Summary
Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.
Abstract
Bepalingen op basis van bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET) een gevoelige en betrouwbare manier om eiwit-eiwit interacties in levende cellen te volgen. BRET is de niet-stralingsoverdracht van energie uit een "donor" luciferase-enzym een "acceptor" fluorescent proteïne. In de meest voorkomende configuratie van deze test, de donor is Renilla reniformis luciferase en de acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Omdat het rendement van energie-overdracht is sterk verte-afhankelijke, observatie van de BRET fenomeen vereist dat de donor en acceptor worden in de nabijheid. Om te testen op een interactie tussen twee eiwitten van belang in gekweekte zoogdiercellen, wordt een proteïne uitgedrukt als een fusie met luciferase en de tweede als een fusie met YFP. Een interactie tussen de twee eiwitten van belang kan de donor en acceptor voldoende nauw energieoverdracht optreden brengen. Vergeleken met andere technieken voor het onderzoeken van eiwit-eiwit inwisselwerkingen, de BRET test is gevoelig, vergt weinig hands-on tijd en weinig reagentia, en is in staat om interacties die zwak, van voorbijgaande aard, of afhankelijk van de biochemische milieu binnen een levende cellen zijn te detecteren. Het is daarom een ideale benadering voor het bevestigen mogelijke interacties voorgesteld door gist twee-hybride of massaspectrometrie proteomics onderzoek, en bovendien is het zeer geschikt voor kartering interactie gebieden, waarbij het effect van post-translationele modificaties van eiwit-eiwit interacties en evaluatie van het effect van mutaties die in de patiënt DNA.
Introduction
Zowel klassieke koppeling en next-generation sequencing analyses van menselijke aandoeningen worden het openbaren van de klinische relevantie van eiwitten die betrokken zijn in een reeks van biologische pathways. Het is vaak het geval dat vóór de identificatie in deze studies, is er weinig of geen onderzoek naar de biologische functie van deze eiwitten zijn. Een vruchtbare weg beginnen de biologische functie van een eiwit van belang te bepalen welke andere eiwitten in de fysiologische omgeving interageert met. Karakteriseren van de moleculaire netwerken op deze manier geeft inzicht in de biologische processen die ten grondslag liggen van het menselijk fenotype.
De meest gebruikte grootschalige screening benaderingen voor het identificeren van kandidaat interactie partners voor eiwitten van belang zijn gist twee-hybride screening 1 en massa-spectrometrie gebaseerde proteomics 2. Deze methoden kunnen zeer succesvol zijn in het suggereren van potentiële interagerende eiwitten, maar are vals-positieve resultaten. Daarom is de bevestiging van een interactie die door gist twee-hybride of massaspectrometrie screening vereist validatie van de interactie met behulp van een tweede techniek. Typisch een co-immunoprecipitatie of pull-down test wordt gebruikt voor dit doel 3. Een nadeel van dergelijke technieken voor validatie is de vereiste voor cellysis, die de intracellulaire omstandigheden die essentieel voor het behoud bepaald eiwit interacties kunnen worden vernietigd. Een tweede nadeel is dat zwak of voorbijgaande eiwit interacties tijdens wasstappen kan worden verstoord. Bovendien zijn deze testen vereisen aanzienlijke praktische tijd beperkt het aantal monsters dat gelijktijdig kan worden verwerkt, en vaak tijdrovende optimalisering van reagentia en protocollen.
Om enkele van de problemen in verband met co-immunoprecipitatie experimenten te overwinnen, zijn er verschillende tests ontwikkeld op basis van fluorescentie-en bioluminescent eiwitten die gebruikt kunnen worden in levende cellen. De eerste testen waren gebaseerd op fluorescentie (of Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), de niet-radiatieve energieoverdracht tussen twee fluorescente eiwitten met overlappende emissie-en excitatiespectra 4. De efficiëntie van de energieoverdracht is sterk afstand afhankelijk, dus observatie van de FRET fenomeen vereist dat de donor en acceptor fluoroforen worden in de nabijheid. Om te testen op een interactie tussen twee eiwitten van belang, wordt een proteïne uitgedrukt als een fusie met het donor-fluorofoor (gewoonlijk cyaan fluorescerend eiwit, GVB) en de tweede als een fusie met de acceptor fluorofoor (gewoonlijk geel fluorescerend eiwit, YFP). Een interactie tussen de twee eiwitten van belang kan de donor en acceptor fluoroforen voldoende nauw energieoverdracht optreden brengen, wat zal resulteren in een meetbare toename van de lichtemissie door het YFP acceptor ten opzichte van de GVB donor. FRET is succesvol detecteren van eiwit-eiwit interacties in levende cellen 4 zijn. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van FRET voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties is de vereiste externe verlichting voor excitatie van de donor fluorofoor. Buitenverlichting resulteert in hoge achtergrond in de emissie-signaal, ongewenste excitatie van de acceptor, en fotobleking van donor en acceptor fluoroforen. Deze effecten verminderen de gevoeligheid van de assay voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties.
Een modificatie van de FRET assay die het probleem van hoge achtergrond overwint externe belichting is de bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET) assay 5,6. In het BRET systeem de donor fluorofoor wordt vervangen door een luciferase-enzym. Dus de energie voor de excitatie van de acceptor fluorofoor wordt gegenereerd in het systeem door de oxidatie van een luciferase substraat, waardoor Buitenverlichting overbodig. In dealgemene configuratie van deze test, de donor Renilla reniformis luciferase en acceptor YFP (voor een bespreking van alternatieve donor en acceptor eiwitten zien Pfleger et al.. 5). Dienovereenkomstig, in dit systeem, een eiwit van belang gefuseerd aan luciferase en een potentieel interactie eiwit YFP, of vice versa. De BRET test vereist de toevoeging van coelenterazine als een substraat voor luciferase. Omdat coelenterazine is celpermeable, is het mogelijk BRET assays in levende cellen. Echter, inheemse coelenterazine instabiel in waterige oplossing en de enzym-onafhankelijke uitsplitsing van coelenterazine zowel vermindert de concentratie van substraat beschikbaar voor de test genereert en autoluminescence, die de gevoeligheid van metingen van luciferaseactiviteit vermindert. Het gebruik van BRET in levende cellen is vergemakkelijkt door de ontwikkeling van beschermde coelenterazines, die in waterige oplossing stabiel, maar worden gesplitst door cytosolische esterases na diffusie door het celmembraan actief coelenterazine in de cel 7 genereren.
Na toevoeging van substraat aan cellen die luciferase-en YFP-fusie-eiwitten, is energieoverdracht gevolg van eiwit-eiwit interacties gekwantificeerd door monitoring emissie van luciferase en YFP. Omdat eiwit interacties direct kan worden gecontroleerd in levende cellen in multi-well platen, de BRET test is een eenvoudige, schaalbare methode voor het valideren van vermeende interacties die is kosten-en tijdbesparend.
Naast valideren vermeende interactors geïdentificeerd proteomische onderzoeksstudies, kan het BRET systeem ook worden gebruikt om testkandidaat interactors gevolg van eerdere biochemische en structurele studies van het eiwit van belang. Zodra de aanwezigheid van een eiwit-eiwit interactie is vastgesteld (hetzij via het BRET assay of andere technieken), de mogelijkheid van de BRET assay emp zijngelegeerd verder om de interactie te karakteriseren. Bijvoorbeeld kan het interagerende regio in kaart gebracht door het genereren afgeknotte versies van de eiwitten, en de betrokkenheid van specifieke resten in de interactie kan worden aangetoond door het creëren puntmutaties. Bovendien kan het modulerende effect van posttranslationele modificaties of kleine moleculen (bijvoorbeeld geneesmiddelen of liganden) van eiwit-eiwit interacties worden onderzocht 8-10.
De BRET test heeft ook een groot potentieel voor het onderzoek naar mutaties geïdentificeerd in patiënten DNA. Wanneer op een rol voor een mutatie is vastgesteld, het bestuderen van het effect van de mutatie van eiwit-eiwit interacties met BRET kan meer onthullen over de moleculaire etiologie van het fenotype 11. Sinds de komst van de volgende generatie sequencing methodologieën, het steeds vaker meerdere potentieel schadelijke mutaties worden geïdentificeerd in een individu, in welk geval het duidelijk is welke rele zijnvant het fenotype 12. In deze situatie kan de BRET test waardevol bij de evaluatie van de impact van de mutaties op de functie van eiwitten en daarmee hun relevantie voor de stoornis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Creatie van plasmiden
- Subkloneren van het cDNA voor elk eiwit van belang in zowel de PLUC en pYFP vectoren, middels standaard moleculair biologische technieken (figuur 1). Voor gedetailleerde protocollen zie Green et al. 13.
- Sequence alle construeert om te verifiëren dat de eiwitten van belang zijn in frame met de Luc / YFP sequence zonder tussenliggende stopcodons.
- Voer wens te bevestigen dat de fusie-eiwitten behouden biologische activiteit functionele bepalingen. In dit geval van de subcellulaire lokalisatie van YFP fusie-eiwitten werd vastgesteld door fluorescentie microscopie.
- Maak expressieplasmiden passende Luc en YFP controle eiwitten door engineering van de relevante targeting signalen in de PLUC en pYFP expressie vectoren. In de hier gepresenteerde geval, het genereren van nucleaire-gerichte Luc en YFP constructen door het invoegen van een nucleair lokalisatie signaal in de PLUC en pYFP vectoren.
- Makeneen positieve controle construct waarin Luc en YFP verweven is in een enkel polypeptide. In de hier gepresenteerde geval genereren van een positieve controle waarbij de YFP coderende sequentie in de vector is geïnsereerd PLUC.
- Selecteer een neutrale vulstof plasmide worden gebruikt om de massa van DNA gelijk in transfectie mixen. Gebruik van een plasmide dat geen eukaryote promotor en derhalve transcriptioneel inactief zoogdiercellen, zoals een bacteriële kloneringsvector.
2. Voorbereiding van DNA Mixes
- Schat de concentratie van de in sectie 1 gebaseerd op absorptie bij 260 nm beschreven plasmiden (1 absorptie eenheid overeenkomt met 50 ug / ml DNA). Bepaal de molecuulmassa van elk plasmide door het aantal basenparen vermenigvuldigen met 650 Da. Gebruik de concentratie en molecuulgewicht aan de molaire concentratie van elk plasmide preparaat te berekenen. Verdun het plasmide-DNA preparaten met een concentratie van 36 nM. Dit zullen de werkvoorradendat zal worden gebruikt om de DNA mixen voor transfectie bereiden.
- Bereid een controle-DNA mengsel dat 1800 ng plasmide vulstof in een eindvolume van 20 pl water.
- Bereid een controle-DNA mengsel dat 5 pl van de PLUC-controleconstruct. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
- Bereid een controle-DNA mengsel dat 5 pl PLUC-controleconstruct en 5 pl pYFP-controleconstruct. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
- Bereid een controle DNA mix met 5 pi van de positieve controle construct. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
- Bereid de volgende DNA mixen testen homodimerisatie van een eiwit van belang, X. Voor elke DNA mengsel gecombineerd 5 ul van de desbetreffende PLUC bouwen en 5 ul van de pvFP bouwen. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
A) PLUC-controle en pYFP-X
B) PLUC-X en pYFP-controle
C) PLUC-X en pYFP-X - Bereid de volgende DNA-mengsels te testen op interactie tussen twee eiwitten van belang, X en Y. Voor elke DNA mengsel gecombineerd 5 ul van de desbetreffende PLUC bouwen en 5 ul van de pYFP construeren. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
A) PLUC-controle en pYFP-X
B) PLUC-X en pYFP-controle
C) PLUC-controle en pYFP-Y
D) PLUC-Y en pYFP-controle
E) PLUC-X en pYFP-Y
F) PLUC-Y en pYFP-X
3. Transfectie
- Oogst Subconfluente HEK293 cellen van een 75 cm2 kolf. Verdun 10% van de totale cellen in 13 ml kweekmedium. Breng 130 pi celsuspensie in elk putje van een witteduidelijke bodem 96-well weefselkweek plaat. Kweekcellen voor 24 uur.
- Bereken het aantal putten worden getransfecteerd door het aantal DNA mixen vermenigvuldigen met 3. Breng serumvrij kweekmedium tot kamertemperatuur. Bereid een master mix met 6,3 ul van serum-vrij medium en 0,18 pi transfectiereagens per putje. Meng door vortexen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Bereid transfectie mengsels door toevoeging van 2 pi DNA mix 20 gl serumvrij medium / transfectie reagens master mix. Niet vortex. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Transfecteren drie putjes met elke transfectie mix afgifte 6,5 gl transfectiemengsel per putje. Kweek van de cellen nog eens 36-48 uur.
4. Meting van BRET Signal
- Los levende cellen luciferase substraat bij 34 mg / ml in DMSO door vortexen.
- Verdun gereconstitueerde levende cellen luciferasesubstraat op 1:1000 in substraat verdunning medium popnieuw verwarmd tot 37 ° C. Laat 50 pi substraat verdunning medium per well. Vortex te mengen. Een neerslag kan vormen, maar zal niet interfereren met de test.
- Zuig het kweekmedium van de 96-well plaat. Pipetteer 50 ul verdund levende cellen luciferase substraat in elk putje. Kweekcellen voor ten minste 2 uur (tot 24 uur).
- Verwijder het deksel van de 96-well plaat en incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de luminometer.
- Meet emissie van Luc en YFP een goed tegelijk. Meet emissie van Luc met behulp van een filter langer dan 470 nm blokkeren golflengten. Meet emissie uit YFP met een 500-600 nm band-pass filter. Integreer emissie signalen over 10 sec.
5. Data Analysis
- Gemiddeld de Luc emissie metingen van de 3 putjes die alleen het vulmiddel plasmide ontvangen. Trek deze waarde van alle andere Luc emissie metingen aan de-achtergrond afgetrokken Luc emissiewaarden produceren.
- Gemiddeld de YFP emissie metingen van de 3 putjes die alleen het vulmiddel plasmide ontvangen. Trek deze waarde van alle andere YFP emissie metingen aan de-achtergrond afgetrokken YFP emissiewaarden produceren.
- Voor elk putje, verdelen de-achtergrond afgetrokken YFP emissiewaarde door de-achtergrond afgetrokken Luc emissiewaarde de ongecorrigeerde BRET verhouding geven.
- Gemiddeld ongecorrigeerde BRET verhoudingen van de drie putjes die waren getransfecteerd met alleen de PLUC controle plasmide. Trek deze waarde van alle andere ongecorrigeerde BRET verhoudingen aan de gecorrigeerde BRET verhoudingen geven.
- Voor elk van de resterende sets van gecorrigeerde BRET verhoudingen gemiddelde waarden van de drie getransfecteerde putten BRET een uiteindelijke verhouding te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het principe van de BRET test wordt geïllustreerd in Figuur 2. De test opstelling gebruikt in de experimenten die hier voorgesteld wordt in Figuur 3. De detectie van een sterk BRET signaal uit cellen getransfecteerd met een luciferase-YFP fusieproteïne bevestigd dat energieoverdracht waarneembaar was in deze experimentele opstelling (figuur 4).
Ons onderzoek richt zich op de rol van het gezin foxp van transcriptionele repressors in ontwikkeling van de hersenen. Heterozygote mutaties die FOXP2 leiden tot een zeldzame vorm van spraak-en taalstoornis, waarvan de meest opvallende kenmerk is ontwikkelingsstoornissen verbale dyspraxie-moeite hebben met het produceren van de complexe sequenties van orofocial spierbewegingen nodig voor spraak 14-16. Hebben FOXP1 mutaties gemeld bij patiënten met autisme spectrum stoornissen en verstandelijke handicap gepaard gaat met ernstige spraak-en taalproblemen 17-20. De interactie van FOXPs met andere eiwitten wordt onderzocht om inzicht in de moleculaire mechanismen om de rol van deze eiwitten hersenontwikkeling relevante verkrijgen.
FOXP2 is bekend dat homo-of heterodimeren met andere foxp familieleden 21 derhalve FOXP2 homodimerisatie werd gebruikt om de BRET assay (figuur 4) valideren. Om te voorkomen dat interactie van FOXP2 fusie-eiwitten in deze test was verdwijnen door eiwitoverexpressie sluiten, de specificiteit van de interactie werd gedemonstreerd door introductie van een mutatie in de leucine zipper domein dimerisatie van FOXP2 (in-frame deletie van residuen E400), die is bekend dat homo-en heterodimerisatie 21 (figuur 5A) verstoren. Bij Luc-FOXP2.DE400 en YFP-FOXP2 fusieproteïnen werden tot co-expressie werd een verlaging van de BRET signaal waargenomen dan wanneer Luc-FOXP2 en YFP-FOXP2 werden co-expressie (Figuur 5B). Dit signaal daling was niet het gevolg van een verandering in de subcellulaire lokalisatie van het mutante eiwit (figuur 5C) of een verschil in expressieniveaus zoals beoordeeld door Western blotting (gegevens niet getoond). Het signaal vermindering werd ook waargenomen bij Luc-FOXP2 werd geuit YFP-FOXP2.DE400 (gegevens niet getoond). Aldus BRET is effectief in het detecteren van eiwit homodimerisatie en de interactie van eiwitten blijft specifieke wanneer deze eiwitten tot overexpressie worden gebracht als luciferase-en YFP-fusies. Bovendien is het gebruik van BRET in combinatie met gerichte mutatie van eiwitten heeft de potentie om afzonderlijke residuen die betrokken zijn bij eiwit-eiwit interacties te identificeren.
Om de effectiviteit van de BRET assay detectie heterotypische interacties, en de interactie van FOXP2 met FOXP1 getest (figuur 6). Een BRET signaal werd waargenomen in beide mogelijke configuraties van de test (dwz met FOXP2 als donor of als de acceptor Fusion eiwit). Daarom is de BRET assay kan zowel homo-en heterotypische interacties te detecteren. Bovendien is de geschiktheid van de BRET test voor het detecteren van interactie FOXP2 met niet-foxp eiwitten werd getest door het onderzoeken van de interactie met CtBP1, een transcriptionele co-repressor en bekende FOXP2 interactiepartner 21. De interactie tussen CtBP1 en FOXP2 werd oorspronkelijk voorgesteld door een gist twee-hybride screening en werd vervolgens bevestigd door co-immunoprecipitatie experimenten 21. De FOXP2-CtBP1 interactie werd gedetecteerd door het BRET assay wanneer FOXP2 was de donor fusieproteïne en CtBP1 was de acceptor, maar niet in de omgekeerde configuratie (figuur 7A). Dergelijke resultaten worden verwacht met de BRET (zie discussie paragraaf). De interactie tussen FOXP2 en CtBP1 waargenomen terwijl slechts een klein deel van CtBP1 werd gelokaliseerd in de kern (figuur 7B), waarbij de gevoeligheid van deze test. Dus de BRETtest is nuttig voor de validatie van vermeende interacties geïdentificeerd door middel van gist twee-hybride screening.
Tenslotte werd de BRET assay toegepast om de effecten van pathogene mutaties in FOXP2 van eiwit-eiwit interacties te onderzoeken. Twee puntmutaties in FOXP2 zijn gemeld aan een zeldzame autosomaal dominante aandoening die spraak en taal (Figuur 8A) veroorzaken. De R553H missense mutatie werd ontdekt door een koppeling studie in een groot gezin waarin de helft van de leden werden getroffen door de aandoening 14. De R328X nonsense mutatie werd ontdekt door gerichte sequencing van het FOXP2 locus in proefpersonen met een diagnose van ontwikkelings-verbale dyspraxie 22. Het vermogen van de mutante eiwitten te dimeriseren met wilde type FOXP2 werd gemeten met de BRET assay. De resultaten met wildtype FOXP2 als donor en mutant FOXP2 de acceptor worden getoond in Figuur 8B. Dezelfde resultaten werden waargenomen met mutant FOXP2 als donor en wild-type als de acceptor (gegevens niet getoond). De R553H mutatie, die binnen het DNA-bindingsdomein van FOXP2, had geen invloed op het vermogen van het mutante eiwit te dimeriseren met het wildtype. De pathogenese van deze mutatie kan daarom ook een dominant negatief effect als gevolg van dimerisatie van de mutant met de normale eiwit 23. De R328X mutatie introduceert een stopcodon, zodat het gecodeerde eiwit mist de leucine zipper dimerisatie domein en het DNA-bindende domein en toont enkele cytoplasmatische mislocalization (Figuur 8C). In overeenstemming met de afwezigheid van de dimerisatie domein en mislocalization naar het cytoplasma, toont het afgeknotte eiwit sterk verminderde interactie met wildtype FOXP2. Deze mutatie is daarom waarschijnlijk pathogeen door haploinsufficiëntie zijn. Dus de BRET assay kan inzicht geven in de biologische effecten van mutaties ontdekt in patiënten.
Figuur 1. Vectoren voor expressie van YFP-en luciferase-fusie-eiwitten. A) Cirkel kaarten van de pYFP en PLUC vectoren. De PLUC vector wordt gebruikt voor expressie van luciferase fusie-eiwitten BRET donoren. De pYFP vector wordt gebruikt voor expressie van YFP fusie-eiwitten als BRET acceptoren. Vectoren hebben een CMV-promoter (P CMV) voor hoog-niveau expressie in zoogdiercellen, een meervoudige kloneringsplaats (MCS) voor insertie van cDNA voor eiwitten van belang en een kanamycineresistentiegen (Kan r) en bacteriële replicatie-oorsprong voor de voortplanting van het plasmide in bacteriën. B) meerdere kloneringsplaats van de PLUC en pYFP vectoren. Het einde van de YFP coderende sequentie wordt weergegeven in blauw. Geselecteerde restrictieplaatsen zijn geannoteerd. Merk op dat de XbaI site is geblokkeerd door overlapping dam methylering in standaard stammen van E. coli. cDNA's die coderen voor eiwitten van belang worden gekloneerd in-frame met de aminozuursequentie getoond. In de hier beschreven experimenten werden inserts gekloneerd in de BamHI en XbaI restrictieplaatsen (onderstreept). Stopcodons zijn verwijderd uit het einde van de luciferase en YFP coderende sequenties een open leesraam omvat het luciferase / YFP en gesubkloneerd cDNA van belang. Stopcodons aanwezig zijn aan het einde van de meervoudige kloneringsplaats in alle drie leesramen (getoond in rood), daarom is het niet essentieel om een stopcodon in het geïnsereerde cDNA omvatten.
Figuur 2. Principe van de BRET systeem. Eiwitten plaats, X en Y, gefuseerd aan een donor-enzym luciferase (Luc, piekemissie 475 nm) en een acceptor fluorescerend eiwit (YFP piek emissie 530 nm), respectievelijk. Fusie-eiwitten tot expressie in gekweekte zoogdiercellen en na toevoeging van een cel-permeabele luciferase substraat emissie van Luc wordt gemeten met een filter langer dan 470 nm en emissie van YFP blokkeren golflengten wordt gemeten met een 500-600 nm banddoorlaatfilter. A) geen interactie tussen eiwit X en eiwit Y energieoverdracht van Luc YFP niet optreedt. B) Interactie tussen eiwit X en eiwit Y Resonantie energieoverbrenging plaatsvindt van Luc YFP veroorzaakt een toename in de verhouding van emissie gemeten met het 500-600 nm banddoorlaatfilter tegenover het filter langer dan 470 nm blokkeren golflengten.
Figuur 3. Assay setup. De test setup te testen vooreen interactie tussen twee eiwitten van belang, X en Y. eiwitten van belang gefuseerd aan luciferase (Luc) als BRET donor en geel fluorescerend eiwit (YFP) als BRET acceptor. In de controle eiwitten, Luc en YFP worden gefuseerd aan een peptide dat een targeting signaal voor de desbetreffende subcellulair compartiment (P), indien van toepassing. A) Controls worden in elke plaat. 1) Mock-transfectiecontrole naar achtergrondconcentraties van luminescentie en fluorescentie als gevolg van lichtmeter lawaai en enzym-onafhankelijke afbraak van substraat vast te stellen; 2) PLUC-control alleen transfectie met het deel van luciferase emissie die wordt gedetecteerd binnen het bereik van YFP emissie in afwezigheid van acceptor BRET stellen; 3) Transfectie van PLUC-controle en pYFP-controle aan de basislijn BRET signaal als gevolg van Luc-YFP interactie vast te stellen; 4) Transfectie van Luc-YFP fusie als een positieve controle te verzekeren dat een BRET signaal kan worden gemeten. B) Reeks experimouderlijke voorwaarden testen een interactie tussen twee eiwitten van belang, X en Y 1, 2, 4, 5) Controles voor niet-specifieke interactie tussen de eiwitten van belang en Luc / YFP; 3) Test staat met X als de donor en Y als de acceptor; 6) Test staat met Y als de donor en X als de acceptor.
Figuur 4. Detectie van FOXP2 homodimerisatie. A) De BRET assay voor de detectie van FOXP2 homodimeren valideren, werden HEK293-cellen getransfecteerd met constructen voor expressie van luciferase (donor) of YFP (acceptor) gefuseerd aan hetzij FOXP2 (P2) of een nucleair lokalisatiesignaal (-). De nucleaire gerichte luciferase en YFP eiwitten dienen als negatieve controles. Als een positieve controle voor detectie van een signaal BRET werden cellen ook getransfecteerd met een construct voor expressie van een luciferase-YF. P fusieproteïne (+) B) Fluorescentie microscopie beelden van cellen getransfecteerd met YFP gefuseerd aan een nucleair lokalisatiesignaal (-) of met YFP gefuseerd aan FOXP2 (P2).
Figuur 5. Gebruik van dimerisatie-deficiënte FOXP2 aan specificiteit van de test aan te tonen. A) Schematische weergave van het FOXP2 eiwit die de positie van de DE400 mutatie, die dimerization verstoort. De leucinezipper dimerisatiedomein wordt getoond in groen en het DNA-bindende domein in het geel. B) Om te testen of overexpressie van eiwitten kan leiden tot vals-positieve resultaten in de BRET assay, de specificiteit van de test werd gemeten met de FOXP2.DE400 variant. Cellen werden getransfecteerd met constructen voor expressie van luciferase (donor) of YFP (acceptor) gefuseerd aan FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) of Nuclear lokalisatiesignaal (-). C) Fluorescentie microscopie beelden van cellen getransfecteerd met YFP gefuseerd aan FOXP2 (P2) of FOXP2.DE400 (DE).
Figuur 6. Detectie van FOXP1-FOXP2 heterodimerisatie. A) De BRET assay voor de detectie van heterodimerisatie tussen de homologe eiwitten FOXP2 en FOXP1 valideren, werden cellen getransfecteerd met constructen voor expressie van luciferase (donor) of YFP (acceptor) gefuseerd aan hetzij FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) of een nucleair lokalisatiesignaal (-). B) Fluorescentie microscopie beelden van cellen getransfecteerd met YFP gefuseerd aan FOXP1 (P1) of FOXP2 (P2).
Figuur 8. Evaluatie van de effecten van pathogene FOXP2 mutaties op eiwit-eiwit interacties. A) Schematische weergave van het FOXP2 eiwit met de posities van de R553H en R328X mutaties die een zeldzame fo veroorzakenrm van spraak-en taalstoornis. De leucine zipper dimerisatiedomein wordt getoond in groen en het DNA-bindende domein in geel. B) De bruikbaarheid van de BRET test voor het evalueren van het effect van pathologische mutaties op eiwit-eiwit-interacties, de effecten van de R553H en R328X mutaties op het vermogen van de mutante eiwitten FOXP2 dimeriseren met normale FOXP2 onderzocht. Cellen werden getransfecteerd met constructen voor expressie van luciferase (donor) of YFP (acceptor) gefuseerd met hetzij normale FOXP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328) of een nucleair lokalisatiesignaal (-). C ) Fluorescentie microscopie beelden van cellen getransfecteerd met YFP gefuseerd aan FOXP2.R553H (R553H) of FOXP2.R328X (R328X). In dit beeld FOXP2.R328X voornamelijk kern, maar in andere cellen in de populatie toont een cytoplasmatische verdeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwerp van het fusie-eiwit expressie constructen is een cruciale stap in het opzetten van de BRET assay. In de hier gepresenteerde experimenten werden de eiwitten van belang gefuseerd aan de C-terminus van luciferase of YFP. Het is ook mogelijk en noodzakelijk zijn, eiwitten gefixeerd op de N-terminus van luciferase / YFP. Voor sommige eiwitten, fusies kunnen alleen worden bij de N-of C-terminus aanvaard Om verstoring van de eiwit structuur en functie te voorkomen. Verder is het voor transmembraan eiwitten, waarin de N en C uiteinden bevinden zich in verschillende subcellulaire compartimenten, de luciferase / YFP eiwitten worden gefuseerd aan het uiteinde dat in dezelfde ruimte als de interactie partner. Bijvoorbeeld, in studies van de interactie tussen transmembraan G-eiwit gekoppelde receptoren en cytoplasmatische β-arrestine, werd de luciferase gefuseerd aan het carboxyl intracellulaire staart van de transmembraan receptor 8. In andere gevallen de geometrie van een eiwit-eiwit interactiop leiden tot energieoverdracht een efficiënter via een van de twee mogelijke combinaties van fusieproteïnen. Af en energie-overdracht kan niet worden gedetecteerd helemaal als het gebruik van slechts een combinatie, die leidt tot vals negatieve resultaten.
De sequentie van de peptide-linker tussen luciferase / YFP en het eiwit van belang kan ook de efficiëntie van de resonantie energieoverbrenging. De linker moet lang genoeg zijn om luciferase / YFP en het eiwit van belang te vouwen zonder belemmering. Een langere linker meer flexibiliteit verlenen aan het polypeptide op het kruispunt van luciferase / YFP en het eiwit van belang, die BRET efficiency kan verhogen door het vergemakkelijken van uitlijning van de donor en acceptor dipolen. Evenwel BRET minder efficiënt als er te veel ruimte voor de linker. In de experimenten hier, klonering van de eiwitten van belang in de BamHI en XbaI plaatsen van de expressie vecren resulteerde in een 23-aminozuur linker, zie figuur 1. Deze linker succesvol is geweest voor het detecteren van interacties tussen verschillende paren van eiwitten.
Alvorens over te gaan tot experimenten Bret moet ervoor worden gezorgd dat de fusie-eiwitten behouden normale biologische activiteit. De werking van YFP kan worden bepaald door directe visualisatie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. De werking van luciferase kan worden getest met behulp van commercieel verkrijgbare kits. Het effect van fusie van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten van belang kan worden beoordeeld door immunokleuring of bij YFP-fusies, door directe visualisatie. Het effect van fusie op de functie van het eiwit van belang kan worden onderzocht door proteïne-specifieke assays - bijvoorbeeld voor een transcriptiefactor passend kan zijn voor DNA-bindende activiteit assay. Merk op dat luminescentie metingen gedurende het experiment voor een handige in-assay bevestigenatie van luciferaseactiviteit.
Het is belangrijk om te overwegen wat de passende controle-constructen voor uw eiwit van belang. YFP en luciferase zijn overwegend cytoplasmatische en zijn daarom passende controles wanneer de eiwitten van belang zijn cytoplasma. Wanneer de eiwitten van belang zijn gelokaliseerd in andere subcellulaire compartimenten wenselijk om luciferase en YFP passen met peptide signalen hun handel naar de relevante compartiment kunnen zijn. Hier de eiwitten van belang waren transcriptiefactoren die zijn gelokaliseerd op de kern, dan luciferase en YFP werden gemodificeerd door de toevoeging van een nucleair lokalisatiesignaal. Specifiek, een peptide met inbegrip van nucleaire lokalisatiesignaal van SV40 grote T antigen (CGYGPKKKRKVGGLDN) werd toegevoegd aan de C-terminus van luciferase en YFP door ligatie van synthetisch dubbelstrengs oligonucleotiden tussen de BamHI en XbaI plaatsen van ee PLUC en pYFP vectoren. Toevoeging van dit signaal veroorzaakte een aanzienlijke herverdeling van proteïne naar de kern (figuur 4B).
Inbegrip van de passende controles is cruciaal voor de interpretatie van BRET experimenten. Een mock-transfectie controle met behulp van een inert vulmiddel plasmide is essentieel om achtergrondconcentraties van luminescentie en fluorescentie als gevolg van lichtmeter lawaai en enzym-onafhankelijke afbraak van substraat vast te stellen. Met moderne luminometers en luciferase substraten achtergrond luminescentie niveaus zijn meestal erg laag. Transfectie met de geschikte controle-luciferase construct in afwezigheid van een YFP construct is belangrijk de hoeveelheid luciferase emissie die wordt gedetecteerd binnen het bereik van YFP emissie in afwezigheid van acceptor BRET stellen. Transfectie met de besturing en controle YFP luciferase constructen verschaft de basislijn BRET signaal dat van Luc-YFP interactie. Voor every paar eiwitten die worden getest op interacties, is het belangrijk om elke een alleen te transfecteren met de juiste controle-construct, zoals geïllustreerd in figuur 3B, om te controleren voor een niet-specifieke interactie tussen de eiwitten worden getest en luciferase / YFP. Vooral bij het uitvoeren van een experiment BRET voor de eerste keer, is het belangrijk om een Luc-YFP fusie-eiwit als positieve controle om te garanderen dat een BRET signaal waarneembaar in de experimentele opstelling. Hier de coderende sequentie van YFP werd gekloneerd in PLUC bij de BamHI en XbaI plaatsen van een fusie-eiwit waarin YFP gefuseerd aan de C-terminus van luciferase produceren.
In het hier beschreven protocol, de samenstelling van de DNA mixen voor transfectie werd berekend met de aanname dat de gemiddelde grootte van de Luc / YFP fusieproteïne expressieconstructen is niet groter dan 7,5 kb. Als de expressie bouwts zijn aanzienlijk groter dan dit, dan is het aantal mol van elk expressieconstruct toegevoegd aan de transfectie mix wellicht worden verminderd zodat de totale hoeveelheid DNA in het mengsel niet de maximaal toelaat de hoeveelheid transfectie reagens overschrijden. Ook de hoeveelheid transfectie reagens en de hoeveelheid DNA in de transfectie mixen kan verhoogd worden ingevolge richtlijnen van de fabrikant. Experimentele manipulatie van 96-well platen wordt versneld door het gebruik van multichannel pipetten en aspirators. Het is wenselijk om variatie tussen monsters in de lengte van transfectiemengsel incubatietijd na toevoeging van DNA om het serumvrij medium / transfectie reagens mix minimaliseren daarom beginnen met het toevoegen transfectie mixen cellen zodra het eerste mengsel is incubatie gedurende 10 min . Omdat de BRET acceptor eiwitten YFP fusies, is het mogelijk om transfectie efficiëntie te beoordelen door fluorescentiemicroscopie of door meting van fluorescentie in een microplaat reader. Het succes van een BRET experiment afhankelijk van een goede mate van transfectie zodat het wenselijk is te zorgen dat transfectie bevredigend alvorens toevoeging van substraat en meting van het signaal BRET. De YFP tag maakt het ook mogelijk kwantificering van acceptor eiwit expressie niveaus met behulp van een microplaatlezer. Kwantificering van acceptor eiwit niveaus kunnen nuttig zijn voor optimalisatie en trouble-shooting van BRET experimenten.
De cellen worden geïncubeerd gedurende ten minste 2 uur met luciferase substraat voor de meting van de BRET signaal zodat een stabiel signaal bereikt. Het is ook aanvaardbaar om cellen geïncubeerd met substraat voor maximaal 24 uur. In dit geval zal de totale luminescentie tellingen lager zijn, maar de BRET verhoudingen moet echter ongewijzigd blijven. Langere incubaties met substraat kan handiger (bijvoorbeeld 's nachts) en ook toestaan dat de meting van BRET signalen voor en na een experimentele manipulatie zoalsals toevoeging van een farmaceutische verbinding. Idealiter optimaliseren cel zaaidichtheid zodat cellen confluentie bereiken in het meetmoment. Als celdichtheid boven optimum dan kan het voordelig zijn om het signaal te meten BRET eerder tijdstip naar cel overgroei te voorkomen. Bij gebruik van een celtype anders dan HEK293, moet u celkweek en transfectie te optimaliseren. BRET experimenten ook met succes uitgevoerd in HeLa-cellen volgens de hieronder beschreven protocol.
In de hier beschreven experimenten werden luminescentie tellingen gemeten bij kamertemperatuur, waarbij de optimale temperatuur voor Renilla luciferaseactiviteit. Bij het uitvoeren van een tijdsverloop experiment in de luminometer het de voorkeur om de temperatuur op 37 ° C. We hebben dezelfde experimenten uitgevoerd bij kamertemperatuur en bij 37 ° C en geen significant verschil in de resultaten waargenomen. Bij het uitvoeren van experimenten bij kamertemperatuur the plaat moet worden toegestaan om 10 min in evenwicht in de lichtmeter voorafgaand aan de meting om stabilisatie van Renilla luciferase activiteit mogelijk te maken. Hier werden luminescentiesignalen geïntegreerd over 10 seconden, die doorgaans met hoge gevoeligheid, met name voor eiwitten met lage expressieniveaus. Evenwel signalen geïntegreerd over kortere tijdsperioden indien voldoende gevoeligheid. Vanwege de stabiliteit van de luminescentie-signaal geproduceerd door de levende cel luciferase substraat, is het aanvaardbaar meten tot 10 seconden per putje bij elke golflengte.
Een interactie tussen twee eiwitten van belang wordt bevestigd door de BRET assay als het signaal van de testomstandigheden aanzienlijk groter is dan de signalen van de desbetreffende controle-omstandigheden. Het ontbreken van een BRET signaal niet noodzakelijkerwijs bevestiging dat een interactie niet optreedt. Bij een onverwachte of negatief resultaat, de totale luminescentie en fluorescentieNVU tellingen moeten worden onderzocht om ervoor te zorgen dat alle putjes correct werden getransfecteerd.
De BRET signaal wordt ook beïnvloed door de verhouding van eiwitexpressie niveaus derhalve nuttig om de relatieve expressieniveaus van de twee eiwitten van belang onderzocht door vergelijking van de fluorescentie telt van putjes getransfecteerd met YFP fusies van de twee eiwitten (of luminescentie telt van putjes getransfecteerd met luciferase fusies). Als een fusie-eiwit tot expressie sterker dan het andere, betere resultaten waarschijnlijk worden verkregen indien het eiwit met het onderste expressieniveau gefuseerd aan luciferase dat het geval in de hier gepresenteerde experimenten was met FOXP2 en CtBP1. Het is ook mogelijk om eiwitniveaus manipuleren door instellen van de molaire verhouding van expressieplasmiden in de transfectie mix. Energieoverdracht tussen bepaalde paren fusie-eiwitten kunnen zeer inefficiënt vanwege de geometrie van de eiwitcomplex. In dergelijkegevallen kan het nuttig zijn om te proberen het fuseren van de eiwitten van belang aan de alternatieve uiteinden van luciferase / YFP.
Het is noodzakelijk om te bevestigen dat de BRET representeert een fysiologische interactie eiwit-eiwit en niet alleen vanwege eiwitoverexpressie. Om deze reden is het belangrijk om bruto overexpressie van eiwitten voorkomen. Specificiteit van een eiwit-eiwit interacties in het BRET systeem kan verder worden bevestigd door het introduceren van mutaties in de eiwitten waarvan bekend is dat de affiniteit van de interactie te verminderen, zoals hier aangetoond via de DE400 variant van FOXP2. De mutante eiwitten kunnen verder worden gebruikt in de concurrentie en verzadiging bindend BRET assays. In een competitie assay worden de concentraties van donor en acceptor fusieproteïnen constant te houden terwijl de concentratie van een gecodeerde versie van een van de interactiepartners als concurrent. Untagged wild-type eiwit moet concurreren met de tag version voor binding aan de interactiepartners, resulterend in een afname van de BRET signaal, terwijl het mutante eiwit een verminderd vermogen om te concurreren de interactie moet vertonen. In een verzadiging bindingstest wordt de concentratie van de donor fusieproteïne constant gehouden, terwijl het verhogen van de concentratie van de acceptor. Voor een specifieke interactie de BRET signaal moet uiteindelijk plateau als alle donormoleculen verzadigd raken met de acceptor. Voor een niet-specifieke interactie, zal de BRET signaal meestal vertonen een kleine lineaire toename gevolg van een toename in willekeurige botsingen tussen de donor en acceptor moleculen. In de praktijk interacties van matige affiniteit van oplosbare proteïnen, kan het moeilijk zijn om een voldoende hoge acceptor bereiken donor verhouding tot verzadiging observeren met behoud van voldoende niveaus van de donor eiwitten voor signaaldetectie.
Voorzichtigheid is geboden bij de interpretatie van differenc worden uitgeoefendes tussen BRET verhoudingen. De BRET test geeft geen kwantitatieve maat voor de affiniteit van een eiwit-eiwit interactie, omdat de efficiëntie van de energieoverdracht wordt door andere dan de sterkte van de interactie eiwit-eiwit factoren. Dergelijke factoren omvatten de verhouding van de niveaus van de fusie-eiwitten in de cel, de geometrie van de interactie en de tarieven van associatie en dissociatie van het complex. De verkregen met twee verschillende paren eiwitten ratio dus niet noodzakelijkerwijs vergeleken, maar vergelijkingen mogelijk zijn tussen verschillende varianten van hetzelfde eiwit, zoals het wildtype en ΔE400 varianten van FOXP2 hier getoond. Af en toe kan licht negatief BRET verhoudingen in acht worden genomen. Negatieve verhoudingen kan de fout in de meting van de basislijn verhouding in cellen getransfecteerd met alleen de PLUC-controlevector. Zeer hoge verhoudingen zijn vaak indicatief voor eiwit aggregatie, die kan worden bevestigd door observatie van getransfecteerde ceLLS met een fluorescentiemicroscoop. Er wordt vastgesteld of aggregatie biologisch relevant of een artefact eiwit overexpressie.
Concluderend, de BRET assay beschreven is een krachtige aanpak om eiwit-eiwit interacties in levende cellen te onderzoeken. De toepassing van BRET is aangetoond voor de doeleinden van het valideren kandidaat interactoren van proteomics onderzoek studies, identificeren van specifieke residuen betrokken bij eiwit-eiwit interacties en de effecten van mutaties in DNA patiënt. Omdat interacties gedetecteerd in real time zonder de vereiste van cellysis, kan de BRET signaal voor en na een behandeling zoals de toevoeging van een farmaceutische verbinding of ligand 7. De BRET assay toont grote belofte voor gebruik in functionele genomica onderzoek naar de biologische relevantie van genetische varianten ontdekt door next-generation sequencing beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanodrop 8000 | Nanodrop | Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes. | |
| 96-microwell plates, flat bottom, white | Greiner Bio One | 655098 | White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off. |
| Infinite F200Pro plate reader with control software | TECAN | Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. | |
| pLuc, pYFP, positive control plasmid | N/A | N/A | Plasmids available from the authors upon request. |
| pGEM-3Zf(+) | Promega | P2271 | Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable. |
| HEK293 cells | ECACC | 85120602 | Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable. |
| DMEM, high glucose, with phenol red | Gibco | 41966 | This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium. |
| DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) | Gibco | 21063 | This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use. |
| OptiMEM | Gibco | 31985 | OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v. |
| GeneJuice transfection reagent | Novagen | 70967 | If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions. |
| DMSO | Sigma | D2650 | Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. |
| EnduRen live-cell substrate | Promega | E6481 | Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium. |
References
- Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
- Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
- Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
- Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
- Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
- Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
- Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
- Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
- O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
- Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
- Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
- Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
- Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
- MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
- Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
