La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Summary

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

Abstract

Los ensayos basados ​​en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) proporcionan un medio sensible y confiable para monitorear las interacciones proteína-proteína en las células vivas. BRET es la transferencia no radiativa de energía a partir de un "donante" de la enzima luciferasa a una proteína fluorescente aceptora. En la configuración más común de este ensayo, el donante es de la luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es proteína amarilla fluorescente (YFP). Debido a que la eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, la observación del fenómeno BRET requiere que el donante y aceptor de estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés en células de mamífero en cultivo, una proteína se expresa como una fusión con la luciferasa y la segunda como una fusión con YFP. Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar el donador y el aceptor suficientemente cerca para que se produzca la transferencia de energía. En comparación con otras técnicas para la investigación de la proteína-proteína eninteracciones, el ensayo BRET es sensible, requiere poca práctica en el tiempo y unos reactivos, y es capaz de detectar interacciones que son débiles, transitorio o dependiente del entorno bioquímico encontrado dentro de una célula viva. Por lo tanto, es un enfoque ideal para la confirmación de las interacciones putativas sugeridas por estudios de proteómica de levadura de dos híbridos o espectrometría de masas, y además es muy adecuado para cartografiar regiones interactuar, evaluar el efecto de las modificaciones post-traduccionales en las interacciones proteína-proteína, y evaluar el impacto de las mutaciones identificadas en el ADN del paciente.

Introduction

Tanto vinculación clásica y de próxima generación análisis de secuenciación de trastornos humanos están revelando la relevancia clínica de las proteínas que participan en una variedad de procesos biológicos. A menudo es el caso que, antes de su identificación en tales estudios, ha habido poca o ninguna investigación del papel biológico de estas proteínas. Una vía fructífera para comenzar a explorar la función biológica de una proteína de interés es identificar qué otras proteínas interactúa con en su contexto fisiológico. Caracterización de las redes moleculares de esta manera proporciona información detallada sobre los procesos biológicos que subyacen al fenotipo humano.

La proyección a gran escala de uso más frecuente se acerca para la identificación de los compañeros de interacción candidatos para las proteínas de interés son la levadura de dos híbridos de ¹ y proteómica basada en la espectrometría de masas ^2. Estos métodos pueden ser muy exitosos en lo que sugiere que interactúan las proteínas potenciales, pero are vulnerable a resultados positivos falsos. Por lo tanto, la confirmación de una interacción identificado por levadura de la espectrometría de masas de dos híbridos o requiere la validación de la interacción utilizando una segunda técnica. Normalmente, un co-inmunoprecipitación o ensayo de pull-down se utiliza para este fin ^3. Una desventaja del uso de tales técnicas para la validación es el requisito para la lisis celular, que destruye las condiciones intracelulares que pueden ser esenciales para el mantenimiento de ciertas interacciones proteína. Una segunda desventaja es que las interacciones débiles o transitorios de proteína pueden ser interrumpidos durante los pasos de lavado. Además, estos ensayos exigen práctica en tiempo significativos, están limitados en el número de muestras que se pueden procesar de forma simultánea, y a menudo requieren la optimización de tiempo de los reactivos y protocolos.

Para superar algunos de los problemas asociados con experimentos de co-inmunoprecipitación, varios ensayos se han desarrollado sobre la base de fluorescente y bioluminescent proteínas que se pueden utilizar en células vivas. El primero de estos ensayos se basan en la fluorescencia (o Förster) Transferencia de energía de resonancia (FRET), la transferencia no radiante de energía entre dos proteínas fluorescentes con la superposición de espectros de emisión y de excitación ^4. La eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, por lo tanto, la observación del fenómeno de FRET requiere que los fluoróforos donador y aceptor estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés, una proteína se expresa como una fusión con el fluoróforo donante (proteína fluorescente cian comúnmente; PPC) y el segundo como una fusión con el fluoróforo aceptor (proteína fluorescente amarilla comúnmente; YFP). Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar a los donantes y aceptor fluoróforos suficientemente próximos para que se produzca la transferencia de energía, lo que resultará en un aumento mensurable en la emisión de luz desde el aceptor YFP en relación con el donante de la PPC. FRET ha tenido éxito en la detección de interacciones proteína-proteína en células vivas ^4. El principal inconveniente del uso de FRET para la detección de interacciones proteína-proteína es el requisito para la iluminación externa para la excitación del fluoróforo donante. Resultados de la iluminación interior en gran fondo en la señal de emisión, excitación no deseada del aceptante, y fotoblanqueo del donante y aceptor fluoróforos. Estos efectos reducen la sensibilidad del ensayo para la detección de interacciones proteína-proteína.

Una modificación del ensayo de FRET, que supera el problema de alto fondo de la iluminación externa es la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) ^5,6 ensayo. En el sistema de BRET el fluoróforo donante se sustituye por una enzima luciferasa. Así, la energía para la excitación del fluoróforo aceptor se genera dentro del sistema por la oxidación de un sustrato de luciferasa, lo que hace innecesaria la iluminación externa. En el másconfiguración común de este ensayo, el donante es luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es YFP (para una discusión de la alternativa de donantes y aceptores de proteínas ver Pfleger et al. ^5). De acuerdo con ello, en este sistema, una proteína de interés se fusiona con una proteína luciferasa y potencialmente interactuar a YFP, o viceversa. El ensayo BRET requiere la adición de coelenterazina como sustrato para la luciferasa. Debido a que la coelenterazina es permeable a las células, es posible llevar a cabo ensayos de BRET en células vivas. Sin embargo, coelenterazina nativa es inestable en solución acuosa, y el desglose-enzima independiente de coelenterazina tanto reduce la concentración de sustrato disponible para el ensayo y genera autoluminiscencia, lo que reduce la sensibilidad de las mediciones de la actividad de luciferasa. El uso de BRET en células vivas ha sido facilitado por el desarrollo de coelenterazines protegidas, que son estables en solución acuosa, pero se escinden por esterasas citosólicass después de la difusión a través de la membrana de la célula para generar coelenterazina activo dentro de la célula ^7.

Después de la adición de sustrato a las células que expresan luciferasa y las proteínas de fusión-YFP, la transferencia de energía resultante de las interacciones proteína-proteína se cuantificó mediante el control de la emisión de la luciferasa y YFP. Debido a las interacciones de proteínas se pueden monitorizar directamente en células vivas en placas de múltiples pocillos, el ensayo BRET constituye un método simple y escalable para la validación de las interacciones putativo que es el costo y eficiente en el tiempo.

Además de validar interactores putativos identificados en estudios de cribado proteómicos, el sistema de BRET también se puede utilizar para candidatos a elementos interactuantes prueba de derivados de estudios bioquímicos y estructurales previas sobre la proteína de interés. Una vez que la existencia de una interacción proteína-proteína se ha establecido (ya sea usando el ensayo BRET o por otras técnicas), existe un potencial para el ensayo BRET para ser EMPLoyed más para caracterizar la interacción. Por ejemplo, las regiones que interactúan se pueden asignar mediante la generación de versiones truncadas de las proteínas, y la participación de residuos específicos en la interacción se puede demostrar mediante la creación de mutaciones puntuales. Además, el efecto modulador de modificaciones postraduccionales o pequeñas moléculas (tales como fármacos o ligandos) sobre las interacciones proteína-proteína puede ser investigado ^8-10.

El ensayo BRET también tiene un gran potencial para la investigación de mutaciones identificadas en el ADN del paciente. En los casos en que se ha establecido un papel causal para una mutación, estudiar el efecto de la mutación en las interacciones proteína-proteína utilizando BRET puede revelar más acerca de la etiología molecular de la fenotipo ^11. Desde el advenimiento de las metodologías de secuenciación de próxima generación, cada vez es más común para varias mutaciones potencialmente dañinos que se identifiquen dentro de un individuo, en cuyo caso no está claro cuáles son releVant para el fenotipo ^12. En esta situación el ensayo BRET puede ser valiosa en la evaluación del impacto de las mutaciones en la función de las proteínas y, por tanto, su importancia para el trastorno.

Protocol

1. Creación de plásmidos

1. Subclonar el ADNc para cada proteína de interés en ambos los vectores pluc y pYFP, ​​utilizando técnicas estándar de biología molecular (Figura 1). Para ver protocolos detallados Green et al ^13.
2. Secuencia de todos los constructos para verificar que las proteínas de interés están en marco con la secuencia de Luc / YFP sin codones de parada intermedios.
3. Realizar ensayos funcionales como se desee para confirmar que las proteínas de fusión conservan su actividad biológica. En el caso que aquí se presenta la localización subcelular de las proteínas de fusión YFP se determinó por microscopía de fluorescencia.
4. Hacer plásmidos de expresión de las proteínas de control apropiadas Luc y YFP mediante el diseño de las señales de orientación pertinentes en los vectores de expresión pLUC y pYFP. En el caso que aquí se presenta, generar constructos Luc y YFP-nucleares dirigida por la inserción de una señal de localización nuclear en los vectores pLUC y pYFP.
5. Haceruna construcción de control positivo en el que Luc y YFP se funden en un único polipéptido. En el caso que aquí se presenta, generar un control positivo en el que se inserta la secuencia de codificación de YFP en el vector pLuc.
6. Seleccionar un plásmido de relleno neutro para ser utilizado para igualar la masa de ADN en las mezclas de transfección. Utilice un plásmido que no tiene promotor eucariota y por lo tanto será transcripcionalmente inactivo en células de mamífero, tales como un vector de clonación bacteriana.

2. Preparación de ADN Mezclas

1. Estimar la concentración de todos los plásmidos descritos en la Sección 1 basado en la absorbancia a 260 nm (1 unidad de absorbancia es equivalente a 50 g / ml de ADN). Determinar la masa molecular de cada plásmido de multiplicar el número de pares de bases por 650 Da. Utilice la concentración y masa molecular para calcular la concentración molar de cada preparación de plásmido. Diluir las preparaciones de ADN de plásmido a una concentración de 36 nM. Estas serán las reservas de trabajoque se usan para preparar las mezclas de ADN para la transfección.
2. Preparar una mezcla de ADN de control que contiene 1.800 ng de plásmido de relleno en un volumen final de 20 l de agua.
3. Prepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de la construcción-el control pLuc. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
4. Preparar una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de constructo de control de pLuc y 5 l de constructo de control de pYFP. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
5. Prepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de construcción de control positivo. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
6. Prepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de homodimerización de una proteína de interés, X. Para cada mezcla de ADN combinar 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construir. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
   A)-Control pLuc y pYFP-X
   B) pLuc-X y control pYFP
   C) pLuc-X y X-pYFP
7. Prepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de una interacción entre un par de proteínas de interés, X e Y. Para cada mezcla de ADN se combinan 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construyen. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
   A)-Control pLuc y pYFP-X
   B) pLuc-X y control pYFP
   C) de control de pLuc y pYFP-Y
   D) pLuc-Y y-control de pYFP
   E) pLuc-X e-Y pYFP
   F) pLuc-Y y pYFP-X

3. Transfección

1. Harvest Subconfluent células HEK293 de un frasco de 75 ^cm2. Diluir 10% del total de células en 13 ml de medio de cultivo. Dispensar 130 l de suspensión celular en cada pocillo de un blancofondo transparente de 96 pocillos placa de cultivo de tejidos. Cultivar las células durante 24 horas.
2. Calcular el número de pozos a ser transfectadas multiplicando el número de mezclas de ADN por 3. Traer medio de cultivo libre de suero a temperatura ambiente. Preparar una mezcla maestra que contiene 6,3 l de medio libre de suero y 0,18 l de reactivo de transfección por pocillo. Mezclar por agitación e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Preparar las mezclas de transfección mediante la adición de 2 l de mezcla de ADN a 20 l de medio / transfección mezcla maestra reactivo libre de suero. No vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Transfectar tres pozos con cada mezcla de transfección dispensar 6,5 l de mezcla de transfección por pocillo. Cultivar las células de un 36 a 48 horas más.

4. Medición de la señal BRET

1. Disolver sustrato de luciferasa de células vivas a 34 mg / ml en DMSO por vórtex.
2. Diluir sustrato de luciferasa de células vivas reconstituido a 1:1.000 en sustrato dilución medio pre-calentado a 37 ° C. Permitir 50 l de medio de dilución de sustrato por pocillo. Vortex para mezclar. Puede formarse un precipitado, pero no va a interferir con el ensayo.
3. Aspirar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos. Dispensar 50 l de sustrato de luciferasa de células vivas diluido en cada pocillo. Células de cultivo durante al menos 2 horas (hasta 24 horas).
4. Retire la tapa de la placa de 96 pocillos y se incuba la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente en el interior del luminómetro.
5. Medida de emisión de Luc y YFP un pozo a la vez. Medida de emisión de Luc usando un filtro de bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm. Medida de emisión de YFP utilizando un filtro de paso de banda de 500-600 nm. Integrar las señales de emisión durante 10 s.

5. Análisis de Datos

1. Promedio de las lecturas de emisión Luc de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones Luc para producir los valores de emisión de Luc fondo-resta.
2. Promedio de las lecturas de emisión de YFP de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones YFP para producir los valores YFP emisión de fondo-resta.
3. Para cada pocillo, se divide el YFP valor de fondo-resta la emisión por el valor Luc fondo-resta de emisión para dar la relación de BRET sin corregir.
4. La media de los coeficientes de BRET no corregidas de los tres pozos que fueron transfectadas con sólo el plásmido de control pLuc. Restar este valor de todas las otras relaciones de BRET no corregidos para dar las proporciones de BRET corregidos.
5. Para cada uno de los restantes conjuntos de relaciones de BRET corregidos, el promedio de los valores de los tres pozos transfectadas para obtener una relación BRET final.

Representative Results

El principio del ensayo BRET se ilustra en la Figura 2. La configuración de ensayo utilizado a través de los experimentos presentados aquí se representa en la figura 3. La detección de una señal BRET fuerte a partir de células transfectadas con una proteína de fusión luciferasa-YFP confirmó que la transferencia de energía era observable en este montaje experimental (Figura 4).

Nuestra investigación se centra en el papel de la familia FOXP de represores transcripcionales en el desarrollo del cerebro. Mutaciones heterocigotas afectan plomo FOXP2 a una rara forma de expresión y el trastorno del lenguaje, de las cuales el elemento más destacado es la dispraxia verbal-la dificultad del desarrollo con la producción de las complejas secuencias de movimientos musculares necesarios para el habla orofocial ^14-16. FOXP1 mutaciones se han reportado en pacientes con trastornos del espectro del autismo y discapacidad intelectual acompañados de problemas de lenguaje ^17-20 voz grave y. La interacción de FOXPs con otras proteínas se está investigando para obtener información sobre los mecanismos moleculares relacionados con el papel de estas proteínas en el desarrollo del cerebro.

FOXP2 se conoce para formar homo-o heterodímeros con otros miembros de la familia FOXP ^21, por lo tanto, se utilizó el FOXP2 homodimerización para validar el ensayo BRET (Figura 4). Para excluir la posibilidad de que la interacción de proteínas de fusión FOXP2 en este ensayo era debido simplemente a la sobreexpresión de la proteína, la especificidad de la interacción se demostró mediante la introducción de una mutación en el dominio de dimerización de cremallera de leucina de FOXP2 (deleción en marco de residuo E400), el cual se conoce para interrumpir homo-y heterodimerización ²¹ (Figura 5A). Cuando las proteínas de fusión Luc-FOXP2.DE400 y YFP-FOXP2 se co-expresaron, se observó una reducción en la señal de BRET en comparación a cuando Luc-FOXP2 y YFP-FOXP2 se co-expresaron (Figura 5B). Esto sireducción gnal no era debido a una alteración en la localización subcelular de la proteína mutante (Figura 5C) o a una diferencia en los niveles de expresión tal como se evaluó por el Western Blot (datos no mostrados). También se observó la reducción de la señal cuando Luc-FOXP2 se expresó con YFP-FOXP2.DE400 (datos no mostrados). Por lo tanto BRET es eficaz en la detección de la homodimerización de proteínas, y la interacción de proteínas sigue siendo específico cuando estas proteínas se sobreexpresa como YFP-fusiones de la luciferasa-y. Además, el uso de BRET en combinación con mutación dirigida de proteínas tiene el potencial de identificar los residuos individuales involucrados en interacciones proteína-proteína.

Para evaluar la eficacia del ensayo BRET en la detección de interacciones heterotípicas, la interacción de FOXP2 con FOXP1 fue probado (Figura 6). Se observó una señal de BRET en ambas configuraciones posibles del ensayo (es decir, con el FOXP2 como el donante o aceptor como la fusioN proteína). Por lo tanto el ensayo BRET es capaz de detectar tanto homo-y las interacciones heterotípicas. Además, la idoneidad del ensayo BRET para detectar la interacción de FOXP2 con proteínas no-FOXP se puso a prueba mediante el examen de la interacción con CtBP1, un co-represor transcripcional y conocida pareja de interacción FOXP2 ^21. La interacción entre CtBP1 y FOXP2 se sugirió originalmente por una pantalla de dos híbridos de levadura y posteriormente fue validada por experimentos de co-inmunoprecipitación ^21. La interacción FOXP2-CtBP1 se detectó mediante el ensayo BRET cuando FOXP2 era la proteína de fusión donante y CtBP1 era el aceptor, pero no en la configuración inversa (Figura 7A). Estos resultados son de esperar con el sistema BRET (ver sección de debate). Se observó la interacción entre el FOXP2 y CtBP1 a pesar de que solamente una proporción menor de CtBP1 se localizó en el núcleo (Figura 7B), destacando la sensibilidad de este ensayo. Así, la BRETensayo es útil para la validación de putativo interacciones identificadas a través de dos híbridos de levadura.

Por último, se empleó el ensayo BRET para examinar los efectos de las mutaciones patógenas en el gen FOXP2 en las interacciones proteína-proteína. Se han reportado dos mutaciones puntuales en el gen FOXP2 para causar un trastorno autosómico dominante poco frecuente que afecta el habla y el lenguaje (Figura 8A). La mutación missense R553H fue descubierto a través de un estudio de ligamiento en una familia numerosa en la que la mitad de los miembros se vieron afectados por el trastorno ^14. La mutación sin sentido R328X fue descubierto a través de la secuencia específica del locus FOXP2 en probandos con un diagnóstico de dispraxia verbal del desarrollo ^22. La capacidad de las proteínas mutantes para dimerizar con el tipo salvaje FOXP2 se evaluó mediante el ensayo BRET. Los resultados utilizando de tipo salvaje FOXP2 como un donante y el FOXP2 mutante como el aceptor se muestran en la Figura 8B. Los mismos resultados se observaron utilizando mFOXP2 utant como el donante y de tipo salvaje como el aceptor (datos no mostrados). La mutación R553H, que está dentro del dominio de unión a ADN de FOXP2, no afectó a la capacidad de la proteína mutante para dimerizar con la de tipo salvaje. Por consiguiente, el mecanismo patogénico de esta mutación puede incluir un efecto negativo dominante resultante de la dimerización del mutante con la proteína normal ^23. La mutación R328X introduce un codón de parada prematuro, con el resultado de que la proteína codificada carece del dominio de dimerización de cremallera de leucina y el dominio de unión a ADN, y muestra algunos mislocalization citoplásmica (Figura 8C). En consonancia con la ausencia del dominio de dimerización y mislocalization al citoplasma, la proteína truncada muestra reduce en gran medida la interacción con el tipo salvaje FOXP2. Esta mutación es por lo tanto probable que sea patógena debido a la haploinsuficiencia. Por lo tanto el ensayo BRET puede dar una idea de los efectos biológicos de mutaciones descubiertas en los pacientes.

Figura 1. Los vectores para la expresión de proteínas YFP-y luciferasa-fusión. A) Los mapas Círculo de los vectores pYFP y pLUC. El vector pLuc se utiliza para la expresión de proteínas de fusión de luciferasa como donantes BRET. El vector pYFP se utiliza para la expresión de proteínas de fusión YFP como aceptadores de BRET. Vectores tienen un promotor de CMV (P _CMV) para la expresión de alto nivel en células de mamífero, un sitio de clonación múltiple (MCS) para la inserción de ADNc para las proteínas de interés, y un gen de resistencia a la kanamicina (Kan ^R) y origen de replicación bacteriano para la propagación de el plásmido en bacterias. B) sitio de clonación múltiple de los vectores pluc y pYFP. El final de la secuencia de codificación de YFP se muestra en azul. Sitios de restricción seleccionados están anotados. Tenga en cuenta que el sitio Xba I es bloqueado por OVErlapping metilación Dam en cepas estándar de E. coli. ADNc que codifican para las proteínas de interés deben ser clonados en marco con la secuencia de aminoácidos mostrada. En los experimentos descritos aquí, los insertos se clonaron en los sitios de restricción Bam HI y Xba I (subrayado). Los codones de parada se han eliminado de la final de la luciferasa y YFP secuencias para proporcionar un marco de lectura abierto que abarca la luciferasa / YFP y se subclonó ADNc codificante de interés. Los codones de parada están presentes en el extremo del sitio de clonación múltiple en los tres marcos de lectura (mostrados en rojo), por lo tanto, no es esencial incluir un codón de parada en el ADNc insertado.

Figura 2. Principio del sistema de BRET. Las proteínas de interés, X e Y, se fusionan a una enzima luciferasa donante (Luc, emisión máxima 475 nm) y una proteína aceptora fluorescente (YFP, pico de emisión 530 nm), respectivamente. Las proteínas de fusión se expresan en células de mamífero en cultivo y después de la adición de un sustrato de luciferasa-permeable a las células, la emisión de Luc se mide usando un filtro de bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm y emisión de YFP se mide usando un filtro de paso de banda de 500-600 nm. A) no se produce ninguna interacción entre la proteína X y proteína de transferencia de Y. La energía del Luc a YFP. B) La interacción entre la proteína X y proteína de transferencia de energía de resonancia se produce a partir de Y. Luc a YFP causando un aumento en la proporción de emisión medida utilizando el filtro de paso de banda de 500-600 nm en comparación con el bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm el filtro.

Figura 3. Instalación de ensayo. La preparación de las pruebas para la prueba deuna interacción entre dos proteínas de interés, X e Y. Las proteínas de interés se fusionan con la luciferasa (Luc) como el donador de BRET y proteína fluorescente amarilla (YFP) como aceptor de BRET. En las proteínas de control, Luc y YFP se fusionan a un péptido que contiene una señal de orientación para el compartimento subcelular relevante (P), en su caso. A) Controles que se incluirán en cada placa. 1) Control de Mock-transfección para establecer los niveles de fondo de luminiscencia y fluorescencia resultante de ruido luminómetro y la descomposición enzimática independiente del sustrato; 2) de control de pLuc sólo transfección para establecer la proporción de emisión de la luciferasa que se detecta dentro de la gama de emisión de YFP en ausencia de un aceptor de BRET; 3) La transfección de control pLuc y control pYFP para establecer la línea base de la señal BRET resultante de la interacción Luc-YFP; 4) La transfección de fusión Luc-YFP como control positivo para asegurar que una señal BRET se puede medir. B) Juego de experimentales condiciones para poner a prueba para la interacción entre dos proteínas de interés, X e Y. 1, 2, 4, 5) Controles para la interacción no específica entre las proteínas de interés y Luc / YFP; 3) condiciones de prueba con X como el donante e Y como aceptor; 6) condiciones de prueba con Y como el donante y X como el aceptor.

Figura 4. Detección de homodimerización FOXP2. A) Para validar el ensayo BRET para la detección de homodímeros FOXP2, las células HEK293 se transfectaron con las construcciones para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a ya sea el FOXP2 (P2) o una señal de localización nuclear (-). La luciferasa nucleares específicos y proteínas YFP sirven como controles negativos. Como control positivo para la detección de una señal de BRET, las células también fueron transfectadas con un constructo para la expresión de una luciferasa-YFImágenes proteína P de fusión (+) B) microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a una señal de localización nuclear (-.) O con YFP fusionado a FOXP2 (P2).

Figura 5. Utilizar de FOXP2-dimerización deficientes para demostrar la especificidad del ensayo. A) Representación esquemática de la proteína FOXP2 que muestra la posición de la mutación DE400, que altera la dimerización. El dominio de dimerización de cremallera de leucina se muestra en verde y el dominio de unión al ADN en amarillo. B) Para probar si la sobreexpresión de las proteínas puede dar lugar a resultados falsos positivos en el ensayo BRET, la especificidad del ensayo se evaluó mediante la FOXP2.DE400 variante. Las células fueron transfectadas con las construcciones para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) o un nucleaImágenes c) microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a FOXP2 (P2) o al FOXP2.DE400 (DE) - señal de localización r ()..

Figura 6. Detección de heterodimerización-FOXP1 FOXP2. A) Para validar el ensayo BRET para la detección de la heterodimerización entre las proteínas homólogas FOXP2 y FOXP1, las células fueron transfectadas con constructos para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a ya sea el FOXP2 (P2), de FOXP1 (P1), o imágenes B) microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a FOXP1 (P1) o a FOXP2 (P2) - una señal de localización nuclear ()..

B) Imágenes de microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a CtBP1 (CtBP) o para FOXP2 (P2).

Figura 8. Evaluación de los efectos de las mutaciones patógenas FOXP2 en interacciones proteína-proteína. A) Representación esquemática de la proteína FOXP2 que muestra las posiciones de las mutaciones R553H y R328X que causan una fo rararm de expresión y trastorno del lenguaje. El dominio de dimerización de cremallera de leucina se muestra en verde y el dominio de unión al ADN en amarillo. B) Evaluar la utilidad del ensayo BRET para evaluar el impacto de las mutaciones patológicas en las interacciones proteína-proteína, los efectos de las mutaciones R553H y R328X en Se examinó la capacidad de las proteínas mutantes FOXP2 a dimerizar con FOXP2 normal. Las células fueron transfectadas con las construcciones para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a ya sea el FOXP2 normal (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), o una señal de localización nuclear (-). C ) Imágenes de microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionan a FOXP2.R553H (R553H) o para FOXP2.R328X (R328X). En esta imagen FOXP2.R328X es predominantemente nuclear, pero en otras células dentro de la población muestra una distribución más citoplasmática.

Discussion

El diseño de las construcciones de expresión de la proteína de fusión es un paso fundamental en la creación del ensayo BRET. En los experimentos presentados aquí, las proteínas de interés se fusionan con el extremo C-terminal de la luciferasa o YFP. También es posible, y puede ser necesario, para fusionar proteínas a la N-terminal de luciferasa / YFP. Para algunas proteínas, las fusiones sólo podrán aceptarse en el extremo N-o C-terminal con el fin de evitar la interrupción de la estructura y función de proteínas. Además, para las proteínas transmembrana en el que el N y C terminales residen en diferentes compartimentos subcelulares, la proteína luciferasa / YFP debe ser fusionada al extremo que está en el mismo compartimento que la pareja de interacción. Por ejemplo, en los estudios de las interacciones entre proteína G transmembrana y citoplasmática receptores acoplados β-arrestina, la luciferasa se ​​fusionó a la cola carboxilo intracelular del receptor transmembrana ^8. En otros casos la geometría de un interacti proteína-proteínael puede dar lugar a la transferencia de energía es más eficiente el uso de una de las dos posibles combinaciones de proteínas de fusión. De vez en cuando la transferencia de energía no puede ser detectado en absoluto si el uso de una sola combinación, lo que lleva a resultados negativos falsos.

La secuencia del enlazador peptídico entre luciferasa / YFP y la proteína de interés también puede afectar a la eficiencia de la transferencia de energía de resonancia. El enlazador debe ser lo suficientemente largo para permitir que la luciferasa / YFP y la proteína de interés se plieguen sin obstáculos. Un enlazador más largo será impartir una mayor flexibilidad para el polipéptido en la unión entre la luciferasa / YFP y la proteína de interés, lo que puede aumentar la eficiencia BRET facilitando la alineación de los dipolos donante y aceptor. Sin embargo, la eficiencia BRET puede disminuir si hay demasiada flexibilidad en el enlazador. En los experimentos aquí, la clonación de las proteínas de interés en los sitios BamH I y Xba I de la expresión VECtores dieron como resultado un enlazador de 23 aminoácidos, como se muestra en la Figura 1. Este enlazador ha sido exitoso para la detección de interacciones entre varios pares de proteínas.

Antes de proceder a Bret experimentos se debe velar por que las proteínas de fusión retienen la actividad biológica normal. El funcionamiento de YFP se puede evaluar mediante visualización directa utilizando un microscopio de fluorescencia. El funcionamiento de la luciferasa se puede ensayar usando kits disponibles comercialmente. El efecto de la fusión en la localización subcelular de las proteínas de interés se puede evaluar mediante inmunotinción, o en el caso de YFP-fusiones, por visualización directa. El efecto de la fusión en la función de la proteína de interés puede ser investigada mediante ensayos específicos de proteína - por ejemplo, para un factor de transcripción puede ser apropiado para ensayar la actividad de unión al ADN. Tenga en cuenta que las mediciones de luminiscencia realizadas durante el experimento proporcionan conveniente confirmar en-ensayoción de la actividad de la luciferasa.

Es importante tener en cuenta lo que las construcciones de control adecuados para su proteína de interés. YFP y luciferasa son predominantemente citoplasmática y son, por tanto, los controles apropiados cuando las proteínas de interés son citoplasmática. Sin embargo, cuando las proteínas de interés se localizan en otros compartimentos subcelulares, puede ser deseable modificar la luciferasa y YFP con señales de péptidos para dirigir su tráfico al compartimiento relevante. Aquí las proteínas de interés fueron los factores de transcripción que están localizados en el núcleo, por lo tanto, la luciferasa y YFP fueron modificados por la adición de una señal de localización nuclear. Específicamente, un péptido que incluye la señal de localización nuclear del antígeno T grande de SV40 (CGYGPKKKRKVGGLDN) se añade al extremo C-terminal de la luciferasa y YFP por ligación de oligonucleótidos de doble cadena sintéticos entre el Bam HI y Xba I sitios de thvectores e pLUC y pYFP. La adición de esta señal causó una redistribución significativa de la proteína al núcleo (Figura 4B).

Incluyendo los controles adecuados es crucial para la interpretación de los experimentos de BRET. Un control maqueta transfección utilizando un plásmido de relleno inerte es esencial para establecer los niveles de fondo de luminiscencia y fluorescencia resultante de ruido luminómetro y la descomposición enzimática independiente del sustrato. Con luminómetros modernas y sustratos luciferasa niveles de luminiscencia de fondo son típicamente muy baja. Transfección con la luciferasa de control apropiado construir en la ausencia de un constructo de YFP es importante establecer la proporción de emisión de la luciferasa que se detecta dentro de la gama de emisión de YFP en ausencia de un aceptor de BRET. La transfección con la luciferasa de control y el control YFP construye proporciona la señal BRET línea de base que resulta de la interacción Luc-YFP. Para vísperary par de proteínas que se ponen a prueba para la interacción, es importante para transfectar cada uno a solas con la construcción de control adecuado, como se ilustra en la Figura 3B, de controlar para cualquier interacción no específica entre las proteínas que se están probando y luciferasa / YFP. Particularmente cuando se realiza un experimento de BRET, por primera vez, es importante incluir una proteína de fusión Luc-YFP como control positivo para asegurar que una señal de BRET es observable en su configuración experimental. Aquí la secuencia de codificación de YFP se clonó en pLuc en los sitios Bam HI y Xba I para generar una proteína de fusión en la que YFP se fusiona con el extremo C-terminal de la luciferasa.

En el protocolo descrito aquí, la composición de la mezcla de ADN para la transfección se calculó con el supuesto de que el tamaño medio de la proteína de fusión Luc / YFP construcciones de expresión no es mayor que 7,5 kb. Si la construcción de expresiónTS son significativamente más grandes que esto, entonces el número de moles de cada constructo de expresión añadido a la mezcla de transfección puede tener que ser reducido para que la cantidad total de ADN en la mezcla no exceda el máximo permitido por la cantidad de reactivo de transfección. Alternativamente, la cantidad de reactivo de transfección y la cantidad de ADN en todas las mezclas de transfección se puede aumentar siguiendo las directrices del fabricante. Manipulación experimental de placas de 96 pocillos se acelera por el uso de pipetas multicanal y aspiradores. Es deseable minimizar la variación entre las muestras en la longitud de tiempo de transfección de incubación de la mezcla después de la adición del ADN al medio / transfección mezcla de reactivo libre de suero, comienza a partir de la adición de las mezclas de transfección a las células tan pronto como la primera mezcla se ha de incubar durante 10 min . Debido a que las proteínas aceptoras BRET son YFP fusiones, es posible evaluar la eficacia de transfección por microscopía de fluorescencia o mediante la medición de la fluorescencia en una microplaca de reAder. El éxito de un experimento de BRET depende de un buen nivel de transfección lo que es aconsejable para garantizar que la transfección es satisfactoria antes de proceder a la adición de sustrato y la medición de la señal de BRET. La etiqueta YFP también permite la cuantificación de los niveles de expresión de proteínas aceptor usando un lector de microplacas. La cuantificación de los niveles de proteína aceptora puede ser útil para la optimización y resolución de problemas de los experimentos de BRET.

Las células deben ser incubadas durante al menos 2 h con sustrato de luciferasa antes de medir la señal de BRET para asegurar que una señal estable se ha logrado. También es aceptable para incubar las células con el sustrato durante un máximo de 24 h. En este caso los recuentos totales de luminiscencia será menor, pero las relaciones de BRET deben ser sin cambios. Incubaciones más largas con sustrato pueden ser más conveniente (por ejemplo, durante la noche) y también permitir la medición de señales de BRET antes y después de una manipulación experimental talescomo la adición de un compuesto farmacéutico. Idealmente, optimizar la densidad de la siembra de células de modo que las células alcanzan la confluencia alrededor del momento de la medición. Si la densidad celular es óptima por encima de entonces puede ser ventajoso medir la señal de BRET en un punto de tiempo anterior para evitar el crecimiento excesivo de células. Si se utiliza un tipo de célula que no sea HEK293, asegúrese de optimizar cultivo de células y transfección condiciones. BRET experimentos también se han realizado con éxito en células HeLa utilizando el protocolo descrito aquí.

En los experimentos descritos aquí, se midieron los recuentos de luminiscencia a temperatura ambiente, que es la temperatura óptima para la actividad de luciferasa de Renilla. Si se realiza un experimento de evolución temporal en el luminómetro es preferible ajustar la temperatura a 37 ° C. Hemos llevado a cabo los mismos experimentos a temperatura ambiente ya 37 ° C y no se observó ninguna diferencia significativa en los resultados. Si la realización de experimentos a temperatura ambiente, the placa se debe permitir que se equilibre 10 min dentro del luminómetro antes de la medición para permitir la estabilización de la actividad de luciferasa de Renilla. Aquí, las señales de luminiscencia se integraron durante 10 s, que típicamente proporciona una alta sensibilidad, especialmente para proteínas con bajos niveles de expresión. Sin embargo, las señales pueden estar integrados en periodos de tiempo más cortos si esto proporciona suficiente sensibilidad. Debido a la estabilidad de la señal de luminiscencia producida por el sustrato de luciferasa de células vivas, es aceptable para medir para un máximo de 10 segundos por pocillo en cada longitud de onda.

Una interacción entre dos proteínas de interés se confirma por el ensayo BRET cuando la señal de la condición de prueba excede significativamente las señales de las condiciones de control pertinentes. La ausencia de una señal de BRET no es necesariamente la confirmación de que una interacción no se produce. En el caso de un resultado inesperado o negativo, la luminiscencia total y fluorescencialos recuentos de NCE deben ser examinados para asegurar que todos los pocillos se transfectaron correctamente.

La señal de BRET también se ve afectada por la relación de los niveles de expresión de proteínas, por lo tanto es útil para examinar los niveles de expresión relativos de las dos proteínas de interés mediante la comparación de las cuentas de fluorescencia de los pozos transfectadas con YFP fusiones de las dos proteínas (o los recuentos de luminiscencia desde pozos transfectadas con las fusiones de luciferasa). Cuando una proteína de fusión se expresa con más fuerza que el otro, mejores resultados son susceptibles de ser obtenido si la proteína con el menor nivel de expresión está fusionado a la luciferasa, que era el caso con el FOXP2 y CtBP1 en los experimentos presentados aquí. También es posible manipular los niveles de proteína mediante el ajuste de la relación molar de plásmidos de expresión en la mezcla de transfección. La transferencia de energía entre ciertos pares de proteínas de fusión puede ser muy ineficiente debido a la geometría del complejo de la proteína. En talescasos puede ser útil para tratar la fusión de las proteínas de interés para el termini alternativa de luciferasa / YFP.

Es necesario confirmar que la señal de BRET representa una interacción proteína-proteína fisiológica y no es simplemente debido a la sobreexpresión de la proteína. Por esta razón, es importante para evitar la sobreexpresión bruto de proteínas. La especificidad de una interacción proteína-proteína en el sistema de BRET más se puede confirmar mediante la introducción de mutaciones en las proteínas que se sabe que reducen la afinidad de la interacción, como se demuestra aquí el uso de la variante de FOXP2 DE400. Las proteínas mutantes se pueden usar además en la competencia y los ensayos de unión de saturación BRET. En un ensayo de competición, las concentraciones de donante y aceptor de proteínas de fusión se mantienen constantes, mientras que el aumento de la concentración de una versión sin etiquetar de una de las parejas de interacción como un competidor. No etiquetado proteína de tipo salvaje debe competir con el v etiquetadoersión para la unión a su pareja de interacción, lo que resulta en una disminución en la señal de BRET, mientras que la proteína mutante debe exhibir una disminución de la capacidad para competir a cabo la interacción. En un ensayo de unión de saturación, la concentración de la proteína de fusión donante se mantiene constante, mientras que el aumento de la concentración del aceptor. Para una interacción específica de la señal BRET eventualmente debería estabilizarse como todas las moléculas donantes se saturan con el aceptor. Para una interacción no específica, la señal de BRET se muestran típicamente un pequeño aumento lineal debido a un aumento en las colisiones aleatorias entre las moléculas donantes y aceptoras. En la práctica, para las interacciones de afinidad moderada entre las proteínas solubles, puede ser difícil lograr un alto aceptor suficiente: relación de donante para observar la saturación al mismo tiempo mantener niveles suficientes de la proteína de donantes para la detección de la señal.

Se debe tener precaución en la interpretación de diferees entre las proporciones de BRET. El ensayo BRET no proporciona una medida cuantitativa de la afinidad de una interacción proteína-proteína debido a la eficiencia de transferencia de energía se ve influenciada por factores distintos de la fuerza de la interacción proteína-proteína. Tales factores incluyen la relación de los niveles de las proteínas de fusión dentro de la célula, la geometría de la interacción, y las tasas de asociación y disociación del complejo. Las relaciones obtenidas con dos pares diferentes de proteínas, por tanto, no pueden necesariamente ser comparados, pero las comparaciones pueden ser posibles entre las diferentes variantes de la misma proteína, tales como con el de tipo salvaje y variantes de ΔE400 FOXP2 mostrados aquí. Ocasionalmente, se pueden observar relaciones de BRET ligeramente negativos. Relaciones negativas pueden dar como resultado a partir del error en la medición de la relación de la línea de base en las células transfectadas con sólo el vector de control de pLuc. Muy altas relaciones son a menudo indicativo de la agregación de proteínas, que puede ser confirmado por la observación de CE transfectadaLLS con un microscopio de fluorescencia. Se debe determinar si la agregación es biológicamente relevante o un artefacto de la sobreexpresión de la proteína.

En conclusión, el ensayo BRET descrito aquí es un enfoque poderoso para investigar las interacciones proteína-proteína en las células vivas. La aplicación de BRET se ha demostrado para los fines de la validación de candidatos a elementos interactuantes a partir de estudios de cribado de proteómica, la identificación de residuos específicos implicados en las interacciones proteína-proteína, y la evaluación de los efectos de las mutaciones encontradas en el ADN del paciente. Dado que las interacciones se detectan en tiempo real sin el requisito para la lisis de células, la señal de BRET se puede medir antes y después de un tratamiento tal como la adición de un compuesto farmacéutico o ligando ^7. El ensayo BRET muestra una gran promesa para el uso en la investigación genómica funcional para evaluar la importancia biológica de las variantes genéticas descubiertas a través de la secuenciación de próxima generación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.