Undersøgelse af protein-protein interaktioner i levende celler Brug Bioluminescens Resonance Energy Transfer

Summary

Interaktioner mellem proteiner er grundlæggende for alle cellulære processer. Brug Bioluminescens Resonance Energy Transfer, kan overvåges interaktionen mellem et par af proteiner i levende celler og i realtid. Endvidere kan virkningerne af potentielt patogene mutationer vurderes.

Abstract

Analyser baseret på Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET) give en følsom og pålidelig måde at overvåge protein-protein interaktioner i levende celler. BRET er den ikke-radiative overførsel af energi fra en "donor" luciferaseenzym til en "acceptor" fluorescerende protein. I den mest almindelige konfiguration af dette assay donoren Renilla R. reniformis luciferase og acceptoren er gult fluorescerende protein (YFP). Da effektiviteten af ​​energioverførsel er stærkt afstand-afhængig, observation af BRET fænomen kræver, at donor og acceptor være i tæt nærhed. For at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse i dyrkede pattedyrceller, er et protein, der udtrykkes som en fusion med luciferase og den anden som en fusion med YFP. En interaktion mellem de to proteiner af interesse kan bringe donor og acceptor tilstrækkelig tæt til energioverførsel at forekomme. Sammenlignet med andre teknikker til at undersøge protein-protein iteractions, den BRET analysen er følsom, kræver lidt hands-on tid og få reagenser, og er i stand til at detektere interaktioner, som er svage, forbigående, eller afhængig af den biokemiske miljø findes inden for en levende celle. Det er derfor en ideel metode til bekræftelse af formodede interaktioner foreslået af gær to-hybrid-eller massespektrometri proteomics undersøgelser, og derudover er det velegnet til kortlægning interagerende regioner, vurdere effekten af ​​post-translationelle modifikationer på protein-protein interaktioner, og evaluere virkningen af ​​mutationer identificeret i patientens DNA.

Introduction

Både klassisk kobling og næste generation sekventering analyser af menneskelige lidelser er afslørende den kliniske relevans af proteiner involveret i en række biologiske veje. Det er ofte tilfældet, at forud for deres identifikation i sådanne undersøgelser, har der været lidt eller ingen undersøgelse af den biologiske rolle af disse proteiner. En frugtbar vej til at begynde at udforske den biologiske funktion af et protein af interesse er at identificere, hvilke andre proteiner, det interagerer med i sin fysiologiske sammenhæng. Karakterisere molekylære netværk på denne måde giver indsigt i de biologiske veje ligger til grund for menneskelig fænotype.

Den hyppigst anvendte storstilet screening tilgange til at identificere kandidat interaktion partnere for proteiner af interesse er gær to-hybrid screening ¹ og massespektrometri-baserede proteomics ^2. Disse metoder kan være meget vellykket i at foreslå potentielle interagerende proteiner, men are sårbar over for falske positive resultater. Derfor bekræftelse af en vekselvirkning identificeret af gær to-hybrid-eller massespektrometri screening kræver validering af interaktionen ved hjælp af en anden teknik. Typisk en co-immunopræcipitation eller pull-down assay anvendes til dette formål ^3. En ulempe ved anvendelse af sådanne teknikker til validering er kravet om cellelyse, som ødelægger de intracellulære betingelser, der kan være afgørende for at opretholde visse protein-interaktioner. En anden ulempe er, at svage eller forbigående protein-interaktioner kan forstyrres under vasketrin. Desuden kræver disse analyser betydelige hands-on tid, er begrænset i antallet af prøver, der kan behandles samtidigt, og kræver ofte tidskrævende optimering af reagenser og protokoller.

For at overvinde nogle af de problemer, der er forbundet med co-immunpræcipitationseksperimenter har flere assays blevet udviklet baseret på fluorescerende og bioluminescent proteiner, der kan anvendes i levende celler. De første af disse assays blev baseret på fluorescens (eller Forster) Resonance Energy Transfer (FRET), den ikke-radiative overførsel af energi mellem to fluorescerende proteiner med overlappende emissions-og excitationsspektre ^4. Effektiviteten af ​​energioverførsel er stærkt afstand afhængig af, derfor observation af FRET fænomen kræver, at donor-og acceptor fluorophores være i tæt nærhed. For at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse, er et protein, der udtrykkes som en fusion med donorfluorophor (almindeligvis cyan fluorescerende protein; FFP) og den anden som en fusion med acceptorfluoroforen (almindeligvis gult fluorescerende protein; YFP). En interaktion mellem de to proteiner af interesse kan bringe donor-og acceptor-fluoroforer tilstrækkelig tæt til energioverførsel at forekomme, hvilket vil resultere i en målelig forøgelse i emissionen af ​​lys fra YFP acceptoren i forhold til donor FFP. FRET har været en succes i forbindelse med afsløring af protein-protein interaktioner i levende celler ^4. Den største ulempe ved anvendelse af FRET til påvisning af protein-protein interaktioner er kravet om ekstern belysning til excitation af donorfluoroforen. Eksterne resultater belysning i høj baggrund i udledningen signal, uønsket excitation af acceptor, og fotoblegning af både donor og acceptor fluorophores. Disse virkninger reducere følsomheden af ​​assayet til påvisning af protein-protein interaktioner.

En modifikation af FRET-assay, der overvinder problemet med høj baggrund fra ekstern belysning er Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET)-assay ^5,6. I BRET systemet donorfluoroforen er erstattet af et luciferaseenzym. Således energi til excitation af acceptoren fluorofor genereres i systemet ved oxidation af et luciferasesubstrat, rendering ekstern belysning unødvendig. I de mestfælles konfiguration af denne analyse, donor er Renilla reniformis luciferase og acceptor er YFP (for en diskussion af alternativ donor og acceptor proteiner se Pfleger et al. ^5). Derfor i dette system, er et protein af interesse er fusioneret til luciferase og et potentielt interagerende protein til YFP, eller omvendt. Den BRET analysen kræver tilsætning af coelenterazin som et substrat for luciferase. Fordi coelenterazin er celle-permeabel, er det muligt at udføre BRET assays levende celler. Men native coelenterazin er ustabilt i vandig opløsning, og enzym-uafhængig fordeling af coelenterazin både reducerer koncentrationen af ​​substratet til rådighed for analysen og genererer autoluminescence, hvilket reducerer følsomheden af ​​målinger af luciferaseaktivitet. Brugen af ​​BRET i levende celler er blevet fremmet af udviklingen af ​​beskyttede coelenterazines, som er stabile i vandig opløsning, men spaltes af cytosol esterases efter diffusion over cellemembranen til at generere aktive coelenterazin i cellen ^7.

Efter tilsætning af substrat til celler, som udtrykker luciferase-og YFP-fusionsproteiner, er energioverførsel som følge af protein-protein interaktioner kvantificeres ved at overvåge emission fra luciferase og YFP. Fordi protein interaktioner kan overvåges direkte i levende celler i flere brønde, den BRET analysen udgør en enkel, skalerbar metode til validering af formodede interaktioner, der er omkostnings-og tidsbesparende.

Ud over at validere putative interaktionskandidater identificeret i proteom screening undersøgelser kan BRET systemet også bruges til at teste interaktionskandidater følger kendte biokemiske og strukturelle undersøgelser af proteinet af interesse. Når forekomsten af ​​en protein-protein interaktion er blevet etableret (enten ved at bruge BRET analysen eller ved andre teknikker), der er potentiale for BRET assay at være employed yderligere at karakterisere interaktion. For eksempel kan de interagerende regioner kortlægges ved at generere afkortede versioner af proteiner, og inddragelse af specifikke rester i samspillet kan påvises ved at skabe punktmutationer. Endvidere kan modulerende virkning af posttranslationelle modifikationer eller små molekyler (såsom lægemidler eller ligander) på protein-protein interaktioner undersøges ^8-10.

Den BRET analyse har også et stort potentiale for at undersøge mutationer identificeret i patientens DNA. I tilfælde, hvor en sygdomsfremkaldende rolle for en mutation er blevet etableret, studere effekten af mutationen på protein-protein interaktioner ved hjælp BRET kan afsløre mere om den molekylære ætiologi fænotype ^11. Siden indførelsen af ​​næste generation sekventering metoder, er det mere almindeligt, at flere potentielt skadelige mutationer skal identificeres inden for et individ, i hvilket tilfælde det er uklart, som er relevante for fænotype ^12. I denne situation BRET analysen kan være værdifulde i at evaluere effekten af ​​mutationer på protein funktion og dermed deres relevans for uorden.

Protocol

1.. Oprettelse af plasmider

1. Subklone cDNA'er for hvert protein af interesse i både pLuc og pYFP vektorer ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker (figur 1). For detaljerede protokoller se Green et al ^13.
2. Sequence alle konstruktioner at kontrollere, at proteiner af interesse er i ramme med Luc / YFP sekvens uden nogen mellemliggende stopcodons.
3. Udfør funktionelle assays som ønsket for at bekræfte, at fusionsproteinerne bevarer biologisk aktivitet. I tilfælde præsenteres her den subcellulære lokalisering af YFP fusionsproteiner blev konstateret ved fluorescensmikroskopi.
4. Gør ekspressionsplasmider til passende Luc og YFP kontrol proteiner ved engineering de relevante målretning signaler ind i pLuc og pYFP ekspressionsvektorer. I tilfælde, der præsenteres her, generere nukleare målrettet Luc og YFP-konstruktioner ved at indsætte et kernelokaliseringssignal ind i pLuc og pYFP vektorer.
5. Foretagen positiv kontrol-konstruktion, hvor Luc og YFP fusioneres til et enkelt polypeptid. I tilfælde, der præsenteres her, genererer en positiv kontrol, hvor kodningssekvensen YFP indsættes i pLuc vektoren.
6. Vælg en neutral fyldstof plasmid anvendes til at udligne massen af ​​DNA i transfektion blandinger. Brug et plasmid, der ikke har nogen eukaryot promotor og vil derfor være transkriptionelt inaktive i mammale celler, såsom en bakteriel kloningsvektor.

2. Fremstilling af DNA-miks

1. Estimere koncentrationen af ​​alle de plasmider er beskrevet i afsnit 1 på grundlag af absorbans ved 260 nm (1 absorbansenhed svarer til 50 mg / ml af DNA). Bestem molekylvægten af ​​hvert plasmid ved at multiplicere antallet af basepar med 650 Da. Brug koncentration og molekylmasse at beregne den molære koncentration af hvert plasmid præparat. Fortynd plasmid-DNA-præparater i en koncentration på 36 nM. Disse vil være de arbejdende lagreder vil blive anvendt til at fremstille DNA-blandinger til transfektion.
2. Der fremstilles en DNA-blanding indeholdende 1.800 ng fyldstof plasmid i et slutvolumen på 20 pi vand.
3. Forbered en kontrol-DNA-blanding indeholdende 5 ul af pLuc-kontrol konstruktion. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.
4. Forbered en kontrol-DNA-blanding indeholdende 5 pi pLuc-kontrol konstruktion og 5 pi pYFP-kontrol konstruktion. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.
5. Forbered en kontrol-DNA-blanding indeholdende 5 pi positiv kontrol konstruktion. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.
6. Klargør følgende DNA blander at teste for homodimerisering af et protein af interesse, X. For hver DNA mix kombinere 5 ul af relevante pLuc konstruere og 5 pi af pYFP konstruere. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.
   A) pLuc-kontrol og pYFP-X
   B) pLuc-X og pYFP-kontrol
   C) pLuc-X og pYFP-X
7. Klargør følgende DNA blander til at teste for en interaktion mellem et par af proteiner af interesse, X og Y. For hver DNA mix kombinere 5 ul af relevante pLuc konstruere og 5 ul af pYFP konstruere. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.
   A) pLuc-kontrol og pYFP-X
   B) pLuc-X og pYFP-kontrol
   C) pLuc-kontrol og pYFP-Y
   D) pLuc-Y og pYFP-kontrol
   E) pLuc-X og pYFP-Y
   F) pLuc-Y og pYFP-X

3. Transfektion

1. Harvest Subkonfluente HEK293-celler fra en 75 ^cm2 kolbe. Fortynd 10% af de totale celler i 13 ml dyrkningsmedium. Doser 130 pi af cellesuspension i hver brønd i en hvidklar bund 96-brønds vævskulturplade. Kultur-celler i 24 timer.
2. Beregne antallet af brønde, der skal transficeres ved at multiplicere antallet af DNA-blandinger med 3. Bring serumfrit dyrkningsmedium til stuetemperatur. Forbered en master-blanding indeholdende 6,3 pi serum-frit medium og 0,18 pi transfektionsreagens pr godt. Vortexes og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
3. Forbered transfektionseksperimenter blander ved tilsætning af 2 ul DNA mix til 20 ul serum-frit medium / transfektionsreagens mester mix. Undlad at slynge. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
4. Transficere tre brønde med hver transfektion blanding dispensering 6.5 pi Transfektionsblandingen per brønd. Kultur cellerne i yderligere 36-48 timer.

4.. Måling af BRET Signal

1. Opløs live-cell luciferasesubstrat til 34 mg / ml i DMSO ved hvirvelbehandling.
2. Fortynd rekonstitueret live-cell luciferasesubstrat på 1:1000 i substrat fortyndingsmediet pre-opvarmet til 37 ° C. Tillad 50 pi substrat fortynding medium per brønd. Vortex at blande. Et præcipitat kan dannes, men ikke vil interferere med analysen.
3. Aspirer dyrkningsmediet fra 96-brønds plade. Doser 50 ul fortyndet live-cell luciferasesubstrat i hver brønd. Kultur-celler i mindst 2 timer (op til 24 timer).
4. Fjern låget fra 96-brønds plade og inkuber pladen i 10 minutter ved stuetemperatur inde i luminometeret.
5. Måle emission fra Luc og YFP et godt ad gangen. Måle emission fra Luc hjælp af et filter blokerer bølgelængder længere end 470 nm. Måle emission fra YFP ved hjælp af en 500-600 nm band-pass filter. Integrer emission signaler over 10 sek.

5.. Dataanalyse

1. Gennemsnittet af emissions aflæsninger Luc fra de 3 brønde, der kun fik fyldstof plasmid. Trække denne værdi fra alle andre Luc emission aflæsninger til at producere Luc emissionsværdier baggrundssubtraktion.
2. Gennemsnittet af emissions aflæsninger YFP fra de 3 brønde, der kun fik fyldstof plasmid. Trække denne værdi fra alle andre YFP emission aflæsninger til at producere YFP emissionsværdier baggrundssubtraktion.
3. For hvert godt, opdele værdi baggrundssubtraktion YFP emission af værdi baggrundssubtraktion Luc emission for at give den ukorrigerede BRET forhold.
4. Gennemsnittet af ukorrigerede Bret nøgletal fra de tre brønde, der blev transficeret med kun pLuc-kontrol plasmid. Trække denne værdi fra alle de andre ikke-korrigerede Bret nøgletal til at give de korrigerede Bret nøgletal.
5. For hver af de resterende sæt af korrigerede Bret nøgletal gennemsnittet af værdierne fra de tre transficerede brønde for at opnå en endelig BRET forhold.

Representative Results

Princippet i BRET assay er illustreret i fig. 2. Assay opsætning anvendes i eksperimenterne præsenteret her er afbildet i fig. 3. Påvisningen af et stærkt BRET signal fra celler transfekteret med et luciferase-YFP fusionsprotein bekræftede, at energioverførsel var observerbare i denne forsøgsopstilling (figur 4).

Vores forskning fokuserer på den rolle, FOXP familien transkriptionelle repressorer i hjernens udvikling. Heterozygote mutationer påvirker FOXP2 føre til en sjælden form for tale-og sprogforstyrrelser, hvoraf det mest fremtrædende træk er udviklende verbal dyspraksi-vanskeligheder med at producere de komplekse sekvenser af orofocial muskelbevægelser kræves for tale ^14-16 FOXP1 mutationer er blevet rapporteret hos patienter. med autismespektrumforstyrrelser og intellektuelle handicap ledsaget af svær tale-og sprogproblemer ^17-20. Samspillet mellem FOXPs med andre proteiner bliver undersøgt at få indblik i de molekylære mekanismer, der er relevante for den rolle, som disse proteiner i hjernens udvikling.

FOXP2 er kendt for at danne homo-eller heterodimerer med andre FOXP familiemedlemmer ^21, derfor FOXP2 homodimerisering blev brugt til at validere BRET assay (figur 4). At udelukke muligheden for, at samspillet mellem FOXP2 fusionsproteiner i denne analyse skyldtes blot at proteinoverekspression blev specificiteten af ​​interaktionen påvist ved at indføre en mutation i leucinzipperen dimeriseringsdomæne af FOXP2 (i-frame sletning af rest E400), som er kendt for at forstyrre homo-og heterodimerisering ²¹ (figur 5A). Når Luc-FOXP2.DE400 og YFP-FOXP2 fusionsproteiner var samudtrykt blev en reduktion i BRET observerede signal i forhold til da Luc-FOXP2 og YFP-FOXP2 var samudtrykt (figur 5B). Denne signal reduktion var ikke på grund af en ændring i den subcellulære lokalisering af det muterede protein (figur 5C), eller en forskel i ekspressionsniveauer vurderet ved Western blotting (data ikke vist). Reduktionen signal blev også observeret, når Luc-FOXP2 blev udtrykt med YFP-FOXP2.DE400 (data ikke vist). Således BRET er effektiv i forbindelse med afsløring protein homodimerisering, og samspillet mellem proteiner forbliver specifik, når disse proteiner overudtrykt som luciferase-og YFP-fusioner. Desuden er brugen af ​​BRET i kombination med en målrettet mutation af proteiner har potentialet til at identificere individuelle rester, der er involveret i protein-protein interaktioner.

For at vurdere effektiviteten af BRET analysen i forbindelse med afsløring heterotypic interaktioner blev samspillet mellem FOXP2 med FOXP1 testes (figur 6). En BRET signal blev observeret i begge mulige konfigurationer af assayet (dvs. FOXP2 som donor eller acceptor fusion protein). Derfor BRET assayet er i stand til at påvise både homo-og heterotypiske interaktioner. Desuden blev egnethed BRET assay til påvisning af interaktion af FOXP2 med ikke-FOXP proteiner testes ved at undersøge interaktionen med CtBP1, en ​​transkriptionel co-repressor og kendt FOXP2 interaktion partner ^21. Samspillet mellem CtBP1 og FOXP2 blev oprindeligt foreslået af en gær to-hybrid skærm og blev efterfølgende valideret af co-immunpræcipitationseksperimenter ^21. Den FOXP2-CtBP1 interaktion blev påvist ved BRET testen, når FOXP2 var donor fusionsproteinet og CtBP1 var acceptor, men ikke i den modsatte konfiguration (figur 7A). Sådanne resultater er kan forventes med det BRET systemet (se Diskussion afsnit). Samspillet mellem FOXP2 og CtBP1 blev observeret, selvom kun en mindre del af CtBP1 blev lokaliseret til kernen (figur 7B), fremhæver følsomheden af denne analyse. Således BRETAnalysen er nyttige for validering af formodede identificerede interaktioner gennem gær to-hybrid screening.

Endelig blev BRET analysen ansat til at undersøge virkningerne af patogene mutationer i FOXP2 på protein-protein interaktioner. To punktmutationer i FOXP2 er blevet rapporteret at forårsage en sjælden autosomal dominant lidelse påvirker tale og sprog (figur 8A). Den R553H missense mutation blev opdaget ved en kobling studie i en stor familie, hvor halvdelen af medlemmerne blev ramt af lidelsen ^14. Den R328X nonsense mutation blev opdaget gennem målrettet sekventering af FOXP2 locus i probander med en diagnose af udviklingsmæssig verbal dyspraksi ^22. Evne mutantproteinerne at dimerisere med vildtype FOXP2 blev vurderet ved hjælp af BRET analysen. Resultaterne via vildtype FOXP2 som donor og mutant FOXP2 som acceptor er vist i figur 8B. De samme resultater blev observeret ved anvendelse af mutant FOXP2 som donor og vild-type som acceptor (data ikke vist). Den R553H mutation, hvilket er inden for DNA-bindende domæne af FOXP2, som ikke påvirker evnen af ​​mutant protein til at dimerisere med vildtypen. Den patogene mekanisme af denne mutation kan derfor omfatte en dominerende negativ effekt som følge af dimerisering af mutanten med det normale protein ^23. Den R328X mutation indfører en tidlig stopkodon, med det resultat, at det kodede protein mangler leucin-zipper-dimerisering domæne og det DNA-bindende domæne, og viser nogle cytoplasmatisk mislocalization (figur 8C). I overensstemmelse med fraværet af dimeriseringsdomænet og mislocalization til cytoplasmaet, viser det afkortede protein stærkt reduceret interaktion med vildtype FOXP2. Denne mutation er derfor sandsynligvis være patogene grundet haploinsufficiency. Således BRET analysen kan give indblik i de biologiske effekter af mutationer opdaget i patienter.

Fig. 1. Vektorer til ekspression af YFP-og luciferase-fusionsproteiner. A) Circle kort over de pYFP og pLuc vektorer. Den pLuc Vektoren anvendes til ekspression af luciferase fusionsproteiner som Bret donorer. Den pYFP Vektoren anvendes til ekspression af YFP fusionsproteiner som BRET acceptorer. Vektorer har en CMV-promotor (P _CMV) til højniveau-ekspression i mammale celler, et multipelt kloningssted (MCS) til indsættelse af cDNA'er for proteiner af interesse, og et kanamycinresistensgen (Kan ^r) og bakterielt replikationsorigin til formering af plasmidet i bakterier. B) multipelt kloningssted af pLuc og pYFP vektorer. Den ende af kodende sekvens YFP er vist i blåt. Valgte restriktionssteder er kommenteret. Bemærk, at XbaI-sitet er blokeret af overlapping dæmning methylering i standard stammer af E. coli. cDNA'er, der koder for proteiner af interesse bør klonet i ramme med aminosyresekvensen vist. I forsøgene, der er beskrevet her, blev inserts klonet ind i BamHI-og Xbal-restriktionssites (understreget). Stop codoner er blevet fjernet fra enden af ​​luciferase og YFP-kodende sekvenser til at give en åben læseramme, der omfatter luciferase / YFP og subklonet cDNA'et af interesse. Stop codoner er til stede ved slutningen af ​​det multiple kloningssite i alle tre læserammer (vist i rødt), det er derfor ikke nødvendigt at medtage et stopcodon i det indsatte cDNA.

Figur 2. Princip for BRET systemet. Proteiner af interesse, X og Y, er fusioneret til en donor luciferaseenzym (Luc topemission 475 nm) og en acceptor fluorescerende protein (YFP, peak emission 530 nm) hhv. Fusionsproteiner udtrykkes i dyrkede pattedyrceller og efter tilsætning af en celle-permeabel luciferasesubstrat, emission Luc måles under anvendelse af et filter blokerer bølgelængder længere end 470 nm og emission fra YFP måles med et 500-600 nm båndpasfilter. A) Ingen interaktion mellem protein X og protein Y. energi overførsel fra Luc til YFP ikke forekommer. B) Samspil mellem protein X og protein Y. resonans energi overførsel sker fra Luc til YFP forårsager en stigning i forholdet mellem emission målt ved hjælp af Den 500-600 nm båndpasfilter forhold til filteret blokerer bølgelængder længere end 470 nm.

Figur 3.. Assay setup. Assay setup til at teste foren interaktion mellem to proteiner af interesse, X og Y. proteiner af interesse er smeltet til luciferase (Luc) som BRET donor og gult fluorescerende protein (YFP) som BRET acceptor. I kontrolgrupperne proteiner er Luc og YFP fusioneret til et peptid indeholdende en målrettet signal for den relevante subcellulært afsnit (P), hvis det er relevant. A) kontrol, der skal inkluderes i hver plade. 1) Mock-transfektion kontrol for at etablere baggrundsniveauer af luminescens og fluorescens som følge af luminometer støj og enzym-uafhængig opdeling af substrat; 2) pLuc-kontrol kun transfektion at fastslå andelen af ​​luciferase emission, der er fundet inden emissionen vifte af YFP i mangel af en BRET acceptor; 3) Transfektion af pLuc-kontrol og pYFP-kontrol for at etablere baseline BRET signal som følge af Luc-YFP interaktion; 4) Transfektion af Luc-YFP fusion som en positiv kontrol for at sikre, at der kan måles en BRET signal. B) Sæt af experimENTAL betingelser for at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse, X og Y. 1, 2, 4, 5) Controls for ikke-specifik interaktion mellem proteiner af interesse og Luc / YFP; 3) Test tilstand med X som donor og Y som acceptor; 6) Test tilstand med Y som donor og X som acceptor.

Fig. 4. Påvisning af FOXP2 homodimerisering. A) at validere BRET assay til påvisning af FOXP2 homodimerer blev HEK293-celler transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til enten FOXP2 (P2) eller et nukleart lokaliseringssignal (-). Det nukleare målrettet luciferase og YFP proteiner tjener som negative kontroller. Som en positiv kontrol til påvisning af en BRET signal blev cellerne også transficeret med en konstruktion til ekspression af et luciferase-YF. P fusionsprotein (+) B) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til et kernelokaliseringssignal (-) eller med YFP fusioneret til FOXP2 (P2).

Figur 5.. Brug af dimerisering-mangel FOXP2 at demonstrere assay specificitet. A) Skematisk diagram af FOXP2 protein viser placeringen af den DE400 mutation, der forstyrrer dimerisering. Leucinzipperen dimeriseringsdomæne vises i grønt, og DNA-bindende domæne i gult. B) For at teste, om overekspression af proteiner kan føre til falsk-positive resultater i BRET assay blev specificiteten af analysen vurderet ved hjælp af FOXP2.DE400 variant. Celler blev transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) eller en nuclear lokaliseringssignal (-). C) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til FOXP2 (P2) eller FOXP2.DE400 (DE).

Figur 6.. Påvisning af FOXP1-FOXP2 heterodimerisering. A) at validere BRET assay til påvisning af heterodimerisering mellem homologe proteiner FOXP2 og FOXP1 blev celler transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til enten FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) eller kernelokaliseringssignalet (-). B) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til FOXP1 (P1) eller FOXP2 (P2).

B) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til CtBP1 (CtBP) eller FOXP2 (P2).

Figur 8. Evaluering af virkningerne af patogene FOXP2 mutationer på protein-protein interaktioner. A) Skematisk diagram af FOXP2 protein viser placeringen af de R553H og R328X mutationer, der forårsager en sjælden form af tale og sprog uorden. Leucinzipperen dimeriseringsdomæne vises i grønt, og DNA-bindende domæne i gult. B) For at vurdere anvendeligheden af BRET analysen for at vurdere virkningen af patologiske mutationer på protein-protein interaktioner, virkningerne af R553H og R328X mutationer på evnen af ​​mutant FOXP2 proteiner dimerisere med normal FOXP2 blev undersøgt. Celler blev transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til enten normal FOXP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), eller et nukleart lokaliseringssignal (-). C ) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP kondenseret til FOXP2.R553H (R553H), eller til FOXP2.R328X (R328X). I dette billede FOXP2.R328X overvejende nukleare, men i andre celler i populationen viser en mere cytoplasmatisk distribution.

Discussion

Udformningen af ​​fusionsproteinekspression konstruktioner er et afgørende skridt i oprettelsen af ​​BRET analysen. I eksperimenterne præsenteret her blev proteinerne af interesse fusioneret til den C-terminale ende af luciferase eller YFP. Det er også muligt, og kan være nødvendig for at smelte proteiner til den N-terminale ende af luciferase / YFP. For nogle proteiner kan fusioner kun blive accepteret på enten N-eller C-terminalen for at undgå forstyrrelse af proteiners struktur og funktion. Endvidere er det for transmembrane proteiner, hvor N og C termini er bosiddende i forskellige subcellulære rum, luciferase / YFP protein skal fusioneret til terminalen, som er i samme rum som samspillet partner. For eksempel, i studier af samspillet mellem transmembrane G-protein-koblede receptorer og cytoplasmatisk β-arrestin, blev luciferase fusioneret til den intracellulære carboxyl hale transmembranreceptor ^8. I andre tilfælde geometrien af ​​et protein-protein-interactiden kan føre til energioverførsel er mere effektive ved hjælp af en af ​​de to mulige kombinationer af fusionsproteiner. Lejlighedsvis energioverførsel registreres muligvis ikke på alle, hvis du bruger kun én kombination, der fører til falsk negative resultater.

Sekvensen af ​​peptidlinker mellem luciferase / YFP og proteinet af interesse, kan også påvirke effektiviteten af ​​resonans energi overførsel. Linkeren bør være lang nok til at tillade luciferase / YFP og proteinet af interesse til at folde uden hindring. En længere linker vil give større fleksibilitet til polypeptid ved krydset mellem luciferase / YFP og det interessante protein, hvilket kan øge BRET effektivitet ved at lette tilpasning af donor-og acceptor dipoler. Dog BRET effektivitet kan falde, hvis der er for meget fleksibilitet i linker. I forsøgene her, kloning af proteiner af interesse ind i BamHI-og Xbal-stederne i udtrykket vectorer resulterede i en 23-aminosyre-linker, som vist i fig. 1. Denne linker har været vellykket til at detektere interaktioner mellem flere par af proteiner.

Inden vi går videre til Bret eksperimenter bør det sikres, at de fusionsproteiner bevarer normal biologisk aktivitet. Driften af ​​YFP kan vurderes ved direkte visualisering under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Driften af ​​luciferase kan analyseres under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits. Virkningen af ​​fusion af den subcellulære lokalisering af proteiner af interesse kan vurderes ved immunfarvning, eller i tilfælde af YFP-fusioner, ved direkte visualisering. Virkningen af fusion på funktionen af proteinet af interesse kan undersøges ved protein-specifikke assays - fx til en transkriptionsfaktor kan det være hensigtsmæssigt at analysere DNA-bindende aktivitet. Bemærk at luminescens målinger foretaget under eksperimentet giver praktisk i-assay confirmtion af luciferaseaktivitet.

Det er vigtigt at overveje, hvad de relevante kontrolforanstaltninger konstruktioner er for din protein af interesse. YFP og luciferase er overvejende cytoplasmatisk og er derfor passende kontroller, når proteiner af interesse er cytoplasmisk. Men når proteinerne af interesse er lokaliseret til andre subcellulære afsnit kan det være ønskeligt at modificere luciferase og YFP med peptid-signaler til at styre deres handel til det relevante rum. Her proteinerne af interesse var transkriptionsfaktorer, som er lokaliseret til kernen derfor luciferase og YFP blev modificeret ved tilsætning af kernelokaliseringssignalet. Specifikt blev et peptid med kernelokaliseringssignalet af SV40 stort T-antigen (CGYGPKKKRKVGGLDN) føjet til C-terminalen af luciferase og YFP ved ligering af syntetiske dobbeltstrengede oligonukleotider mellem BamHI og XbaI-steder af the pLuc og pYFP vektorer. Tilsætning af dette signal forårsagede en signifikant omfordeling af protein til cellekernen (fig. 4B).

Herunder passende kontrol er afgørende for fortolkningen af ​​Bret eksperimenter. En mock-transfektion styring med et inaktivt fyldstof plasmid er vigtigt at etablere baggrundsniveauer af luminescens og fluorescens som følge af luminometer støj og enzym-uafhængig opdeling af substrat. Med moderne luminometre og luciferase substrater baggrund luminescens niveauer er typisk meget lavt. Transfektion med den passende kontrol luciferase konstruere i mangel af en YFP konstruktion er vigtigt at fastslå andelen af ​​luciferase emission, der er fundet inden emissionen vifte af YFP i mangel af en BRET acceptor. Transfektion med kontrol luciferase og kontrol YFP konstruktionerne giver baseline BRET signal, der resulterer fra Luc-YFP interaktion. For every par af proteiner, der er testet for interaktion, er det vigtigt at transficere hver alene med passende kontrol-konstruktionen, som illustreret i figur 3B, for at kontrollere for ikke-specifik interaktion mellem proteinerne testes og luciferase / YFP. Især når du udfører en BRET eksperiment for første gang, er det vigtigt at medtage en Luc-YFP fusionsprotein som positiv kontrol for at sikre, at en BRET signal kan observeres i din forsøgsopstilling. Her den kodende sekvens af YFP blev klonet ind pLuc på Bam HI og Xba I-stederne for at generere et fusionsprotein, hvori YFP er fusioneret til den C-terminale ende af luciferase.

I protokollen beskrevet her, sammensætningen af ​​DNA blander til transfektion blev beregnet ud fra den antagelse, at den gennemsnitlige størrelse af Luc / YFP fusionsprotein ekspressionskonstruktioner ikke er større end 7,5 kb. Hvis udtrykket konstruktionts er væsentligt større end dette, så antallet af mol af hver ekspressionskonstruktion tilsat til Transfektionsblandingen muligvis nedsættes, således at den samlede mængde DNA i blandingen ikke overstiger den maksimalt tilladte af mængden af ​​transfektionsreagens. Alternativt mængden af ​​transfektionsreagens og mængden af ​​DNA i alle transfektion blandinger kan øges i overensstemmelse med producentens retningslinjer. Eksperimentel manipulation af 96-brønds plader fremskyndes ved anvendelse af multikanal pipetter og aspiratorer. Det er ønskeligt at minimere variationen mellem prøver i længden af ​​Transfektionsblandingen inkubationstid efter tilsætning af DNA til serum-frit medium / transfektion reagensblanding derfor begynde at tilføje transfektion blander celler, så snart den første blanding er inkubering i 10 minutter . Fordi BRET acceptor proteiner er YFP-fusioner, er det muligt at vurdere transfektionseffektivitet ved fluorescensmikroskopi eller ved måling af fluorescens i en mikroplade reAder. Succes for en BRET eksperiment afhænger af et godt niveau af transfektion så det er tilrådeligt at sikre, at transfektion er tilfredsstillende, før du fortsætter til tilsætning af substrat og måling af BRET signal. YFP tag muliggør også kvantificering af acceptor-protein-ekspressionsniveauer ved anvendelse af en mikropladelæser. Kvantificering af acceptor protein niveauer kan være nyttige for optimering og fejlfinding af Bret eksperimenter.

Cellerne inkuberes i mindst 2 timer med luciferasesubstrat før måling af BRET signal for at sikre, at et stabilt signal er opnået. Det er også acceptabelt at inkubere cellerne med substrat for op til 24 timer. I dette tilfælde totalluminescens tæller vil være lavere, men BRET forhold bør være uændret. Længere inkubationer med substrat kan være mere bekvemt (fx natten over), og også tillader måling af Bret signaler før og efter en eksperimentel manipulation sådansom tilsætning af en farmaceutisk forbindelse. Ideelt optimere celle podningstæthed således at cellerne når konfluens omkring tidspunktet for målingen. Hvis celletæthed er over optimal så kan det være fordelagtigt at måle BRET signal på et tidligere tidspunkt for at undgå celle overvækst. Hvis du bruger en celletype andet end HEK293, skal du sørge for at optimere cellekultur og transfektion forhold. BRET eksperimenter er også blevet udført i HeLa-celler under anvendelse af protokollen beskrevet her.

I forsøgene, der er beskrevet her, blev luminescens tællinger målt ved stuetemperatur, hvilket er den optimale temperatur for Renilla-luciferase-aktivitet. Hvis der udføres et tidsforløb eksperiment i luminometeret foretrækkes det at indstille temperaturen ved 37 ° C. Vi har udført samme eksperimenter ved stuetemperatur og ved 37 ° C og ingen signifikant forskel i resultaterne blev observeret. Hvis der udføres forsøg ved stuetemperatur the plade bør have lov til at ækvilibrere 10 min inde i luminometeret før målingen for at muliggøre stabilisering af Renilla-luciferase-aktivitet. Her blev luminescens signaler integreret over 10 sekunder, hvilket typisk giver høj følsomhed, især for proteiner med lave ekspressionsniveauer. Dog kan signaler integreres over kortere perioder, hvis det giver tilstrækkelig følsomhed. På grund af stabiliteten af ​​luminescenssignal produceret af live-cell luciferasesubstrat, er det acceptabelt at måle op til 10 sek per brønd ved hver bølgelængde.

En interaktion mellem to proteiner af interesse bekræftes af BRET analysen, når signalet fra testbetingelsen overstiger signalerne fra de relevante kontrol-betingelser markant. Fraværet af et BRET signal er ikke nødvendigvis bekræftelse af, at en interaktion ikke forekommer. I tilfælde af en uventet eller negativt resultat, totalluminescens og fluorescererNCE tæller bør undersøges for at sikre, at alle brønde blev transficeret korrekt.

Den BRET signalet påvirkes også af forholdet mellem protein udtryk niveauer derfor er det nyttigt at undersøge de relative ekspressionsniveauer for de to proteiner af interesse ved at sammenligne fluorescens tæller fra brønde transficeret med YFP fusioner af de to proteiner (eller luminescens tællinger fra brønde transficeret med luciferase fusioner). Når et fusionsprotein udtrykker stærkere end den anden, sandsynligvis vil blive opnået, hvis proteinet med den lavere ekspressionsniveau er fusioneret til luciferase, som det var tilfældet med FOXP2 og CtBP1 i eksperimenterne præsenteret her bedre resultater. Det er også muligt at manipulere proteinniveauer ved justering af molforholdet af ekspressionsplasmider i transfektion mix. Energioverførsel mellem visse par af fusionsproteiner kan være meget ineffektive på grund af geometrien af ​​det protein-kompleks. I et sådanttilfælde kan det være umagen værd at forsøge at sammensmelte de proteiner, af interesse for alternative termini af luciferase / YFP.

Det er nødvendigt at bekræfte, at BRET signalet repræsenterer en fysiologisk protein-protein interaktion og er ikke blot på grund af protein overekspression. Af denne grund er det vigtigt at undgå grov overekspression af proteiner. Specificitet af et protein-protein-interaktion i BRET systemet kan yderligere bekræftes ved at indføre mutationer i de proteiner, der er kendt for at reducere affiniteten af ​​interaktion, som påvist her ved hjælp af DE400 variant af FOXP2. De mutante proteiner kan endvidere anvendes i konkurrence og mætningsbinding Bret assays. I et kompetitivt assay, holdes konstante koncentrationer af donoren og acceptoren fusionsproteiner samtidig øge koncentrationen af ​​et ukodet version af et af de interaktionspartnere som en konkurrent. Untagged vildtypeprotein skal konkurrere med den mærkede vertering for binding til dens interaktion partner, hvilket resulterer i et fald i BRET signalet, mens mutant protein bør udvise en reduceret evne til at konkurrere ud interaktionen. I en mætning bindingsassay koncentrationen af ​​donor fusionsprotein holdes konstant, og samtidig øge koncentrationen af ​​acceptoren. For en specifik interaktion BRET signalet med tiden skal plateau som alle donor molekyler bliver mættet med acceptor. For en ikke-specifik interaktion, vil BRET signalet typisk viser en lille lineær stigning skyldes en stigning i tilfældige kollisioner mellem donor-og acceptor-molekyler. I praksis for interaktioner af moderat affinitet mellem opløselige proteiner, kan det være vanskeligt at opnå en tilstrækkelig høj acceptor: donor-forholdet for at observere mætning samtidig opretholde tilstrækkelige niveauer af donor protein til påvisning signal.

Der bør udvises forsigtighed i fortolkningen af ​​differences mellem Bret nøgletal. Den BRET analysen ikke giver en kvantitativ måling af affinitet af et protein-protein interaktioner, fordi effektiviteten af ​​energioverførsel påvirkes af andre end styrken af ​​interaktionen protein-protein faktorer. Sådanne faktorer omfatter forholdet mellem niveauerne af fusionsproteinerne i cellen, geometri interaktion, og satserne for association og dissociation af komplekset. Forholdene opnået med to forskellige par af proteiner kan derfor ikke nødvendigvis sammenlignes, men sammenligninger kan være muligt mellem de forskellige varianter af det samme protein, såsom med vildtype-og ΔE400 varianter af FOXP2 vist her. Indimellem kan en anelse negativ Bret nøgletal overholdes. Negative nøgletal kan skyldes fejl i måling af baseline-forholdet i celler transficeret med kun pLuc-kontrol vektor. Meget høje forhold er ofte tegn på proteinaggregering, hvilket kan bekræftes ved observation af transficerede ceLLS med et fluorescensmikroskop. Det bør bestemmes, hvis sammenlægning er biologisk relevant eller en artefakt af protein overekspression.

Afslutningsvis BRET assayet beskrevet her er en kraftfuld metode til at undersøge protein-protein interaktioner i levende celler. Anvendelsen af ​​BRET er påvist med henblik på validering interaktionskandidater fra proteom screening undersøgelser, identificere specifikke rester involveret i protein-protein interaktioner, og evaluere virkningerne af mutationer findes i patientens DNA. Fordi interaktioner detekteres i realtid uden kravet om cellelysis kan måles BRET signal før og efter en behandling, såsom tilføjelse af en farmaceutisk forbindelse eller ligand ^7. Den BRET analysen viser meget lovende til brug i funktionelle genomforskning for at vurdere den biologiske relevans af genetiske varianter opdaget gennem næste generation sekventering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.