Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Summary

Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind von grundlegender Bedeutung für alle zellulären Prozesse. Verwendung Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer, kann die Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen in lebenden Zellen und in Echtzeit überwacht werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen von potentiell pathogenen Mutationen zu beurteilen.

Abstract

Assays, die auf Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer (BRET) eine empfindliche und zuverlässige Mittel zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu überwachen. BRET ist die nicht-strahlende Energieübertragung von einem "Geber" Luciferase-Enzym, um eine "Akzeptor-Fluoreszenzprotein. Bei der häufigsten Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor gelb fluoreszierendes Protein (YFP). Da die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängige Beobachtung des BRET Phänomen erfordert, dass der Donor und der Akzeptor in der Nähe sein. Um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse in kultivierte Säugerzellen zu testen, wird ein Protein als Fusion mit Luciferase und die zweite als eine Fusion mit YFP ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen. Im Vergleich zu anderen Techniken für die Untersuchung von Protein-Protein-inWechselwirkungen, die BRET-Assay ist empfindlich, erfordert wenig Handhabungszeit und einige Reagenzien und ist in der Lage, Wechselwirkungen, die schwache, vorübergehende, oder abhängig von der biochemischen Umgebung innerhalb einer lebenden Zelle gefunden werden, sind zu erkennen. Es ist daher ein idealer Ansatz für die Bestätigung mutmaßlichen Wechselwirkungen von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Proteomik Studien vorgeschlagen, und außerdem ist es gut geeignet für die Zuordnung der Interaktion Regionen, die den Effekt von post-translationalen Modifikationen auf Protein-Protein-Wechselwirkungen und Bewertung der Auswirkungen von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert.

Introduction

Sowohl klassische Verknüpfung und Next-Generation-Sequencing-Analysen von menschlichen Erkrankungen werden enthüllt die klinische Bedeutung von Proteinen in einer Reihe von biologischen Stoffwechselwegen beteiligt. Es ist oft der Fall, dass vor der Identifizierung in dieser Untersuchungen hat es wenig oder keine Untersuchung der biologischen Funktion dieser Proteine. Ein fruchtbarer Weg erkunden die biologische Funktion eines Proteins von Interesse zu beginnen, ist zu erkennen, welche anderen Proteinen interagiert es mit in seine physiologischen Kontext. Charakterisierung molekularer Netzwerke auf diese Weise Einblicke in die biologischen Signalwege des menschlichen Phänotyp zugrunde liegen.

Die am häufigsten verwendete Groß Screening Ansätze zur Identifizierung von Kandidaten-Interaktionspartner für Proteine ​​von Interesse sind ^{Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-1} und Massenspektrometrie-basierte Proteomik ^2. Diese Methoden können in die eine mögliche interagierende Proteine ​​sehr erfolgreich sein, aber arE anfällig für falsch-positive Ergebnisse. Daher Bestätigung einer Interaktion von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Screening identifizierten erfordert Validierung der Interaktion mit einer zweiten Technik. Typischerweise wird eine Co-Immunfällung oder Pull-down-Assays für diesen Zweck ³ verwendet. Ein Nachteil der Verwendung derartiger Techniken zur Validierung der Anforderung zur Zelllyse, welche die intrazellulären Bedingungen, die für die Aufrechterhaltung bestimmter Protein-Wechselwirkungen sein können zerstört. Ein zweiter Nachteil ist, dass schwache oder transiente Protein-Interaktionen während der Waschschritte kann gestört werden. Darüber hinaus sind diese Assays verlangen bedeutende praktische Zeit werden in der Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden kann, begrenzt, und oft zeitaufwändige Optimierung von Reagenzien und Protokollen.

Um einige der Probleme, mit Co-Immunopräzipitation Experimente zu überwinden, wurden mehrere Assays, die auf Fluoreszenz-und biolum entwickeltinescent Proteine, die in lebenden Zellen verwendet werden kann. Die ersten dieser Tests wurden auf Fluoreszenz (oder Förster) Resonanzenergietransfer (FRET), die nicht-strahlende Energieübertragung zwischen zwei fluoreszierende Proteine ​​mit überlappenden Emissions-und Anregungsspektren ⁴ basiert. Die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängig, also die Beobachtung des FRET Phänomen erfordert, dass die Donor-und Akzeptor-Fluorophore in unmittelbarer Nähe sein. Und die zweite als eine Fusion mit dem Akzeptor-Fluorophor (üblicherweise gelb fluoreszierendes Protein, YFP), um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse zu testen, wird ein Protein als Fusion mit dem Donor-Fluorophor (GFP allgemein cyan fluoreszierendes Protein) ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor Fluorophore nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen, was zu einer messbaren Erhöhung der Emission von Licht aus dem Akzeptor YFP bezogen auf die GFP Spender führen wird. FRET wurde im Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen ⁴ erfolgreich. Der Hauptnachteil der Verwendung von FRET zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist die Voraussetzung für eine externe Beleuchtung zur Anregung des Donor-Fluorophors. Aussenbeleuchtung zu hohen Hintergrund in der Emissionssignal, unerwünschte Anregung des Akzeptor und Bleichen von Spender-und Akzeptor-Fluorophore. Diese Effekte verringern die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Eine Veränderung des FRET-Assay, der das Problem der hohen Hintergrund von externen Beleuchtungswindet die Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET)-Assay ^5,6. Im BRET-System der Donor-Fluorophor durch eine Luciferase-Enzym ersetzt. Somit ist die Energie für die Anregung des Akzeptor-Fluorophors in dem System durch die Oxidation eines Luciferase-Substrat erzeugt, der eine externe Beleuchtung notwendig. In der am meistenallgemeine Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor YFP (für eine Diskussion der alternativen Donor-und Akzeptor-Proteine ​​siehe Pfleger et al. ^5). Dementsprechend wird in diesem System ein Protein von Interesse an Luciferase und einem potentiell interagierenden Protein YFP oder umgekehrt fusioniert. BRET-Assay erfordert die Zugabe von Coelenterazin als Substrat für Luciferase. Da Coelenterazin zellpermeables, ist es möglich, BRET-Assays mit lebenden Zellen durchzuführen. Jedoch ist natives Coelenterazin in wässriger Lösung instabil, und das Enzym-unabhängigen Abbau von Coelenterazin sowohl die Konzentration von Substrat für den Test zur Verfügung und erzeugt Autolumineszenz, die die Empfindlichkeit der Messung der Luciferase-Aktivität reduziert. Die Verwendung von BRET in lebenden Zellen wurde durch die Entwicklung von Schutz Coelenterazine, die in wässriger Lösung stabil sind, aber durch cytosolische Esterase erleichterts nach der Diffusion durch die Zellmembran zum aktiven Coelenterazin in die Zelle ⁷ zu erzeugen.

Nach der Zugabe von Substrat zu Zellen Luciferase-und YFP-Fusionsproteine ​​exprimieren, wird die Energieübertragung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die zu durch Überwachung der Emission von Luciferase und YFP quantifiziert. Weil Protein-Wechselwirkungen direkt in lebende Zellen in Multi-Well-Platten beobachtet werden, stellt die BRET-Untersuchung eine einfache, skalierbare Verfahren zur Validierung putative Wechselwirkungen, kosten-und zeiteffizient ist.

Neben der Validierung putativen Interaktoren in Proteom-Screening Studien identifiziert, kann das BRET-System auch Testkandidat Interaktoren, die aus dem Stand der biochemischen und strukturellen Studien zu dem Protein von Interesse verwendet werden. Nachdem das Vorliegen einer Protein-Protein-Wechselwirkung (entweder unter Verwendung des BRET-Assays oder durch andere Verfahren) hergestellt wurde, gibt es ein Potential für die BRET-Untersuchung zu emp seinLoyed weiter, um die Interaktion zu charakterisieren. Zum Beispiel können die zusammenwirkenden Bereiche durch Erzeugen stumpf Versionen der Proteine ​​abgebildet werden, und die Beteiligung von spezifischen Resten in der Interaktion kann durch die Schaffung von Punktmutationen nachgewiesen werden. Weiterhin kann die modulatorische Wirkung von posttranslationalen Modifikationen oder kleine Moleküle (z. B. Drogen oder Liganden) an Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht werden ^8-10.

BRET-Assay hat auch ein großes Potenzial für die Untersuchung von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert. In Fällen, wo eine ursächliche Rolle für eine Mutation festgestellt wurde, die Untersuchung der Wirkung der Mutation auf die Protein-Protein-Interaktionen mit BRET kann mehr über die molekularen Ätiologie des Phänotyps ¹¹ offenbaren. Seit dem Aufkommen von Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation, ist es zunehmend üblich, mehrere potentiell schädlichen Mutationen in einer einzelnen identifiziert werden, in welchem ​​Fall es nicht klar, welche rele sindvant mit dem Phänotyp ^12. In dieser Situation kann der BRET-Untersuchung wertvoll bei der Bewertung der Auswirkungen der Mutationen auf die Proteinfunktion und damit ihre Bedeutung für die Erkrankung.

Protocol

1. Erstellung der Plasmide

1. Subklonierung der cDNA für jedes Protein von Interesse in sowohl den pLuc und pYFP Vektoren unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken (Abbildung 1). Für detaillierte Protokolle siehe Green et al ^13.
2. Sequence alle Konstrukte, um zu überprüfen, dass die Proteine ​​von Interesse sind im Rahmen mit dem Luc / YFP-Sequenz ohne dazwischen Stop-Codons.
3. Funktionstests durchzuführen, wie gewünscht, um zu bestätigen, daß die Fusionsproteine, die biologische Aktivität beibehalten. In dem hier vorliegenden Fall wurde die subzelluläre Lokalisation von YFP Fusionsproteine ​​mittels Fluoreszenzmikroskopie ermittelt.
4. Machen Expressionsplasmide für entsprechende Luc und YFP Kontrollproteinen durch gentech die relevanten Targeting-Signale in den pLuc und pYFP Expressionsvektoren. In dem hier vorgestellten Fall erzeugen Kernziel Luc und YFP-Konstrukten durch Einfügen eines Kernlokalisationssignal in die pLuc pYFP und Vektoren.
5. Macheneine positive Kontrolle, in der Luc-Konstrukt und YFP zu einem einzigen Polypeptid fusioniert. In dem hier dargestellten Fall erzeugen eine positive Kontrolle, bei der die YFP-kodierenden Sequenz in den Vektor eingefügt pLuc.
6. Wähle einen neutralen Füllstoff-Plasmid verwendet werden, um die Masse der DNA-Transfektion in Mischungen auszugleichen. Verwenden ein Plasmid, das keine eukaryotischen Promotor und daher transkriptionell inaktiv in Säugerzellen, wie beispielsweise einer bakteriellen Clonierungsvektor.

2. Herstellung von DNA-Mischungen

1. Schätzung der Konzentration aller in Abschnitt 1 auf der Basis der Absorption bei 260 nm beschriebenen Plasmide (1 Absorptionseinheit beträgt 50 ug / ml DNA). Bestimmung der Molekülmasse von jedem Plasmid durch Multiplizieren der Anzahl von Basenpaaren von 650 Da. Verwenden der Konzentration und Molmasse, um die molare Konzentration der einzelnen Plasmid-Präparation zu berechnen. Verdünne die Plasmid-DNA-Präparationen in einer Konzentration von 36 nM. Diese werden die Arbeitsvorräte werdendas wird verwendet, um die DNA-Mischungen für die Transfektion vorzubereiten.
2. Vorbereitung einer Kontroll-DNA-Gemisch, das 1,800 ng Plasmid-Füllstoff in einem Endvolumen von 20 &mgr; l Wasser.
3. Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der pLuc-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
4. Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul pLuc-Kontrollkonstrukt und 5 ul pYFP-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
5. Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der positiven Kontrolle Konstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
6. Bereiten Sie die folgenden DNA mischt, um für die Homodimerisierung eines Proteins von Interesse, X. Test für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul des pYFP zu konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
   A) pLuc-Steuerung und pYFP-X
   B) pLuc-X und pYFP-Steuer
   C) pLuc-X und-X pYFP
7. Bereiten Sie die folgenden DNA vermischt, um eine Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen von Interesse zu testen, X und Y für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul der pYFP konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
   A) pLuc-Steuerung und pYFP-X
   B) pLuc-X und pYFP-Steuer
   C) pLuc-Steuerung und pYFP-Y
   D) pLuc-Y und pYFP-Steuer
   E) pLuc-X-und-Y pYFP
   F) pLuc-Y und X-pYFP

3. Transfektion

1. Ernte subkonfluenten HEK293-Zellen aus einem 75 cm ^2-Kolben. Verdünnte 10% der gesamten Zellen in 13 ml Kulturmedium. Dispense 130 ul Zellsuspension in jede Vertiefung einer weißendurchsichtigem Boden 96-well Gewebekulturplatte. Kulturzellen für 24 Stunden.
2. Berechnung der Anzahl der Vertiefungen durch Multiplikation der Anzahl der DNA-Mischungen von 3 transfiziert werden. Bringen serumfreiem Kulturmedium auf Raumtemperatur. Erstellen Sie einen Master-Mix mit 6,3 ul Serum-freien Medium und 0,18 ul Transfektionsreagenz pro Vertiefung. Durch Vortexen mischen und bei Raumtemperatur für 5 min.
3. Bereiten Transfektion Mischungen durch Zugabe von 2 ul DNA-Mix auf 20 ul Serum-freien Medium / Transfektionsreagenz Master-Mix. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
4. Transfektion von drei Brunnen mit jeder Transfektion Mix Abgabe 6,5 ul Transfektionsmischung pro Vertiefung. Kultur die Zellen für weitere 36 bis 48 Stunden.

4. Messung von BRET-Signal

1. Auflösen lebenden Zellen Luciferase Substrat bei 34 mg / ml in DMSO durch Vortexen.
2. Verdünnen wiederhergestellt Lebendzell-Luciferase-Substrat bei 1:1000 in Verdünnungsmedium Substrat pauf 37 ° C wieder erwärmt, Lassen Sie 50 ul Substrat Verdünnungsmedium pro Vertiefung. Vortex mischen. Ein Niederschlag bilden kann, aber nicht mit dem Assay interferieren.
3. Absaugen Kulturmedium aus der 96-Well-Platte. Geben Sie 50 ul verdünnte Lebendzell-Luciferase-Substrat in jede Vertiefung. Kulturzellen für mindestens 2 Stunden (bis zu 24 h).
4. Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und Inkubation der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur in dem Luminometer.
5. Messen von Emissions Luc und YFP eine gut zu einem Zeitpunkt. Messen Emission von Luc mit einem Filter blockieren Wellenlängen größer als 470 nm ist. Messen von Emissions YFP Verwendung eines 500-600 nm Bandpass-Filters. Integrieren Emissionssignale über 10 sek.

5. Data Analysis

1. Mittelwert der Luc Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen Luc Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswerte zu erzeugen.
2. Mittelwert der YFP Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen YFP-Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswerte zu erzeugen.
3. Für jeden gut, teilen Sie die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswert durch den Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswert um den unkorrigierten BRET-Verhältnis geben.
4. Mittelwert der unkorrigierten BRET-Verhältnisse aus den drei Brunnen, die nur mit dem pLuc-Kontroll-Plasmid transfiziert wurden. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen unkorrigierten BRET-Verhältnisse, um die korrigierten BRET-Verhältnisse zu geben.
5. Für jeden der verbleibenden Sätze von korrigierten BRET-Verhältnisse, der Mittelwert der Werte aus den drei Vertiefungen transfiziert, um eine endgültige BRET-Verhältnis zu erhalten.

Representative Results

Das Prinzip der BRET-Untersuchung ist in Fig. 2 dargestellt. Assay-Setup in den hier vorgestellten Experimenten verwendet, ist in Fig. 3 dargestellt. Die Erfassung eines starken BRET-Signal von Zellen mit einem Luciferase-YFP Fusionsprotein transfiziert bestätigt, dass die Energieübertragung zu beobachten war in dieser Versuchsanordnung (Fig. 4).

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Rolle der Familie von FOXP Transkriptionsrepressoren in der Gehirnentwicklung. Heterozygote Mutationen, die FOXP2 führen zu einer seltenen Form von Sprech-und Sprachstörungen, von denen das auffälligste Merkmal ist Entwicklungs verbale Dyspraxie-Schwierigkeiten mit der Herstellung der komplexen Sequenzen von orofocial Muskelbewegungen für die Sprach ^14-16 erforderlich. FOXP1 Mutationen wurden bei Patienten berichtet, mit Autismus-Spektrum-Störungen und geistige Behinderung begleitet von schweren Sprech-und Sprachprobleme ^17-20. Die Wechselwirkung von FOXPs mit anderen Proteinen untersucht wird, um Einsichten in die molekularen Mechanismen, die für die Rolle dieser Proteine ​​in der Entwicklung des Gehirns zu erhalten.

FOXP2 ist bekannt, dass Homo-oder Heterodimere mit anderen FOXP Familienmitglieder ^21, deshalb FOXP2 Homodimerisierung wurde die BRET-Assay (Abbildung 4) validieren zu bilden. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Interaktion von FOXP2 Fusionsproteinen in diesem Assay allein aufgrund Proteinexpression war auszuschließen, wurde die Spezifität der Wechselwirkung durch die Einführung einer Mutation in der Leucin-Zipper-Dimerisierung Domäne FOXP2 (in-frame-Deletion der Rest E400), demonstriert, Es ist bekannt, Homo-und Heterodimerisierung ²¹ (Fig. 5A) zu stören. Wenn Luc-FOXP2.DE400 und YFP-FOXP2 Fusionsproteine ​​gemeinsam exprimiert wurden, wurde eine Verringerung des BRET-Signal verglichen damit, wenn Luc-FOXP2 und YFP-FOXP2 co-exprimiert wurden (5B) beobachtet. Diese signal Reduktion war nicht aufgrund einer Änderung in der subzellulären Lokalisierung des mutierten Proteins (Fig. 5C) oder einer Differenz im Expressionsniveaus wie durch Western-Blotting (Daten nicht gezeigt) beurteilt. Auch wurde die Signalreduktion beobachtet, wenn Luc-FOXP2 wurde mit YFP-FOXP2.DE400 (Daten nicht gezeigt) ausgedrückt. Somit BRET dient zur Erfassung von Protein-Homodimerisierung und die Wechselwirkung von Proteinen verbleibt, wenn diese Proteine ​​spezifisch sind, wie Luciferase-und YFP-Fusionen überexprimiert. Weiterhin ist die Verwendung von BRET in Kombination mit gezielten Mutation von Proteinen hat das Potenzial, einzelnen Reste in Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind.

Um die Wirksamkeit des BRET-Assay beim Nachweis hetero Wechselwirkungen zu untersuchen, wurde die Wechselwirkung von FOXP2 mit FOXP1 (Fig. 6) untersucht. Ein BRET-Signal wurde in beiden möglichen Konfigurationen des Assays, dh mit FOXP2 als Spender oder als Akzeptor fusio beobachtet (N-Protein). Deshalb ist die BRET-Assay in der Lage ist, sowohl homo-und hetero Wechselwirkungen zu erkennen. Darüber hinaus wurde die Eignung des BRET-Assay zum Nachweis der Wechselwirkung mit nicht-FOXP2 FOXP Proteine ​​durch Untersuchung der Wechselwirkung mit CtBP1 ein transkriptionelles Ko-Repressor und FOXP2 bekannte Interaktionspartner ²¹ getestet. Die Interaktion zwischen CtBP1 und FOXP2 wurde ursprünglich von einer Hefe-Zwei-Hybrid-Screen vorgeschlagen und wurde anschließend von Co-Immunpräzipitationsexperimenten ²¹ validiert. FOXP2-CtBP1 Wechselwirkung wurde durch die BRET-Untersuchung erkannt wird, wenn FOXP2 war der Donor-Fusionsprotein und CtBP1 war der Akzeptor, nicht aber in umgekehrter Konfiguration (Fig. 7A). Solche Ergebnisse sind mit dem BRET-System (siehe Diskussion werden) zu erwarten. Die Wechselwirkung zwischen FOXP2 und CtBP1 beobachtet, selbst wenn nur ein geringer Anteil der CtBP1 wurde in den Zellkern (7B) lokalisiert und hebt die Sensitivität dieses Tests. So ist die BRETTest ist nützlich für die Validierung von mutmaßlichen Wechselwirkungen durch Hefe-Zwei-Hybrid-Screening identifiziert.

Schließlich wurde das BRET-Assay verwendet, um die Wirkungen von pathogenen Mutationen in FOXP2 auf Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Zwei Punktmutationen in FOXP2 wurde berichtet, dass eine seltene autosomal-dominante Erkrankung, die Sprech-und Sprach (8A) verursachen. Die R553H Missense-Mutation wurde durch ein Gestänge Studie in einer großen Familie, in der die Hälfte der Mitglieder wurden von der Erkrankung betroffen sind ¹⁴ entdeckt. Der R328X Nonsense-Mutation wurde durch gezielte Sequenzierung des FOXP2-Locus in Probanden mit der Diagnose einer Entwicklungs verbale Dyspraxie ²² entdeckt. Die Fähigkeit der mutierten Proteine ​​mit Wildtyp-FOXP2 Dimerisierung wurde mit der BRET-Assay beurteilt. Die Ergebnisse unter Verwendung von Wildtyp-FOXP2 als Spender-und Mutanten-FOXP2 als Akzeptor in 8B gezeigt. Die gleichen Ergebnisse wurden unter Verwendung von m beobachtetutant FOXP2 als Donor und Wildtyp-als Akzeptor (Daten nicht gezeigt). Die R553H-Mutation, die in der DNA-Bindungsdomäne von FOXP2 ist, hatte keinen Einfluss auf die Fähigkeit des mutierten Proteins mit dem Wildtyp-Dimerisierung. Der pathogene Mechanismus dieser Mutation kann daher einen dominant negativen Effekt von Dimerisierung der Mutante mit dem normalen Protein ²³ resultieren. Die R328X-Mutation führt ein vorzeitiges Stoppcodon, mit dem Ergebnis, daß das codierte Protein fehlt die Leucin-Zipper-Dimerisierung Domäne und die DNA-Bindungsdomäne und eine cytoplasmatische Mislokalisation zeigt (Fig. 8C). Im Einklang mit der Abwesenheit des Dimerisierungsdomäne und Fehllokalisation in das Zytoplasma, zeigt die verkürzten Proteins stark reduziert Interaktion mit Wildtyp-FOXP2. Diese Mutation ist daher wahrscheinlich pathogenen aufgrund Haploinsuffizienz sein. Damit das BRET-Assay kann Einblick in die biologischen Auswirkungen von Mutationen bei Patienten entdeckt werden.

Fig. 1 ist. Vektoren für die Expression von YFP-und Luciferase-Fusionsproteinen. A) Kreis Karten der pYFP pLuc und Vektoren. Die pLuc Vektor für die Expression des Luciferase-Fusionsproteine ​​als BRET Spendern verwendet. Die pYFP Vektor für die Expression von YFP-Fusionsproteine ​​verwendet als BRET-Akzeptor. Vektoren eine CMV-Promotor _(CMV-P) für eine hohe Expression in Säugerzellen, eine multiple Klonierungsstelle (MCS) zum Einführen von cDNAs, die für Proteine ​​von Interesse und ein Kanamycin-Resistenzgen (Kan ^r) und bakteriellen Replikationsursprung zur Vermehrung das Plasmid in Bakterien. B) Mehrfachklonierungsstelle der pLuc und pYFP Vektoren. Das Ende des YFP kodierenden Sequenz ist blau dargestellt. Ausgewählte Restriktionsstellen sind annotiert. Beachten Sie, dass die XbaI-Stelle wird von ove blockiertrlapping dam-Methylierung in Standard-Stämme von E. coli. cDNAs, die für Proteine ​​von Interesse kodierende sollte im Rahmen mit der Aminosäuresequenz gezeigt kloniert werden. In den hier beschriebenen Experimenten wurden die Einsätze in die Bam HALLO-und XbaI-Restriktionsstellen (unterstrichen) kloniert. Stop-Codons am Ende des Luciferase entfernt und YFP kodierenden Sequenzen, um einen offenen Leserahmen umfasst, die die Luciferase / YFP und subkloniert cDNA von Interesse bereitzustellen. Stop-Codons vorhanden sind am Ende der multiplen Klonierungsstelle in allen drei Leserahmen (in rot), daher ist es nicht wesentlich, ein Stop-Codon in der eingefügten cDNA beinhalten.

2. Prinzip des BRET-System. Proteine ​​von Interesse, X und Y, an einem Donor-Luciferase-Enzyms (Luc, Spitzenemission 475 n verschmolzenm) und ein Akzeptor-Fluoreszenzprotein (YFP, Spitzenemission 530 nm) sind. Fusionsproteine ​​werden in kultivierte Säugetierzellen exprimiert und nach der Zugabe von einer Zelle durchlässigen Luciferase Substrat Emission von Luc wird unter Verwendung eines Filters Sperrwellenlängen länger als 470 nm und einer Emission von YFP wird unter Verwendung eines 500-600 nm Bandpassfilter gemessen wird. A) keine Wechselwirkung zwischen Protein X und Protein Y Energieübertragung von der Luc YFP nicht auftritt. B) Wechselwirkung zwischen Protein X und Protein Y-Resonanz-Energietransfer von Luc YFP was eine Erhöhung in dem Verhältnis der Emission gemessen mit der 500-600 nm-Bandpassfilter im Vergleich zu dem Filtersperrwellenlängen länger als 470 nm ist.

Abbildung 3. Assay-Setup. Der Test-Setup auf die getesteteine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse, X und Y. Die Proteine ​​von Interesse werden auf Luciferase (Luc) als BRET-Donor und gelb fluoreszierendes Protein (YFP) als BRET-Akzeptor fusioniert. In den Kontrollproteine, Luc und YFP auf ein Peptid, das eine Targeting-Signal für den entsprechenden subzellulären Kompartiment (P) fusioniert, gegebenenfalls. A) Steuerelemente in jeder Platte enthalten sein. 1) Mock-Transfektion Kontrolle zu Hintergrundwerten von Lumineszenz und Fluoreszenz von Luminometer Lärm und Enzym-unabhängigen Abbau von Substrat resultierende schaffen; 2) pLuc-Steuerung nur Transfektion der Anteil der Luciferase-Emission, die in den Emissionsbereich des YFP bei Abwesenheit eines BRET-Akzeptor erkannt wird schaffen; 3) Transfektion von pLuc-Steuerung und-Kontrolle pYFP um die Grundlinie BRET-Signal von Luc-YFP Wechselwirkung resultierende schaffen; 4) Transfektion von Luc-YFP Fusion als eine positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass ein BRET-Signal gemessen werden kann. B) Set experimental Bedingungen für eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse zu testen, X und Y 1, 2, 4, 5) Kontrollen für nicht-spezifische Wechselwirkung zwischen den Proteinen von Interesse und Luc / YFP; 3) Testbedingung mit X als Donor und als Akzeptor Y; 6) Testbedingung mit Y als Donor und X als Akzeptor.

Abbildung 4. Nachweis von FOXP2 Homodimerisierung. A) zu dem BRET-Assay für den Nachweis von FOXP2 Homodimere zu validieren, wurden HEK293-Zellen mit Konstrukten, die zur Expression von Luciferase (Donor) und YFP (Akzeptor) entweder FOXP2 (P2) oder ein Kernlokalisierungssignal fusioniert transfiziert (-). Die Kernziel Luciferase und YFP Proteine ​​dienen als Negativkontrollen. Als positive Kontrolle zum Nachweis einer BRET-Signal, wurden die Zellen ebenfalls mit einem Konstrukt für die Expression eines Luciferase-YF transfizierten. P-Fusionsprotein (+) B) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Zellen mit YFP transfiziert mit einem Kernlokalisationssignal (fused -) oder mit YFP an FOXP2 (P2) verschmolzen ist.

Abbildung 5. Verwenden von Dimerisierung-defizienten FOXP2 zu Test-Spezifität zu demonstrieren. A) Schematische Darstellung des FOXP2-Protein, das die Position des DE400 Mutation, die Dimerisierung stört. Die Leucin-Zipper Dimerisierungsdomäne wird grün angezeigt und die DNA-bindende Domäne in gelb. B) zu testen, ob die Überexpression von Proteinen kann zu falsch-positiven Ergebnisse in der BRET-Assay führen, wurde die Spezifität des Assays mit dem FOXP2.DE400 bewertet Variante. Die Zellen wurden mit Konstrukten zur Expression von Luciferase (Donor) oder YFP (Akzeptor) zu FOXP2 (P2) fusioniert, FOXP2.DE400 (DE) oder eine nuclea transfiziertr Lokalisationssignal (-). C) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Zellen mit YFP transfiziert, um FOXP2 (P2) oder FOXP2.DE400 (DE) fusioniert.

Abbildung 6. Nachweis von FOXP1 FOXP2-Heterodimerisierung. A) zu dem BRET-Assay für den Nachweis von Heterodimerisierung zwischen den homologen Proteinen und FOXP2 FOXP1 validieren, wurden die Zellen mit Konstrukten zur Expression von Luciferase (Donor) und YFP (Akzeptor) entweder FOXP2 (P2 fusioniert) transfiziert, FOXP1 (P1) oder ein Kernlokalisierungssignal (-). B) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Zellen mit YFP transfiziert FOXP1 (P1) oder in FOXP2 (P2) verschmolzen ist.

B) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Zellen mit YFP transfiziert, um CtBP1 (CtBP) oder an FOXP2 (P2) fusioniert.

Figur 8. Bewertung der Auswirkung FOXP2 pathogenen Mutationen auf Protein-Protein-Wechselwirkungen. A) Schematische Darstellung des FOXP2-Protein, die die Positionen der R553H und R328X Mutationen, die eine seltene fo verursachenrm von Sprech-und Sprachstörungen. Die Leucin-Zipper-Dimerisierung Domäne ist grün, und die DNA-Bindungsdomäne in gelb. B) Um die Nützlichkeit des BRET-Assay für die Bewertung der Auswirkungen von pathologischen Veränderungen der Protein-Protein-Wechselwirkungen zu beurteilen gezeigt, sind die Wirkungen der R553H und R328X Mutationen die Fähigkeit der mutierten Proteine ​​FOXP2 mit normalen FOXP2 dimerisieren untersucht. (-). C wurden die Zellen mit Konstrukten zur Expression von Luciferase (Donor) und YFP (Akzeptor) entweder normale FOXP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328) oder ein Kernlokalisierungssignal fusioniert transfizierten ) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Zellen mit YFP transfiziert fusioniert FOXP2.R553H (R553H) oder an FOXP2.R328X (R328X). In diesem Bild FOXP2.R328X überwiegend Kern, aber in anderen Zellen in der Population zeigt eine cytoplasmatische Verteilung.

Discussion

Die Konstruktion der Fusionsprotein-Expressionskonstrukte ist ein kritischer Schritt bei der Einrichtung der BRET-Untersuchung. In den hier vorgestellten, wurden die Proteine ​​von Interesse an den C-Terminus von Luciferase oder YFP fusioniert. Es ist auch möglich und kann notwendig sein, um Proteine ​​an dem N-Terminus von Luciferase / YFP verschmelzen. Bei einigen Proteinen Fusionen können entweder nur an den N-oder C-Terminus um eine Unterbrechung der Proteinstruktur und-funktion zu vermeiden akzeptiert. Außerdem für Transmembranproteine ​​in der der N-und C-Termini befinden sich in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten, die Luciferase / Protein YFP muss bis zur Endstation, die im selben Raum wie das Interaktionspartner ist abgesichert werden. Zum Beispiel in Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Trans G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und zytoplasmatischen β-Arrestin, die Luciferase zu der intrazellulären Carboxyl-Schwanz der Transmembranrezeptor ⁸ fusioniert. In anderen Fällen ist die Geometrie eines Protein-Protein-Interaktivitätkann auf der Energieübertragung effizienter ist mit einem der beiden möglichen Kombinationen von Fusionsproteinen führen. Gelegentlich Energietransfer kann nicht erkannt werden, wenn überhaupt nur mit einer Kombination, die zu falsch-negative Ergebnisse.

Die Sequenz des Peptidlinker zwischen Luciferase / YFP und das Protein von Interesse kann auch Auswirkungen auf die Effizienz der Resonanzenergietransfer. Der Linker sollte lang genug sein, damit Luciferase / YFP und das Protein von Interesse, ohne Behinderung zu falten. Eine längere Linker flexibler an das Polypeptid an der Verbindung zwischen Luciferase / YFP und dem Protein von Interesse, die BRET-Effizienz durch die Erleichterung der Ausrichtung der Donor-und Akzeptor-Dipole erhöhen können verleihen. Jedoch kann BRET Effizienz verringern, wenn es zu viel Flexibilität im Linker. In den Experimenten hier Klonierung der Proteine ​​von Interesse in die BamH I und Xba I-Stellen des Expressionsvektortoren ergab eine 23-Aminosäuren-Linker, wie in Fig. 1 gezeigt. Dieser Linker wurde zum Nachweis Wechselwirkungen zwischen mehreren Paaren von Proteinen erfolgreich.

Bevor auf Experimente Bret es sollte sichergestellt werden, dass die Fusionsproteine ​​behalten normale biologische Aktivität. Die Funktionsweise des YFP durch direkte Visualisierung mit einem Fluoreszenzmikroskop beurteilt. Die Funktionsweise der Luciferase unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits getestet werden. Die Wirkung der Fusion auf die subzelluläre Lokalisation von Proteinen von Interesse kann durch Immunfärbung oder im Fall von YFP-Fusionen umfasst, die durch direkte Visualisierung beurteilen. Die Wirkung der Fusion auf die Funktion des Proteins von Interesse kann durch Protein-spezifischen Assays untersucht werden - z. B. für einen Transkriptionsfaktor kann es angebracht sein, um DNA-Bindungsaktivität zu untersuchen. Beachten Sie, dass die Lumineszenz-Messungen während des Experiments gemacht bieten bequeme in-Test bestätigenation der Luciferase-Aktivität.

Es ist wichtig, zu überlegen, was die entsprechenden Kontrollstrukturen sind in dem Protein von Interesse. YFP und Luciferase sind überwiegend zytoplasmatische und sind daher geeignete Kontrollen, wenn die Proteine ​​von Interesse sind zytoplasmatisch. Jedoch, wenn die interessierenden Proteine ​​in andere subzellulären Kompartimenten lokalisiert kann es wünschenswert sein Luciferase und YFP mit Peptidsignale modifizieren, um ihre Handels zu dem Fach zu lenken. Hier werden die Proteine ​​von Interesse waren Transkriptionsfaktoren, die in den Zellkern lokalisiert sind daher Luciferase und YFP wurden durch die Zugabe von einem Kernlokalisationssignal modifiziert. Insbesondere wurde ein Peptid, das dem Kernlokalisierungssignal des SV40-Large-T-Antigen (CGYGPKKKRKVGGLDN) an den C-Terminus von Luciferase und YFP durch Ligation von synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotiden zwischen der Bam HALLO-und XbaI-Stellen von th fügtenE pLuc pYFP und Vektoren. Zugabe dieses Signal eine signifikante Umverteilung des Proteins in den Zellkern (4B).

Einschließlich der entsprechenden Kontrollen ist entscheidend für die Interpretation von BRET Experimenten. Ein Mock-Transfektion Steuer Verwendung eines inerten Füllstoff Plasmid ist unerlässlich, um Hintergrundwerte von Lumineszenz und Fluoreszenz von Luminometer Lärm und Enzym-unabhängigen Abbau von Substrat resultierende etablieren. Mit modernen Luminometern und Luciferase Substrate Hintergrund Lumineszenz Ebenen sind in der Regel sehr gering. Transfektion mit der entsprechenden Steuer Luciferase-Konstrukts in Abwesenheit einer YFP-Konstrukt ist wichtig, den Anteil der Luciferase-Emission, die in den Emissionsbereich des YFP bei Abwesenheit eines BRET-Akzeptor erkannt wird etablieren. Die Transfektion mit der Steuerung und Kontrolle Luciferase YFP-Konstrukte bietet die Grundlinie BRET-Signal von Luc-YFP-Interaktion entstehen. Für Vorabendry Paar von Proteinen, die für die Interaktion getestet werden, ist es wichtig, jedes alleine mit den entsprechenden Kontrollkonstrukt transfiziert, wie in Fig. 3B dargestellt ist, um für jede nicht-spezifische Wechselwirkung zwischen den Proteinen getestet und Luciferase / YFP steuern. Insbesondere bei der Durchführung eines Experiments BRET zum ersten Mal, ist es wichtig, eine Luc-YFP Fusionsproteins als Positivkontrolle umfassen, um sicherzustellen, dass ein BRET-Signal beobachtbar ist in Ihrem Versuchsaufbau. Hier wird die kodierende Sequenz des YFP wurde an den BamHI HALLO-und XbaI-Stellen in pLuc kloniert, um ein Fusionsprotein, bei dem YFP an den C-Terminus von Luciferase fusioniert ist, zu erzeugen.

In dem hier beschriebenen Protokoll, die Zusammensetzung der DNA-Mischungen für die Transfektion wurde unter der Annahme, dass die durchschnittliche Größe der Luc / YFP Fusionsprotein-Expressionskonstrukte nicht größer als 7,5 kb berechnet. Wenn der Ausdruck Bauts deutlich größer sind als diese, dann die Anzahl der Mole jedes Expressionskonstrukt zum Transfektionsgemisch gegeben haben möglicherweise reduziert, so dass die Gesamtmenge an DNA in der Mischung nicht die maximal um den Betrag der Transfektionsreagenz erlaubt nicht übersteigt. Alternativ kann die Menge des Transfektionsreagenz und die Menge an DNA in allen Transfektion Mischungen können nach den Richtlinien des Herstellers erhöht werden. Experimentelle Manipulation von 96-Well-Platten wird durch die Verwendung von Mehrkanalpipetten und Aspiratoren beschleunigt. Es ist wünschenswert, Unterschiede zwischen den Proben in der Länge Transfektionsgemisch Inkubationszeit nach der Zugabe von DNA zu dem serumfreien Medium / Transfektionsreagenz Mischung zu minimieren, beginnt somit das Hinzufügen Transfektion vermischt, um Zellen, sobald die erste Mischung wurde für 10 min wurde die Inkubation . Da die BRET-Akzeptor YFP Fusionsproteine ​​sind, ist es möglich, die Effizienz der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie oder durch Messung der Fluoreszenz in einem Mikroplatten-Wieder beurteilenader. Der Erfolg eines BRET-Experiment hängt von einem guten Niveau der Transfektion so ist es ratsam, um sicherzustellen, dass die Transfektion zufriedenstellend ist, bevor Sie mit Zugabe von Substrat und die Messung der BRET-Signal. Die YFP-Tag ermöglicht auch die Quantifizierung von Protein-Akzeptor-Expressionsniveaus mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader. Quantifizierung der Akzeptor-Protein-Spiegel kann für die Optimierung und Fehlerbehebung von BRET Versuche.

Zellen sollten für mindestens 2 h mit Luciferase-Substrat vor dem Messen des BRET-Signal, um sicherzustellen, daß ein stabiles Signal erreicht worden ist, inkubiert werden. Es ist auch möglich, Zellen mit dem Substrat bis zu 24 h inkubiert. In diesem Fall wird die Gesamt Lumineszenz zählt niedriger sein, aber die BRET-Verhältnisse sollten unverändert. Längere Inkubationen mit Substrat kann bequemer sein (zB über Nacht) und erlauben die Messung von BRET-Signale vor und nach einer experimentellen Manipulation solcherals Zugabe einer pharmazeutischen Verbindung. Idealerweise optimieren Zellaussaatdichte, so dass die Zellen Konfluenz erreichen, um die Zeit der Messung. Wenn die Zelldichte oberhalb optimale dann kann es vorteilhaft sein, die BRET-Signal zu einem früheren Zeitpunkt zu messen, um die Zellwucherung zu vermeiden. Wenn Sie einen Zelltyp als HEK293, lesen Zellkultur und Transfektion Bedingungen zu optimieren. BRET Experimente wurden ebenfalls erfolgreich in HeLa-Zellen unter Verwendung der hier beschriebenen Protokoll durchgeführt.

In den hier beschriebenen Experimenten wurden die Lumineszenz-Zählungen bei Raumtemperatur, was die optimale Temperatur für Renilla-Luciferase-Aktivität gemessen. Bei Durchführung einer Zeitverlaufsexperiment im Luminometer ist es bevorzugt, die Temperatur auf 37 ° C eingestellt wird Wir haben die gleichen Experimente bei Raumtemperatur und bei 37 ° C durchgeführt wird und keine signifikante Differenz in den Ergebnissen beobachtet wurde. Wenn die Durchführung von Experimenten bei Raumtemperatur, thE Platte erlaubt sein sollte, 10 Minuten in der Luminometer vor der Messung ins Gleichgewicht zu einer Stabilisierung der Renilla-Luciferase-Aktivität zu ermöglichen. Hier wurden Lumineszenz-Signale über 10 sec, die in der Regel eine hohe Sensitivität integriert, vor allem für Proteine ​​mit niedrigen Expressionsniveaus. Allerdings kann Signale über kürzere Zeiträume integriert werden, wenn diese eine ausreichende Empfindlichkeit. Aufgrund der Stabilität des durch den lebenden Zellen Luciferase Substrat hergestellt Lumineszenzsignal, ist es akzeptabel, für bis zu 10 Sekunden pro Vertiefung bei jeder Wellenlänge zu messen.

Eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse durch die BRET-Untersuchung bestätigt, wenn das Signal von der Testbedingung die Signale von den entsprechenden Kontrollbedingungen signifikant überschreitet. Das Fehlen eines BRET-Signal nicht notwendigerweise eine Bestätigung, dass eine Wechselwirkung nicht auftritt. Im Falle eines unerwarteten oder negatives Ergebnis die Gesamt Lumineszenz und fluoreszierennce zählt, sollte geprüft werden, um sicherzustellen, dass alle Wells vollständig transfiziert wurden.

Das BRET-Signal wird auch durch das Verhältnis von Proteinexpressionsniveaus beeinflusst daher ist es nützlich, um die relativen Expressionsniveaus der beiden Proteine ​​von Interesse durch Vergleich der Fluoreszenzzählungen von Vertiefungen mit YFP-Fusionen der beiden Proteine ​​(oder die Lumineszenz von transfizierten zählt prüfen Brunnen mit den Luciferase-Fusionen transfiziert). Wenn ein Fusionsprotein stärker als die andere drückt, sind bessere Ergebnisse wahrscheinlich erzielt, wenn das Protein mit der niedrigeren Expressionsniveau an Luciferase, was der Fall bei FOXP2 und CtBP1 in den hier vorgestellten Experimenten wurde fusioniert werden. Es ist auch möglich, Proteinspiegel durch Einstellen des Molverhältnisses von Expressionsplasmiden im Transfektionsgemisch zu manipulieren. Energietransfer zwischen bestimmten Paaren von Fusionsproteinen kann sehr ineffizient aufgrund der Geometrie des Proteinkomplexes sein. In solchenFällen kann es sinnvoll sein, zu versuchen Verschmelzen der Proteine ​​von Interesse für die alternative Termini der Luciferase / YFP.

Es ist notwendig, zu bestätigen, dass das BRET-Signal stellt eine physiologische Protein-Protein-Wechselwirkung und ist nicht einfach auf Proteinexpression. Aus diesem Grund ist es wichtig, Bruttoüberexpression von Proteinen zu vermeiden. Spezifität einer Protein-Protein-Interaktion im BRET-System kann durch Einführen von Mutationen in Proteinen, die bekannt sind, um die Affinität der Wechselwirkung zu reduzieren, da hier mit dem DE400 Variante des FOXP2 gezeigt bestätigt. Die mutierten Proteine ​​können weiter im Wettbewerb und Sättigungsbindungs ​​BRET-Assays verwendet werden. In einem kompetitiven Test werden die Konzentrationen der Donator-und Akzeptor-Fusionsproteine ​​konstant gehalten, während die Erhöhung der Konzentration eines unbezeichnet Version von einer der Wechselwirkungspartner als Konkurrent. Nicht markierte Wildtyp-Protein sollte mit dem getaggt v konkurrierenAusführung Anleitung für die Bindung an seinen Interaktionspartner, was zu einer Abnahme in der BRET-Signal, wohingegen das mutante Protein sollte eine reduzierte Fähigkeit zum Wettbewerb die Wechselwirkung aufweisen. In einem Sättigungsbindungstest wird die Konzentration des Donors Fusionsprotein konstant gehalten, während die Konzentration des Akzeptors. Für eine spezifische Wechselwirkung sollte das BRET-Signal schließlich Plateau wie alle Spender Moleküle mit dem Akzeptor gesättigt. Für eine nicht-spezifische Wechselwirkung wird die BRET-Signal zeigen typischerweise einen kleinen linearen Anstieg auf einen Anstieg in zufälliger Kollisionen zwischen den Donor-und Akzeptor-Molekülen. In der Praxis, für die Interaktion von mittlerer Affinität zwischen löslichen Proteinen, kann es schwierig sein, eine ausreichend hohe Akzeptor erreichen: Geber Verhältnis zur Sättigung zu beobachten während auch ausreichende Mengen des Proteins für die Signalgebererkennung.

Vorsicht ist bei der Interpretation der differenc ausgeübt werdenes zwischen BRET-Verhältnisse. Die BRET-Untersuchung nicht ein quantitatives Maß für die Affinität eines Protein-Protein-Wechselwirkung, da die Effizienz der Energieübertragung wird durch andere als die Stärke der Protein-Protein-Interaktionsfaktoren beeinflusst. Derartige Faktoren umfassen das Verhältnis des Gehalts der Fusionsproteine ​​in der Zelle, die die Geometrie der Interaktion und die Geschwindigkeiten der Assoziation und Dissoziation des Komplexes. Die mit zwei verschiedenen Paaren von Proteinen erhalten Verhältnisse kann daher nicht unbedingt verglichen werden, aber Vergleiche zwischen verschiedenen Varianten des gleichen Proteins, wie mit dem Wildtyp-und ΔE400 Varianten von FOXP2 hier gezeigten möglich sein. Gelegentlich kann leicht negativ BRET-Verhältnisse beobachtet werden. Negative Verhältnisse der Fehler bei der Messung des Basisverhältnisses in Zellen mit nur dem pLuc-Kontrollvektor transfizierten resultieren. Sehr hohe Verhältnisse sind oft Anzeichen für Proteinaggregation, die durch Beobachtung von transfizierten ce bestätigt werden kannlls mit einem Fluoreszenzmikroskop. Es sollte festgestellt werden, ob Aggregation biologisch relevanten oder ein Artefakt der Proteinexpression.

Im Ergebnis ist die hier beschriebene BRET-Assay ein leistungsfähiges Konzept, um Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Anwendung von BRET wurde zum Zwecke der Validieren von Kandidateninteraktoren von Proteom-Screening Studien Identifizierung spezifischer Reste an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt, und die Bewertung der Auswirkungen von Mutationen in DNA gefunden Patienten nachgewiesen. Da Wechselwirkungen in Echtzeit ohne die Notwendigkeit zur Zelllyse entdeckt wird, kann das BRET-Signal vor und nach einer Behandlung, wie die Zugabe einer pharmazeutischen Verbindung oder Ligand ⁷ gemessen werden. BRET-Assay zeigt großes Versprechen für die Verwendung in funktionellen Genomforschung, die biologische Relevanz der genetischen Varianten durch Next-Generation-Sequenzierung entdeckt zu beurteilen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.