Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence

Summary

Les interactions entre protéines sont essentielles à tous les processus cellulaires. Utilisation Bioluminescence Resonance Energy Transfer, l'interaction entre une paire de protéines peut être surveillée dans des cellules vivantes et en temps réel. En outre, les effets des mutations potentiellement pathogènes peuvent être évaluées.

Abstract

Essais basés sur le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) fournissent un moyen sensibles et fiables pour surveiller les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. BRET est le transfert non radiatif de l'énergie à partir d'un "donneur" à une enzyme luciférase "accepteur" protéine fluorescente. Dans la configuration la plus courante de ce dosage, le donneur est la luciférase de Renilla et l'accepteur est une protéine fluorescente jaune (YFP). Parce que l'efficacité du transfert d'énergie est fortement dépendant de la distance, de l'observation du phénomène BRET exige que le donneur et l'accepteur se trouver à proximité. Pour tester une interaction entre deux protéines d'intérêt dans des cellules de mammifères en culture, une protéine est exprimée comme une fusion avec la luciférase et la seconde comme une fusion avec YFP. Une interaction entre les deux protéines d'intérêt peut apporter le donneur et accepteur suffisamment proche pour le transfert de l'énergie de se produire. Par rapport à d'autres techniques d'investigation protéine-protéine dansinteractions, l'essai BRET est sensible, nécessite peu de mains sur le temps et quelques réactifs, et est capable de détecter les interactions qui sont faibles et transitoires, ou dépendant de l'environnement biochimique trouvé dans une cellule vivante. Il s'agit donc d'une approche idéale pour confirmer les interactions putatives ont été proposées par les deux hybrides de levure ou des études de protéomique par spectrométrie de masse, et en outre, il est bien adaptée pour les régions de cartographie interagissant, l'évaluation de l'effet de modifications post-traductionnelles sur les interactions protéine-protéine, et évaluer l'impact des mutations identifiées dans l'ADN du patient.

Introduction

Tant liaison classique et nouvelle génération analyses séquençage de troubles humains sont révélateurs de la pertinence clinique de protéines impliquées dans une gamme de voies biologiques. Il est souvent le cas que, préalablement à leur identification dans de telles études, on a observé peu ou pas d'investigation du rôle biologique de ces protéines. Une piste intéressante pour commencer à explorer la fonction biologique d'une protéine d'intérêt est d'identifier d'autres protéines interagit avec dans son contexte physiologique. Caractérisant les réseaux moléculaires de cette façon permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents du phénotype humain.

Le dépistage à grande échelle le plus fréquemment utilisé des approches pour identifier les partenaires d'interaction de candidats pour des protéines d'intérêt sont la levure dépistage double-hybride ¹ et protéomique basée sur la spectrométrie de masse ^2. Ces méthodes peuvent être très réussie en proposant des protéines interagissant potentiels, mais are vulnérables à des résultats faussement positifs. Par conséquent, la confirmation d'une interaction identifié par deux hybrides de levure ou de dépistage de la spectrométrie de masse nécessite l'interaction de validation en utilisant une seconde technique. Généralement, une co-immunoprécipitation ou dosage déroulant est utilisé à cet effet ^3. Un inconvénient de l'utilisation de telles techniques de validation est la condition pour la lyse des cellules, ce qui détruit les conditions intracellulaires qui peuvent être essentielles pour le maintien de certaines interactions protéiques. Un deuxième inconvénient est que les interactions entre protéines faibles ou transitoires peuvent être perturbées lors des étapes de lavage. En outre, ces dosages demandent significatives le temps de manipulation, sont limités dans le nombre d'échantillons qui peuvent être traités en même temps, et nécessitent souvent l'optimisation des temps de réactifs et de protocoles.

Pour surmonter certains des problèmes associés à des expériences de co-immunoprécipitation, plusieurs dosages ont été développés sur la base de fluorescence et bioluminescent protéines qui peuvent être utilisées dans des cellules vivantes. Les premiers essais ont été basés sur la fluorescence (ou Förster) de transfert d'énergie par résonance (FRET), le transfert non radiatif de l'énergie entre deux protéines fluorescentes avec chevauchement spectres d'émission et d'excitation ^4. L'efficacité du transfert d'énergie est fortement dépendant de la distance, par conséquent, l'observation du phénomène de FRET nécessite que les fluorophores donneurs et accepteurs d'être en étroite proximité. Pour tester une interaction entre deux protéines d'intérêt, une protéine est exprimée comme une fusion avec le fluorophore donneur (protéine fluorescente communément cyan; PCP) et le second en tant que fusion avec le fluorophore accepteur (protéine fluorescente communément jaune; YFP). Une interaction entre les deux protéines d'intérêt peut apporter les fluorophores donneur et accepteur suffisamment proches pour le transfert de l'énergie de se produire, ce qui se traduira par une augmentation mesurable de l'émission de lumière de l'accepteur YFP par rapport au donneur PCP. FRET a été couronnée de succès dans la détection des interactions protéine-protéine dans des cellules vivantes ^4. Le principal inconvénient de l'utilisation de FRET pour la détection des interactions protéine-protéine est la condition pour l'éclairage extérieur pour l'excitation du fluorophore donneur. Les résultats de l'éclairage extérieur à haute fond dans le signal d'émission, non désirée excitation de l'accepteur, et photoblanchiment des fluorophores donneur et accepteur. Ces effets réduisent la sensibilité du dosage pour la détection des interactions protéine-protéine.

Une modification de l'essai de FRET qui résout le problème de fond élevé de l'éclairage extérieur est le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) dosage ^5,6. Dans le système de BRET du fluorophore donneur est remplacée par une enzyme luciférase. Ainsi, l'énergie pour l'excitation du fluorophore accepteur est générée au sein du système par l'oxydation d'un substrat de la luciférase, ce qui rend inutile l'éclairage extérieur. Dans la plupartla configuration courante de ce test, le donneur est luciférase de Renilla reniformis et l'accepteur est la YFP (pour une discussion sur les protéines donneur alternatif et accepteurs voir Pfleger et al. ^5). En conséquence, dans ce système, une protéine d'intérêt est fusionnée à la luciférase et une protéine interagissant potentiellement à YFP, ou vice versa. L'essai BRET nécessite l'addition de coelentérazine en tant que substrat pour la luciférase. Parce que la coelentérazine est perméable aux cellules, il est possible d'effectuer des dosages de BRET dans les cellules vivantes. Cependant, la coelentérazine native est instable en solution aqueuse, et la décomposition d'enzyme indépendant de la coelentérazine la fois de réduire la concentration de substrat disponible pour le test et génère autoluminescence, ce qui réduit la sensibilité des mesures de l'activité de la luciférase. L'utilisation de BRET dans les cellules vivantes a été facilitée par le développement de cœlentérazines protégées, qui sont stables en solution aqueuse mais sont clivés par estérase cytosoliques après diffusion à travers la membrane de la cellule pour générer coelentérazine actif à l'intérieur de la cellule ^7.

Après l'addition du substrat à des cellules exprimant la luciférase et la YFP protéines de fusion, le transfert d'énergie résultant d'interactions protéine-protéine est quantifiée en contrôlant l'émission de la luciférase et la YFP. Parce que les interactions protéine peuvent être contrôlées directement dans les cellules vivantes dans des plaques multi-puits, l'essai BRET constitue une méthode simple et évolutive pour valider les interactions putatifs qui est le coût en temps et en efficacité.

En plus de valider interacteurs putatifs identifiés dans les études de dépistage de la protéomique, le système BRET peut également être utilisé pour interacteurs candidats de test découlant des études biochimiques et structurales antérieures sur la protéine d'intérêt. Une fois que l'existence d'une interaction protéine-protéine a été établie (soit en utilisant l'essai de BRET ou par d'autres techniques), il existe un potentiel pour l'essai de BRET pour être empLoyed en outre de caractériser l'interaction. Par exemple, les régions qui interagissent peuvent être mappés en générant des versions tronquées des protéines, et l'implication de résidus spécifiques de l'interaction peuvent être démontrés en créant des mutations ponctuelles. En outre, l'effet modulateur de modifications post-traductionnelles ou de petites molécules (telles que des médicaments ou des ligands) sur les interactions protéine-protéine peut être étudiée ^8-10.

L'essai BRET a aussi un grand potentiel pour l'étude des mutations identifiées dans l'ADN du patient. Dans les cas où un rôle causal pour une mutation a été établie, l'étude de l'effet de la mutation sur les interactions protéine-protéine à l'aide de BRET peut révéler plus sur l'étiologie moléculaire du phénotype ^11. Depuis l'avènement de méthodes de séquençage de prochaine génération, il est de plus en plus commun pour plusieurs mutations potentiellement nuisibles à être identifiés dans un individu, dans ce cas, on ne sait pas qui sont pertiVant au phénotype ^12. Dans cette situation, l'essai BRET peut être utile dans l'évaluation de l'impact des mutations sur la fonction des protéines et donc leur pertinence à la maladie.

Protocol

Une. Création de plasmides

1. Sous-cloner les ADNc pour chacune des protéines d'intérêt dans les deux vecteurs Pluc et pYFP, ​​en utilisant des techniques standards de biologie moléculaire (figure 1). Pour les protocoles détaillés voir Green et al ^13.
2. Toutes les constructions de séquence pour vérifier que les protéines d'intérêt sont en phase avec la séquence Luc / YFP, sans codons d'arrêt intermédiaires.
3. Effectuer des essais fonctionnels comme souhaité afin de confirmer que les protéines de fusion conservent une activité biologique. Dans le cas présenté ici, la localisation subcellulaire des protéines de fusion YFP a été déterminée par microscopie à fluorescence.
4. Faire des plasmides d'expression pour les protéines de contrôle Luc et YFP appropriées par l'ingénierie des signaux de ciblage appropriées dans les vecteurs d'expression et Pluc pYFP. Dans le cas présenté ici, générer des constructions Luc et YFP nucléaires ciblées par l'insertion d'un signal de localisation nucléaire dans les vecteurs pLuc et pYFP.
5. Faireune construction de contrôle positif dans lequel Luc et YFP sont fusionnés en un seul polypeptide. Dans le cas présenté ici, de générer un témoin positif dans lequel la séquence codante de la YFP est inséré dans le vecteur pLuc.
6. Sélectionner un plasmide de remplissage neutre à utiliser pour égaliser la masse d'ADN dans les mélanges de transfection. Utilisation d'un plasmide qui n'a pas de promoteur eucaryote et sera donc transcriptionnellement inactif dans les cellules de mammifères, par exemple un vecteur de clonage bactérien.

2. Préparation de l'ADN Mixes

1. Estimer la concentration de tous les plasmides décrits dans la section 1 sur la base de l'absorbance à 260 nm (1 unité d'absorbance est équivalente à 50 pg / ml d'ADN). Déterminer la masse moléculaire de chaque plasmide en multipliant le nombre de paires de bases par 650 Da. Utilisation de la concentration et de la masse moléculaire pour calculer la concentration molaire de chaque préparation de plasmide. Diluer les préparations d'ADN de plasmide à une concentration de 36 nM. Ce seront les stocks de roulementqui seront utilisés pour préparer les mélanges d'ADN pour la transfection.
2. Préparer un mélange d'ADN de contrôle contenant 1800 ng de plasmide de remplissage dans un volume final de 20 ul d'eau.
3. Préparer un mélange d'ADN témoin contenant 5 ul du produit d'assemblage pLuc-contrôle. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
4. Préparer un mélange d'ADN de contrôle contenant 5 pi de pLuc contrôle construction et 5 pi de pYFP contrôle construction. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
5. Préparer un mélange d'ADN témoin contenant 5 ul de construction témoin positif. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
6. Préparez le mélange ADN suivante pour tester homodimérisation d'une protéine d'intérêt, X. Pour chaque mélange d'ADN combiner 5 pi de la pLuc pertinent construire et 5 pi de la pYFP construire. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
   A) pLuc-contrôle et pYFP-X
   B) pLuc-X et pYFP-contrôle
   C) pLuc-X et pYFP-X
7. Préparer le mélange d'ADN suivant pour tester une interaction entre une paire de protéines d'intérêt, X et Y. Pour chaque mélange d'ADN combinent 5 ul de la pLuc pertinent construire et 5 ul de la pYFP construisent. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l'ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l'eau pour amener le volume final à 20 pi.
   A) pLuc-contrôle et pYFP-X
   B) pLuc-X et pYFP-contrôle
   C) pLuc-contrôle et pYFP-Y
   D) pLuc-Y et pYFP-contrôle
   E) pLuc-X et Y-pYFP
   F) pLuc-Y et X-pYFP

3. Transfection

1. Récolte subconfluentes cellules HEK293 à partir d'un flacon de 75 cm ^2. Diluer à 10% des cellules totales dans 13 ml de milieu de culture. Distribuer 130 l de suspension cellulaire dans chaque puits d'une blancheclair à fond plaque de 96 puits de culture de tissu. Culture des cellules pendant 24 heures.
2. Calculer le nombre de puits à transfecter en multipliant le nombre de mélanges d'ADN en 3. Porter le milieu de culture exempt de sérum à température ambiante. Préparer un mélange maître contenant 6,3 ul de milieu sans sérum et 0,18 ul réactif de transfection par puits. Mélanger au vortex et incuber à température ambiante pendant 5 min.
3. Préparez des mélanges de transfection en ajoutant 2 ul d'ADN mélange à 20 pi de milieu / réactif de transfection master mix sans sérum. Ne pas vortex. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
4. Transfecter trois puits avec chaque mélange de transfection de distribution de 6,5 pi de mélange de transfection par puits. Culture des cellules pour un autre 36-48 h.

4. Mesure de BRET Signal

1. Dissoudre le substrat de la luciférase des cellules vivantes à 34 mg / ml dans le DMSO par vortex.
2. Diluer substrat de la luciférase des cellules vivantes reconstitué à 1:1000 dans le substrat dilution moyen pre-chauffé à 37 ° C. Laisser 50 ul de milieu de dilution du substrat par puits. Vortex à mélanger. Un précipité peut se former, mais ne va pas interférer avec le dosage.
3. Aspirer le milieu de culture à partir de la plaque à 96 puits. Distribuer 50 ul de substrat de la luciférase des cellules vivantes dilué dans chaque puits. Culture de cellules pendant au moins 2 h (jusqu'à 24 h).
4. Enlever le couvercle de la plaque à 96 puits et incuber la plaque pendant 10 min à température ambiante à l'intérieur du luminomètre.
5. Mesurer les émissions de Luc et YFP un bien à la fois. Mesurer les émissions de Luc en utilisant un filtre de blocage des longueurs d'onde de 470 nm. Mesurer l'émission à partir de la YFP en utilisant un filtre passe-bande de 500 à 600 nm. Intégrer des signaux d'émission de plus de 10 sec.

5. Analyse des données

1. La moyenne des lectures d'émission Luc des 3 puits n'ayant reçu que le plasmide de remplissage. Soustraire cette valeur de toutes les autres lectures d'émission Luc à produire des valeurs d'émission Luc fond soustrait.
2. La moyenne des lectures d'émission YFP des 3 puits n'ayant reçu que le plasmide de remplissage. Soustraire cette valeur de toutes les autres lectures d'émission YFP pour produire des valeurs d'émission YFP fond soustrait.
3. Pour chaque puits, il faut diviser la valeur d'émission YFP fond soustrait de la valeur d'émission Luc fond soustrait pour donner le rapport de BRET non corrigée.
4. La moyenne des ratios de BRET non corrigées des trois puits qui ont été transfectées avec seulement le plasmide pLuc-contrôle. Soustraire cette valeur à partir de tous les autres rapports de BRET non corrigées pour donner les rapports de BRET corrigé.
5. Pour chacun des ensembles restants de rapports de BRET corrigé, la moyenne des valeurs des trois puits transfectés pour obtenir un rapport final BRET.

Representative Results

Le principe de l'essai de BRET est illustré sur la figure 2. L'installation de dosage utilisée dans les expériences présentées ici est représenté sur la figure 3. La détection d'un signal de BRET solide à partir de cellules transfectées avec une protéine de fusion luciférase-YFP a confirmé que le transfert d'énergie était observable dans ce dispositif expérimental (figure 4).

Notre recherche se concentre sur le rôle de la famille FOXP de répresseurs de la transcription dans le développement du cerveau. Mutations hétérozygotes FOXP2 conduit à une forme rare de la parole et des troubles du langage, dont la caractéristique la plus importante est le développement verbal dyspraxie-difficulté de produire des séquences complexes de mouvements musculaires orofocial nécessaires pour la parole ^14-16. Mutations FOXP1 ont été rapportés chez des patients des troubles du spectre de l'autisme et la déficience intellectuelle accompagnés par la parole grave et des problèmes linguistiques ^17-20. L'interaction de FOXPs avec d'autres protéines est à l'étude pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires relatives au rôle de ces protéines dans le développement du cerveau.

FOXP2 est connu pour former des homo-ou hétérodimères avec d'autres membres de la famille FOXP ^21, donc FOXP2 homodimérisation a été utilisé pour valider l'essai de BRET (Figure 4). Pour exclure la possibilité que l'interaction des protéines FOXP2 de fusion dans cet essai était due simplement à surexpression de la protéine, la spécificité de l'interaction a été démontrée par l'introduction d'une mutation dans le domaine de FOXP2 de dimérisation de fermeture Eclair leucine (deletion en phase de résidu E400), qui qui est connu pour perturber les homo-et hétérodimérisation ²¹ (figure 5A). Lorsque des protéines de fusion Luc et YFP-FOXP2.DE400-Foxp2 étaient co-exprimés, une réduction du signal de BRET a été observée par rapport à quand Luc et YFP-FOXP2-FOXP2 ont été co-exprimés (figure 5B). Cette signal réduction n'était pas due à une altération de la localisation subcellulaire de la protéine mutante (figure 5C) ou d'une différence dans les niveaux d'expression évaluée par transfert de Western (données non présentées). La réduction du signal a également été observée lors de Luc-FOXP2 a été exprimé avec la YFP-FOXP2.DE400 (données non présentées). Ainsi BRET est efficace pour la détection de protéine homodimérisation, et l'interaction des protéines demeure spécifique lorsque ces protéines sont surexprimées que la luciférase et la YFP-fondues. En outre, l'utilisation de BRET en combinaison avec une mutation ciblée de protéines est susceptible d'identifier les résidus particuliers impliqués dans les interactions protéine-protéine.

Pour évaluer l'efficacité de l'essai BRET dans la détection des interactions hétérotypiques, l'interaction avec des FOXP2 FOXP1 a été testée (figure 6). Un signal de BRET a été observée dans les deux configurations possibles de l'essai (c'est à dire avec FOXP2 comme donneur ou comme accepteur de fusion protéine). Par conséquent, l'essai de BRET est en mesure de détecter à la fois des homo-et des interactions hétérotypiques. En outre, l'aptitude de l'essai BRET pour détecter l'interaction avec des protéines de FOXP2 non FOXP a été testée en examinant l'interaction avec CtBP1, un co-répresseur de la transcription et connue partenaire d'interaction FOXP2 ^21. L'interaction entre CtBP1 et FOXP2 a été suggéré par un écran à deux hybrides de levure et a ensuite été validé par des expériences de co-immunoprécipitation ^21. L'interaction FOXP2-CtBP1 a été détecté par le test BRET lorsque FOXP2 était la protéine de fusion donneur et l'accepteur CtBP1 était, mais pas dans la configuration inverse (Figure 7A). Ces résultats sont à prévoir avec le système BRET (voir la section Discussion). L'interaction entre FOXP2 et CtBP1 a été observée, même si seulement une petite proportion de CtBP1 a été localisé dans le noyau (figure 7B), mettant en évidence la sensibilité de ce test. Ainsi, le BRETdosage est utile pour la validation des interactions putatifs identifiés par criblage levure double hybride.

Enfin, l'essai BRET a été utilisé pour examiner les effets des mutations pathogènes dans FOXP2 sur les interactions protéine-protéine. Deux mutations ponctuelles dans FOXP2 ont été signalés à causer une maladie autosomique dominante rare affectant parole et du langage (figure 8A). La mutation faux-sens R553H a été découvert grâce à une étude de liaison dans une grande famille dans laquelle la moitié des membres ont été affectés par la maladie ^14. La mutation non-sens R328X a été découvert par séquençage ciblé du locus de FOXP2 dans probants avec un diagnostic de dyspraxie verbale de développement ^22. L'aptitude des protéines mutantes de se dimériser avec le type sauvage FOXP2 a été évaluée en utilisant l'essai de BRET. Les résultats à l'aide de type sauvage FOXP2 en tant que donateur et FOXP2 mutant comme accepteur sont présentés dans la figure 8B. Les mêmes résultats ont été observés en utilisant mFOXP2 utant en tant que donneur et de type sauvage en tant que l'accepteur (données non présentées). La mutation R553H, qui se situe dans le domaine de liaison à l'ADN de FOXP2, n'a pas affecté l'aptitude de la protéine mutante à se dimériser avec le type sauvage. Le mécanisme pathogène de cette mutation peut donc inclure un effet dominant négatif résultant de la dimérisation de la protéine mutante avec la normale ^23. La mutation R328X introduit un codon d'arrêt prématuré, de sorte que la protéine codée est dépourvue du domaine de dimérisation de fermeture Eclair leucine et le domaine de liaison à l'ADN, et montre une certaine mauvaise localisation cytoplasmique (Figure 8C). En accord avec l'absence du domaine de dimérisation et de mauvaise localisation vers le cytoplasme, la protéine tronquée montre fortement réduite interaction avec le type sauvage FOXP2. Cette mutation est donc susceptible d'être pathogène en raison de l'haplo-insuffisance. Ainsi, le dosage BRET peut donner un aperçu sur les effets biologiques des mutations découvertes chez les patients.

Figure 1. Vecteurs pour l'expression de protéines et YFP-luciférase-fusion. A) des cartes du Cercle des vecteurs pYFP et pLuc. Le vecteur pLuc est utilisé pour l'expression de protéines de fusion luciférase en tant que donneurs de BRET. Le vecteur pYFP est utilisé pour l'expression de protéines de fusion YFP BRET comme accepteurs. Les vecteurs ont un promoteur de CMV (P _CMV) pour l'expression de haut niveau dans des cellules de mammifères, un site de clonage multiple (MCS) pour l'insertion d'ADNc pour les protéines d'intérêt et un gène de résistance à la kanamycine (Kan ^r) et l'origine de replication bactérienne pour la propagation de le plasmide dans les bactéries. B) site de clonage multiple des vecteurs Pluc et pYFP. La fin de la séquence codante de la YFP est représentée en bleu. Sites de restriction sélectionnés sont annotées. A noter que le site Xba I est bloqué par overlapping barrage méthylation dans des souches de référence de E. coli. Les ADNc codant pour des protéines présentant un intérêt doivent être clones dans le cadre avec la séquence d'acides aminés représentée. Dans les expériences décrites ici, les inserts ont été clones dans les sites de restriction Bam HI et Xba I (soulignés). Des codons d'arrêt ont été retirés de la fin de la luciférase et la YFP séquences codant pour fournir un cadre de lecture ouvert qui englobe la luciférase / YFP et sous-cloné l'ADNc d'intérêt. Des codons d'arrêt sont présents à la fin du site de clonage multiple dans les trois cadres de lecture (en rouge), par conséquent, il n'est pas indispensable d'inclure un codon d'arrêt dans l'ADNc inséré.

Figure 2. Principe du système BRET. Protéines d'intérêt, X et Y, sont fusionnées à un donneur d'enzyme luciférase (Luc, pic d'émission 475 nm) et d'une protéine accepteur fluorescente (YFP, le pic d'émission de 530 nm), respectivement. Les protéines de fusion sont exprimées dans des cellules de mammifère en culture et après l'addition d'un substrat de la luciférase de cellules perméables, l'émission de Luc est mesurée en utilisant un filtre bloquant les longueurs d'onde plus longue que 470 nm et une émission à partir de la YFP est mesurée en utilisant un filtre passe-bande de 500 à 600 nm. A) n interaction entre la protéine X et le transfert de la protéine Y. de l'énergie à partir de la Luc à YFP ne se produit pas. B) L'interaction entre la protéine X et la protéine de transfert d'énergie Y. La résonance se produit à partir de Luc avec une YFP qui provoque une augmentation du ratio de l'émission mesurée à l'aide le filtre passe-bande de 500 à 600 nm par rapport au filtre bloquant les longueurs d'onde plus longue que 470 nm.

Figure 3. Configuration de test. L'installation d'essai pour testerune interaction entre deux protéines d'intérêt, X et Y. Les protéines d'intérêt sont fusionné à la luciférase (Luc) à titre de donneur BRET et la protéine fluorescente jaune (YFP) comme accepteur de BRET. Dans les protéines de contrôle, Luc et YFP sont fusionnés à un peptide contenant un signal de ciblage pour le compartiment sous-cellulaire approprié (P), le cas échéant. A) Contrôle à être inclus dans chaque plaque. 1) contrôle Mock-transfection d'établir des niveaux de luminescence et de fluorescence résultant du bruit de luminomètre et l'éclatement de l'enzyme-substrat indépendant de fond; 2)-pLuc contrôle seulement transfection d'établir la proportion de l'émission de la luciférase qui est détectée à l'intérieur de la plage d'émission de la YFP en l'absence d'un accepteur de BRET; 3) La transfection de pLuc-contrôle et pYFP-contrôle pour établir le signal de référence de BRET résultant de l'interaction Luc-YFP; 4) La transfection de Luc-YFP fusion comme un contrôle positif à veiller à ce que un signal de BRET peut être mesurée. B) Ensemble de expérimconditions ent pour tester une interaction entre deux protéines d'intérêt, X et Y. 1, 2, 4, 5) des contrôles d'interaction non spécifique entre les protéines d'intérêt et Luc / YFP; 3) Conditions de test avec X comme donneur et Y comme accepteur; 6) Conditions de test avec Y comme donneur et X comme accepteur.

Figure 4. Détection de FOXP2 homodimérisation. A) Afin de valider l'essai de BRET pour la détection d'homodimères d'Foxp2, des cellules HEK293 ont été transfectées avec des constructions d'expression de la luciférase (donneur) ou YFP (accepteur) fusionné à une ou l'autre FOXP2 (P2) ou un signal de localisation nucléaire (-). La luciférase dirigé vers le noyau et les protéines YFP servent de témoins négatifs. Comme témoin positif pour la détection d'un signal de BRET, les cellules ont également été transfectées avec un produit d'assemblage pour l'expression de la luciférase a-YFLes images P protéine de fusion (+) B) de microscopie de fluorescence de cellules transfectées avec la YFP fusionnée à un signal de localisation nucléaire (-.) Ou avec la YFP fusionnée à FOXP2 (P2).

Figure 5. Utiliser de dimérisation déficient FOXP2 à démontrer la spécificité du test. A) Représentation schématique de la protéine FOXP2 montrant la position de la mutation DE400, ce qui perturbe la dimérisation. Le domaine de dimérisation de fermeture Eclair leucine est représenté en vert et le domaine de liaison à l'ADN en jaune. B) Pour tester si la surexpression de protéines peut conduire à des résultats faux-positifs dans l'essai de BRET, la spécificité de l'essai a été évaluée à l'aide du FOXP2.DE400 variante. Les cellules ont été transfectées avec des constructions d'expression de la luciférase (donneur) ou YFP (accepteur) fusionné à FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) ou un nucleaimages C) de microscopie de fluorescence de cellules transfectées avec la YFP fusionnés à FOXP2 (P2) ou de FOXP2.DE400 (DE) - r du signal de localisation ()..

Figure 6. Détection de FOXP1-FOXP2 hétérodimérisation. A) Afin de valider l'essai de BRET pour la détection d'hétérodimérisation entre les protéines homologues Foxp2 et FOXP1, les cellules ont été transfectées avec des constructions d'expression de la luciférase (donneur) ou YFP (accepteur) fusionné à une ou l'autre FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) ou les images B) de microscopie de fluorescence de cellules transfectées avec la YFP fusionnés à FOXP1 (P1) ou à FOXP2 (P2) - d'un signal de localisation nucléaire ()..

B) des images de microscopie de fluorescence de cellules transfectées avec la YFP fusionnée à CtBP1 (CtBP) ou de FOXP2 (P2).

Figure 8. Évaluation des effets des mutations de FOXP2 pathogènes sur les interactions protéine-protéine. A) Schéma de la protéine FOXP2 montrant les positions des mutations R553H et R328X qui provoquent une fo rarerm de la parole et des troubles du langage. Le domaine de dimérisation de glissière à leucine est représenté en vert et le domaine de liaison à l'ADN en jaune. B) Pour évaluer l'utilité de l'essai de BRET pour évaluer l'impact des mutations pathologiques sur les interactions protéine-protéine, les effets des mutations R553H et R328X sur la capacité des protéines mutantes FOXP2 à dimériser avec FOXP2 normale ont été examinés. Les cellules ont été transfectées avec des constructions d'expression de la luciférase (donneur) ou YFP (accepteur) soit fusionnée à FOXP2 normal (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), ou un signal de localisation nucléaire (-). C ) des images de microscopie de fluorescence de cellules transfectées avec la YFP fusionnée à FOXP2.R553H (R553H) ou à FOXP2.R328X (R328X). Dans cette image FOXP2.R328X est principalement nucléaire, mais dans d'autres cellules au sein de la population présente une distribution plus cytoplasmique.

Discussion

La conception des produits d'assemblage d'expression de protéines de fusion est une étape critique dans la mise en place de l'essai de BRET. Dans les expériences présentées ici, les protéines d'intérêt ont été fusionnées à l'extrémité C-terminale de la luciférase ou de la YFP. Il est également possible, et peut être nécessaire, pour faire fondre les protéines à l'extrémité N-terminale de la luciférase / YFP. Pour certaines protéines, les fusions ne peuvent être acceptées à l'extrémité N-ou C-terminale afin d'éviter toute perturbation de la structure et la fonction des protéines. En outre, pour des protéines transmembranaires dans laquelle l'extrémité N et C terminales se trouvent dans différents compartiments sous-cellulaires, la luciférase / protéine YFP doit être fusionnée à l'extrémité qui se trouve dans le même compartiment que le partenaire d'interaction. Par exemple, dans les études sur les interactions entre transmembranaires G récepteurs couplés aux protéines cytoplasmiques et β-arrestine, la luciférase a été fusionné à l'extrémité carboxyle queue intracellulaire du récepteur transmembranaire ^8. Dans d'autres cas, la géométrie d'une protéine-protéine interactisur peut conduire à un transfert d'énergie étant plus efficace avec l'une des deux combinaisons possibles de protéines de fusion. Parfois transfert d'énergie ne peut pas être détecté du tout si vous utilisez une seule combinaison, conduisant à des résultats faussement négatifs.

La séquence du linker peptidique entre la luciférase / YFP et la protéine d'intérêt peut également affecter l'efficacité du transfert d'énergie de résonance. Le segment de liaison doit être suffisamment longue pour permettre la luciférase / YFP et la protéine d'intérêt à se plient sans entrave. Un segment de liaison plus longue peut conférer une plus grande souplesse pour le polypeptide à la jonction entre la luciférase / YFP et la protéine d'intérêt, ce qui peut augmenter l'efficacité de BRET en facilitant l'alignement des dipôles de donneur et d'accepteur. Cependant, l'efficacité BRET peut diminuer si il ya trop de souplesse dans l'éditeur de liens. Dans les expériences ici, le clonage des protéines d'intérêt dans les sites BamH I et Xba I du vec d'expressionteurs ont donné lieu à un segment de liaison de l'acide 23-amino, comme le montre la Figure 1. Cette liaison a été couronnée de succès pour détecter les interactions entre plusieurs paires de protéines.

Avant de procéder à Bret expériences, il convient de s'assurer que les protéines de fusion conservent une activité biologique normale. Le fonctionnement de la YFP peut être évaluée par visualisation directe en utilisant un microscope à fluorescence. Le fonctionnement de la luciférase peut être dosée en utilisant des kits disponibles dans le commerce. L'effet de la fusion sur la localisation subcellulaire des protéines d'intérêt peut être évaluée par coloration immunologique, ou dans le cas de fusions-YFP, par visualisation directe. L'effet de la fusion sur la fonction de la protéine d'intérêt peut être étudiée par des tests spécifiques d'une protéine - par exemple, pour un facteur de transcription, il peut être approprié pour doser l'activité de liaison à l'ADN. Notez que les mesures de luminescence faites au cours de l'expérience pratique fournissent confirmer en testtion de l'activité de la luciférase.

Il est important de considérer ce que les structures de contrôle appropriées sont pour votre protéine d'intérêt. YFP et la luciférase sont principalement cytoplasmique et sont donc des contrôles appropriés lorsque les protéines d'intérêt sont cytoplasmique. Cependant, lorsque les protéines d'intérêt sont localisés dans d'autres compartiments subcellulaires, il peut être souhaitable de modifier la luciférase et la YFP à des signaux peptidiques pour diriger leur trafic dans le compartiment concerné. Ici, les protéines d'intérêt sont des facteurs de transcription qui sont localisés dans le noyau, par conséquent, la luciférase et la YFP ont été modifiées par l'ajout d'un signal de localisation nucléaire. Plus précisément, un peptide comprenant le signal de localisation nucléaire de l'antigène grand T de SV40 (CGYGPKKKRKVGGLDN) a été ajoutée à l'extrémité C-terminale de la luciférase et la YFP par ligature des oligonucleotides synthétiques double brin entre le site Bam HI et Xba I de the pLuc et pYFP vecteurs. L'addition de ce signal provoqué une redistribution considérable de protéines vers le noyau (Figure 4B).

Y compris les contrôles appropriés est crucial pour l'interprétation des expériences de BRET. Un contrôle maquette transfection en utilisant une charge inerte plasmide est essentiel d'établir des niveaux de luminescence et de fluorescence résultant du bruit de luminomètre et la répartition de l'enzyme-substrat indépendant de fond. Avec luminomètres modernes et des substrats de luciférase niveaux de luminescence de fond sont généralement très bas. La transfection avec l'luciférase de commande approprié construire en l'absence d'un produit d'assemblage YFP est important d'établir la proportion de l'émission de la luciférase qui est détectée à l'intérieur de la plage d'émission de la YFP en l'absence d'un accepteur de BRET. Transfection avec la luciférase et de contrôle commande YFP construit fournit le signal de référence de BRET résultant de l'interaction Luc-YFP. Pour veillery paire de protéines qui sont testées pour l'interaction, il est important pour transfecter chacun une seule avec le produit d'assemblage de commande approprié, comme illustré sur la figure 3B, pour contrôler pour toute interaction non spécifique entre les protéines à l'essai de la luciférase et / YFP. En particulier, lorsque l'exécution d'une expérience de BRET pour la première fois, il est important d'inclure une protéine de fusion Luc-YFP comme témoin positif pour veiller à ce qu'un signal de BRET est observable dans la configuration expérimentale. Ici, la séquence codante de la YFP a été clone dans les sites pLuc Bam HI et Xba I pour produire une protéine de fusion dans laquelle la YFP est fusionnée à l'extrémité C-terminale de la luciférase.

Dans le protocole décrit ici, la composition du mélange d'ADN pour la transfection a été calculée avec l'hypothèse selon laquelle la taille moyenne de la protéine de fusion expression Luc / YFP construit n'est pas supérieure à 7,5 kb. Si la construction d'expressionts sont significativement plus grands que cela, alors le nombre de moles de chaque construction ajouté au mélange de transfection d'expression peut encore être réduite de sorte que la quantité totale d'ADN dans le mélange ne dépasse pas le maximum autorisé par la quantité de réactif de transfection. En variante, la quantité de réactif de transfection et de la quantité d'ADN dans tous les mélanges de transfection peut être augmentée en suivant les directives du fabricant. La manipulation expérimentale de plaques à 96 puits est accéléré par l'utilisation de pipettes multicanaux et aspirateurs. Il est souhaitable de minimiser la variation entre les échantillons dans le temps transfection mélange d'incubation après addition de l'ADN dans le milieu / réactif de transfection mélange exempt de sérum, par conséquent, commencer l'ajout de transfection se mélange aux cellules dès que la première composition a été en incubation pendant 10 min . Parce que les protéines de fusion accepteur de BRET sont YFP, il est possible d'évaluer l'efficacité de transfection par microscopie à fluorescence ou par mesure de la fluorescence dans un re de microplaquesader. Le succès d'une expérience BRET dépend d'un bon niveau de transfection il est donc conseillé de veiller à ce que la transfection est satisfaisant avant de procéder à l'addition de substrat et la mesure du signal BRET. La balise YFP permet aussi la quantification des niveaux d'expression de la protéine acceptrice en utilisant un lecteur de microplaque. Quantification des niveaux de protéine accepteur peut être utile pour l'optimisation et le dépannage des expériences de BRET.

Les cellules doivent être mises en incubation pendant au moins 2 heures avec de la luciférase substrat avant de mesurer le signal de BRET pour veiller à ce qu'un signal stable a été atteint. Il est également possible d'incuber les cellules avec un substrat pour un maximum de 24 heures. Dans ce cas, les chiffres totaux de luminescence seront plus faibles, mais les ratios de BRET devrait être inchangé. Incubations plus longues avec substrat peut être plus commode (par exemple, la nuit) et également permettre la mesure de signaux BRET avant et après une manipulation expérimentale commeque l'addition d'un composé pharmaceutique. Idéalement, optimiser la densité de semis de cellule de sorte que les cellules atteignent la confluence au moment de la mesure. Si la densité de cellules est au-dessus optimale alors il peut être avantageux de mesurer le signal BRET à un point de temps plus tôt pour éviter la prolifération cellulaire. Si vous utilisez un type de cellule autre que HEK293, veillez à optimiser culture cellulaire et transfection conditions. Expériences de BRET ont également été effectués avec succès dans des cellules HeLa en utilisant le protocole décrit ici.

Dans les expériences décrites ici, les chiffres de luminescence ont été mesurées à la température ambiante, ce qui est la température optimale pour l'activité de la luciférase de Renilla. Si vous effectuez une expérience du temps bien sûr dans le luminomètre il est préférable de régler la température à 37 ° C. Nous avons réalisé les mêmes expériences à température ambiante et à 37 ° C et pas de différence significative dans les résultats n'a été observée. Si la réalisation d'expériences à la température ambiante, ee plaque devrait être autorisé à s'équilibrer 10 min à l'intérieur du luminomètre avant la mesure pour permettre la stabilisation de l'activité de la luciférase de Renilla. Ici, les signaux de luminescence ont été intégrés en 10 s, ce qui donne généralement une sensibilité élevée, en particulier pour des protéines avec des faibles niveaux d'expression. Cependant, les signaux peuvent être intégrés sur des périodes de temps plus courtes si cela fournit une sensibilité suffisante. En raison de la stabilité du signal de luminescence produit par le substrat de la luciférase des cellules vivantes, il est acceptable de mesurer pour un maximum de 10 secondes par puits à chaque longueur d'onde.

Une interaction entre deux protéines d'intérêt est confirmé par l'essai de BRET, lorsque le signal à partir de la condition de test est supérieure de façon significative des signaux provenant des conditions de contrôle concernés. L'absence d'un signal de BRET n'est pas nécessairement une confirmation du fait que l'interaction ne se produit pas. Dans le cas d'un résultat inattendu ou négatif, de la luminescence et de fluorescence totalence chiffres doivent être examinés afin de s'assurer que tous les puits ont été transfectées correctement.

Le signal de BRET est également affectée par le rapport entre les niveaux d'expression de protéine par conséquent, il est utile d'examiner les niveaux d'expression relatifs des deux protéines d'intérêt en comparant les comptages de fluorescence dans les puits transfectés avec des fusions YFP des deux protéines (ou les chiffres de luminescence à partir de puits transfectées avec les fusions de luciférase). Quand une protéine de fusion exprime plus fortement que l'autre, de meilleurs résultats sont susceptibles d'être obtenus si la protéine avec le niveau d'expression plus faible est fusionné à la luciférase, ce qui était le cas avec FOXP2 et CtBP1 dans les expériences présentées ici. Il est également possible de manipuler les taux de protéine en ajustant le rapport molaire des plasmides d'expression dans le mélange de transfection. Le transfert d'énergie entre certaines paires de protéines de fusion peut être très inefficace en raison de la géométrie du complexe protéique. Dans cecas, il peut être intéressant d'essayer la fusion des protéines d'intérêt de la gare Termini de remplacement de la luciférase / YFP.

Il est nécessaire de confirmer que le signal de BRET représente une interaction protéine-protéine physiologique et n'est pas simplement due à la surexpression de la protéine. Pour cette raison, il est important d'éviter la sur-expression de protéines brutes. La spécificité d'une interaction protéine-protéine dans le système BRET peut en outre être confirmée en introduisant des mutations dans les protéines qui sont connus pour réduire l'affinité de l'interaction, comme démontré ici en utilisant la variante de FOXP2 DE400. Les protéines mutantes peuvent en outre être utilisés en compétition et essais BRET liaison saturation. Dans un dosage par compétition, la concentration de donneur et accepteur des protéines de fusion sont maintenues constantes tout en augmentant la concentration d'une version non marqué de l'un des partenaires d'interaction en tant que concurrent. Untagged protéine de type sauvage doit rivaliser avec la v marquéersion pour la liaison à son partenaire d'interaction, résultant en une diminution du signal de BRET, tandis que la protéine mutante doit présenter une capacité réduite à concurrence rupture de l'interaction. Dans un essai de liaison de saturation, la concentration de la protéine de fusion donneur est maintenue constante, tout en augmentant la concentration de l'accepteur. Pour une interaction spécifique du signal BRET devrait finalement se stabiliser comme toutes les molécules de donateurs devenir saturé avec l'accepteur. Pour une interaction non spécifique, le signal BRET est généralement une légère hausse linéaire due à une augmentation des collisions aléatoires entre les molécules de donneur et accepteur. Dans la pratique, pour les interactions d'affinité modérée entre les protéines solubles, il peut être difficile d'obtenir une assez grande accepteur: rapport des bailleurs de fonds à respecter la saturation tout en maintenant des niveaux suffisants de la protéine donatrice pour la détection du signal.

Il faut être prudent dans l'interprétation de differences entre les ratios de BRET. L'essai BRET ne fournit pas une mesure quantitative de l'affinité d'une interaction protéine-protéine en raison de l'efficacité du transfert d'énergie est influencée par des facteurs autres que la force de l'interaction protéine-protéine. Ces facteurs comprennent le rapport entre les niveaux des protéines de fusion dans la cellule, la géométrie de l'interaction, et les taux d'association et de dissociation du complexe. Les rapports obtenus avec deux paires différentes de protéines par conséquent ne peuvent pas nécessairement être comparées, mais les comparaisons sont possibles entre les différentes variantes de la même protéine, tels que le type sauvage et des variants de ΔE400 FOXP2 indiqués ici. De temps en temps, les ratios de BRET légèrement négatives peuvent être observées. Ratios négatives peuvent résulter de l'erreur dans la mesure du rapport de base dans les cellules transfectées avec le vecteur seul pLuc-contrôle. Des ratios très élevés sont souvent révélateurs de l'agrégation des protéines, ce qui peut être confirmé par l'observation des CE transfectéeslls avec un microscope à fluorescence. Il convient de déterminer si l'agrégation est biologiquement pertinente ou un artefact de surexpression de la protéine.

En conclusion, l'essai BRET décrit ici est une approche puissante pour étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. L'application de BRET a été démontré aux fins de validation de molécules candidates d'interaction à partir d'études de dépistage de la protéomique, l'identification des résidus spécifiques impliqués dans les interactions protéine-protéine, et évaluer les effets des mutations trouvées dans l'ADN du patient. Étant donné que les interactions sont détectées en temps réel, sans qu'il soit nécessaire pour la lyse de la cellule, le signal de BRET peut être mesurée avant et après un traitement tel que l'addition d'un composé pharmaceutique ou un ligand ^7. L'essai BRET est très prometteur pour une utilisation dans la recherche en génomique fonctionnelle pour évaluer la pertinence biologique des variants génétiques découvertes par le séquençage de prochaine génération.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.