Summary
प्रोटीन के बीच बातचीत सभी सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए मौलिक हैं. Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का उपयोग करना, प्रोटीन की एक जोड़ी के बीच बातचीत जीवित कोशिकाओं में और वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकती है. इसके अलावा, संभावित रोगजनक परिवर्तन के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है.
Abstract
Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) पर आधारित assays जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की निगरानी के लिए एक संवेदनशील और विश्वसनीय साधन प्रदान करते हैं. ब्रेट एक 'स्वीकर्ता' फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक 'दाता' luciferase एंजाइम से ऊर्जा के गैर विकरणशील हस्तांतरण है. इस परख का सबसे सामान्य विन्यास में, दाता Renilla reniformis luciferase है और स्वीकर्ता पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) है. ऊर्जा स्थानांतरण की क्षमता दृढ़ता से दूरी पर निर्भर है क्योंकि ब्रेट घटना का अवलोकन दाता और स्वीकर्ता पास में होने की आवश्यकता है. सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद के लिए परीक्षण करने के लिए, एक प्रोटीन luciferase और YFP के साथ एक संलयन के रूप में दूसरे के साथ एक संलयन के रूप में व्यक्त किया जाता है. ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद दाता और ऊर्जा स्थानांतरण होने के लिए पर्याप्त करीब स्वीकर्ता ला सकते हैं. में प्रोटीन, प्रोटीन की जांच के लिए अन्य तकनीकों की तुलनाteractions ब्रेट परख संवेदनशील है, छोटे हाथों पर समय और कुछ अभिकर्मकों की आवश्यकता है, और कमजोर क्षणिक, या एक जीवित कोशिका के भीतर पाया जैव रासायनिक वातावरण पर निर्भर हैं जो बातचीत का पता लगाने में सक्षम है. इसलिए यह खमीर दो संकर या मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स पढ़ाई ने सुझाव दिया ख्यात बातचीत की पुष्टि के लिए एक आदर्श तरीका है, और इसके अलावा यह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर बाद translational संशोधनों के प्रभाव का आकलन करने, मानचित्रण बातचीत क्षेत्रों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और रोगी डीएनए में पहचान परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन.
Introduction
अनुक्रमण मानव विकारों का विश्लेषण करती है शास्त्रीय लिंकेज और अगली पीढ़ी के दोनों जैविक रास्ते की एक श्रेणी में शामिल प्रोटीन के नैदानिक प्रासंगिकता खुलासा कर रहे हैं. यह पहले इस तरह के अध्ययन में उनकी पहचान करने के लिए, इन प्रोटीनों की जैविक भूमिका का कम या कोई जांच हुई है, कि अक्सर मामला है. ब्याज की एक प्रोटीन की जैविक समारोह की खोज शुरू करने के लिए एक उपयोगी एवेन्यू इसे अपनी शारीरिक संदर्भ में आदान प्रदान के साथ अन्य जो प्रोटीन की पहचान करने के लिए है. इस फैशन में आणविक नेटवर्क निस्र्पक मानव phenotype अंतर्निहित जैविक रास्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.
सबसे अक्सर इस्तेमाल बड़े पैमाने पर प्रदर्शन ब्याज की प्रोटीन के लिए उम्मीदवार बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण खमीर दो संकर स्क्रीनिंग 1 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स 2 हैं. इन तरीकों में संभावित बातचीत प्रोटीन सुझाव में बहुत सफल हो सकता है, लेकिन गिरफ्तारी कर सकते हैंझूठी सकारात्मक परिणाम की चपेट में ई. इसलिए, खमीर दो संकर या मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्क्रीनिंग द्वारा की पहचान एक बातचीत की पुष्टि एक दूसरी तकनीक का उपयोग कर बातचीत के सत्यापन की आवश्यकता है. आमतौर पर एक सह immunoprecipitation या पुल से नीचे परख इस उद्देश्य के 3 के लिए इस्तेमाल किया जाता है. सत्यापन के लिए इस तरह की तकनीक का उपयोग करने का एक नुकसान यह निश्चित प्रोटीन बातचीत को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो सकता है कि intracellular शर्तों को नष्ट कर देता है, जो सेल, के लिए आवश्यकता है. एक दूसरा नुकसान यह है कि कमजोर या क्षणिक प्रोटीन बातचीत धोने चरणों के दौरान बाधित हो सकता है. इसके अलावा, इन assays, महत्वपूर्ण हाथों पर समय की मांग एक साथ कार्रवाई की जा सकती है कि नमूनों की संख्या में सीमित कर रहे हैं, और अक्सर अभिकर्मकों और प्रोटोकॉल का समय लेने वाली अनुकूलन की आवश्यकता है.
सह immunoprecipitation प्रयोगों से जुड़ी समस्याओं में से कुछ पर काबू पाने, कई assays फ्लोरोसेंट और biolum के आधार पर विकसित किया गया हैजीवित कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है कि inescent प्रोटीन. पहले इस तरह के assays प्रतिदीप्ति (या फोरस्टर) प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट), अतिव्यापी उत्सर्जन और उत्तेजना स्पेक्ट्रा 4 के साथ दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच ऊर्जा के गैर विकरणशील हस्तांतरण पर आधारित थे. ऊर्जा स्थानांतरण की क्षमता इसलिए झल्लाहट घटना का अवलोकन दाता और स्वीकर्ता fluorophores पास में होने की आवश्यकता है, दृढ़ता से दूरी पर निर्भर है. और स्वीकर्ता fluorophore (आमतौर पर पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन, YFP) के साथ एक संलयन के रूप में दूसरा, ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद के लिए परीक्षण करने के लिए, एक प्रोटीन दाता fluorophore (पाकिस्तानी सामान्यतः सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ एक संलयन के रूप में व्यक्त किया जाता है. ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद पाकिस्तानी दाता को YFP स्वीकर्ता रिश्तेदार से प्रकाश का उत्सर्जन में एक औसत दर्जे वृद्धि का परिणाम देगा, जो ऊर्जा के स्थानांतरण होने के लिए पर्याप्त करीब दाता और स्वीकर्ता fluorophores ला सकते हैं. एफआरएट जीवित कोशिकाओं 4 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में सफल रहा है. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए झल्लाहट का उपयोग करने का मुख्य दोष दाता की fluorophore उत्तेजना के लिए बाहरी रोशनी के लिए आवश्यकता है. उत्सर्जन संकेत, स्वीकर्ता के अवांछित उत्तेजना, और दाता और स्वीकर्ता fluorophores दोनों की photobleaching में उच्च पृष्ठभूमि में बाहरी रोशनी का परिणाम है. इन प्रभावों को प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए परख की संवेदनशीलता को कम.
बाहरी रोशनी से उच्च पृष्ठभूमि की समस्या पर काबू पा जो झल्लाहट परख के एक संशोधन Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) परख 5,6 है. ब्रेट प्रणाली में दाता fluorophore एक luciferase एंजाइम की जगह है. इस प्रकार स्वीकर्ता की fluorophore उत्तेजना के लिए ऊर्जा अनावश्यक बाहरी रोशनी प्रतिपादन, एक luciferase सब्सट्रेट के ऑक्सीकरण द्वारा प्रणाली के भीतर उत्पन्न होता है. अधिकांश मेंइस परख के आम विन्यास, दाता Renilla luciferase reniformis और स्वीकर्ता (वैकल्पिक दाता और स्वीकर्ता प्रोटीन की एक चर्चा के लिए Pfleger एट अल. 5 देखें) YFP है. तदनुसार, इस प्रणाली में, ब्याज की एक प्रोटीन luciferase और एक संभावित बातचीत प्रोटीन YFP के लिए, या ठीक इसके विपरीत से जुड़े हुए है. ब्रेट परख luciferase के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में coelenterazine का होना आवश्यक है. Coelenterazine सेल पारगम्य है, क्योंकि यह जीवित कोशिकाओं में ब्रेट assays के प्रदर्शन करने के लिए संभव है. हालांकि, देशी coelenterazine जलीय घोल में अस्थिर है, और coelenterazine के एंजाइम से स्वतंत्र टूटने परख के लिए उपलब्ध सब्सट्रेट की एकाग्रता कम कर देता है और luciferase गतिविधि की माप की संवेदनशीलता को कम कर देता है जो autoluminescence उत्पन्न दोनों. जीवित कोशिकाओं में ब्रेट के उपयोग जलीय घोल में स्थिर हैं लेकिन साइटोसोलिक esterase से चिपके रहते हैं, जो संरक्षित coelenterazines, के विकास के द्वारा सुविधा किया गया हैसेल 7 अंदर सक्रिय coelenterazine उत्पन्न करने के लिए कोशिका झिल्ली भर में प्रसार के बाद है.
Luciferase और YFP संलयन प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को सब्सट्रेट के अलावा के बाद, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत से उत्पन्न ऊर्जा हस्तांतरण luciferase और YFP से उत्सर्जन की निगरानी के द्वारा मात्रा निर्धारित है. प्रोटीन बातचीत बहु अच्छी तरह प्लेटें में जीवित कोशिकाओं में सीधे नजर रखी जा सकती क्योंकि ब्रेट परख लागत और समय कुशल है कि ख्यात बातचीत मान्य करने के लिए एक सरल, स्केलेबल विधि का गठन किया.
प्रोटिओमिक स्क्रीनिंग अध्ययन में पहचान की ख्यात interactors मान्य करने के अलावा, ब्रेट प्रणाली भी ब्याज की प्रोटीन पर पूर्व जैव रासायनिक और संरचनात्मक अध्ययन से उत्पन्न होने वाले परीक्षण के उम्मीदवार interactors करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अस्तित्व (ब्रेट परख का उपयोग करके या अन्य तकनीकों के द्वारा या तो) स्थापित किया गया है एक बार जब ब्रेट परख ईएमपी होने के लिए, वहाँ की क्षमता हैloyed आगे बातचीत करने के लिए चिह्नित. उदाहरण के लिए, बातचीत क्षेत्रों प्रोटीन का छोटा संस्करण उत्पन्न करके मैप किया जा सकता है, और बातचीत में विशिष्ट अवशेषों की भागीदारी बिंदु उत्परिवर्तन बनाकर प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अलावा, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर posttranslational संशोधनों या (जैसे दवाओं या ligands के रूप में) छोटे अणुओं की modulatory प्रभाव 8-10 जांच की जा सकती है.
ब्रेट परख भी रोगी डीएनए में पहचान म्यूटेशन की जांच के लिए काफी संभावना है. मामलों में एक परिवर्तन के लिए एक प्रेरणा भूमिका ब्रेट फेनोटाइप 11 की आणविक एटियलजि के बारे में अधिक प्रकट हो सकता है का उपयोग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन, स्थापित किया गया है जहां. कई संभावित हानिकारक उत्परिवर्तन यह rele हैं जो स्पष्ट नहीं है जो मामले में, एक व्यक्ति के भीतर की पहचान की जा करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के तरीके के आगमन के बाद से, यह तेजी से सामान्य हैफेनोटाइप से 12 Vant. इस स्थिति में ब्रेट परख प्रोटीन समारोह पर परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन करने में मूल्यवान और विकार को इसलिए उनकी प्रासंगिकता हो सकती है.
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Protocol
Plasmids के 1. निर्माण
- (चित्रा 1) मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग कर, दोनों pLuc और pYFP वैक्टर में ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन के लिए cDNAs Subclone. विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए ग्रीन एट अल 13 देखें.
- अनुक्रम सभी ब्याज की प्रोटीन कोई हस्तक्षेप रोकने के codons साथ ल्यूक / YFP अनुक्रम के साथ फ्रेम में हैं कि सत्यापित करने के लिए निर्माण करती है.
- संलयन प्रोटीन जैविक गतिविधि को बनाए रखने कि पुष्टि करने के लिए वांछित के रूप में कार्यात्मक assays के प्रदर्शन. यहाँ प्रस्तुत मामले में YFP संलयन प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया गया था.
- PLuc और pYFP अभिव्यक्ति वैक्टर में प्रासंगिक लक्ष्यीकरण संकेतों इंजीनियरिंग द्वारा उचित ल्यूक और YFP नियंत्रण के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids बनाओ. यहाँ प्रस्तुत मामले में, pLuc और pYFP वैक्टर में एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत डालने से परमाणु लक्षित ल्यूक और YFP निर्माणों उत्पन्न करते हैं.
- बनानाल्यूक और YFP एक एकल पॉलीपेप्टाइड में जुड़े हुए हैं, जिनमें एक सकारात्मक नियंत्रण का निर्माण. यहाँ प्रस्तुत मामले में, YFP कोडन अनुक्रम pLuc वेक्टर में डाला जाता है, जिसमें एक सकारात्मक नियंत्रण उत्पन्न करते हैं.
- अभिकर्मक मिक्स में डीएनए की बड़े पैमाने पर बराबर करने के लिए प्रयोग की जाने वाली एक तटस्थ भराव प्लाज्मिड का चयन करें. कोई यूकेरियोटिक प्रमोटर है कि एक प्लाज्मिड का प्रयोग करें और इसलिए इस तरह के एक जीवाणु क्लोनिंग वेक्टर के रूप में स्तनधारी कोशिकाओं में transcriptionally निष्क्रिय हो जाएगा.
डीएनए घोला जा सकता है की 2. तैयारी
- 260 एनएम पर absorbance के आधार पर धारा 1 में वर्णित सभी plasmids के एकाग्रता अनुमान (1 absorbance यूनिट 50 माइक्रोग्राम / डीएनए के मिलीग्राम के बराबर है). 650 दा से बेस जोड़े की संख्या से गुणा करके प्रत्येक प्लाज्मिड की आणविक जन निर्धारित. प्रत्येक प्लाज्मिड तैयारी की दाढ़ एकाग्रता की गणना करने के लिए एकाग्रता और आणविक द्रव्यमान का प्रयोग करें. 36 एनएम के एक एकाग्रता के लिए प्लास्मिड डीएनए तैयारी पतला. ये काम कर रहे शेयरों में होगीकि अभिकर्मक के लिए डीएनए घोला जा सकता है तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- पानी के 20 μl के अंतिम मात्रा में भराव प्लाज्मिड के 1,800 एनजी युक्त नियंत्रण डीएनए मिश्रण तैयार करें.
- PLuc नियंत्रण निर्माण के 5 μl युक्त नियंत्रण डीएनए मिश्रण तैयार करें. 1,800 एनजी के लिए कुल डीएनए बड़े पैमाने पर लाने के लिए पूरक प्लाज्मिड जोड़ें. 20 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें.
- PLuc नियंत्रण निर्माण के 5 μl और pYFP नियंत्रण निर्माण के 5 μl युक्त नियंत्रण डीएनए मिश्रण तैयार करें. 1,800 एनजी के लिए कुल डीएनए बड़े पैमाने पर लाने के लिए पूरक प्लाज्मिड जोड़ें. 20 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें.
- सकारात्मक नियंत्रण निर्माण के 5 μl युक्त नियंत्रण डीएनए मिश्रण तैयार करें. 1,800 एनजी के लिए कुल डीएनए बड़े पैमाने पर लाने के लिए पूरक प्लाज्मिड जोड़ें. 20 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें.
- निम्नलिखित डीएनए प्रासंगिक pLuc निर्माण के 5 μl और py के 5 μl गठबंधन प्रत्येक डीएनए मिश्रण के लिए ब्याज, एक्स के एक प्रोटीन की homodimerization के लिए परीक्षण करने के लिए घोला जा सकता है की तैयारीएफपी का निर्माण. 1,800 एनजी के लिए कुल डीएनए बड़े पैमाने पर लाने के लिए पूरक प्लाज्मिड जोड़ें. 20 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें.
ए) pLuc नियंत्रण और pYFP-X
बी) pLuc-X और pYFP नियंत्रण
सी) pLuc-X और pYFP-X - निम्नलिखित डीएनए ब्याज की प्रोटीन की एक जोड़ी के बीच एक संवाद के लिए परीक्षण करने के लिए घोला जा सकता है तैयार, एक्स और वाई प्रत्येक डीएनए मिश्रण के लिए प्रासंगिक pLuc निर्माण के 5 μl गठबंधन और pYFP के 5 μl का निर्माण. 1,800 एनजी के लिए कुल डीएनए बड़े पैमाने पर लाने के लिए पूरक प्लाज्मिड जोड़ें. 20 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें.
ए) pLuc नियंत्रण और pYFP-X
बी) pLuc-X और pYFP नियंत्रण
सी) pLuc नियंत्रण और pYFP-Y
डी) pLuc-Y और pYFP नियंत्रण
ई) pLuc-X और pYFP-Y
एफ) pLuc-Y और pYFP-X
3. अभिकर्मक
- हार्वेस्ट एक 75 सेमी 2 कुप्पी से HEK293 कोशिकाओं subconfluent. संस्कृति के माध्यम से 13 मिलीलीटर में कुल कोशिकाओं के 10% पतला. एक सफेद रंग की प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 130 μl बग़ैरस्पष्ट 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट तली. 24 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं.
- 3 से डीएनए घोला जा सकता है की संख्या से गुणा करके ट्रांसफ़ेक्ट हो कुओं की संख्या की गणना. कमरे के तापमान को सीरम मुक्त मध्यम संस्कृति लाओ. सीरम मुक्त माध्यम से 6.3 μl और अच्छी तरह से प्रति 0.18 μl अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार करें. Vortexing द्वारा मिक्स और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- सीरम मुक्त मध्यम / अभिकर्मक अभिकर्मक मास्टर मिश्रण के 20 μl डीएनए मिश्रण के 2 μl जोड़कर अभिकर्मक घोला जा सकता है तैयार. नहीं भंवर करो. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- अच्छी तरह से प्रति अभिकर्मक मिश्रण के 6.5 μl वितरण प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण के साथ तीन कुओं Transfect. एक और 36-48 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं.
ब्रेट सिग्नल की 4. मापन
- Vortexing द्वारा DMSO में 34 मिलीग्राम / एमएल में रहने कक्ष luciferase सब्सट्रेट भंग.
- सब्सट्रेट कमजोर पड़ने मध्यम पी में 1:1,000 में पुनर्गठित रहने कक्ष luciferase सब्सट्रेट पतला37 डिग्री सेल्सियस तक फिर से गरम 50 सब्सट्रेट कमजोर पड़ने माध्यम के μl प्रति अच्छी तरह से की अनुमति दें. मिश्रण करने के लिए भंवर. एक वेग फार्म का हो सकता है, लेकिन परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा.
- 96 अच्छी तरह से थाली से संस्कृति के माध्यम aspirate. प्रत्येक कुएं में पतला रहने कक्ष luciferase सब्सट्रेट के 50 μl बांटना. कम से कम 2 घंटे (24 घंटे) के लिए संस्कृति कोशिकाओं.
- 96 अच्छी तरह से थाली से ढक्कन हटाएँ और luminometer अंदर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए थाली सेते हैं.
- अच्छी तरह से एक समय में ल्यूक और YFP एक से उत्सर्जन उपाय. अब 470 एनएम से तरंग दैर्ध्य अवरुद्ध एक फिल्टर का उपयोग ल्यूक से उत्सर्जन उपाय. एक 500-600 एनएम बैंड पास फिल्टर का उपयोग YFP से उत्सर्जन उपाय. 10 सेकंड से अधिक उत्सर्जन संकेत एकीकृत.
5. डेटा विश्लेषण
- केवल भराव प्लाज्मिड प्राप्त है कि 3 कुओं से ल्यूक उत्सर्जन रीडिंग औसत. पृष्ठभूमि घटाया ल्यूक उत्सर्जन मूल्यों का उत्पादन करने के लिए अन्य सभी ल्यूक उत्सर्जन रीडिंग से इस मूल्य घटाना.
- केवल भराव प्लाज्मिड प्राप्त है कि 3 कुओं से YFP उत्सर्जन रीडिंग औसत. पृष्ठभूमि घटाया YFP उत्सर्जन मूल्यों का उत्पादन करने के लिए अन्य सभी YFP उत्सर्जन रीडिंग से इस मूल्य घटाना.
- प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, uncorrected ब्रेट अनुपात देने के लिए पृष्ठभूमि घटाया ल्यूक उत्सर्जन मूल्य द्वारा पृष्ठभूमि घटाया YFP उत्सर्जन मूल्य को विभाजित.
- केवल pLuc नियंत्रण प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे कि तीन कुओं से uncorrected ब्रेट अनुपात औसत. सुधारा ब्रेट अनुपात देने के लिए अन्य सभी uncorrected ब्रेट अनुपात से इस मूल्य घटाना.
- सुधारा ब्रेट अनुपात की शेष सेट में से प्रत्येक के लिए, एक अंतिम ब्रेट अनुपात प्राप्त करने के लिए तीन ट्रांसफ़ेक्ट कुओं से मूल्यों औसत.
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Representative Results
ब्रेट परख के सिद्धांत चित्रा 2 में सचित्र है. यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों भर में इस्तेमाल परख सेटअप 3 चित्र में दिखाया गया है. एक luciferase-YFP संलयन प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से एक मजबूत ब्रेट संकेत का पता लगाने के ऊर्जा हस्तांतरण नमूदार था कि पुष्टि की इस प्रयोगात्मक सेटअप में (चित्रा 4).
हमारे शोध से मस्तिष्क के विकास में transcriptional repressors के FOXP परिवार की भूमिका पर केंद्रित है. सबसे प्रमुख विशेषता भाषण 14-16 के लिए आवश्यक orofocial मांसपेशी आंदोलनों की जटिल दृश्यों का निर्माण के साथ विकास संबंधी मौखिक दुष्क्रिया-कठिनाई है जो की वाणी और भाषा विकार की एक दुर्लभ रूप है, को Foxp2 नेतृत्व को प्रभावित करने विषमयुग्मजी म्यूटेशन. FOXP1 परिवर्तन के मरीजों में सूचित किया गया है गंभीर भाषण और भाषा की समस्याओं 17-20 के साथ आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और बौद्धिक विकलांगता के साथ. अन्य प्रोटीन के साथ FOXPs की बातचीत के मस्तिष्क के विकास में इन प्रोटीनों की भूमिका के लिए प्रासंगिक आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए जांच की जा रही है.
Foxp2 इसलिए Foxp2 homodimerization ब्रेट परख (चित्रा 4) को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अन्य FOXP परिवार के सदस्यों को 21, साथ होमोसेक्सुअल या heterodimers फार्म करने के लिए जाना जाता है. इस परख में Foxp2 संलयन प्रोटीन की बातचीत बस प्रोटीन overexpression की वजह से था कि संभावना को बाहर करने, बातचीत की विशिष्टता, (छाछ E400 के में फ्रेम विलोपन) Foxp2 की leucine जिपर dimerization डोमेन में एक परिवर्तन शुरू करने से प्रदर्शन किया गया जो होमोसेक्सुअल और heterodimerization 21 (चित्रा 5A) को बाधित करने के लिए जाना जाता है. ल्यूक-FOXP2.DE400 और YFP-Foxp2 संलयन प्रोटीन सह व्यक्त किया गया जब ब्रेट संकेत में कमी ल्यूक-Foxp2 और YFP-Foxp2 (चित्रा 5 ब) के सह व्यक्त किया गया जब की तुलना में मनाया गया. इस सीपश्चिमी सोख्ता (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा मूल्यांकन के रूप में gnal कमी उत्परिवर्ती प्रोटीन (चित्रा 5C) के subcellular स्थानीयकरण में या अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर करने के लिए एक परिवर्तन के कारण नहीं था. ल्यूक-Foxp2 YFP-FOXP2.DE400 (नहीं दिखाया डेटा) के साथ व्यक्त किया गया था जब संकेत कमी भी मनाया गया. इस प्रकार ब्रेट प्रोटीन homodimerization का पता लगाने में प्रभावी है, और इन प्रोटीनों luciferase और YFP-fusions के रूप में overexpressed रहे हैं जब प्रोटीन की बातचीत विशिष्ट बनी हुई है. इसके अलावा, प्रोटीन की लक्षित उत्परिवर्तन के साथ संयोजन में ब्रेट के उपयोग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में शामिल व्यक्ति के अवशेषों की पहचान करने की क्षमता है.
Heterotypic बातचीत का पता लगाने में ब्रेट परख के प्रभाव का आकलन करने के लिए, FOXP1 साथ Foxp2 की बातचीत (चित्रा 6) का परीक्षण किया गया था. एक ब्रेट संकेत यानी दाता के रूप में Foxp2 साथ या स्वीकर्ता FUSIO के रूप में (परख के दोनों संभावित विन्यास में मनाया गयाn प्रोटीन). इसलिए ब्रेट परख होमोसेक्सुअल और heterotypic बातचीत दोनों का पता लगाने में सक्षम है. इसके अलावा, गैर FOXP प्रोटीन के साथ Foxp2 की बातचीत का पता लगाने के लिए ब्रेट परख की उपयुक्तता CtBP1, एक transcriptional सह repressor और ज्ञात Foxp2 बातचीत साथी 21 के साथ बातचीत की जांच से परीक्षण किया गया था. CtBP1 और Foxp2 के बीच बातचीत मूल रूप से एक खमीर दो संकर स्क्रीन द्वारा सुझाव दिया गया था और बाद में सह immunoprecipitation प्रयोगों 21 द्वारा मान्य किया गया था. Foxp2 दाता संलयन प्रोटीन था और CtBP1 नहीं बल्कि रिवर्स विन्यास (चित्रा 7A) में, स्वीकर्ता था जब Foxp2-CtBP1 बातचीत ब्रेट परख द्वारा खोजा गया था. इस तरह के परिणामों ब्रेट प्रणाली (चर्चा अनुभाग देखें) के साथ उम्मीद की जानी हैं. Foxp2 और CtBP1 के बीच बातचीत CtBP1 की ही एक नाबालिग अनुपात इस परख की संवेदनशीलता पर प्रकाश डाला, नाभिक (चित्रा 7B) के लिए स्थानीयकृत किया गया था, भले ही मनाया गया. इस प्रकार ब्रेटपरख खमीर दो संकर स्क्रीनिंग के माध्यम से पहचान की ख्यात बातचीत की मान्यता के लिए उपयोगी है.
अंत में, ब्रेट परख प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर Foxp2 में रोगजनक परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए नियुक्त किया गया था. Foxp2 में दो बिंदु उत्परिवर्तन भाषण और भाषा (चित्रा 8A) को प्रभावित करने वाले एक दुर्लभ autosomal प्रमुख विकार का कारण बताया गया है. R553H missense उत्परिवर्तन आधे सदस्यों विकार 14 से प्रभावित थे, जिसमें एक बड़े परिवार में एक से उठाना अध्ययन के माध्यम से की खोज की थी. R328X बकवास उत्परिवर्तन विकास मौखिक दुष्क्रिया 22 के निदान के साथ probands में Foxp2 लोकस के लक्षित अनुक्रमण के माध्यम से की खोज की थी. जंगली प्रकार Foxp2 साथ dimerize को उत्परिवर्ती प्रोटीन की क्षमता ब्रेट परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. स्वीकर्ता के रूप में एक दाता और उत्परिवर्ती Foxp2 के रूप में जंगली प्रकार Foxp2 का उपयोग कर परिणाम चित्रा 8B में दिखाया गया. एक ही परिणाम मीटर का उपयोग कर मनाया गयास्वीकर्ता (नहीं दिखाया डेटा) के रूप में दाता और जंगली प्रकार के रूप में utant Foxp2. Foxp2 के डीएनए बाध्यकारी डोमेन के भीतर है जो R553H उत्परिवर्तन, जंगली प्रकार के साथ dimerize को उत्परिवर्ती प्रोटीन की क्षमता को प्रभावित नहीं किया. इस उत्परिवर्तन की रोगजनक तंत्र इसलिए सामान्य प्रोटीन 23 के साथ उत्परिवर्ती के dimerization से उत्पन्न एक प्रमुख नकारात्मक प्रभाव शामिल हो सकते हैं. R328X उत्परिवर्तन इनकोडिंग प्रोटीन leucine जिपर dimerization डोमेन और डीएनए बाध्यकारी डोमेन का अभाव है, और कुछ cytoplasmic mislocalization (चित्रा 8C) से पता चलता है कि परिणाम के साथ, एक समय से पहले बंद codon परिचय. कोशिका द्रव्य को dimerization डोमेन और mislocalization के अभाव के अनुरूप, छोटा प्रोटीन बहुत जंगली प्रकार Foxp2 साथ बातचीत कम से पता चलता है. यह परिवर्तन इसलिए कारण haploinsufficiency को रोगजनक होने की संभावना है. इस प्रकार ब्रेट परख रोगियों की खोज में म्यूटेशन का जैविक प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
चित्रा 1. YFP और luciferase संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए वैक्टर. ए) pYFP और pLuc वैक्टर के सर्किल नक्शे. pLuc वेक्टर ब्रेट दाताओं के रूप में luciferase संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग किया जाता है. ब्रेट स्वीकार करने के रूप में pYFP वेक्टर YFP संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग किया जाता है. वैक्टर स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च स्तर की अभिव्यक्ति के लिए एक सीएमवी प्रमोटर (पी सीएमवी), ब्याज की प्रोटीन के लिए cDNAs की प्रविष्टि के लिए एक कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस), और एक kanamycin प्रतिरोध जीन (कान आर) और के प्रचार के लिए बैक्टीरियल प्रतिकृति मूल है बैक्टीरिया में प्लाज्मिड. बी) pLuc और pYFP वैक्टर के एकाधिक क्लोनिंग साइट. YFP कोडन अनुक्रम के अंत नीले रंग में दिखाया गया है. चयनित प्रतिबंध साइटों एनोटेट कर रहे हैं. Xba मैं साइट ove द्वारा अवरुद्ध है कि नोटई. के मानक उपभेदों में बांध मेथिलिकरण rlapping कोलाई. ब्याज की प्रोटीन के लिए कोडिंग cDNAs में फ्रेम दिखाया अमीनो एसिड अनुक्रम के साथ क्लोन किया जाना चाहिए. यहाँ वर्णित प्रयोगों में, आवेषण (रेखांकित) बैम हाय और Xba मैं प्रतिबंध साइटों में क्लोन किया गया. बंद करो codons luciferase के अंत से हटा दिया गया है और YFP luciferase / YFP और ब्याज की subcloned सीडीएनए को शामिल एक खुला पढ़ने फ्रेम प्रदान करने के लिए दृश्यों कोडन. बंद करो codons इसलिए यह डाला सीडीएनए में एक बंद codon शामिल करने के लिए आवश्यक नहीं है, (लाल रंग में दिखाया गया है) के लिए सभी तीन पढ़ने फ्रेम में कई क्लोनिंग साइट के अंत में मौजूद हैं.
ब्रेट प्रणाली के चित्रा 2. सिद्धांत. ब्याज की प्रोटीन, एक्स और वाई, एक दाता luciferase एंजाइम (ल्यूक, शिखर उत्सर्जन 475 n करने के लिए जुड़े हुए हैंएम) और एक स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP, शिखर उत्सर्जन 530 एनएम), क्रमशः. फ्यूजन प्रोटीन सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं और ल्यूक से एक सेल पारगम्य luciferase सब्सट्रेट, उत्सर्जन के निम्न अलावा एक 500-600 एनएम बैंड पास फिल्टर का उपयोग कर मापा जाता है अब YFP से 470 एनएम और उत्सर्जन की तुलना में तरंग दैर्ध्य अवरुद्ध एक फिल्टर का उपयोग कर मापा जाता है. प्रोटीन एक्स और प्रोटीन के बीच ए) प्रोटीन एक्स और YFP तक ल्यूक से प्रोटीन वाई ऊर्जा स्थानान्तरण के बीच कोई बातचीत नहीं होती है. बी) इंटरेक्शन वाई प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का उपयोग करके मापा उत्सर्जन का अनुपात में वृद्धि के कारण YFP तक ल्यूक से होता है 500-600 एनएम बैंड पास फिल्टर अब 470 एनएम से तरंग दैर्ध्य अवरुद्ध फिल्टर की तुलना में.
चित्रा 3. परख सेटअप. के लिए परीक्षण करने के लिए परख सेटअपएक बातचीत ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच, एक्स और ब्याज की वाई प्रोटीन ब्रेट स्वीकर्ता के रूप में ब्रेट दाता और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के रूप में luciferase (ल्यूक) के लिए जुड़े हुए हैं. . ए) प्रत्येक थाली में शामिल होने के लिए नियंत्रण अगर उचित नियंत्रण प्रोटीन में, ल्यूक और YFP, प्रासंगिक subcellular कम्पार्टमेंट (पी) के लिए एक लक्ष्य संकेत युक्त एक पेप्टाइड इनकार कर रहे हैं. Luminescence और luminometer शोर और सब्सट्रेट के एंजाइम से स्वतंत्र टूटने से उत्पन्न प्रतिदीप्ति की पृष्ठभूमि के स्तर को स्थापित करने के लिए 1) मॉक अभिकर्मक नियंत्रण; 2) एक ब्रेट स्वीकर्ता के अभाव में YFP के उत्सर्जन सीमा के भीतर का पता लगाया है जो luciferase उत्सर्जन का अनुपात स्थापित करने के लिए pLuc नियंत्रण केवल अभिकर्मक; 3) pLuc नियंत्रण और ल्यूक-YFP बातचीत से उत्पन्न आधारभूत ब्रेट संकेत स्थापित करने के लिए pYFP नियंत्रण के अभिकर्मक; 4) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ल्यूक-YFP संलयन के अभिकर्मक एक ब्रेट संकेत मापा जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए. बी) experim का सेटब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद के लिए परीक्षण करने के अंदरूनी स्थितियों, एक्स और वाई 1, 2, 4, 5) ब्याज और ल्यूक / YFP के प्रोटीन के बीच गैर विशिष्ट बातचीत के लिए नियंत्रण; स्वीकर्ता के रूप में दाता और वाई के रूप में एक्स के साथ 3) टेस्ट हालत; स्वीकर्ता के रूप में दाता और एक्स के रूप में वाई के साथ 6) टेस्ट हालत.
Foxp2 homodimerization की चित्रा 4. जांच. ए) Foxp2 homodimers का पता लगाने के लिए ब्रेट परख मान्य करने के लिए, HEK293 कोशिकाओं luciferase (दाता) या Foxp2 (P2) या एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत या तो इनकार YFP (स्वीकर्ता) की अभिव्यक्ति के लिए निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया (-). परमाणु लक्षित luciferase और YFP प्रोटीन के रूप में नकारात्मक नियंत्रण सेवा करते हैं. एक ब्रेट संकेत का पता लगाने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को भी एक luciferase-YF की अभिव्यक्ति के लिए एक निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया) या YFP Foxp2 (P2) से जुड़े हुए साथ -. एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (के लिए जुड़े हुए YFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के पी संलयन प्रोटीन (+) बी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों.
चित्रा 5. परख विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए dimerization की कमी Foxp2 का प्रयोग करें. Dimerization बाधित जो DE400 उत्परिवर्तन की स्थिति दिखा Foxp2 प्रोटीन की ए) योजनाबद्ध आरेख. leucine जिपर dimerization डोमेन हरे रंग में दिखाया गया है और प्रोटीन की overexpression ब्रेट परख में झूठी सकारात्मक परिणाम दे सकते है कि क्या परीक्षण करने के लिए पीला. बी) में डीएनए बाध्यकारी डोमेन, परख की विशिष्टता FOXP2.DE400 का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था संस्करण. कोशिकाओं luciferase (दाता) या Foxp2 (P2) से जुड़े हुए YFP (स्वीकर्ता), FOXP2.DE400 (डे) या एक nuclea की अभिव्यक्ति के लिए निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गयाआर स्थानीयकरण संकेत (-). Foxp2 (P2) के लिए या FOXP2.DE400 (डे) के लिए जुड़े हुए YFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की सी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों.
FOXP1-Foxp2 heterodimerization की चित्रा 6. जांच. ए) मुताबिक़ प्रोटीन Foxp2 और FOXP1 के बीच heterodimerization का पता लगाने के लिए ब्रेट परख मान्य करने के लिए, कोशिकाओं luciferase (दाता) या Foxp2 (p2 या तो इनकार YFP (स्वीकर्ता)) की अभिव्यक्ति के लिए निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे, FOXP1 (P1) या एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (-). FOXP1 (P1) के लिए या Foxp2 (P2) से जुड़े हुए YFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की बी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों.
चित्रा 8. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर रोगजनक Foxp2 परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन. एक दुर्लभ के लिए जो कारण R553H और R328X परिवर्तन के पदों पर दिखा Foxp2 प्रोटीन की ए) योजनाबद्ध आरेखभाषण और भाषा विकार के आरएम. leucine जिपर dimerization डोमेन हरी और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर रोग परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए ब्रेट परख की उपयोगिता का आकलन करने के लिए पीले. बी में डीएनए बाध्यकारी डोमेन) में दिखाया गया है, पर R553H और R328X परिवर्तन के प्रभाव सामान्य Foxp2 साथ dimerize को उत्परिवर्ती Foxp2 प्रोटीन की क्षमता की जांच की गई. (-). सी कोशिकाओं luciferase (दाता) या या तो सामान्य Foxp2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), या एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत के लिए जुड़े हुए YFP (स्वीकर्ता) की अभिव्यक्ति के लिए निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया ) YFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों FOXP2.R553H (R553H) के लिए या FOXP2.R328X (R328X) से जुड़े हुए. इस छवि में FOXP2.R328X मुख्य रूप से परमाणु है, लेकिन आबादी के भीतर अन्य कक्षों में एक अधिक cytoplasmic वितरण से पता चलता है.
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Discussion
संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति निर्माणों की डिजाइन ब्रेट परख स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों में, ब्याज की प्रोटीन luciferase या YFP के सी टर्मिनस से इनकार कर रहे थे. यह भी संभव है, और luciferase / YFP के एन टर्मिनस के लिए प्रोटीन फ्यूज करने के लिए जरूरी हो जाता है. कुछ प्रोटीन के लिए, fusions केवल प्रोटीन संरचना और समारोह के विघटन से बचने के क्रम में एन या सी टर्मिनस पर या तो स्वीकार किया जा सकता है. इसके अलावा, transmembrane प्रोटीन के लिए जो में और एन सी Termini luciferase / YFP प्रोटीन बातचीत भागीदार के रूप में एक ही डिब्बे में है जो टर्मिनस से इनकार किया जाना चाहिए, अलग subcellular डिब्बों में रहते हैं. उदाहरण के लिए, transmembrane जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स और cytoplasmic β arrestin के बीच बातचीत के अध्ययन में, luciferase transmembrane रिसेप्टर 8 के intracellular carboxyl पूंछ इनकार किया गया था. अन्य मामलों में एक प्रोटीन, प्रोटीन interacti की ज्यामितिपर ऊर्जा हस्तांतरण संलयन प्रोटीन के दो संभावित संयोजनों में से एक का उपयोग कर अधिक कुशल होने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. कभी कभी ऊर्जा हस्तांतरण झूठी नकारात्मक परिणामों के प्रमुख, सभी में केवल एक संयोजन का उपयोग अगर नहीं पाया जा सकता है.
luciferase / YFP और ब्याज की प्रोटीन के बीच पेप्टाइड linker के अनुक्रम भी प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण की क्षमता को प्रभावित कर सकता है. लिंकर luciferase / YFP और ब्याज की प्रोटीन बाधा के बिना गुना करने के लिए अनुमति देने के लिए काफी लंबे समय के लिए किया जाना चाहिए. एक लंबे समय तक लिंकर luciferase / YFP और दाता और स्वीकर्ता द्विध्रुव के संरेखण की सुविधा से ब्रेट दक्षता में वृद्धि हो सकती है, जो ब्याज के प्रोटीन के बीच जंक्शन पर पॉलीपेप्टाइड के लिए अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करेगा. लिंकर में बहुत अधिक लचीलापन है कि अगर वहाँ हालांकि, ब्रेट दक्षता कम हो सकती है. यहाँ प्रयोगों में, अभिव्यक्ति ग्राम शिक्षा समिति के BamH मैं और Xba मैं साइटों में ब्याज की प्रोटीन की क्लोनिंगचित्रा 1 में दिखाया गया है tors, एक 23 एमिनो एसिड लिंकर में हुई. इस linker प्रोटीन के कई जोड़े के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए सफल रहा है.
प्रयोगों ब्रेट आगे बढ़ने से पहले यह संलयन प्रोटीन सामान्य जैविक गतिविधि को बनाए रखने कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए. YFP के कामकाज एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. luciferase के कामकाज व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग assayed किया जा सकता है. ब्याज की प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण पर फ्यूजन का प्रभाव प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा, immunostaining, या YFP-fusions के मामले में द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. ब्याज की प्रोटीन के समारोह पर संलयन के प्रभाव प्रोटीन विशिष्ट assays के द्वारा जांच किया जा सकता है - उदाहरण के लिए, एक प्रतिलेखन कारक के लिए यह डीएनए बाध्यकारी गतिविधि परख के लिए उपयुक्त हो सकता है. प्रयोग के दौरान बनाया कि luminescence माप सुविधाजनक में परख की पुष्टि प्रदान नोटluciferase गतिविधि का समझना.
यह उचित नियंत्रण निर्माणों अपने हित के प्रोटीन के लिए क्या कर रहे हैं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. YFP और luciferase मुख्य रूप से cytoplasmic हैं और ब्याज की प्रोटीन cytoplasmic हैं इसलिए जब उचित नियंत्रण कर रहे हैं. ब्याज की प्रोटीन अन्य subcellular डिब्बों के लिए स्थानीय कर रहे हैं फिर भी, जब यह प्रासंगिक डिब्बे को उनके अवैध व्यापार करने के लिए प्रत्यक्ष पेप्टाइड संकेतों के साथ luciferase और YFP संशोधित करने के लिए वांछनीय हो सकता है. यहाँ ब्याज की प्रोटीन इसलिए luciferase, नाभिक के लिए स्थानीय कर रहे हैं और YFP एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत के अलावा द्वारा संशोधित किया गया है कि प्रतिलेखन कारक थे. विशेष रूप से, SV40 बड़ी टी प्रतिजन (CGYGPKKKRKVGGLDN) के परमाणु स्थानीयकरण संकेत सहित एक पेप्टाइड बाम हाय और वीं की Xba मैं साइटों के बीच सिंथेटिक डबल असहाय oligonucleotides ligating द्वारा luciferase और YFP के सी टर्मिनस के साथ जोड़ दिया गया थाई pLuc और pYFP वैक्टर. इस संकेत के अलावा नाभिक (चित्रा 4 बी) के लिए प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण पुनर्वितरण का कारण बना.
उचित नियंत्रण सहित ब्रेट प्रयोगों की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक निष्क्रिय भराव प्लाज्मिड का उपयोग कर एक नकली अभिकर्मक नियंत्रण luminescence और luminometer शोर और सब्सट्रेट के एंजाइम से स्वतंत्र टूटने से उत्पन्न प्रतिदीप्ति की पृष्ठभूमि के स्तर को स्थापित करने के लिए आवश्यक है. आधुनिक luminometers और luciferase substrates के साथ पृष्ठभूमि luminescence स्तर आमतौर पर बहुत कम हैं. उचित नियंत्रण luciferase एक YFP निर्माण के अभाव में निर्माण के साथ अभिकर्मक एक ब्रेट स्वीकर्ता के अभाव में YFP के उत्सर्जन सीमा के भीतर का पता लगाया है जो luciferase उत्सर्जन का अनुपात स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. YFP constructs नियंत्रण luciferase और नियंत्रण के साथ अभिकर्मक ल्यूक-YFP बातचीत से उत्पन्न आधारभूत ब्रेट संकेत देता है. ईव के लिएबातचीत के लिए परीक्षण कर रहे हैं कि प्रोटीन की RY जोड़ी, यह परीक्षण किया जा रहा प्रोटीन और luciferase / YFP के बीच किसी भी गैर विशिष्ट बातचीत के लिए नियंत्रित करने के लिए, चित्रा 3 बी में सचित्र के रूप में, उचित नियंत्रण के निर्माण के साथ अकेले हर एक transfect करने के लिए महत्वपूर्ण है. पहली बार के लिए एक ब्रेट प्रयोग का प्रदर्शन, खासकर जब यह एक ब्रेट संकेत अपने प्रयोगात्मक सेटअप में नमूदार है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ल्यूक-YFP संलयन प्रोटीन शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ YFP के कोडन अनुक्रम YFP luciferase की सी टर्मिनस से जुड़े हुए है, जिसमें एक संलयन प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए बाम हाय और Xba मैं साइटों पर pLuc में क्लोन किया गया था.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, डीएनए की संरचना अभिकर्मक ल्यूक / YFP संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति का औसत आकार 7.5 केबी से अधिक नहीं है constructs कि इस धारणा के साथ गणना की गई के लिए घोला जा सकता है. यदि अभिव्यक्ति निर्माणटीएस इस तुलना में काफी बड़े होते हैं, तो अभिकर्मक मिश्रण में जोड़ा प्रत्येक अभिव्यक्ति निर्माण के moles की संख्या मिश्रण में डीएनए की कुल राशि अभिकर्मक अभिकर्मक की राशि द्वारा अनुमत अधिकतम से अधिक नहीं है कि इतनी कम किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से सभी अभिकर्मक मिक्स में अभिकर्मक अभिकर्मक और डीएनए की मात्रा की राशि निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन बढ़ाया जा सकता है. 96 अच्छी तरह प्लेटें की प्रयोगात्मक हेरफेर मल्टीचैनल pipettes और एस्पिरेटरों के उपयोग से तेजी लाई है. इसलिए यह पहली मिश्रण 10 मिनट के लिए incubating गया है के रूप में अभिकर्मक के रूप में जल्द ही कोशिकाओं को घोला जा सकता है, उनका कहना शुरू, सीरम मुक्त मध्यम / अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए डीएनए के अलावा के बाद अभिकर्मक मिश्रण ऊष्मायन समय की लंबाई में नमूनों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए वांछनीय है . ब्रेट स्वीकर्ता प्रोटीन YFP fusions होते हैं, क्योंकि यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा या एक microplate पुनः में प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा अभिकर्मक दक्षता का आकलन करना संभव हैAder. यह कि अभिकर्मक ब्रेट संकेत के सब्सट्रेट और माप के अलावा करने के लिए आगे बढ़ने से पहले संतोषजनक है यह सुनिश्चित करने के लिए सलाह दी जाती है ताकि एक ब्रेट प्रयोग की सफलता के अभिकर्मक के एक अच्छे स्तर पर निर्भर करता है. YFP टैग भी एक microplate रीडर का उपयोग स्वीकर्ता प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है. स्वीकर्ता प्रोटीन के स्तर की मात्रा का अनुकूलन और ब्रेट प्रयोगों की मुसीबत शूटिंग के लिए उपयोगी हो सकता है.
कोशिकाओं को एक स्थिर संकेत हासिल किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ब्रेट संकेत को मापने से पहले luciferase सब्सट्रेट के साथ कम से कम 2 घंटे के लिए incubated किया जाना चाहिए. यह अप करने के लिए 24 घंटे के लिए सब्सट्रेट के साथ कोशिकाओं को सेते भी स्वीकार्य है. इस मामले में कुल luminescence मायने रखता कम हो जाएगा, लेकिन ब्रेट अनुपात अपरिवर्तित होना चाहिए. सब्सट्रेट के साथ लंबे समय तक incubations (रातोंरात, उदाहरण के लिए) और अधिक सुविधाजनक हो सकता है और यह भी एक प्रयोगात्मक हेरफेर से पहले और बाद ब्रेट संकेतों के माप अनुमति दे सकता है जैसे किएक दवा परिसर के अतिरिक्त के रूप में. कोशिकाओं माप के समय के आसपास confluency तक पहुँचने के लिए इतना है कि आदर्श रूप में, सेल बोने घनत्व का अनुकूलन. सेल घनत्व इष्टतम ऊपर है तो यह सेल अतिवृद्धि से बचने के लिए एक पहले के समय बिंदु पर ब्रेट संकेत को मापने के लिए फायदेमंद हो सकता है. HEK293 के अलावा किसी अन्य कोशिका प्रकार का उपयोग करते हैं, तो सेल संस्कृति और अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करें. ब्रेट प्रयोगों को भी सफलतापूर्वक यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग HELA कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया है.
यहाँ वर्णित प्रयोगों में, luminescence मायने रखता Renilla luciferase गतिविधि के लिए अधिकतम तापमान है, जो कमरे के तापमान पर मापा गया. Luminometer में एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग का प्रदर्शन तो यह 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर सेट करने के लिए बेहतर है हम कमरे के तापमान पर और 37 डिग्री सेल्सियस पर ही प्रयोगों का प्रदर्शन किया है और परिणाम में कोई महत्वपूर्ण अंतर मनाया गया. कमरे के तापमान, वें पर प्रयोगों प्रदर्शन तोई प्लेट Renilla luciferase गतिविधि के स्थिरीकरण की अनुमति से पहले माप के लिए luminometer अंदर 10 मिनट संतुलित करने की अनुमति दी जानी चाहिए. इधर, luminescence संकेत विशेष रूप से कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ प्रोटीन के लिए, आम तौर पर उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है, जो 10 सेकंड, अधिक एकीकृत किया गया. यह पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान करता है हालांकि, अगर संकेतों कम समय अवधि में एकीकृत किया जा सकता है. कारण जीना सेल luciferase सब्सट्रेट द्वारा उत्पादित luminescence संकेत की स्थिरता के लिए, यह प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में अच्छी तरह से करने के लिए प्रति 10 सेकंड के लिए उपाय करने के लिए स्वीकार्य है.
परीक्षण हालत से संकेत काफी प्रासंगिक नियंत्रण की स्थिति से संकेत से अधिक है जब ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद ब्रेट परख द्वारा पुष्टि की है. एक ब्रेट संकेत के अभाव एक बातचीत उत्पन्न नहीं होती है कि जरूरी पुष्टि नहीं है. एक अप्रत्याशित या नकारात्मक परिणाम के मामले में, कुल luminescence और प्रतिदीप्तिnce मायने रखता है सभी कुओं को सही ढंग से ट्रांसफ़ेक्ट गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए जांच की जानी चाहिए.
ब्रेट संकेत भी प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के अनुपात से प्रभावित होता है इसलिए इसमें से दो प्रोटीन (या luminescence गिनती के YFP fusions के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कुओं से प्रतिदीप्ति मायने रखता तुलना करके ब्याज की दो प्रोटीनों के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए उपयोगी है कुओं) luciferase fusions के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. एक संलयन प्रोटीन अधिक दृढ़ता से अन्य की तुलना में व्यक्त करता है, जब बेहतर परिणाम कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ प्रोटीन यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों में Foxp2 और CtBP1 के साथ मामला था जो luciferase, से जुड़े हुए है अगर प्राप्त होने की संभावना है. यह अभिकर्मक मिश्रण में अभिव्यक्ति plasmids के दाढ़ अनुपात समायोजन करके प्रोटीन के स्तर में हेरफेर करने के लिए भी संभव है. संलयन प्रोटीन के कुछ जोड़े के बीच ऊर्जा हस्तांतरण की वजह से प्रोटीन जटिल की ज्यामिति को बहुत अक्षम हो सकता है. ऐसे मेंमामलों में यह luciferase / YFP के वैकल्पिक Termini के लिए ब्याज की प्रोटीन fusing प्रयास करने के लिए सार्थक हो सकता है.
यह ब्रेट संकेत एक शारीरिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है और बस के कारण प्रोटीन overexpression के लिए नहीं है कि पुष्टि करने के लिए आवश्यक है. इस कारण से यह प्रोटीन का सकल overexpression से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. ब्रेट प्रणाली में एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की विशिष्टता आगे Foxp2 की DE400 संस्करण प्रयोग कर के रूप में प्रदर्शन, बातचीत का आकर्षण कम करने के लिए जाना जाता है कि प्रोटीन में उत्परिवर्तन शुरू करने से इस बात की पुष्टि की जा सकती है. उत्परिवर्ती प्रोटीन आगे प्रतियोगिता और ब्रेट assays के बंधन संतृप्ति में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्रतियोगी के रूप में बातचीत के भागीदारों में से एक के एक untagged संस्करण की एकाग्रता में वृद्धि करते हुए एक प्रतियोगिता परख में, दाता और स्वीकर्ता संलयन प्रोटीन की सांद्रता स्थिर रखा जाता है. Untagged जंगली प्रकार के प्रोटीन में चिह्नित वी के साथ प्रतिस्पर्धा करना चाहिएउत्परिवर्ती प्रोटीन बातचीत बाहर प्रतिस्पर्धा करने के लिए एक कम क्षमता का प्रदर्शन करना चाहिए जबकि ब्रेट संकेत में कमी के परिणामस्वरूप, अपनी बातचीत साथी के लिए बाध्य करने के लिए ersion. स्वीकर्ता की एकाग्रता में वृद्धि करते हुए एक संतृप्ति बाध्यकारी परख में, दाता संलयन प्रोटीन की एकाग्रता, स्थिर रखा है. एक विशिष्ट बातचीत के लिए ब्रेट संकेत अंततः स्वीकर्ता साथ संतृप्त हो सभी दाता अणुओं के रूप में पठार चाहिए. एक गैर विशिष्ट बातचीत के लिए ब्रेट संकेत आम तौर पर कारण दाता और स्वीकर्ता अणुओं के बीच यादृच्छिक टक्कर में वृद्धि करने के लिए एक छोटा सा रैखिक वृद्धि दिखाएगा. दाता अनुपात भी संकेत का पता लगाने के लिए दाता प्रोटीन की पर्याप्त स्तर को बनाए रखने, जबकि संतृप्ति निरीक्षण करने के लिए: व्यवहार में, घुलनशील प्रोटीन के बीच उदार आत्मीयता से बातचीत के लिए, यह एक उच्च पर्याप्त स्वीकर्ता हासिल करना मुश्किल हो सकता है.
सावधानी differenc की व्याख्या में प्रयोग किया जाना चाहिएब्रेट अनुपात के बीच तों. ऊर्जा स्थानांतरण की क्षमता प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की ताकत के अलावा अन्य कारकों से प्रभावित होता है क्योंकि ब्रेट परख एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के आकर्षण का एक मात्रात्मक उपाय प्रदान नहीं करता है. इस तरह के कारकों सेल के भीतर संलयन प्रोटीन के स्तर का अनुपात, बातचीत की ज्यामिति, और एसोसिएशन और जटिल की हदबंदी की दरें शामिल हैं. प्रोटीन के दो विभिन्न जोड़े के साथ प्राप्त अनुपात इसलिए जरूरी तुलना नहीं की जा सकती, लेकिन तुलना में इस तरह के जंगली प्रकार और यहाँ दिखाया Foxp2 की ΔE400 वेरिएंट के साथ उसी के रूप में प्रोटीन के विभिन्न संस्करणों के बीच संभव हो सकता है. कभी कभी, थोड़ा नकारात्मक ब्रेट अनुपात देखा जा सकता है. नकारात्मक अनुपात केवल pLuc नियंत्रण वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में आधारभूत अनुपात की माप में त्रुटि से हो सकता है. बहुत उच्च अनुपात ट्रांसफ़ेक्ट CE के अवलोकन से इसकी पुष्टि की जा सकती है जो प्रोटीन एकत्रीकरण, की अक्सर संकेत कर रहे हैंएक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ LLS. एकत्रीकरण जैविक रूप से प्रासंगिक या प्रोटीन overexpression की एक artifact है अगर यह निर्धारित किया जाना चाहिए.
अंत में, यहाँ वर्णित ब्रेट परख जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. ब्रेट के आवेदन, प्रोटिओमिक स्क्रीनिंग अध्ययन से उम्मीदवार interactors मान्य के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में शामिल विशिष्ट अवशेषों की पहचान करने, और रोगी के डीएनए में पाया परिवर्तन के प्रभाव के मूल्यांकन के प्रयोजनों के लिए प्रदर्शन किया गया है. बातचीत सेल के लिए आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में पता चला रहे हैं क्योंकि ब्रेट संकेत एक ऐसी दवा परिसर या ligand 7 के अतिरिक्त के रूप में एक पहले और इलाज के बाद मापा जा सकता है. ब्रेट परख अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के माध्यम से खोज की आनुवंशिक वेरिएंट की जैविक प्रासंगिकता का आकलन करने के लिए कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान में इस्तेमाल के लिए महान वादा दिखाता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanodrop 8000 | Nanodrop | Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes. | |
| 96-microwell plates, flat bottom, white | Greiner Bio One | 655098 | White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off. |
| Infinite F200Pro plate reader with control software | TECAN | Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. | |
| pLuc, pYFP, positive control plasmid | N/A | N/A | Plasmids available from the authors upon request. |
| pGEM-3Zf(+) | Promega | P2271 | Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable. |
| HEK293 cells | ECACC | 85120602 | Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable. |
| DMEM, high glucose, with phenol red | Gibco | 41966 | This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium. |
| DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) | Gibco | 21063 | This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use. |
| OptiMEM | Gibco | 31985 | OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v. |
| GeneJuice transfection reagent | Novagen | 70967 | If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions. |
| DMSO | Sigma | D2650 | Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. |
| EnduRen live-cell substrate | Promega | E6481 | Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium. |
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