Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Summary

Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l'interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati.

Abstract

Le prove basate sul trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET) forniscono un mezzo sensibile e affidabile per monitorare le interazioni proteina-proteina in cellule vive. BRET è il trasferimento non radiativo di energia da un 'donatore' enzima luciferasi ad una proteina fluorescente 'accettore'. Nella configurazione più comune di questa analisi, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l'accettante è proteina fluorescente gialla (YFP). Poiché l'efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, osservazione del fenomeno BRET richiede che il donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse in cellule di mammifero in coltura, una proteina è espressa come una fusione con luciferasi e la seconda come una fusione con YFP. L'interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare il donatore e accettore sufficientemente stretto per trasferimento di energia a verificarsi. Rispetto ad altre tecniche per indagare proteina-proteina ininterazioni, il saggio BRET è sensibile, richiede poca hands-on tempo e poche reagenti, ed è in grado di rilevare le interazioni che sono deboli, transitori, o dipendente per l'ambiente biochimico trovato all'interno di una cella dal vivo. E 'quindi un approccio ideale per la conferma interazioni putativi suggeriti da lievito two-hybrid o spettrometria di massa proteomica studi, e in aggiunta è particolarmente adatto per le regioni mappatura interagire, valutando l'effetto di modificazioni post-traduzionali sulle interazioni proteina-proteina, e valutare l'impatto delle mutazioni identificate nel DNA paziente.

Introduction

Sia il collegamento classica e sequenziamento di prossima generazione analisi dei disturbi umani stanno rivelando la rilevanza clinica delle proteine ​​coinvolte in una serie di percorsi biologici. E 'spesso il caso che, prima della loro identificazione in tali studi, c'è stata poca o nessuna indagine del ruolo biologico di queste proteine. Una via ancora da cominciare ad esplorare la funzione biologica di una proteina di interesse è quello di identificare quali altre proteine ​​interagisce con nel suo contesto fisiologico. Caratterizzare reti molecolari in questo modo fornisce approfondimenti sui percorsi biologici alla base del fenotipo umano.

Lo screening su larga scala più frequentemente utilizzato approcci per l'identificazione di partner di interazione candidati per le proteine ​​di interesse sono il lievito di screening del doppio ibrido ¹ e massa proteomica basata ^{spettrometria-2.} Questi metodi possono essere molto efficace nel suggerire proteine ​​che interagiscono potenziali, ma arposta vulnerabile a risultati falsi positivi. Pertanto, la conferma di una interazione individuato da lievito doppio ibrido o lo screening spettrometria di massa richiede la convalida dell'interazione con una seconda tecnica. In genere si utilizza un co-immunoprecipitazione o dosaggio pull-down per questo scopo ^3. Uno svantaggio dell'utilizzo di tali tecniche per la validazione è il requisito per la lisi delle cellule, che distrugge le condizioni intracellulari che possono essere essenziali per mantenere certe interazioni proteina. Un secondo svantaggio è che le interazioni deboli o transitori proteine ​​potrebbero essere disturbati durante le fasi di lavaggio. Inoltre, questi saggi richiedono hands-on tempo significativo, sono limitate nel numero di campioni che possono essere elaborati simultaneamente, e spesso richiedono l'ottimizzazione in termini di tempo di reagenti e protocolli.

Per superare alcuni dei problemi associati con esperimenti di co-immunoprecipitazione, diverse analisi sono stati sviluppati sulla base fluorescente e bioluminescent proteine ​​che possono essere utilizzati in cellule vive. I primi tali saggi erano basati su fluorescenza (o Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), il trasferimento non radiativo di energia tra due proteine ​​fluorescenti con sovrapposizione di emissione e spettri di eccitazione ^4. L'efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, quindi osservazione del fenomeno FRET richiede che i fluorofori donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse, una proteina è espressa come una fusione con il fluoroforo donatore (proteina fluorescente comunemente ciano; PCP) e la seconda come una fusione con il fluoroforo accettore (proteina fluorescente comunemente giallo; YFP). L'interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare i fluorofori donatore e accettore sufficientemente vicini per il trasferimento di energia si verifichi, che si tradurrà in un aumento misurabile l'emissione di luce da accettore YFP relativa al donatore PCP. FRET è riuscita a individuare le interazioni proteina-proteina in cellule vive ^4. Lo svantaggio principale di utilizzare FRET per rilevare le interazioni proteina-proteina è il requisito per illuminazione esterna per l'eccitazione del fluoroforo donatore. Risultati illuminazione esterna in alta sfondo nel segnale di emissione, di eccitazione indesiderata della accettore, e photobleaching del donatore e del fluorofori accettore. Questi effetti riducono la sensibilità del saggio per rivelare le interazioni proteina-proteina.

Una modifica del dosaggio FRET che supera il problema di fondo elevato di illuminazione esterna è la bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET) dosaggio ^5,6. Nel sistema di BRET il fluoroforo donatore viene sostituito da un enzima luciferasi. Così l'energia per l'eccitazione del fluoroforo accettore viene generato all'interno del sistema per ossidazione di un substrato di luciferasi, rendendo inutile illuminazione esterna. Nella piùconfigurazione comune di questo test, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l'accettore è YFP (per una discussione di donatore alternativo e proteine ​​accettore vedere Pfleger et al. ^5). Di conseguenza, in questo sistema, una proteina di interesse è fuso ad una proteina luciferasi e potenzialmente interagenti per YFP, o viceversa. La prova BRET richiede l'aggiunta di coelenterazina come substrato per la luciferasi. Poiché coelenterazina è cellula-permeabile, è possibile effettuare saggi BRET in cellule vive. Tuttavia, coelenterazina nativo è instabile in soluzione acquosa, e la ripartizione enzima-indipendente di coelenterazina sia riduce la concentrazione di substrato disponibile per il dosaggio e genera autoluminescence, che riduce la sensibilità di misurazione dell'attività di luciferasi. L'uso di BRET in cellule vive è stata facilitata dallo sviluppo di coelenterazines protette, che sono stabili in soluzione acquosa, ma vengono scisse da esterasi citosolicos dopo la diffusione attraverso la membrana cellulare per generare coelenterazina attiva all'interno della cella ^7.

Dopo l'aggiunta di substrato di cellule che esprimono proteine ​​YFP-fusione-luciferasi, e il trasferimento di energia derivante da interazioni proteina-proteina viene quantificata attraverso il monitoraggio delle emissioni di luciferasi e YFP. Poiché le interazioni proteina possono essere monitorati direttamente in cellule vive in piastre multi-pozzetto, il saggio BRET costituisce un metodo semplice e scalabile per la convalida interazioni putativi che costo e in tempi rapidi.

Oltre a convalidare putativi interattori identificati in studi di screening proteomica, il sistema di BRET può essere utilizzato anche per interattori prova candidati derivanti da precedenti studi biochimici e strutturali sulla proteina di interesse. Una volta stabilita l'esistenza di una interazione proteina-proteina (utilizzando la prova BRET o con altre tecniche), esiste il potenziale per la prova BRET sia empnon legato per caratterizzare ulteriormente l'interazione. Ad esempio, le regioni interagenti possono essere mappati generando versioni troncate di proteine, e il coinvolgimento di specifici residui nell'interazione possono essere dimostrati creando mutazioni puntiformi. Inoltre, l'effetto modulatorio di modifiche post-traduzionali o piccole molecole (ad esempio farmaci o ligandi) sulle interazioni proteina-proteina può essere indagata ^8-10.

Il test BRET ha anche un grande potenziale per lo studio mutazioni identificate nel DNA del paziente. Nei casi in cui è stato stabilito un ruolo causativo per una mutazione, studiando l'effetto della mutazione sulle interazioni proteina-proteina mediante BRET può rivelare più sulla eziologia molecolare del fenotipo ^11. Con l'avvento delle metodologie di sequenziamento di prossima generazione, è sempre più comune per le diverse mutazioni potenzialmente dannosi per l'identificazione all'interno di un individuo, nel qual caso non è chiaro quali sono relenenti al fenotipo ^12. In questa situazione la prova BRET può essere utile nel valutare l'impatto di mutazioni sulla funzione della proteina e quindi la loro rilevanza per il disturbo.

Protocol

1. Creazione di plasmidi

1. Subclone i cDNA per ogni proteina di interesse in entrambi i vettori pluc e pYFP, ​​utilizzando tecniche di biologia molecolare standard (Figura 1). Per i protocolli dettagliati vedere Green et al ^13.
2. Sequenza tutti i costrutti per verificare che le proteine ​​di interesse in frame con la sequenza Luc / YFP senza intermedi codoni di stop.
3. Effettuare saggi funzionali come desiderato per confermare che le proteine ​​di fusione conservano attività biologica. Nel caso qui presentato localizzazione subcellulare delle proteine ​​di fusione YFP è stata accertata mediante microscopia a fluorescenza.
4. Fai plasmidi di espressione appropriata, proteine ​​di controllo Luc e YFP progettando i segnali di targeting rilevanti nei vettori di espressione pluc e pYFP. Nel caso qui presentato, generare Luc e YFP costrutti nucleari mirati inserendo un segnale di localizzazione nucleare nei vettori pluc e pYFP.
5. Rendereun costrutto controllo positivo in cui Luc e YFP si fondono in un singolo polipeptide. Nel caso qui presentato, generare un controllo positivo in cui la sequenza codificante YFP è inserito nel vettore pluc.
6. Selezionare un plasmide riempitivo neutro da utilizzare per equalizzare la massa di DNA in miscele di trasfezione. Utilizzare un plasmide che non ha promotore eucariotico e quindi sarà trascrizionalmente inattivo in cellule di mammifero, come un vettore di clonazione batterica.

2. Preparazione dei Mixes DNA

1. Valutare la concentrazione di tutti i plasmidi descritti nella Sezione 1 basato su assorbanza a 260 nm (1 unità di assorbanza è equivalente a 50 mg / ml di DNA). Determinare la massa molecolare di ciascun plasmide moltiplicando il numero di coppie di basi da 650 bis. Utilizzare la concentrazione e la massa molecolare per calcolare la concentrazione molare di ciascun preparato plasmide. Diluire le preparazioni di DNA plasmide ad una concentrazione di 36 nM. Questi saranno i titoli di lavoroche verranno utilizzati per preparare le miscele DNA per trasfezione.
2. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 1.800 ng di plasmide riempitivo in un volume finale di 20 ml di acqua.
3. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto pluc-controllo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
4. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di pluc controllo costrutto e 5 ml di pYFP controllo costrutto. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
5. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto di controllo positivo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
6. Preparare la seguente miscela DNA per verificare omodimerizzazione di una proteina di interesse, X. Per ogni miscela di DNA combinare 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 microlitri del pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
   A) pluc-controllo e pYFP-X
   B) pluc-X e pYFP controllo
   C) pluc-X e pYFP-X
7. Preparare la seguente miscela DNA per verificare un'interazione tra una coppia di proteine ​​di interesse, X e Y. Per ogni miscela di DNA combinano 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 ml di pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
   A) pluc-controllo e pYFP-X
   B) pluc-X e pYFP controllo
   C) pluc-controllo e pYFP-Y
   D) pluc-Y e pYFP controllo
   E) pluc-X e pYFP-Y
   F) pluc-Y e pYFP-X

3. Transfezione

1. Harvest subconfluente cellule HEK293 da un pallone 75 centimetri ^2. Diluire il 10% delle cellule totali in 13 ml di terreno di coltura. Pipettare 130 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una biancachiaro a fondo piastra a 96 pozzetti di coltura tissutale. Cellule di coltura per 24 ore.
2. Calcolare il numero di pozzetti da trasfettate moltiplicando il numero di miscele di DNA da 3. Portare terreno privo di siero cultura a temperatura ambiente. Preparare una master mix contenente 6,3 ml di mezzo privo di siero e 0,18 ml di reagente di trasfezione per bene. Mescolare nel vortex e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
3. Preparare miscele di trasfezione con l'aggiunta di 2 ml di miscela di DNA a 20 microlitri di media / trasfezione reagente master mix privo di siero. Non vortex. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
4. Transfect tre pozzi con ciascuna miscela di trasfezione erogazione di 6,5 ml di miscela di trasfezione per pozzetto. Cultura le cellule di un ulteriore 36-48 ore.

4. Misurazione di segnale BRET

1. Sciogliere live-cell substrato luciferasi a 34 mg / ml in DMSO di vortex.
2. Diluire ricostituito live-cell substrato luciferasi a 1:1000 in substrato diluizione medio pri-riscaldato a 37 ° C. Lasciare 50 ml di substrato medio diluizione per pozzetto. Vortex per mescolare. Potrebbe formarsi un precipitato, ma non interferisce con il test.
3. Aspirare il terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti. Dispensare 50 ml di diluito live-cell substrato di luciferasi in ciascun pozzetto. Cellule di coltura per almeno 2 ore (fino a 24 ore).
4. Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti ed incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente all'interno luminometro.
5. Misurare le emissioni da Luc e YFP un bene alla volta. Misurare le emissioni da Luc usando un filtro di blocco lunghezze d'onda superiore a 470 nm. Misurare le emissioni di YFP usando un filtro passa-banda 500-600 nm. Integrare segnali di emissione oltre 10 sec.

5. Analisi dei dati

1. Calcolare la media dei valori di emissione Luc dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione Luc per produrre i valori di emissione Luc fondo-sottratto.
2. Calcolare la media dei valori di emissione YFP dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione YFP per produrre i valori di emissione YFP fondo-sottratto.
3. Per ogni bene, dividere il valore delle emissioni YFP background-sottratto dal valore delle emissioni Luc background-sottratto per dare il rapporto BRET corretta.
4. Calcolare la media dei rapporti BRET corretti dai tre pozzi che sono state trasfettate con il solo plasmide pluc-controllo. Sottrarre questo valore da tutti gli altri rapporti BRET corretti per dare i rapporti BRET corretti.
5. Per ciascuno dei rimanenti gruppi di rapporti BRET corretti, la media dei valori delle tre pozzi trasfettate avere un rapporto BRET finale.

Representative Results

Il principio della prova BRET è illustrato nella Figura 2. Il setup dosaggio utilizzato nel corso degli esperimenti presentati qui è mostrata in Figura 3. L'individuazione di un forte segnale BRET da cellule trasfettate con una proteina di fusione luciferasi-YFP confermato che il trasferimento di energia era osservabile in questa configurazione sperimentale (Figura 4).

La nostra ricerca si concentra sul ruolo della famiglia FOXP di repressori trascrizionali nello sviluppo del cervello. Mutazioni eterozigoti che colpiscono FOXP2 portare ad una rara forma di parola e di disturbo del linguaggio, di cui la caratteristica più importante è sviluppo disprassia verbale, difficoltà a produrre le complesse sequenze di movimenti muscolari orofocial necessari per il discorso ^14-16. Mutazioni FoxP1 sono stati riportati in pazienti con disturbi dello spettro autistico e ritardo mentale accompagnati da una grave espressione e problemi linguistici ^17-20. L'interazione di FOXPs con altre proteine ​​è indagato per ottenere informazioni sui meccanismi molecolari rilevanti al ruolo di queste proteine ​​nello sviluppo cerebrale.

FOXP2 è noto per formare omo-o eterodimeri con altri membri della famiglia FOXP ^21, quindi FOXP2 omodimerizzazione è stato usato per validare il test BRET (Figura 4). Per escludere la possibilità che l'interazione di proteine ​​FOXP2 fusione in questo saggio era dovuto semplicemente sovraespressione della proteina, la specificità dell'interazione è stata dimostrata con l'introduzione di una mutazione nel dominio di dimerizzazione leucina zipper di FOXP2 (in-frame delezione del residuo E400), che è noto per disturbare omo e heterodimerization ²¹ (Figura 5A). Quando le proteine ​​di fusione Luc-FOXP2.DE400 e YFP-FOXP2 sono stati co-espresso, una riduzione del segnale BRET è stato osservato rispetto a quando Luc-FOXP2 e YFP-FOXP2 sono stati co-espressi (Figura 5B). Questo SIriduzione segnal non era dovuta ad una alterazione nella localizzazione subcellulare della proteina mutante (Figura 5C) o ad una differenza di livelli di espressione come valutato mediante western blotting (dati non mostrati). La riduzione del segnale è stata osservata anche quando Luc-FOXP2 è stata espressa con YFP-FOXP2.DE400 (dati non mostrati). Così BRET è efficace nel rilevare proteine ​​omodimerizzazione, e l'interazione di proteine ​​resta specifica quando queste proteine ​​sono sovraespressione come YFP-fusioni-luciferasi e. Inoltre, l'uso di BRET in combinazione con mutazione mirata di proteine ​​ha il potenziale per identificare singoli residui coinvolti in interazioni proteina-proteina.

Per valutare l'efficacia della prova BRET nel rilevare interazioni eterotipica, l'interazione di FOXP2 con FOXP1 stata testata (Figura 6). Un segnale BRET è stato osservato in entrambe le configurazioni possibili del saggio (cioè con FOXP2 come donatore o come fusio accettoren proteina). Pertanto la prova BRET è in grado di rilevare le interazioni eterotipica sia omo-e. Inoltre, l'idoneità della prova BRET per rilevare l'interazione di FOXP2 con proteine ​​non FOXP stato testato esaminando l'interazione con CtBP1, un co-repressore trascrizionale e noto socio interazione FOXP2 ^21. L'interazione tra CtBP1 e FOXP2 stato originariamente suggerito da uno schermo doppio ibrido di lievito e successivamente è stato convalidato da esperimenti di co-immunoprecipitazione ^21. L'interazione FOXP2-CtBP1 stato rilevato dalla prova BRET quando FOXP2 era la proteina di fusione donatore e l'accettore CtBP1 era, ma non nella configurazione inversa (Figura 7A). Tali risultati sono da attendersi con il sistema di BRET (vedere la sezione Discussione). L'interazione tra FOXP2 e CtBP1 è stata osservata, anche se solo una piccola percentuale del CtBP1 è stato localizzato nel nucleo (Figura 7B), mettendo in evidenza la sensibilità di questo test. Così il BRETsaggio è utile per la convalida delle interazioni putativi identificati attraverso lo screening di lievito due ibridi.

Infine, la prova BRET è stato impiegato per esaminare gli effetti di mutazioni patogene in FOXP2 sulle interazioni proteina-proteina. Due mutazioni puntiformi in FOXP2 sono stati segnalati per causare una rara malattia autosomica dominante che colpisce parola e di lingua (Figura 8A). La mutazione missenso R553H è stato scoperto attraverso uno studio di linkage in una grande famiglia nella quale la metà dei membri sono stati colpiti dalla malattia ^14. Il nonsense mutazione R328X è stato scoperto mediante sequenziamento mirato del locus FOXP2 in probandi con una diagnosi di sviluppo disprassia verbale ^22. La capacità delle proteine ​​mutanti per dimerizzare con wild-type FOXP2 è stata valutata utilizzando il test BRET. I risultati usando wild-type FOXP2 come donatore e FOXP2 mutante come accettore sono mostrati nella Figura 8B. Gli stessi risultati sono stati osservati utilizzando mFOXP2 utant come donatore e wild-type come accettore (dati non mostrati). La mutazione R553H, che è all'interno del dominio di legame al DNA di FOXP2, non ha influenzato la capacità della proteina mutante di dimerize con wild-type. Il meccanismo patogenetico di questa mutazione può quindi comprendere un effetto dominante negativo derivante dalla dimerizzazione del mutante con la proteina normale ^23. La mutazione R328X introduce un codone di stop prematuro, con il risultato che la proteina codificata manca il dominio di dimerizzazione leucina cerniera e il dominio di legame al DNA, e mostra alcuni mislocalization citoplasmatica (Figura 8C). Coerentemente con l'assenza del dominio di dimerizzazione e mislocalization al citoplasma, la proteina troncata mostra notevolmente ridotta interazione con wild-type FOXP2. Questa mutazione è quindi probabile che sia patogeni causa di haploinsufficiency. Così la prova BRET può fornire indicazioni sugli effetti biologici di mutazioni scoperti in pazienti.

Figura 1. Vettori per l'espressione di proteine ​​YFP-e luciferasi-fusione. A) le mappe Circolo dei vettori pYFP e pluc. Il vettore pluc viene utilizzato per l'espressione di proteine ​​di fusione luciferasi come donatori BRET. Il vettore pYFP viene utilizzato per l'espressione di proteine ​​di fusione YFP come accettori BRET. Vettori hanno un promotore CMV (P _CMV) per l'espressione ad alto livello in cellule di mammifero, un sito di clonazione multipla (MCS) per l'inserimento di cDNA per proteine ​​di interesse, e un gene per la resistenza alla kanamicina (Kan ^r) e origine di replicazione batterica per la propagazione di plasmide in batteri. B) sito di clonaggio multiplo dei vettori pluc e pYFP. La fine della sequenza codificante YFP è mostrata in blu. Siti di restrizione selezionate vengono annotati. Si noti che il sito XbaI viene bloccato da overlapping diga di metilazione in ceppi standard di E. coli. I cDNA codificanti per proteine ​​di interesse dovrebbero essere clonati in-frame con la sequenza aminoacidica mostrata. Negli esperimenti qui descritti, gli inserti sono stati clonati nei siti di restrizione Bam HI e Xba I (sottolineato). Codoni di stop sono stati rimossi dalla fine della luciferasi e YFP sequenze codificanti per fornire una fase di lettura aperta che comprende la luciferasi / YFP e subclonato cDNA di interesse. Codoni di stop sono presenti alla fine del sito di clonaggio multiplo in tutte tre cornici di lettura (indicati in rosso), quindi non è indispensabile inserire un codone di stop nel cDNA inserito.

Figura 2. Principio del sistema di BRET. Proteine ​​di interesse, X e Y, sono fusi ad un enzima luciferasi donatore (Luc, picco di emissione 475 nm) e una proteina accettore fluorescente (YFP, picco di emissione 530 nm), rispettivamente. Proteine ​​di fusione sono espressi in cellule di mammifero in coltura e dopo l'aggiunta di un substrato di luciferasi cellula-permeabile, emissione di Luc è misurata con un filtro di blocco lunghezze d'onda superiore a 470 nm ed emissione da YFP è misurata utilizzando un filtro passa-banda 500-600 nm. A) Nessuna interazione tra proteina e proteina di trasferimento X Y. Energia dal Luc a YFP non si verifica. B) Interazione tra proteine ​​X e Y. proteina Resonance trasferimento di energia avviene da Luc a YFP causando un aumento del rapporto di emissione misurata usando il filtro passa-banda 500-600 nm rispetto al filtro di blocco lunghezze d'onda superiore a 470 nm.

Figura 3. Setup del test. La configurazione test per verificareuna interazione tra due proteine ​​di interesse, X e Y. Le proteine ​​di interesse sono fusi a luciferasi (Luc) come donatore BRET e proteina fluorescente gialla (YFP) come accettore BRET. Nelle proteine ​​di controllo, Luc e YFP sono fusi ad un peptide contenente un segnale di targeting per il comparto subcellulare rilevante (P), se del caso. A) Controlli da inserire in ciascuna piastra. 1) Controllo Mock-trasfezione per stabilire i livelli di luminescenza e fluorescenza derivante dal rumore luminometro e la ripartizione enzima indipendente substrato di fondo; 2) solo pluc-trasfezione controllo per stabilire la percentuale di emissione luciferasi che viene rilevata nell'intervallo emissione di YFP in assenza di un accettore BRET; 3) trasfezione di pluc-controllo e pYFP-controllo per stabilire il segnale di base BRET derivante dall'interazione Luc-YFP; 4) trasfezione di Luc-YFP fusione come un controllo positivo al fine di garantire che un segnale BRET può essere misurata. B) Set di sperimcondizioni bientali per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse, X e Y. 1, 2, 4, 5) Controlli di interazione non-specifica tra le proteine ​​di interesse e Luc / YFP; 3) Condizioni di prova con X come il donatore e Y come l'accettante; 6) Condizioni di prova con Y come il donatore e X come accettore.

Figura 4. Individuazione di FOXP2 omodimerizzazione. A) Per convalidare la prova BRET per la rilevazione di omodimeri FOXP2, cellule HEK293 sono state trasfettate con costrutti di espressione di luciferasi (donatore) o YFP (accettore) fuso a uno FOXP2 (P2) o un segnale di localizzazione nucleare (-). La luciferasi nucleare mirato e proteine ​​YFP servono come controlli negativi. Come controllo positivo per la rilevazione di un segnale BRET, le cellule sono state anche transfettate con un costrutto di espressione di una luciferasi-YFImmagini proteina di fusione P (+) B) microscopia a fluorescenza di cellule trasfettate con YFP fuse ad un segnale di localizzazione nucleare (-.) O con YFP fuso FOXP2 (P2).

Figura 5. Usa di dimerizzazione carenti di FOXP2 per dimostrare dosaggio specificità. A) Rappresentazione schematica della proteina FOXP2 che mostra la posizione della mutazione DE400, che interrompe dimerizzazione. Il dominio di dimerizzazione leucina zipper viene visualizzato in verde e il dominio di legame al DNA in giallo. B) Per verificare se la sovraespressione di proteine ​​può portare a risultati falsi-positivi nel test BRET, la specificità del test è stata valutata utilizzando il FOXP2.DE400 variante. Le cellule sono state transfettate con costrutti per l'espressione della luciferasi (donatore) e YFP (accettore) fusa a FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) o nucleiimmagini C) microscopia a fluorescenza di cellule trasfettate con YFP fuse ad FOXP2 (P2) o per FOXP2.DE400 (DE) - localizzazione segnale r ()..

Figura 6. Rilevamento di FOXP1-FOXP2 eterodimerizzazione. A) Per convalidare la prova BRET per la rilevazione di eterodimerizzazione tra le proteine ​​omologhe FOXP2 e FoxP1, le cellule sono state trasfettate con costrutti di espressione di luciferasi (donatore) o YFP (accettore) fuso a uno FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) o immagini B) microscopia a fluorescenza di cellule trasfettate con YFP fuse ad FOXP1 (P1) o di FOXP2 (P2) - un segnale di localizzazione nucleare ()..

B) immagini di microscopia a fluorescenza di cellule trasfettate con YFP fuse ad CtBP1 (CtBP) o per FOXP2 (P2).

Figura 8. Valutare gli effetti delle mutazioni FOXP2 patogeni sulle interazioni proteina-proteina. A) Rappresentazione schematica della proteina FOXP2 che mostra le posizioni delle mutazioni R553H e R328X che causano un fo rararm di parola e di disturbo del linguaggio. Il dominio di dimerizzazione leucina zipper è mostrato in verde e il dominio di legame al DNA in giallo. B) Per valutare l'utilità della prova BRET per valutare l'impatto di mutazioni patologiche sulle interazioni proteina-proteina, gli effetti delle mutazioni R553H e R328X su la capacità delle proteine ​​mutanti di FOXP2 dimerize con FOXP2 normale sono stati esaminati. Le cellule sono state transfettate con costrutti di espressione di luciferasi (donatore) o YFP (accettore) fuso a uno FOXP2 normale (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328) o un segnale di localizzazione nucleare (-). C ) immagini di microscopia a fluorescenza di cellule trasfettate con YFP fusi FOXP2.R553H (R553H) o per FOXP2.R328X (R328X). In questa immagine FOXP2.R328X è prevalentemente nucleare, ma in altre cellule all'interno della popolazione presenta una distribuzione più citoplasmatica.

Discussion

Il design dei costrutti di espressione della proteina di fusione è un passo fondamentale nella creazione del test BRET. Negli esperimenti presentati qui, le proteine ​​di interesse sono stati fusi al C-terminale della luciferasi o YFP. E 'anche possibile, e può essere necessario, per fondere le proteine ​​al N-terminale della luciferasi / YFP. Per alcune proteine, le fusioni possono essere accettate solo sia la N-o C-terminale al fine di evitare interruzioni della struttura e funzione delle proteine. Inoltre, per le proteine ​​transmembrana in cui l'N e C termini risiedono in differenti compartimenti subcellulari, il / proteina YFP luciferasi deve essere fusa al capolinea che si trova nella stessa cella come partner di interazione. Per esempio, in studi sulle interazioni tra transmembrana G recettori accoppiati alle proteine ​​citoplasmatiche e β-arrestina, la luciferasi è stata fusa al carbossile coda intracellulare del recettore transmembrana ^8. In altri casi la geometria di una interacti proteina-proteinaon può comportare il trasferimento di energia essendo più efficiente utilizzando uno dei due possibili combinazioni di proteine ​​di fusione. Occasionalmente trasferimento di energia non può essere rilevato a tutti, se utilizza una sola combinazione, portando a risultati falsi negativi.

La sequenza del peptide linker tra luciferasi / YFP e la proteina di interesse può anche influenzare l'efficienza del trasferimento di energia di risonanza. Il linker deve essere sufficientemente lungo da consentire luciferasi / YFP e la proteina di interesse per piegare senza ostacoli. Un linker più impartirà maggiore flessibilità al polipeptide all'incrocio tra luciferasi / YFP e la proteina di interesse, che possono aumentare l'efficienza BRET facilitando l'allineamento dei dipoli donatore e accettore. Tuttavia, l'efficienza BRET può diminuire se c'è troppa flessibilità nel linker. Negli esperimenti qui, clonazione delle proteine ​​di interesse nei siti BamH I e Xba I del vec espressionetori comportato un linker acido 23-ammino, come mostrato nella Figura 1. Questo linker ha avuto successo per rilevare interazioni tra diverse coppie di proteine.

Prima di procedere a Bret esperimenti si deve garantire che le proteine ​​di fusione conservano la normale attività biologica. Il funzionamento di YFP può essere valutata mediante visualizzazione diretta utilizzando un microscopio a fluorescenza. Il funzionamento di luciferasi può essere saggiata utilizzando kit disponibili in commercio. L'effetto della fusione sulla localizzazione subcellulare di proteine ​​di interesse può essere valutata mediante immunoistochimica, o in caso di YFP-fusioni, tramite visualizzazione diretta. L'effetto della fusione sulla funzione della proteina di interesse può essere studiata mediante saggi specifici per proteine ​​- ad esempio, per un fattore di trascrizione può essere appropriato per saggiare l'attività di legame al DNA. Notare che le misure di luminescenza effettuate durante l'esperimento forniscono conveniente confermano in-testzione di attività luciferasi.

E 'importante considerare ciò che gli opportuni costrutti di controllo sono per la vostra proteina di interesse. YFP e luciferasi sono prevalentemente citoplasmatica e sono quindi adeguati controlli quando le proteine ​​di interesse sono citoplasmatica. Tuttavia, quando le proteine ​​di interesse sono localizzate ad altri compartimenti subcellulari può essere desiderabile modificare luciferasi e YFP con segnali peptidici per dirigere il loro traffico al compartimento pertinente. Qui le proteine ​​di interesse sono fattori di trascrizione che sono localizzati al nucleo, quindi luciferasi e YFP sono stati modificati mediante l'aggiunta di un segnale di localizzazione nucleare. In particolare, un peptide compreso il segnale di localizzazione nucleare del grande antigene T di SV40 (CGYGPKKKRKVGGLDN) è stato aggiunto al C-terminale della luciferasi e YFP legando oligonucleotidi sintetici a doppio filamento tra la Bam HI e Xba I siti di the pluc e pYFP vettori. Aggiunta di questo segnale causato una significativa redistribuzione di proteine ​​nel nucleo (Figura 4B).

Compresi gli opportuni controlli è fondamentale per l'interpretazione degli esperimenti BRET. Un controllo mock-trasfezione con un plasmide carica inerte è essenziale per stabilire i livelli di luminescenza e fluorescenza derivante dal rumore luminometro e la ripartizione enzima indipendente substrato di fondo. Con luminometri moderne e substrati luciferasi livelli di luminescenza di fondo sono in genere molto basse. Trasfezione con la luciferasi controllo appropriato costruire in assenza di un costrutto YFP è importante stabilire la proporzione di emissione luciferasi che viene rilevata nell'intervallo emissione di YFP in assenza di un accettore BRET. Trasfezione con la luciferasi di comando e controllo YFP costruisce fornisce il segnale di riferimento BRET derivante dall'interazione Luc-YFP. Per vigiliaCoppia ry di proteine ​​che vengono testati per l'interazione, è importante per trasfettare ciascuno da solo con il costrutto di controllo appropriato, come illustrato nella Figura 3B, di controllare, ad ogni interazione aspecifica tra le proteine ​​stati testati e luciferasi / YFP. In particolare quando si esegue un esperimento BRET per la prima volta, è importante comprendere una proteina di fusione Luc-YFP come controllo positivo per assicurare che un segnale BRET è osservabile nella configurazione sperimentale. Qui la sequenza codificante di YFP è stato clonato in pluc nei siti Bam HI e Xba I per generare una proteina di fusione in cui YFP è fuso al C-terminale della luciferasi.

Nel protocollo qui descritto, la composizione della mescola DNA per la trasfezione è stata calcolata con il presupposto che la dimensione media della espressione della proteina di fusione Luc / YFP costruisce non è maggiore di 7,5 kb. Se la costruzione di espressionets sono significativamente più grande di questo, allora il numero di moli di ciascun costrutto di espressione aggiunto alla miscela di trasfezione può deve essere ridotta in modo che la quantità totale di DNA nella miscela non superi il massimo consentito dalla quantità di reagente di trasfezione. In alternativa, la quantità di reagente di trasfezione e la quantità di DNA in tutte le miscele di trasfezione può essere aumentata seguendo le istruzioni del fabbricante. Manipolazione sperimentale di piastre a 96 pozzetti è accelerato con l'uso di pipette multicanale e aspiratori. È desiderabile minimizzare variazione tra campioni nella lunghezza del tempo trasfezione miscela di incubazione dopo l'aggiunta del DNA a medio / trasfezione miscela reagente senza siero, decorre quindi aggiungendo trasfezione mescola di cellule appena prima della miscela abbia incubato per 10 min . Poiché le proteine ​​accettore BRET sono fusioni YFP, è possibile valutare l'efficienza di trasfezione mediante microscopia a fluorescenza o misurando la fluorescenza in una micropiastra reAder. Il successo di un esperimento BRET dipende da un buon livello di trasfezione quindi è consigliabile assicurare che trasfezione è soddisfacente prima di procedere all'aggiunta di substrato e misura del segnale BRET. Il tag YFP permette anche la quantificazione dei livelli di espressione della proteina accettore utilizzando un lettore di micropiastre. Quantificazione dei livelli di proteina accettore può essere utile per l'ottimizzazione e la risoluzione dei problemi di esperimenti BRET.

Le cellule devono essere incubate per almeno 2 ore con luciferasi substrato prima di misurare il segnale BRET per assicurare che un segnale stabile è stato raggiunto. E 'accettabile anche per incubare le cellule con il substrato per un massimo di 24 ore. In questo caso i conteggi totali luminescenza sarà inferiore, ma il rapporto BRET lasciare inalterati. Incubazione più lunghi con substrato può essere più conveniente (es, durante la notte) e anche permettere di misurare segnali BRET prima e dopo una manipolazione sperimentale talecome aggiunta di un composto farmaceutico. Idealmente, ottimizzare densità di semina cellulare in modo che le cellule raggiungono la confluenza intorno al momento della misurazione. Se la densità cellulare è ottimale sopra allora può essere vantaggioso per misurare il segnale BRET in un punto temporale precedente per evitare la crescita eccessiva di cellule. Se si utilizza un tipo cellulare diverso HEK293, assicurarsi di ottimizzare le condizioni di coltura e trasfezione di cellule. BRET esperimenti sono stati eseguiti con successo in cellule HeLa usando il protocollo qui descritto.

Negli esperimenti qui descritti, conteggi di luminescenza sono stati misurati a temperatura ambiente, che è la temperatura ottimale per l'attività di luciferasi Renilla. Se si esegue un esperimento tempo portate in luminometro è preferibile impostare la temperatura a 37 ° C. Abbiamo eseguito lo stesso esperimento a temperatura ambiente ea 37 ° C e nessuna differenza significativa nei risultati è stata osservata. Se l'esecuzione di esperimenti a temperatura ambiente, the piastra deve essere lasciato equilibrare 10 min all'interno luminometro prima della misura per consentire stabilizzazione dell'attività Renilla luciferasi. Qui, segnali di luminescenza sono stati integrati oltre 10 sec, che fornisce tipicamente alta sensibilità, soprattutto per proteine ​​con bassi livelli di espressione. Tuttavia, i segnali possono essere integrati su periodi di tempo più brevi se questo fornisce sensibilità sufficiente. Grazie alla stabilità del segnale di luminescenza prodotta dal substrato luciferasi live-cella, è accettabile per misurare per 10 sec per pozzetto a ciascuna lunghezza d'onda.

Una interazione tra due proteine ​​di interesse è confermato dalla prova BRET quando il segnale dalla condizione di test supera significativamente i segnali delle condizioni di controllo pertinenti. L'assenza di un segnale BRET non è necessariamente conferma che una interazione non si verifica. Nel caso di un risultato inatteso o negativo, il totale luminescenza e fluorescenzaconta SNO devono essere esaminati per garantire che tutti i pozzetti sono state trasfettate correttamente.

Il segnale BRET è anche influenzata dal rapporto dei livelli di espressione di proteine ​​quindi è utile esaminare i livelli di espressione relativi delle due proteine ​​di interesse confrontando i conteggi fluorescenza da pozzi trasfettate con YFP fusioni delle due proteine ​​(o il conteggio di luminescenza da pozzetti trasfettate con le fusioni luciferasi). Quando una proteina di fusione esprime più forte rispetto agli altri, risultati migliori sono suscettibili di essere ottenuto se la proteina con il livello di espressione inferiore è fusa alla luciferasi, come era il caso con FOXP2 e CtBP1 negli esperimenti qui presentati. È anche possibile manipolare i livelli di proteina regolando il rapporto molare di plasmidi di espressione nella miscela di trasfezione. Il trasferimento di energia tra alcune coppie di proteine ​​di fusione può essere molto inefficiente a causa della geometria del complesso proteico. In talecasi può valere la pena di provare a fondere le proteine ​​di interesse al capolinea alternativa di luciferasi / YFP.

È necessario confermare che il segnale BRET rappresenta un'interazione fisiologica proteina-proteina e non è semplicemente dovuta alla sovraespressione della proteina. Per questo motivo è importante evitare sovraespressione lordo di proteine. Specificità di un'interazione proteina-proteina nel sistema di BRET può essere ulteriormente confermata introducendo mutazioni nelle proteine ​​che sono noti per ridurre l'affinità dell'interazione, come dimostrato qui utilizzando la variante DE400 di FOXP2. Le proteine ​​mutanti possono ulteriormente essere usate in competizione e vincolante saggi BRET saturazione. In un saggio di competizione, le concentrazioni di donatore e accettore proteine ​​di fusione sono mantenute costanti, aumentando la concentrazione di una versione non etichettato di uno dei partner di interazione come concorrente. Senza tag proteina wild-type dovrebbe competere con la v taggatoersione per il legame con il suo partner di interazione, con una conseguente diminuzione del segnale BRET, mentre la proteina mutante deve presentare una ridotta capacità di competere l'interazione. In un saggio di legame di saturazione, la concentrazione della proteina di fusione donatore viene mantenuta costante, mentre aumenta la concentrazione del accettore. Per una interazione specifica il segnale BRET dovrebbe eventualmente plateau come tutte le molecole donatrici diventato saturo con l'accettore. Per una interazione aspecifica, il segnale BRET mostra tipicamente un piccolo aumento lineare a causa di un aumento collisioni casuali tra le molecole donatore e accettore. In pratica, per interazioni di moderata affinità tra proteine ​​solubili, può essere difficile ottenere un sufficiente accettore alta: rapporto donatore osservare saturazione pur mantenendo livelli sufficienti di proteina donatore per il rilevamento del segnale.

Deve essere usata cautela nell'interpretazione di differences rapporti tra BRET. La prova BRET non fornisce una misura quantitativa dell'affinità di un'interazione proteina-proteina perché l'efficienza del trasferimento di energia è influenzata da fattori diversi dalla forza dell'interazione proteina-proteina. Tali fattori comprendono il rapporto tra i livelli di proteine ​​di fusione all'interno della cellula, la geometria dell'interazione, ei tassi di associazione e di dissociazione del complesso. I rapporti ottenuti con due differenti coppie di proteine ​​quindi non possono necessariamente essere confrontati, ma i confronti possono essere possibili tra diverse varianti della stessa proteina, come con il wild-type e ΔE400 varianti di FOXP2 mostrati qui. Occasionalmente, si possono osservare i rapporti BRET leggermente negativi. Proporzioni negativi possono essere determinati dal errore nella misurazione del rapporto basale nelle cellule transfettate con il solo vettore pluc-controllo. Rapporti molto elevati sono spesso indice di aggregazione della proteina, che può essere confermata dall'osservazione di ce trasfettateLLS con un microscopio a fluorescenza. Si dovrebbe determinare se l'aggregazione è biologicamente rilevante o un artefatto di proteina sovraespressione.

In conclusione, la prova BRET qui descritto è un approccio efficace per studiare le interazioni proteina-proteina nelle cellule vive. L'applicazione di BRET è stata dimostrata ai fini della convalida interattori candidati da studi di screening proteomica, individuando specifici residui coinvolti nelle interazioni proteina-proteina, e valutare gli effetti delle mutazioni presenti nel DNA del paziente. Poiché le interazioni vengono rilevati in tempo reale senza la necessità di lisi cellulare, il segnale BRET può essere misurato prima e dopo un trattamento come l'aggiunta di un composto farmaceutico o ligando ^7. Il saggio BRET mostra la grande promessa per l'uso in ricerca genomica funzionale per valutare la rilevanza biologica delle varianti genetiche scoperte attraverso sequenziamento di prossima generazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.