグは、マイクロプレートリーダーを用いて受容体蛋白質発現レベルの定量化を可能にする。受容体タンパク質レベルの定量化は、最適化およびBRET実験のトラブルシューティングのために有用であり得る。
細胞は、安定した信号が達成されたことを確認するBRET信号を測定する前に、ルシフェラーゼ基質で少なくとも2時間インキュベートされるべきである。これは、最大24時間、基質と細胞をインキュベートしても良い。この場合、総発光数は低くなりますが、BRET比は不変である必要があります。基板との長いインキュベーション（一晩、EG）より便利になり、また、そのような実験操作の前と後のBRET信号の測定を可能にすることができる医薬化合物の添加である。細胞は、測定時のまわり密集度に到達するように理想的には、細胞播種密度を最適化します。細胞密度が最適より上である場合、それは細胞の異常増殖を回避するために、早い時点でのBRET信号を測定することが有利であり得る。 HEK293以外の細胞タイプを使用している場合は、細胞培養およびトランスフェクション条件を最適化するようにしてください。 BRET実験にも成功ここに記載したプロトコルを用いてHeLa細胞において行われている。
ここに記載した実験において、発光カウントはウミシイタケルシフェラーゼ活性のための最適温度である室温で測定した。照度計の経時実験を行う場合は、37℃に温度を設定することが好ましい我々は、室温及び37℃で同じ実験を行い、結果に有意差は観察されなかった。室温で実験を行う場合、第電子プレートは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の安定化を可能にするために、測定前にルミノメーターの内部10分間平衡化させるべきである。ここで、発光シグナルは、特に低い発現レベルを有するタンパク質について、典型的に高い感度を提供する10秒にわたって積分した。これは十分な感度を提供する場合は、信号は、より短い期間にわたって積分してもよい。による生細胞のルシフェラーゼ基質によって生成される発光シグナルの安定性は、各波長でウェルごとに最大10秒間測定することが許容される。
試験条件からの信号が有意に関連する制御条件からの信号を超えた場合に、目的の2つのタンパク質間の相互作用は、BRETアッセイによって確認される。 BRETシグナルの不在は、相互作用が発生しないことを確認する必要はありません。予期しない、または否定的な結果の場合には、総発光と蛍光を発するNCE数はすべてのウェルが正しくトランスフェクションしたことを確認するために検討すべきである。
BRET信号は、従って、それは2つのタンパク質のYFP融合体（又はからの発光回数をトランスフェクトしたウェルからの蛍光カウント数を比較することにより、目的の2つのタンパク質の相対発現レベルを調べるために有用であるタンパク質の発現レベルの比によって影響を受けるルシフェラーゼの融合でトランスフェクションしたウェル）。一つの融合タンパク質は、他方よりもより強く発現する場合に、良好な結果は、より低い発現レベルを有する蛋白質がここに提示した実験でFOXP2 CtBP1であった場合、ルシフェラーゼに融合された場合に得られる可能性がある。これは、トランスフェクション混合物中の発現プラスミドのモル比を調整することにより、タンパク質レベルを操作することも可能である。融合タンパク質の特定の対の間のエネルギー移動は、タンパク質複合体の形状に非常に非効率的であってもよい。このような中例には、ルシフェラーゼ/ YFPの代替末端に目的タンパク質を融合しようとする価値があるかもしれません。
なお、BRET信号は、生理学的タンパク質 - タンパク質相互作用を表し、単にタンパク質過剰発現によるものではないことを確認する必要がある。この理由は、タンパク質の総過剰発現を回避することが重要である。 BRETシステムにおけるタンパク質 - タンパク質相互作用の特異性は、さらに、DE400 FOXP2の変異体を用いてここで実証されるように、相互作用の親和性を減少させることが知られているタンパク質に変異を導入することにより確認することができる。変異体タンパク質は、競争やBRETアッセイ飽和結合に使用することができる。競争相手として相互作用パートナーのいずれかのタグなしバージョンの濃度を増加させながら、競合アッセイにおいて、ドナーとアクセプターの融合タンパク質の濃度は一定に保たれる。タグなしの野生型タンパク質は、タグ付きVと競合するべきである変異型タンパク質が相互作用を競争する能力の低下を示さなければならないのに対し、BRETシグナルが低下する、その相互作用パートナーへの結合にERSION。アクセプタの濃度を増加させながら、飽和結合アッセイでは、ドナー融合タンパク質の濃度は、一定に保たれる。すべてのドナー分子が受容体で飽和になるとの特異的な相互作用のためにBRETシグナルは、最終的にプラトー必要があります。非特異的な相互作用のために、BRET信号は、典型的に、ドナーとアクセプター分子との間のランダムな衝突の増加に小さい線形増加を示すであろう。実際には、可溶性タンパク質の間の中程度の親和性の相互作用のためには、十分に高いアクセプターを達成することが困難であり得る：また、信号検出のためのドナータンパク質の十分なレベルを維持しながら、ドナー比が飽和を観察する。
注意differencの解釈に注意が必要であるBRET比間ES。エネルギー移動の効率は、タンパク質 - タンパク質相互作用の強さ以外の要因によって影響されるので、BRETアッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用の親和性の定量的尺度を提供しない。このような因子は、細胞内の融合タンパク質のレベルの比は、相互作用の幾何学的形状、および複合体の会合および解離速度を含む。タンパク質の二つの異なる対を用いて得られた比は、したがって、必ずしも比較できないが、比較には、野生型およびここに示されているFOXP2のΔE400亜種と同じタンパク質の異なる亜種間でも可能である。時々、わずかに負BRET比を観察することができる。負の比率はpLucをコントロールベクターでトランスフェクトした細胞におけるベースライン比の測定誤差に起因し得る。非常に高い比率は、多くの場合、トランスフェクトされたCEの観察により確認することができるタンパク質凝集の指標である蛍光顕微鏡でLLS。凝集は、生物学的に関連またはタンパク質過剰発現の人工物であるかどうかが決定されるべきである。
結論として、ここに記載BRETアッセイは、生細胞におけるタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための強力なアプローチである。 BRETの適用は、プロテオミクススクリーニング研究から候補インタラクターを検証するタンパク質 - タンパク質相互作用に関与する特異的残基を同定し、患者DNA中に見出される変異の効果を評価する目的のために実証されている。相互作用は、細胞溶解を必要とせずにリアルタイムで検出されるので、BRET信号は、医薬化合物またはリガンド7の添加などの処理の前後に測定することができる。 BRETアッセイは、次世代シーケンシングによって発見遺伝的変異の生物学的関連性を評価するための機能ゲノミクス研究で使用するための大きな期待を示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、マックスプランク協会によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanodrop 8000 | Nanodrop | Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes. | |
| 96-microwell plates, flat bottom, white | Greiner Bio One | 655098 | White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off. |
| Infinite F200Pro plate reader with control software | TECAN | Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. | |
| pLuc, pYFP, positive control plasmid | N/A | N/A | Plasmids available from the authors upon request. |
| pGEM-3Zf(+) | Promega | P2271 | Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable. |
| HEK293 cells | ECACC | 85120602 | Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable. |
| DMEM, high glucose, with phenol red | Gibco | 41966 | This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium. |
| DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) | Gibco | 21063 | This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use. |
| OptiMEM | Gibco | 31985 | OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v. |
| GeneJuice transfection reagent | Novagen | 70967 | If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions. |
| DMSO | Sigma | D2650 | Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. |
| EnduRen live-cell substrate | Promega | E6481 | Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium. |
References
- Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
- Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
- Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
- Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
- Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
- Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
- Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
- Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
- O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
- Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
- Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
- Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
- Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
- MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
- Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
