Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Summary

Interaktioner mellan proteiner är grundläggande för alla cellulära processer. Använda Bioluminescence Resonance Energy Transfer, kan interaktionen mellan ett par av proteiner följas i levande celler och i realtid. Vidare kan effekterna av potentiellt patogena mutationer bedömas.

Abstract

Analyser baserade på Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) ger en känslig och tillförlitligt sätt att övervaka protein-proteininteraktioner i levande celler. BRET är den icke-strålningstransport av energi från en "givare" luciferas enzym till en "acceptor" fluorescerande protein. I den vanligaste konfigurationen för denna analys, är givare Renilla reniformis-luciferas och acceptorn är gul fluorescerande protein (YFP). Eftersom effektiviteten i energiöverföring är starkt avståndsberoende, kräver observation av BRET fenomenet att givaren och mottagaren vara i närheten. För att testa en interaktion mellan två proteiner av intresse i odlade däggdjursceller, är ett protein uttrycks som en fusion med luciferas och den andra som en fusion med YFP. En interaktion mellan de två proteiner av intresse kan föra givaren och acceptorn är tillräckligt nära för att energiöverföring skall ske. Jämfört med andra tekniker för att undersöka protein-protein iteractions, den BRET-analysen är känslig, kräver lite praktisk tid och några reagenser, och kan upptäcka interaktioner som är svag, övergående, eller beroende av den biokemiska miljön finns inom en levande cell. Det är därför en idealisk metod för att bekräfta förmodade interaktioner föreslagits av jäst två-hybrid eller masspektrometri proteomik studier, och dessutom är väl lämpad för kartläggning samverkande regionerna, att bedöma effekten av posttranslationella modifieringar på protein-proteininteraktioner, och utvärdera effekten av mutationer som identifierats i patientens DNA.

Introduction

Både klassisk koppling och nästa generations sekvensering analyser av mänskliga sjukdomar avslöjar den kliniska relevansen av proteiner involverade i en rad biologiska banor. Det är ofta så att, före deras identifiering i sådana studier, har det varit lite eller ingen undersökning av den biologiska rollen av dessa proteiner. En fruktbar väg att börja utforska den biologiska funktionen hos ett protein av intresse är att identifiera vilka andra proteiner det interagerar med i dess fysiologiska sammanhang. Karakterisera molekylära nätverk på detta sätt ger insikter i de biologiska mekanismer som ligger bakom människans fenotyp.

Den mest använda storskalig screening metoder för att identifiera kandidatinteraktionspartner för proteiner av intresse är jäst två-hybrid screening ¹ och masspektrometri-baserad proteomik ^2. Dessa metoder kan vara mycket framgångsrik i att föreslå potentiella interagerande proteiner, men are utsatta för falska positiva resultat. Därför är en bekräftelse på en interaktion identifieras av jäst två-hybrid eller masspektrometri screening kräver validering av interaktionen med hjälp av en annan metod. Typiskt en co-immunoprecipitation eller pull-down-analysen används för detta ändamål ^3. En nackdel med att använda sådana tekniker för validering är kravet för cellys, vilket förstör de intracellulära förhållanden som kan vara nödvändigt för att hålla vissa proteininteraktioner. En andra nackdel är att svaga eller transienta proteininteraktioner kan störas under tvättningsstegen. Dessutom är dessa analyser kräver betydande praktisk tid, är begränsade i antalet prover som kan behandlas samtidigt, och kräver ofta tidskrävande optimering av reagenser och protokoll.

För att övervinna några av de problem som är förknippade med co-immunoprecipitation experiment har flera tester utvecklats baserat på fluorescerande och bioluminescent proteiner som kan användas i levande celler. De första analyserna var baserade på fluorescens (eller Förster) resonansenergiöverföring (FRET), den icke-strålande energiöverföring mellan två fluorescerande proteiner med överlappande emissions-och exciteringsspektra ^4. Effektiviteten för energiöverföring är starkt avståndsberoende därför observation av FRET-fenomen kräver att donator-och acceptor-fluoroforer vara i omedelbar närhet. För att testa med avseende på en interaktion mellan två proteiner av intresse, är ett protein som uttrycks som en fusion med donatorfluoroforen (vanligen cyan fluorescent protein, GFP) och den andra som en fusion med acceptorfluoroforen (vanligen gul fluorescerande protein; YFP). En interaktion mellan de två proteiner av intresse kan föra donator och acceptor fluoroforer tillräckligt nära för energiöverföring att ske, vilket kommer att leda till en mätbar ökning av utsläpp av ljuset från YFP acceptor i förhållande till den gemensamma fiskeripolitiken donatorn. FRET har varit framgångsrik i att upptäcka protein-proteininteraktioner i levande celler ^4. Den huvudsakliga nackdelen med användning av FRET för att detektera protein-proteininteraktioner är kravet på extern belysning för excitering av donatorfluoroforen. Ytterbelysning ger hög bakgrund i emissionssignalen, oönskad excitation av acceptor, och fotoblekning för både givare och acceptor fluoroforer. Dessa effekter minskar känsligheten hos analysen för att detektera protein-proteininteraktioner.

En modifiering av FRET-assay, som övervinner problemet med höga bakgrunden från ytterbelysning är Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-analys ^5,6. I BRET systemet donatorfluoroforen är ersatt med en luciferas-enzymet. Sålunda energin för exciteringen av acceptorfluoroforen alstras inom systemet genom oxidation av ett luciferas-substrat, vilket gör ytterbelysning onödig. I den mestvanlig konfiguration av denna analys, som är givare Renilla reniformis-luciferas och acceptorn är YFP (för en diskussion av alternativa donator-och acceptor-proteiner se Pfleger et al. ^5). Följaktligen, i detta system är ett protein av intresse smält till luciferas och ett potentiellt interagerande protein till YFP, eller vice versa. Den BRET-analysen kräver tillsats av coelenterazine som substrat för luciferas. Eftersom coelenterazin är cell-permeabel, är det möjligt att utföra BRET analyser i levande celler. Emellertid är nativt coelenterazine instabil i vattenlösning, och enzymet oberoende uppdelning av coelenterazin både reducerar koncentrationen av substratet tillgängligt för analysen och genererar autoluminescence, vilket minskar känsligheten hos mätningar av luciferasaktivitet. Användningen av BRET i levande celler har underlättats genom utvecklingen av skyddade coelenterazines, vilka är stabila i vattenlösning men klyvs av cytosolisk esterass efter diffusion över cellmembranet för att generera aktiv coelenterazine inuti cellen ^7.

Efter tillsats av substrat till celler som uttrycker luciferas-och YFP-fusionsproteiner, är energiöverföringen till följd av protein-proteininteraktioner kvantifierades genom övervakning av utsläpp från luciferas och YFP. Eftersom proteininteraktioner kan övervakas direkt i levande celler i flerbrunnsplattor, utgör BRET-analysen en enkel, skalbar metod för validering förmodade interaktioner som är kostnads-och tidseffektivt.

Förutom att validera förmodade interactmedlemmar identifierats i proteomic screeningstudier kan BRET systemet också användas för att testa kandidatinteragerande som härrör från tidigare kända biokemiska och strukturella studier av proteinet av intresse. Så snart det finns en protein-proteininteraktion har fastställts (antingen genom att använda BRET analysen eller genom andra tekniker), det finns potential för BRET analysen för att vara anstlegerade ytterligare karaktärisera interaktionen. Till exempel kan de samverkande regionerna kartläggas genom att generera stympade versioner av proteinerna, och medverkan av specifika rester i interaktionen kan visas genom att skapa punktmutationer. Vidare kan den modulerande effekten av posttranslationella modifieringar eller små molekyler (såsom läkemedel eller ligander) på protein-proteininteraktioner undersökas ^8-10.

Den BRET-analysen har också stora möjligheter att utreda mutationer som identifierats i patientens DNA. I fall där en orsakande roll för en mutation har fastställts, att studera effekten av mutationen på protein-protein-interaktioner med användning BRET kan avslöja mer om den molekylära etiologin av fenotypen ^11. Sedan tillkomsten av nästa generations sekvenseringsmetoder, är det allt vanligare att flera potentiellt skadliga mutationer kan identifieras inom en individ, i vilket fall det är oklart vilka är relevantavanta till fenotypen ^12. I denna situation BRET analysen kan vara värdefullt för att utvärdera effekten av mutationer på proteiners funktion och därmed deras relevans för sjukdom.

Protocol

1. Skapande av plasmider

1. Subklona cDNA för varje protein av intresse i både de pLuc och pYFP vektorerna, med hjälp av standardmässiga molekylärbiologiska tekniker (Figur 1). För detaljerade protokoll se Green m.fl. ^13.
2. Sekvens alla konstruktioner för att kontrollera att de proteiner av intresse är i ram med Luc / YFP sekvens utan några mellanliggande stoppkodoner.
3. Utför funktionella analyser som önskas för att bekräfta att fusionsproteinerna bibehåller biologisk aktivitet. I det fall som presenteras här den subcellulära lokaliseringen av YFP-fusionsproteiner fastställdes genom fluorescensmikroskopi.
4. Gör uttrycksplasmider för lämpliga Luc och YFP kontrollproteiner genom att konstruera och tillverka de relevanta inriktningssignalerna i pLuc och pYFP expressionsvektorer. I det fall som presenteras här, genererar nukleära inriktade Luc och YFP-konstruktionerna genom att sätta in en nukleär lokaliseringssignal i pLuc och pYFP vektorer.
5. Gören positiv kontroll konstruktion där Luc och YFP är sammansmälta till en enda polypeptid. I det fall som presenteras här, generera en positiv kontroll vid vilken YFP-kodande sekvensen sätts in i pLuc vektorn.
6. Välj ett neutralt fyll plasmid som skall användas för att utjämna massan av DNA i transfektions blandningar. Använd en plasmid som inte har någon eukaryot promotor och kommer därför att vara transkriptionellt inaktivt i däggdjursceller, såsom en bakteriell kloningsvektor.

2. Beredning av DNA Mixer

1. Beräkna koncentrationen av alla plasmider som beskrivs i avsnitt 1 baserat på absorbans vid 260 nm (1 absorbans enhet är ekvivalent med 50 | ig / ml DNA). Bestäm molekylmassa av varje plasmid genom att multiplicera antalet baspar från 650 Da. Använd koncentration och molekylvikt för att beräkna den molära koncentrationen av varje plasmid-preparat. Späd plasmiden DNA-beredningar till en koncentration av 36 nM. Dessa kommer att vara arbets lagersom kommer att användas för att framställa DNA-blandningar för transfektion.
2. Bered en DNA-kontrollblandning innehållande 1800 ng av fyll plasmid i en slutlig volym av 20 | il vatten.
3. Förbered en kontroll-DNA mix innehållande 5 pl av pLuc-kontroll konstruktion. Lägg filler plasmid för att det totala DNA-massa till 1.800 ng. Tillsätt vatten för att bringa den slutliga volymen till 20 pl.
4. Förbered en kontroll-DNA mix innehållande 5 pl av pLuc-kontroll konstruktion och 5 pl av pYFP-kontroll konstruktion. Lägg filler plasmid för att det totala DNA-massa till 1.800 ng. Tillsätt vatten för att bringa den slutliga volymen till 20 pl.
5. Förbered en kontroll-DNA mix innehållande 5 pl av positiv kontroll konstruktion. Lägg filler plasmid för att det totala DNA-massa till 1.800 ng. Tillsätt vatten för att bringa den slutliga volymen till 20 pl.
6. Bered följande DNA blandar till testet för homodimerisering av ett protein av intresse, X. För varje DNA-blandning kombinera 5 ul av den relevanta pLuc konstruera och 5 | il av pYFP konstruera. Lägg filler plasmid för att det totala DNA-massa till 1.800 ng. Tillsätt vatten för att bringa den slutliga volymen till 20 pl.
   A) pLuc-kontroll och pYFP-X
   B) pLuc-X och pYFP-kontroll
   C) pLuc-X och pYFP-X
7. Bered följande DNA blandar för att testa för en interaktion mellan ett par av proteiner av intresse, X och Y. För varje DNA-blandning kombinera 5 ul av den relevanta pLuc konstruera och 5 ul av pYFP konstruera. Lägg filler plasmid för att det totala DNA-massa till 1.800 ng. Tillsätt vatten för att bringa den slutliga volymen till 20 pl.
   A) pLuc-kontroll och pYFP-X
   B) pLuc-X och pYFP-kontroll
   C) pLuc-kontroll och pYFP-Y
   D) pLuc-Y och pYFP-kontroll
   E) pLuc-X och pYFP-Y
   F) pLuc-Y och pYFP-X

3. Transfektion

1. Harvest Subkonfluenta HEK293-celler från en 75 cm ^2-kolv. Späd ut 10% av de totala cellerna i 13 ml odlingsmedium. Dispensera 130 pl av cellsuspensionen i varje brunn i en vitklarbottnade 96-brunnars vävnadsodlingsplatta. Kultur celler under 24 timmar.
2. Beräkna antalet brunnar som skall transfekteras genom att multiplicera antalet DNA blandningar genom 3. Ta med serumfritt odlingsmedium till rumstemperatur. Förbered en huvudblandning innehållande 6,3 pl av serumfritt medium och 0,18 l transfektion reagens per brunn. Blanda genom skakning och inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
3. Förbered transfektion blandningar genom tillsats av 2 pl av DNA-blandning till 20 | il serumfritt medium / transfektion reagens huvudblandning. Inte virvel. Inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
4. Transfektion av tre brunnar med varje transfektion mix dispense 6.5 l av transfektion mix per brunn. Kultur cellerna för ytterligare 36-48 timmar.

4. Mätning av BRET Signal

1. Lös live-cell luciferassubstrat vid 34 mg / ml i DMSO genom virvelbildning.
2. Späd rekonstituerade live-cell luciferassubstrat på 1:1000 i substratspädningsmediet påter värmdes till 37 ° C. Låt 50 pl substratspädmedel per brunn. Vortex att blanda. En fällning kan bildas, men kommer inte att interferera med analysen.
3. Aspirera odlingsmedium från 96-brunnars platta. Fördela 50 pl utspätt live-cell luciferas substrat i varje brunn. Kultur celler för åtminstone 2 h (upp till 24 h).
4. Ta bort locket från den 96-brunnars platta och inkubera plattan under 10 min vid rumstemperatur inne i luminometem.
5. Mät utsläppen från Luc och YFP man väl i taget. Mät utsläppen från Luc använda ett filter som blockerar våglängder längre än 470 nm. Mät utsläppen från YFP använda ett 500-600 nm bandpassfilter. Integrera signaler utsläpp under 10 sek.

5. Dataanalys

1. Medelvärdet Luc utsläpps avläsningar från de tre brunnar som fick endast påfyllnings plasmiden. Subtrahera detta värde från alla andra Luc utsläpps avläsningar för att producera bakgrundskorrigerad Luc utsläppsvärden.
2. Medelvärdet YFP utsläpps avläsningar från de tre brunnar som fick endast påfyllnings plasmiden. Subtrahera detta värde från alla andra YFP utsläpp avläsningar för att producera bakgrundskorrigerad YFP utsläppsvärden.
3. För varje brunn, dela bakgrunden korrigerad YFP utsläpp av bakgrundskorrigerad Luc utsläpp för att ge den okorrigerade BRET förhållandet.
4. Medelvärdes de okorrigerade BRET förhållanden från tre brunnar som var transfekterade med endast pLuc-kontroll-plasmid. Subtrahera detta värde från alla andra okorrigerade Bret nyckeltal för att ge de korrigerade Bret nyckeltal.
5. För var och en av de återstående uppsättningarna av rättade Bret förhållanden skall det genomsnittliga värdena från de tre transfekterade brunnarna för att erhålla en slutlig BRET förhållande.

Representative Results

Principen för BRET analysen illustreras i figur 2. Analysen inställnings använts genom experiment som presenteras här är avbildad i figur 3. Detekteringen av en stark BRET signalen från celler som transfekterats med en luciferas-YFP fusionsproteinet bekräftades att energiöverföring kunde observeras i denna experimentuppställning (Figur 4).

Vår forskning fokuserar på den roll som FOXP familj av transkriptions repressors i hjärnans utveckling. Heterozygota mutationer som påverkar FOXP2-genen leder till en ovanlig form av tal-och språkstörning, av vilka den mest framträdande drag är utvecklings verbal dyspraxi-svårigheter med att producera de komplexa sekvenser av orofocial muskelrörelser som krävs för tal ^14-16 FOXP1 mutationer har rapporterats hos patienter. med autismspektrumstörningar och utvecklingsstörning tillsammans med svår tal-och språkproblem ^17-20. Samspelet mellan FOXPs med andra proteiner utreds för att få insikt i de molekylära mekanismer som är relevanta för den roll dessa proteiner i hjärnans utveckling.

FOXP2 är känt att bilda homo-eller heterodimerer med andra FOXP familjemedlemmar ^21, därför FOXP2 homodimerisering användes för att validera BRET-analysen (figur 4). För att utesluta möjligheten att interaktion av FOXP2 fusionsproteiner i denna analys berodde helt enkelt till-proteinöveruttryck var specificiteten hos växelverkan påvisas genom att introducera en mutation i leucin-zipper-dimeriseringsdomänen av FOXP2 (i-läsram deletion av rester E400), vilket är känd för att störa homo-och heterodimerisering ²¹ (fig 5A). När Luc-FOXP2.DE400 och YFP-FOXP2-genen fusionsproteiner samuttrycktes ades en minskning av BRET signalen observeras jämfört med när Luc-FOXP2 och YFP-FOXP2 samuttrycktes (Figur 5B). Denna signal reduktion var inte på grund av en förändring av den subcellulära lokaliseringen av det muterade proteinet (figur 5C) eller på en skillnad i expressionsnivåer som bedöms av Western blotting (data visas ej). Signalen minskning observerades också när Luc-FOXP2 uttrycktes med YFP-FOXP2.DE400 (data visas ej). Sålunda BRET är effektiv i att upptäcka proteinhomodimerisering, och interaktionen av proteiner förblir specifik när dessa proteiner är överuttryckta som luciferas-och YFP-fusionerna. Vidare har användningen av BRET i kombination med riktad mutation av proteiner har potential att identifiera enskilda rester som är involverade i protein-proteininteraktioner.

För att bedöma effektiviteten i BRET analysen att upptäcka heterotypiska interaktioner, var växelverkan av FOXP2 med FOXP1 testad (Figur 6). En BRET signal observerades i båda möjliga konfigurationer av analysen (dvs. med FOXP2 som donator eller som acceptor fusion protein). Därför BRET-analysen kan upptäcka både homo-och heterotypiska interaktioner. Vidare har användbarheten av BRET analys för att detektera interaktionen av FOXP2 med icke-FOXP proteiner testas genom att undersöka interaktionen med CtBP1, en ​​transkriptionell samtidig repressorn och känd FOXP2 interaktion partner ^21. Samspelet mellan CtBP1 och FOXP2 ursprungligen föreslog en jäst två-hybrid-skärm och därefter validerats av co-Immunutfällningsexperiment ^21. Den FOXP2-CtBP1 interaktion detekterades genom BRET assay när FOXP2 var donatorfusionsproteinet och CtBP1 var acceptorn, men inte i den omvända konfigurationen (figur 7A). Sådana resultat är att vänta med BRET-systemet (se diskussion avsnitt). Samspelet mellan FOXP2 och CtBP1 observerades även om endast en mindre del av CtBP1 lokaliserades till kärnan (figur 7B), belyser hur känslig denna analys. Således BRETanalys är användbar för validering av förmodade interaktioner genom jäst två-hybrid screening.

Slutligen var det BRET analysen används för att undersöka effekterna av patogena mutationer i FOXP2 på protein-proteininteraktioner. Två punktmutationer i FOXP2-genen har rapporterats orsaka en sällsynt autosomalt dominant sjukdom som påverkar tal och språk (figur 8A). Den R553H missense mutation upptäcktes genom en länk studie i en stor familj där hälften av ledamöterna har påverkats av sjukdomen ^14. Den R328X nonsensmutation upptäcktes genom riktad sekvensering av FOXP2 locus i probander med en diagnos av utvecklings verbal dyspraxia ^22. Förmågan för de muterade proteinerna att dimerisera med vildtyp FOXP2 bedömdes med hjälp av BRET assay. Resultaten med användning av vildtyp FOXP2 som givare och mutant FOXP2 som acceptor visas i figur 8B. Samma resultat observerades med användning av mutant FOXP2 som donator och vildtyp som acceptor (data visas ej). Den R553H-mutationen, vilket är inom den DNA-bindande domänen hos FOXP2, påverkade inte förmågan hos mutantproteinet att dimerisera med den vilda typen. Den patogena mekanismen för denna mutation kan därför innehålla en dominant negativ effekt till följd av dimerisering av mutanten med det normala proteinet ^23. Den R328X-mutationen införs en för tidig stoppkodon, med resultatet att det kodade proteinet saknar den leucinblixtlås dimeriseringsdomänen och den DNA-bindande domänen, och visar några cytoplasmisk mislocalization (figur 8C). I överensstämmelse med den frånvaro av dimeriseringsdomänen och mislocalization till cytoplasman, visar det trunkerade proteinet kraftigt reducerad interaktion med vildtyp FOXP2. Denna mutation är därför sannolikt att vara sjukdomsframkallande på grund av haploinsufficiency. Således kan den BRET analysen ge insikt i de biologiska effekterna av mutationer upptäcktes hos patienter.

Figur 1. Vektorer för expression av YFP-och luciferas-fusionsproteiner. A) Circle kartor över de pYFP och pLuc vektorer. Den pLuc Vektorn används för expression av luciferas-fusionsproteiner som BRET givare. Den pYFP Vektorn används för expression av YFP-fusionsproteiner som BRET acceptorer. Vektorer har en CMV-promotor (P _CMV) för hög nivå expression i däggdjursceller, ett multipelkloningsställe (MCS) för insättning av cDNA för proteiner av intresse, och en kanamycinresistensgen (Kan ^{'^)} och bakteriellt replikationsursprung för förökning av plasmiden i bakterier. B) multipla kloningsstället av de pLuc och pYFP vektorer. Den ände av YFP-kodande sekvensen visas i blått. Utvalda restriktionsställen är kommenterad. Notera att Xbal-stället är blockerat av overlapping damm metylering i vanliga stammar av E. coli. cDNA-sekvenser som kodar för proteiner av intresse bör klonas i ram med den aminosyrasekvens som visas. I de experiment som beskrivs här, var skär klonas in i BamHI-och Xbal-restriktionsställen (understruket). Stoppkodoner har tagits bort från slutet av luciferas och YFP kodande sekvenser för att ge en öppen läsram som omfattar luciferas / YFP och klonades cDNA av intresse. Stoppkodoner är närvarande vid slutet av det multipla kloningsstället i alla tre läsramar (visas i rött), därför är det inte nödvändigt att inkludera ett stoppkodon i den insatta cDNA.

Figur 2. Princip för BRET systemet. Proteiner av intresse, X och Y, är kondenserad till en luciferas donator enzym (Luc, emissionstoppen 475 nm) och en acceptor fluorescerande protein (YFP, toppvärdet för 530 nm), respektive. Fusionsproteiner uttrycks i odlade däggdjursceller, och efter tillsats av en cell-permeabel luciferassubstrat, emission från Luc mäts med användning av ett filter som blockerar våglängder längre än 470 nm och emission från YFP mäts med användning av ett 500-600 nm bandpassfilter. A) Ingen interaktion mellan protein X och protein Y. energiöverföring från Luc till YFP inte förekommer. B) Interaktion mellan protein X och protein Y. resonansenergiöverföring sker från Luc till YFP orsakar en ökning i förhållandet utsläppet mäts med det 500-600 nm bandpassfilter jämfört med filtret blockerar våglängder längre än 470 nm.

Figur 3. Analys setup. Analys setup för att testaen interaktion mellan två proteiner av intresse, X och Y. Proteiner av intresse smält till luciferas (Luc) som BRET donator och gula fluorescerande protein (YFP) som BRET acceptor. I kontrollproteiner, Luc och YFP är fuserade till en peptid som innehåller en målsökningssignal för den relevanta subcellulär avdelning (P), om så är lämpligt. A) kontroller som skall ingå i varje platta. 1) Mock-transfektion kontroll för att fastställa bakgrundsnivåer av luminiscens och fluorescens följd av luminometer buller och enzym oberoende nedbrytning av substrat; 2) pLuc-kontroll endast transfektion att fastställa hur stor andel av luciferas utsläpp som upptäcks inom emissions intervallet YFP i avsaknad av en BRET acceptor; 3) Transfektion av pLuc-kontroll och pYFP-kontroll för att fastställa baslinjen BRET signalen följd av Luc-YFP interaktion; 4) Transfektion av Luc-YFP fusion som en positiv kontroll för att säkerställa att en BRET signal kan mätas. B) Set av experimental betingelser för att testa för en växelverkan mellan två proteiner av intresse, X och Y. 1, 2, 4, 5) Kontroller för icke-specifik växelverkan mellan proteinerna av intresse och Luc / YFP; 3) Test skick med X som givaren och Y som acceptor; 6) Provförhållanden med Y som donator och X som acceptor.

Figur 4. Detektion av FOXP2 homodimerisering. A) För att validera BRET analys för detektion av FOXP2 homodimerer ades HEK293-celler som transfekterats med konstruktioner för expression av luciferas (donator) eller YFP (acceptor) fusionerad till antingen FOXP2 (P2) eller en nukleär lokaliseringssignal (-). Kärnkrafts riktade luciferas och YFP proteiner fungerar som negativa kontroller. Som en positiv kontroll för detekteringen av en BRET signal ades cellerna även transfekterades med ett konstrukt för uttryck av ett luciferas-YF. P-fusionsprotein (+) B) fluorescensmikroskopi bilder av celler transfekterade med YFP fuserade till en nukleär lokaliseringssignal (-) eller med YFP fuserad till FOXP2 (P2).

Figur 5. Användning av dimeriseringsfattiga FOXP2 att påvisa analysens specificitet. A) Schematisk beskrivning av FOXP2 protein som visar läget för den DE400 mutation, som avbryter dimerisering. Leucinblixtlåset dimeriseringsdomänen visas i grönt och den DNA-bindande domänen i gult. B) För att testa om överuttryck av proteiner kan leda till falskt positiva resultat i BRET analysen var analysens specificitet utvärderas med hjälp av FOXP2.DE400 varianten. Celler transfekterades med konstruktioner för expression av luciferas (donator) eller YFP (acceptor) fuserad till FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) eller en Nuclear lokaliseringssignal (-). C) fluorescensmikroskopi bilder av celler transfekterade med YFP fuserade till FOXP2 (P2) eller till FOXP2.DE400 (DE).

Figur 6. Detektion av FOXP1-FOXP2 heterodimerisering. A) För att validera BRET analys för detektion av heterodimerisering mellan de homologa proteinerna FOXP2 och FOXP1 ades celler transfekterades med konstrukt för uttryck av luciferas (donator) eller YFP (acceptor) fusionerad till antingen FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) eller en nukleär lokaliseringssignal (-). B) fluorescensmikroskopi bilder av celler transfekterade med YFP fuserade till FOXP1 (P1) eller till FOXP2 (P2).

B) fluorescensmikroskopi bilder av celler transfekterade med YFP fuserade till CtBP1 (CTBP) eller till FOXP2 (P2).

Figur 8. Utvärdera effekterna av patogena FOXP2 mutationer på protein-proteininteraktioner. A) Schematisk beskrivning av FOXP2 protein som visar positionerna för de R553H och R328X mutationer som orsakar en sällsynt form av tal-och språkstörning. Leucinblixtlåset dimeriseringsdomänen visas i grönt och den DNA-bindande domänen i gult. B) För att bedöma nyttan av BRET analysen för att utvärdera effekterna av patologiska mutationer i protein-proteininteraktioner, effekterna av R553H och R328X mutationer på förmågan hos de mutanta FOXP2 proteiner att dimerisera med normal FOXP2 undersöktes. Celler transfekterades med konstruktioner för expression av luciferas (donator) eller YFP (acceptor) fusionerad till antingen normal FOXP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328) eller en nukleär lokaliseringssignal (-). C ) fluorescensmikroskopi bilder av celler transfekterade med YFP smält till FOXP2.R553H (R553H) eller till FOXP2.R328X (R328X). I denna bild FOXP2.R328X är övervägande nukleära, men i andra celler i populationen visar en mera cytoplasmisk fördelning.

Discussion

Utformningen av fusionsproteinexpressionskonstruktionerna är ett kritiskt steg i upprättandet av BRET analysen. I de experiment som presenteras här var de proteiner av intresse smält till C-änden av luciferas eller YFP. Det är även möjligt, och kan vara nödvändigt, för att sammansmälta proteiner till N-terminus av luciferas / YFP. För vissa proteiner kan fusioner accepteras endast på antingen N-eller C-terminalen för att undvika avbrott i proteiners struktur och funktion. Dessutom, för transmembranproteiner, där N-och C-terminalerna är bosatta i olika subcellulära fack, luciferas / YFP protein skall smält till ändstationen som är i samma fack som samspelet partner. Till exempel, i studier av interaktionen mellan transmembran G-proteinkopplade receptorer och cytoplasmisk β-arrestin rades luciferas fuserad till den intracellulära karboxyl-svans av transmembranreceptor ^8. I andra fall är geometrin hos ett protein-protein interactiden kan leda till energiöverföring att vara mer effektivt med användning av en av de två möjliga kombinationer av fusionsproteiner. Ibland energiöverföring kanske inte upptäcks alls om att bara använda en kombination, vilket leder till falskt negativa resultat.

Sekvensen för peptidlinker mellan luciferas / YFP och proteinet av intresse kan också påverka effektiviteten av resonansenergiöverföring. Länkaren bör vara tillräckligt långa för att luciferas / YFP och proteinet av intresse att lägga sig utan hinder. En längre länkaren kommer att ge större flexibilitet till polypeptiden vid korsningen mellan luciferas / YFP och proteinet av intresse, vilket kan öka BRET effektivitet genom att underlätta anpassningen av donator och acceptor dipoler. Dock kan BRET effektivitet minskar om det finns för mycket flexibilitet i länkaren. I de experiment som här, kloning av proteinerna av intresse in i BamH I-och Xba I-ställena i expressions vectorer resulterade i en 23-aminosyra-linker, som visas i figur 1. Denna linker har varit framgångsrikt för att detektera interaktioner mellan flera par av proteiner.

Innan du fortsätter till Bret experiment bör man se till att fusionsproteiner bibehåller normal biologisk aktivitet. Driften av YFP kan bedömas genom direkt visualisering med användning av ett fluorescensmikroskop. Driften av luciferas kan analyseras med användning av kommersiellt tillgängliga kit. Effekten av fusion på den subcellulära lokaliseringen av proteiner av intresse kan utvärderas genom immunfärgning, eller i fallet med YFP-fusioner genom direkt visualisering. Effekten av fusion på funktionen av proteinet av intresse kan undersökas med proteinspecifika analyser - t.ex. för en transkriptionsfaktor kan det vara lämpligt att analysera DNA-bindande aktivitet. Observera att luminiscens mätningar som gjorts under försöket ger bekväm in-analys bekräftaration av luciferasaktivitet.

Det är viktigt att tänka på vad de kontrollsystem konstruktioner är för ditt protein av intresse. YFP och luciferas är övervägande cytoplasma och är därför lämpliga kontroller när proteiner av intresse är cytoplasma. När emellertid de proteiner av intresse är lokaliserade till andra subcellulära fack kan det vara önskvärt att modifiera luciferas och YFP med peptidsignaler för att styra deras handel till det relevanta facket. Här proteiner av intresse var transkriptionsfaktorer som är lokaliserade till kärnan, därför luciferas och YFP modifierades genom tillsats av en nukleär lokaliseringssignal. Speciellt framställdes en peptid inklusive den nukleära lokaliseringssignalen av SV40 stor T-antigen (CGYGPKKKRKVGGLDN) bifogas till C-terminalen av luciferas och YFP genom ligering av syntetiska dubbelsträngade oligonukleotider mellan BamHI-och Xbal-ställena i: tee pLuc och pYFP vektorer. Tillsats av denna signal orsakade en signifikant redistribution av proteinet till cellkärnan (fig 4B).

Inklusive lämpliga kontroller är avgörande för tolkningen av Bret experiment. En mock-transfektion kontroll med hjälp av en inert filler plasmid är viktigt att fastställa bakgrundsnivåer av luminiscens och fluorescens följd av luminometer buller och enzym oberoende nedbrytning av substrat. Med moderna luminometrar och luciferas substrat bakgrunds luminiscens nivåer är oftast mycket låg. Transfektion med lämplig styr luciferas konstruera i frånvaro av en YFP konstrukt är viktigt att fastställa hur stor andel av luciferas emission som detekteras inom utsläppsintervall för YFP i frånvaro av en BRET acceptor. Transfektion med kontroll luciferas och kontroll YFP konstruerar ger baslinjen BRET signalen följd av Luc-YFP interaktion. För every par av proteiner som är testade för interaktion är det viktigt att transfektera var och en ensam med lämplig styrkonstruktion, såsom visas i figur 3B, för att kontrollera för någon icke-specifik interaktion mellan proteinerna som provas och luciferas / YFP. Särskilt när du utför en BRET experiment för första gången, är det viktigt att inkludera en Luc-YFP fusionsprotein som positiv kontroll för att säkerställa att en BRET signal kan observeras i din experimentuppställning. Här den kodande sekvensen av YFP klonades in pLuc vid BamHI-och Xba I-ställena för att generera ett fusionsprotein i vilket YFP är sammansmält med C-änden av luciferas.

I det protokoll som beskrivs här, sammansättningen av det DNA blandar för transfektion beräknades med antagande av att den genomsnittliga storleken på den Luc / YFP fusionsproteinet expressionskonstruktioner inte är större än 7,5 kb. Om uttrycket byggts är betydligt större än detta, så att antalet mol av varje expressionskonstruktionen sattes till transfektion blandningen kan behöva minskas, så att den totala mängden av DNA i blandningen inte överstiger den högsta tillåtna genom mängden transfektionsreagens. Alternativt kan mängden transfektionsreagens och mängden DNA i samtliga transfektions blandningarna kan ökas genom att följa tillverkarens riktlinjer. Experimental manipulation av 96-brunnars plattor påskyndas genom användning av flerkanalspipetter och sugapparater. Det är önskvärt att minimera variation mellan prover i längden av transfektion mix inkubationstiden efter tillsats av DNA till serumfritt medium / transfektionsreagens mix därför börja lägga transfektion blandar till celler så snart den första blandningen har inkubering under 10 min . Eftersom BRET acceptor-proteinerna är YFP-fusioner, är det möjligt att bedöma transfektionseffektivitet genom fluorescensmikroskopi eller genom mätning av fluorescens i en mikroplatt reader. Framgång för en BRET experiment beror på en god nivå av transfektion så är det lämpligt att se till att transfektion är tillfredsställande innan du fortsätter med tillsats av substrat och mätning av BRET signalen. Den YFP taggen möjliggör också kvantifiering av acceptor proteinexpressionsnivåer med hjälp av en mikroplattläsare. Kvantifiering av acceptor proteinnivåer kan vara användbara för optimering och felsökning av Bret experiment.

Celler bör odlas i åtminstone två timmar med luciferassubstrat innan mätning av BRET signalen för att säkerställa att en stabil signal har uppnåtts. Det är också acceptabelt att inkubera celler med substrat för upp till 24 timmar. I detta fall är den totala luminiscens räkningar kommer att vara lägre, men BRET förhållanden bör vara oförändrade. Längre inkubationer med substratet kan vara mer bekvämt (t.ex. över natten) och också tillåta mätningen av BRET signaler före och efter en experimentell manipulation sådansåsom tillsats av en farmaceutisk förening. Helst optimera cell seedning densitet, så att cellerna att växa samman kring tiden för mätningen. Om celltätheten är högre än optimalt då det kan vara fördelaktigt att mäta BRET signal vid en tidigare tidpunkt för att undvika cell överväxt. Om du använder en celltyp än HEK293, se till att optimera cellkultur och transfektion förhållanden. BRET experiment har också utförts med godkänt resultat i HeLa-celler med användning av det protokoll som beskrivs här.

I de experiment som beskrivs här, var luminiscens kroppar mättes vid rumstemperatur, vilket är den optimala temperaturen för Renilla-luciferas-aktivitet. Vid utförande av en tid-course experiment i luminometern är det föredraget att ställa in temperaturen vid 37 ° C. Vi har utfört samma experiment vid rumstemperatur och vid 37 ° C och ingen signifikant skillnad i de resultat som observerades. Om du utför experiment vid rumstemperatur, the platta bör komma till jämvikt 10 minuter inne i luminometern före mätningen för att möjliggöra stabilisering av Renilla luciferas aktivitet. Här, var luminiscens signaler integreras över 10 sekunder, som normalt ger hög känslighet, särskilt för proteiner med låga nivåer. Dock får signaler integreras under kortare tidsperioder, om det ger tillräcklig känslighet. På grund av stabiliteten av luminiscens-signal som produceras av levande celler luciferas-substrat, är det godtagbart att mäta i upp till 10 sekunder per brunn vid varje våglängd.

En interaktion mellan två proteiner av intresse bekräftas av BRET analysen när signalen från test tillståndet väsentligt överstiger signalerna från de relevanta kontrollförhållandena. Frånvaron av en BRET-signal är inte nödvändigtvis en bekräftelse på att en interaktion inte inträffar. I fallet med en oväntad eller negativt resultat, den totala luminiscensen och fluorescerarNCE status bör undersökas för att se till att alla brunnar transfekterades korrekt.

Den BRET signal påverkas även av förhållandet mellan proteinexpressionsnivåer är det därför lämpligt att undersöka de relativa expressionsnivåerna för de två proteiner av intresse genom att jämföra fluorescensvärden från brunnar transfekterade med YFP fusioner av de två proteiner (eller luminescensen räknar från brunnar transfererats med luciferas fusioner). När ett fusionsprotein uttrycks starkare än den andra, bättre resultat kommer sannolikt att erhållas om proteinet med den lägre expressionsnivå är sammansmält med luciferas, vilket var fallet med FOXP2 och CtBP1 i de experiment som presenteras här. Det är även möjligt att manipulera proteinnivåer genom att justera det molära förhållandet av expressionsplasmider i transfektion mix. Energiöverföring mellan vissa par av fusionsproteiner kan vara mycket ineffektivt på grund av geometrin hos proteinkomplexet. I ett sådantfall kan det vara värt att försöka smälta proteiner av intresse för alternativa termini av luciferas / YFP.

Det är nödvändigt att bekräfta att den BRET signalen representerar en fysiologisk interaktion protein-protein och är inte helt enkelt på grund av proteinuttryckning. Av denna anledning är det viktigt att undvika grov överuttryck av proteiner. Specificitet hos en protein-proteininteraktion i BRET Systemet kan vidare bekräftas genom att införa mutationer i de proteiner som är kända för att minska affiniteten hos interaktionen, vilket visas här med användning av DE400 variant av FOXP2. De mutanta proteinerna kan vidare användas i konkurrensen och mättnadsbindning BRET analyser. I en konkurrensanalys är de koncentrationer av donator och acceptor-fusionsproteiner hålls konstant medan ökning av koncentrationen av ett otaggat version av en av interaktionspartner som konkurrent. Untagged vildtypsprotein bör konkurrera med den märkta vertering för bindning till dess interaktion partner, vilket resulterar i en minskning i BRET signal, medan det mutanta proteinet bör uppvisa en minskad förmåga att konkurrera ut interaktionen. I ett mättningsbindningsanalys, är koncentrationen av donatorfusionsprotein hålls konstant, medan ökning av koncentrationen av acceptorn. För en specifik interaktion med BRET signalen bör slutligen platå som alla donatormolekyler blir mättad med acceptor. För en icke-specifik interaktion kommer BRET signalen vanligtvis visar en liten linjär ökning till följd av en ökning av slumpmässiga kollisioner mellan donator och acceptormolekyler. I praktiken, för interaktioner med måttlig affinitet mellan lösliga proteiner, kan det vara svårt att uppnå en tillräckligt hög acceptor: donator förhållandet att observera mättnad samtidigt upprätthålla tillräckliga nivåer av givar protein för signaldetektering.

Försiktighet bör iakttas vid tolkning av skillnad näres mellan Bret nyckeltal. Den BRET-analysen ger inte ett kvantitativt mått på affiniteten för ett protein-proteininteraktion eftersom effektiviteten i energiöverföringen påverkas av andra än styrkan i växelverkan protein-proteinfaktorer. Sådana faktorer innefattar förhållandet av nivåerna av fusionsproteinerna i cellen, geometrin hos interaktionen, och procentsatserna för association och dissociation av komplexet. Förhållandena erhållna med två olika par av proteiner kan således inte nödvändigtvis jämföras, men jämförelser kan vara möjligt mellan olika varianter av samma protein, såsom med den vilda typen och ΔE400 varianter av FOXP2 som visas här. Ibland kan något negativa Bret förhållanden iakttas. Negativa förhållanden kan bero på fel i mätningen av utgångsförhållandet i celler transfekterade med enbart pLuc-kontrollvektor. Mycket höga förhållanden är ofta ett tecken på proteinaggregering, vilket kan bekräftas genom observation av transfekterade cells med ett fluorescensmikroskop. Det bör fastställas om sammanläggning är biologiskt relevanta eller en artefakt av proteinuttryck.

Sammanfattningsvis BRET analys som beskrivs här är en kraftfull metod för att undersöka protein-proteininteraktioner i levande celler. Tillämpningen av BRET har visats i syfte att validera kandidat interactmedlemmar från proteomik screeningstudier, identifiera specifika rester involverade i protein-proteininteraktioner, och utvärdera effekterna av mutationer som finns i patientens DNA. Eftersom interaktioner detekteras i realtid utan krav på cell-lys, kan BRET signalen mätas före och efter en behandling såsom tillsats av en farmaceutisk förening eller ligand ^7. Den BRET-analysen visar mycket lovande för användning inom funktionell genomik forskning för att bedöma den biologiska relevansen av genetiska varianter som upptäcks genom nästa generations sekvensering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.