Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Summary

As interações entre proteínas são fundamentais para todos os processos celulares. Usando bioluminescência Transferência de Energia de Ressonância, a interacção entre um par de proteínas podem ser monitoradas em células vivas e em tempo real. Além disso, os efeitos das mutações potencialmente patogénicos pode ser avaliada.

Abstract

Ensaios com base na transferência de Bioluminescência Resonance Energy (BRET) fornecer meios sensíveis e confiáveis ​​para monitorar as interações proteína-proteína em células vivas. BRET é a transferência não radiativa de energia a partir de uma enzima luciferase 'dador' para uma proteína fluorescente "aceitadora". Na configuração mais comum deste ensaio, o doador é Renilla reniformis luciferase eo receptor é uma proteína fluorescente amarela (YFP). Devido a eficiência de transferência de energia é fortemente dependente da distância, a observação do fenômeno BRET exige que o doador e receptor estar em estreita proximidade. Para se testar a interacção entre duas proteínas de interesse em células de mamíferos em cultura, uma proteína é expressa como uma fusão com a luciferase e a segunda forma de uma fusão com a YFP. Uma interação entre as duas proteínas de interesse podem levar o doador e receptor suficientemente perto para a transferência de energia para ocorrer. Em comparação com outras técnicas para a investigação de proteína-proteína eminterações, o ensaio BRET é sensível, requer pouca prática em tempo e alguns reagentes, e é capaz de detectar as interações que são fracos, transitórios, ou dependente do ambiente bioquímico encontrado dentro de uma célula viva. É, portanto, uma abordagem ideal para confirmar interacções putativos sugeridos pela proteómica estudos de levedura de dois híbridos ou de espectrometria de massa, e, além disso, é bem apropriado para as regiões de mapeamento interagindo, avaliando o efeito de modificações pós-traducionais sobre as interacções proteína-proteína, e avaliar o impacto das mutações identificadas no DNA do paciente.

Introduction

Ambos ligação clássica e de próxima geração analisa seqüenciamento de doenças humanas estão revelando a relevância clínica de proteínas envolvidas em uma variedade de caminhos biológicos. É muitas vezes o caso de que, antes da sua identificação, em tais estudos, verificou-se pouca ou nenhuma investigação do papel biológico destas proteínas. Uma via proveitosa para começar a explorar a função biológica de uma proteína de interesse é o de identificar quais outras proteínas que interagem com o seu contexto na fisiológico. Caracterizando redes moleculares desta forma fornece insights sobre os caminhos biológicos subjacentes ao fenótipo humano.

A triagem em larga escala mais utilizado abordagens para identificação de parceiros de interação candidatos para proteínas de interesse são fermento de rastreio de dois híbridos ¹ e proteômica baseada em espectrometria de massa ^2. Estes métodos podem ser muito bem sucedido em sugerir potenciais proteínas que interagem, mas arenviar um e vulneráveis ​​a resultados falsos positivos. Portanto, a confirmação de uma interação identificado por levedura híbrida de dois ou screening espectrometria de massa requer a validação da interação com uma segunda técnica. Tipicamente, uma co-imunoprecipitação ou suspenso ensaio é utilizado para este fim ^3. Uma desvantagem do uso de tais técnicas para a validação é o requisito para a lise da célula, que destrói as condições intracelulares que podem ser essenciais para a manutenção de certas interacções proteína. Uma segunda desvantagem é que as interacções proteína fracos ou transiente pode ser interrompida durante a etapa de lavagem. Além disso, estes ensaios exigem mãos no tempo significativos, são limitados no número de amostras que podem ser processadas ao mesmo tempo, e frequentemente requerem optimização demorado de reagentes e protocolos.

Para ultrapassar alguns dos problemas associados com as experiências de co-imunoprecipitação, vários ensaios foram desenvolvidos com base na fluorescência e bioluminescent proteínas que podem ser utilizados em células vivas. Os primeiros desses ensaios foram baseados em fluorescência (ou Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), a transferência não radiativa de energia entre duas proteínas fluorescentes com sobreposição de espectros de emissão e excitação ^4. A eficiência de transferência de energia é fortemente dependente da distância, por conseguinte, a observação do fenómeno FRET requer que os doadores e aceitadores de fluoróforos estar em estreita proximidade. Para se testar a interacção entre duas proteínas de interesse, uma proteína é expressa como uma fusão com o fluoróforo dador (proteína fluorescente vulgarmente ciano; PCP) e a segunda, como uma fusão com o fluoróforo aceitador (proteína fluorescente vulgarmente amarelo; YFP). Uma interacção entre as duas proteínas de interesse podem trazer os doadores e aceitadores de fluoróforos suficientemente estreitas para a transferência de energia para ocorrer, o que vai resultar num aumento mensurável na emissão de luz a partir do aceitador YFP em relação ao dador PCP. FRET tem sido bem sucedido na detecção de interacções proteína-proteína em células vivas ^4. A principal desvantagem do uso de FRET para detectar interacções proteína-proteína é o requisito para uma iluminação externa para a excitação do fluoróforo dador. Iluminação resultados externas no alto de fundo no sinal de emissão, excitação indesejável do receptor, e fotodegradação do dador e do fluorophores aceitador. Estes efeitos reduzem a sensibilidade do ensaio para a detecção de interacções proteína-proteína.

Uma modificação do ensaio de FRET, que ultrapassa o problema do elevado fundo de iluminação externa é a transferência de bioluminescência Resonance Energy (BRET) ensaio de ^5,6. No sistema BRET o fluoróforo dador está substituído por um enzima luciferase. Assim, a energia de excitação do fluoróforo aceitador é gerado dentro do sistema através da oxidação de um substrato da luciferase, tornando desnecessário iluminação exterior. Na maioriaconfiguração comum deste ensaio, o dador é de Renilla reniformis luciferase e o aceitador é YFP (para uma discussão de dador alternativa e proteínas aceitadoras ver Pfleger et al. ^5). Assim, neste sistema, uma proteína de interesse é fundida a uma proteína de luciferase e potencialmente interagindo com YFP, ou vice-versa. O ensaio BRET requer a adição de celenterazina como um substrato para a luciferase. Porque coelenterazina é célula-permeável, que é possível realizar ensaios de BRET em células vivas. No entanto, a coelenterazina nativa é instável em solução aquosa, e a desagregação independente de enzima de coelenterazina tanto reduz a concentração do substrato disponível para o ensaio e gera autoluminescence, o que reduz a sensibilidade das medições da actividade da luciferase. O uso de BRET em células vivas tem sido facilitada pelo desenvolvimento de coelenterazines protegidas, as quais são estáveis ​​em solução aquosa mas são clivadas por esterase citosólicas após difusão através da membrana celular para gerar coelenterazina activo dentro da câmara ^7.

Após a adição de substrato para as células que expressam as proteínas de fusão de luciferase-YFP-e, a transferência de energia resultante de interacções proteína-proteína é quantificada através da monitorização da emissão de luciferase e YFP. Como as interações protéicas podem ser monitorados diretamente em células vivas em placas multi-bem, o ensaio BRET constitui um método simples e escalável, para validar as interações putativos que é custo-eficiente e em tempo.

Além de validar interactores putativas identificadas em estudos de rastreio proteomic, o sistema BRET também pode ser usado para testar candidatos interactores provenientes de estudos bioquímicos e estruturais anteriores sobre a proteína de interesse. Uma vez que a existência de uma interacção proteína-proteína foi estabelecido (ou usando o ensaio BRET ou por outras técnicas), existe potencial para o ensaio BRET ser employed para caracterizar a interação. Por exemplo, as regiões que interagem podem ser mapeadas através da geração de versões truncadas de proteínas, e a participação de resíduos específicos na interacção pode ser demonstrada através da criação de mutações pontuais. Além disso, o efeito modulador de modificações pós-tradução ou moléculas pequenas (tais como drogas ou ligandos) em interacções proteína-proteína podem ser investigadas ^8-10.

O ensaio BRET também tem um grande potencial para a investigação de mutações identificadas no DNA do paciente. Nos casos em que um papel causal para uma mutação tenha sido estabelecida, a estudar o efeito da mutação sobre as interacções proteína-proteína utilizando BRET pode revelar mais sobre a etiologia molecular do fenótipo ^11. Desde o advento de metodologias de sequenciamento de próxima geração, que é cada vez mais comum para várias mutações potencialmente prejudiciais para ser identificado dentro de um indivíduo, caso em que não está claro quais são relevante para o fenótipo ^12. Nesta situação, o ensaio BRET pode ser valiosa na avaliação do impacto das mutações na função de proteínas e, consequentemente, a sua relevância para o transtorno.

Protocol

1. Criação de plasmídeos

1. Subclonar os ADNc para cada uma das proteínas de interesse em ambos os vectores płuc e pYFP, ​​utilizando técnicas de biologia molecular convencionais (Figura 1). Para protocolos detalhados ver Green et al ^13.
2. Sequência de todas as construções para verificar que as proteínas de interesse são em moldura com a sequência de Luc / YFP sem intervenientes codões de paragem.
3. Realizar ensaios funcionais, tal como desejado para confirmar que as proteínas de fusão retêm a actividade biológica. No caso apresentado a localização subcelular de proteínas de fusão YFP foi determinado por microscopia de fluorescência.
4. Adicione os plasmídeos de expressão para as proteínas de controlo Luc e YFP adequadas, projetando os sinais de segmentação relevantes para os vectores de expressão e płuc pYFP. No caso apresentado, gerar Luc e YFP construções nucleares-alvo através da inserção de um sinal de localização nuclear em vetores pluc e pYFP.
5. Fazeruma construção controle positivo em que Luc e YFP são fundidos em um único polipeptídeo. No caso aqui apresentado, gerar um controlo positivo, em que a sequência de codificação de YFP é inserido no vector płuc.
6. Seleccionar um plasmídeo de enchimento neutro a ser utilizada para equalizar a massa de ADN nas misturas de transfecção. Usar um plasmídeo que não tem o promotor eucariótico e, por conseguinte, será transcricionalmente inactivo em células de mamíferos, como por exemplo um vector de clonagem bacteriana.

2. Preparação de ADN Misturas

1. Estimar a concentração de todos os plasmídeos descritos na secção 1 com base na absorvância a 260 nm (1 unidade de absorvância é equivalente a 50 ug / ml de DNA). Determinar a massa molecular de cada um dos plasmídeos através da multiplicação do número de pares de bases de 650 Da. Utilizar a concentração e da massa molecular para calcular a concentração molar de cada preparação de plasmídeo. Dilui-se as preparações de DNA de plasmídeo a uma concentração de 36 nM. Estas serão as ações de trabalhoque irão ser usadas para preparar as misturas de ADN para transfecção.
2. Prepara-se uma mistura de ADN de controlo que contém 1.800 ng de plasmídeo de enchimento em um volume final de 20 ul de água.
3. Prepara-se uma mistura de ADN de controlo contendo 5 ul da construção płuc-controlo. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
4. Prepare uma mistura de DNA controle contendo 5 mL de pluc de controle de construção e 5 mL de pYFP de controle de construção. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
5. Prepara-se uma mistura de ADN de controlo contendo 5 ul de construção de controle positivo. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
6. Preparar a seguinte mistura de ADN para testar a homodimerização de uma proteína de interesse, X. Para cada mistura de ADN combinar 5 ul da płuc relevante construir e 5 ul do pYFP construir. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
   A) płuc-controlo e pYFP-X
   B) płuc-X e pYFP controle
   C) płuc-X e X-pYFP
7. Preparar a seguinte mistura de ADN para testar a interacção entre um par de proteínas de interesse, X e Y. Para cada mistura de ADN combinar 5 ul da płuc relevante construir e 5 ul da pYFP construir. Adicionar plasmídeo enchimento para levar a massa total de ADN de 1800 ng. Adicionar água para levar o volume final a 20 ul.
   A) płuc-controlo e pYFP-X
   B) płuc-X e pYFP controle
   C) płuc-controlo e pYFP-Y
   D) pluc-Y e pYFP-controle
   E) płuc-X e Y-pYFP
   F) płuc-Y e X-pYFP

3. Transfecção

1. Colheita confluentes células HEK293 de um frasco de 75 cm ^2. Dilui-se 10% do total de células em 13 ml de meio de cultura. Dispensar 130 ul de suspensão celular em cada poço de um brancode fundo transparente de 96 cavidades da placa de cultura de tecidos. Células de cultura para 24 horas.
2. Calcular o número de poços para ser transfectada, multiplicando o número de combinações de DNA de 3. Traga meio de cultura isento de soro até à temperatura ambiente. Prepara-se uma mistura principal contendo 6,3 mL de meio isento de soro e reagente de transfecção 0,18 mL por poço. Misturar em vortex e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
3. Prepare a mistura de transfecção por adição de 2 ul de mistura de ADN para 20 mL de meio / transfecção mistura principal reagente livre de soro. Não vórtice. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
4. Transfecção três poços com cada mistura de transfecção dispensar 6,5 ul de mistura de transfecção por poço. Cultura das células por mais um 36-48 hr.

4. Medição de BRET sinal

1. Dissolver substrato luciferase em células vivas em 34 mg / ml em DMSO por vórtex.
2. Diluir substrato luciferase em células vivas reconstituído em 1:1.000 em substrato de diluição médio pre-aquecida a 37 ° C. Permitir 50 mL de meio de diluição de substrato por poço. Vortex para misturar. Um precipitado pode formar, mas não irá interferir com o ensaio.
3. Aspirar o meio de cultura da placa de 96 poços. Dispensar 50 ul de substrato de luciferase em células vivas diluída para cada poço. Células de cultura durante pelo menos 2 horas (até 24 horas).
4. Remover a tampa da placa de 96 poços e incuba-se a placa durante 10 minutos a temperatura ambiente no interior do luminómetro.
5. Medir emissão de Luc e YFP um poço de cada vez. Medir emissão de Luc utilizando um filtro de bloqueio de comprimentos de onda mais longo do que 470 nm. Medir emissão de YFP utilizando um filtro passa-banda de 500-600 nm. Integrar sinais de emissão ao longo de 10 sec.

5. Análise de Dados

1. Calcule a média das leituras de emissões Luc dos três poços que receberam apenas o plasmídeo de enchimento. Subtraia este valor de todas as outras leituras de emissão Luc para produzir os valores de emissão de Luc subtraído-fundo.
2. Calcule a média das leituras de emissões YFP dos três poços que receberam apenas o plasmídeo de enchimento. Subtraia este valor de todas as outras leituras de emissão YFP para produzir os valores de emissão YFP subtraído-fundo.
3. Para cada bem, divida o valor de emissão YFP subtraído-fundo pelo valor de emissão de Luc subtraído-fundo para dar a razão BRET sem correção.
4. Calcule a média dos índices de BRET não corrigidas dos três poços que foram transfectadas apenas com o plasmídeo płuc-controlo. Subtrair esse valor a partir de todas as outras proporções BRET não corrigidos para dar as proporções BRET corrigidos.
5. Para cada um dos conjuntos restantes de rácios BRET corrigidos, a média dos valores dos três poços transfectadas para obter uma razão final de BRET.

Representative Results

O princípio do ensaio BRET é ilustrada na Figura 2. A configuração do ensaio usado ao longo das experiências aqui apresentadas é descrito na Figura 3. A detecção de um sinal de BRET forte a partir de células transfectadas com uma proteína de fusão de luciferase-YFP confirmou que a transferência de energia foi observável nesta configuração experimental (Figura 4).

Nossa pesquisa centra-se no papel da família FOXP de repressores transcricionais no desenvolvimento do cérebro. Mutações heterozigóticas afetam FOXP2 levar a uma forma rara de expressão e de distúrbio de linguagem, da qual a característica mais proeminente é desenvolvimento verbal dispraxia-dificuldade em produzir as seqüências complexas de movimentos musculares orofocial necessários para a fala ^14-16. Mutações FoxP1 têm sido relatados em pacientes com perturbações do espectro do autismo e deficiência mental acompanhada de discurso severa e problemas de linguagem ^17-20. A interação de FOXPs com outras proteínas está sendo investigado para obter insights sobre os mecanismos moleculares relevantes para o papel destas proteínas no desenvolvimento do cérebro.

Foxp2 é conhecido para formar homo-ou heterodímeros com outros membros da família FOXP ^21, por conseguinte, Foxp2 homodimerização foi usada para validar o ensaio BRET (Figura 4). Para excluir a possibilidade de que a interacção de proteínas de fusão Foxp2 neste ensaio era devido simplesmente a superexpressão da proteína, a especificidade da interacção foi demonstrada através da introdução de uma mutação no domínio de dimerização de fecho de leucina de Foxp2 (deleção em enquadramento do resíduo E400), o qual é conhecido por perturbar homo-e heterodimerização ²¹ (Figura 5A). Quando as proteínas de fusão Luc-FOXP2.DE400 e YFP FOXP2 foram co-expressos, uma redução no sinal de BRET foi observada em comparação com quando Luc-Foxp2 e YFP Foxp2 foram co-expressos (Figura 5B). Este sinal de redução não era devido a uma alteração na localização subcelular da proteína mutante (Figura 5C) ou a uma diferença nos níveis de expressão, tal como avaliado por transferência Western (dados não apresentados). A redução de sinal, também foi observada quando Luc-Foxp2 foi expressa com a YFP FOXP2.DE400 (dados não mostrados). Assim BRET é eficaz na detecção homodimerização proteína, ea interação de proteínas permanece específico quando estas proteínas são superexpressos como YFP fusões luciferase-e. Além disso, o uso de BRET em combinação com a mutação alvo das proteínas tem o potencial para identificar resíduos individuais envolvidas em interacções proteína-proteína.

Para avaliar a eficácia do ensaio BRET na detecção de interações heterotípicos, a interação do FOXP2 com FOXP1 foi testado (Figura 6). Um sinal BRET foi observada em ambas as configurações possíveis do ensaio (isto é, com Foxp2 como dador ou aceitador, como o fusioproteína N). Portanto, o ensaio de BRET é capaz de detectar ambas as interacções heterotípicos homo-e. Além disso, a aptidão do ensaio BRET para detectar a interacção de Foxp2 com proteínas não-FOXP foi testada através da análise da interacção com CtBP1, um co-repressor da transcrição e conhecido parceiro de interacção Foxp2 ^21. A interação entre CtBP1 e FOXP2 foi originalmente sugerido por uma tela de dois híbridos de levedura e foi posteriormente validado por experimentos de co-imunoprecipitação ^21. A interacção Foxp2-CtBP1 foi detectada pelo ensaio BRET quando Foxp2 era a proteína de fusão dos doadores e CtBP1 foi o aceitador, mas não na configuração inversa (Figura 7A). Tais resultados são esperados com o sistema BRET (ver secção Discussão). A interação entre o FOXP2 e CtBP1 foi observada, embora apenas uma pequena proporção de CtBP1 foi localizada para o núcleo (Figura 7B), destacando a sensibilidade do ensaio. Assim, o BRETensaio é útil para a validação das interacções putativos identificados através de rastreio de levedura de dois híbridos.

Finalmente, o ensaio BRET foi empregado para examinar os efeitos de mutações patogénicas em Foxp2 em interacções proteína-proteína. Duas mutações pontuais no FOXP2 foram relatados para causar uma doença autossômica dominante rara que afeta a fala ea linguagem (Figura 8A). A mutação missense R553H foi descoberto através de um estudo de ligação em uma grande família, na qual metade dos membros foram afetados pela doença ^14. A mutação nonsense R328X foi descoberto através de seqüenciamento alvo do locus FOXP2 em probandos com diagnóstico de dispraxia verbal de desenvolvimento ^22. A capacidade das proteínas mutantes de formar dímeros com o tipo selvagem Foxp2 foi avaliada utilizando o ensaio de BRET. Os resultados utilizando o tipo selvagem Foxp2 como um doador e Foxp2 mutante como o aceitador estão apresentados na Figura 8B. Os mesmos resultados foram observados utilizando mFoxp2 utant como o dador e do tipo selvagem como o aceitador (dados não mostrados). A mutação R553H, o que está dentro do domínio de ligação ao ADN de Foxp2, não afecta a capacidade da proteína mutante de formar dímeros com o tipo selvagem. O mecanismo patogénico desta mutação pode, portanto, incluir um efeito negativo dominante resultante da dimerização do mutante com a proteína normal ^23. A mutação R328X introduz um codão de paragem prematuro, com o resultado de que a proteína codificada não possui o domínio de dimerização de fecho de leucina e o domínio de ligação ao ADN, e mostra alguns mislocalization citoplasmático (Figura 8C). Consistente com a ausência do domínio de dimerização e mislocalization para o citoplasma, a proteína truncada mostra muito reduzida interacção com o tipo selvagem Foxp2. Esta mutação é, portanto, susceptível de ser patogênica devido a haploinsuficiência. Assim, o ensaio BRET pode fornecer insights sobre os efeitos biológicos das mutações descobertas em pacientes.

Figura 1. Vectores de expressão de proteínas YFP e luciferase de fusão. A) mapas Círculo dos vetores pYFP e pluc. O vector płuc é usado para a expressão de proteínas de fusão de luciferase como doadores de BRET. O vector pYFP é usado para a expressão de proteínas de fusão como YFP BRET aceitadores. Os vectores têm um promotor de CMV _(CMV P) para a expressão de alto nível em células de mamífero, um local de clonagem múltipla (MCS) para a inserção de ADNc de proteínas de interesse, e um gene de resistência à canamicina (Kan ^r) e origem de replicação bacteriana para a propagação de o plasmídeo em bactérias. B) sítio de clonagem múltipla dos vectores płuc e pYFP. O fim da sequência de codificação de YFP é mostrado em azul. Sítios de restrição selecionadas são anotados. Note-se que o sítio Xbal é bloqueado por overlapping barragem metilação em cepas padrão de E. coli. cDNAs que codificam para proteínas de interesse deveriam ser clonado em enquadramento com a sequência de aminoácidos mostrada. Nas experiências aqui descritas, as inserções foram clonados nos locais de restrição BamHI e Xbal (sublinhados). Os codões de paragem foram removidos a partir do final da luciferase e YFP sequências codificantes para fornecer um quadro de leitura aberta que abrange a luciferase / YFP e subclonado de cDNA de interesse. Codões de paragem estão presentes no final do local de clonagem múltipla em todos os três quadros de leitura (indicados a vermelho), pelo que não é essencial para incluir um codão de paragem no cDNA inserido.

Figura 2. Princípio do sistema BRET. Proteínas de interesse, X e Y, são fundidas com uma enzima doador luciferase (Luc, o pico de emissão de 475 nm) e uma proteína fluorescente aceitadora (YFP, pico de emissão de 530 nm), respectivamente. As proteínas de fusão são expressas em células de mamíferos em cultura e após a adição de um substrato da luciferase de células-permeável, a emissão de Luc é medida usando um filtro de bloqueio de comprimentos de onda mais longo do que 470 nm e emissão a partir de YFP é medida utilizando um filtro passa-banda de 500-600 nm. A) Sem a interacção entre a proteína X e Y. proteína de transferência de energia a partir do Luc para YFP não ocorre. B) A interacção entre a proteína X e Y. Ressonância proteína de transferência de energia ocorre a partir de Luc a YFP causando um aumento na proporção de emissão medido usando o filtro passa-banda de 500-600 nm, em comparação com o filtro de bloqueio de comprimentos de onda mais longo do que 470 nm.

Configuração do ensaio Figura 3.. A configuração de ensaio para testaruma interacção entre duas proteínas de interesse, X e Y. As proteínas de interesse são fundidas com a luciferase (Luc) como o doador BRET e proteína fluorescente amarela (YFP) como o aceitador de BRET. Nas proteínas de controlo, Luc e YFP são fundidas com um péptido contendo um sinal de direccionamento para o compartimento subcelular relevante (P), se for caso disso. UM) Controla a ser incluída em cada placa. 1) controle Mock-transfecção de estabelecer níveis de luminescência e fluorescência resultante do ruído luminometer e discriminação independente de enzima de substrato de fundo; 2) płuc-transfecção de controlo apenas para estabelecer a percentagem de emissão de luciferase que é detectada no intervalo de emissão de YFP, na ausência de um aceitador de BRET; 3) A transfecção de pluc-controle e pYFP-controle para estabelecer a linha de base do sinal BRET resultante da interação Luc-YFP; 4) A transfecção de fusão Luc-YFP como um controlo positivo para assegurar que um sinal de BRET pode ser medido. B) Definir de Experimental condições para testar a interação entre duas proteínas de interesse, X e Y. 1, 2, 4, 5) Os comandos de interação não-específica entre as proteínas de interesse e Luc / YFP; 3) condições de teste com X como o Y e dador como o aceitador; 6) condições de teste com Y como o dador e X como o aceitador.

Figura 4. Detecção de Foxp2 homodimerização. A) Para validar o ensaio BRET para a detecção de homodímeros FOXP2, células HEK293 foram transfectadas com construções de expressão de luciferase (doador) ou YFP (aceitador) fundidos a qualquer Foxp2 (P2) ou um sinal de localização nuclear (-). A luciferase alvo nuclear e as proteínas YFP servir como controles negativos. Como um controlo positivo para a detecção de um sinal de BRET, as células também foram transfectadas com um constructo para a expressão de uma luciferase-YFAs imagens de microscopia de fluorescência da proteína de fusão P (+) B) de células transfectadas com YFP fundidos com um sinal de localização nuclear (-.) Ou com YFP fundido com Foxp2 (P2).

Figura 5. Use de Foxp2 dimerização deficiente para demonstrar a especificidade do ensaio. A) Diagrama esquemático da proteína FOXP2 mostrando a posição da mutação DE400, o que perturba dimerização. O domínio de dimerização de fecho de leucina é mostrada a verde e o domínio de ligação de ADN em amarelo. B) Para testar se a sobre-expressão de proteínas pode levar a resultados falsos positivos no ensaio BRET, a especificidade do ensaio foi avaliado utilizando a FOXP2.DE400 variante. As células foram transfectadas com construções de expressão de luciferase (doador) ou YFP (aceitador) fundido com Foxp2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) ou uma nucleaAs imagens de microscopia de fluorescência C) de células transfectadas com YFP fundidos com Foxp2 (P2) ou FOXP2.DE400 (DE) - r sinal de localização ()..

Figura 6. Detecção de heterodimerização FOXP1-Foxp2. A) Para validar o ensaio BRET para a detecção da heterodimerização entre as proteínas homólogas FOXP2 e FoxP1, as células foram transfectadas com construções de expressão de luciferase (doador) ou YFP (aceitador) fundidos a qualquer Foxp2 (P2), FOXP1 (P1) ou As imagens de microscopia de fluorescência B) de células transfectadas com YFP fundidos com FOXP1 (P1) ou Foxp2 (P2) - um sinal de localização nuclear ()..

B) As imagens de microscopia de fluorescência de células transfectadas com YFP fundidos com CtBP1 (CtBP) ou Foxp2 (P2).

Figura 8. Avaliação dos efeitos de mutações patogénicas FOXP2 em interacções proteína-proteína. A) Representação esquemática da proteína Foxp2 mostrando as posições das mutações R553H e R328X que causam uma fo rararm de expressão e de distúrbio de linguagem. O domínio de dimerização de fecho de leucina é mostrada a verde e o domínio de ligação de ADN em amarelo. B) Para avaliar a utilidade do ensaio BRET para avaliar o impacto das mutações patológicas em interacções proteína-proteína, os efeitos das mutações R328X e R553H na a capacidade das proteínas mutantes FOXP2 para dimerizar com Foxp2 normal foram examinados. As células foram transfectadas com construções de expressão de luciferase (doador) ou YFP (aceitador) fundidos a qualquer Foxp2 normal (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), ou um sinal de localização nuclear (-). C ) imagens de microscopia de fluorescência de células transfectadas com YFP fundido com FOXP2.R553H (R553H) ou FOXP2.R328X (R328X). Nesta imagem FOXP2.R328X é predominantemente nuclear, mas em outras células dentro da população mostra uma distribuição mais citoplasmática.

Discussion

O design das construções de expressão de proteínas de fusão é um passo crítico na criação do ensaio BRET. Nas experiências aqui apresentadas, as proteínas de interesse foram fundidos com o terminal C da luciferase ou YFP. Também é possível, e pode ser necessário, para fundir as proteínas para o N-terminal de luciferase / YFP. Para algumas proteínas, fusões só podem ser aceites em qualquer N-ou C-terminal, a fim de evitar a ruptura da estrutura e função de proteínas. Além disso, para as proteínas transmembranares, em que o N e C terminais residir em diferentes compartimentos subcelulares, o / proteína YFP luciferase deve ser fundido com o terminal que está no mesmo compartimento que o parceiro de interacção. Por exemplo, no estudo das interacções entre transmembranares G receptores acoplados à proteína citoplasmática e β-arrestina, a luciferase foi fundido com a cauda carboxilo intracelular do receptor transmembranar ^8. Em outros casos, a geometria de uma proteína-proteína interactino pode levar à transferência de energia sendo mais eficiente utilizando uma das duas possibilidades de combinações de proteínas de fusão. Ocasionalmente transferência de energia pode não ser detectado em tudo se usando apenas uma combinação, levando a resultados falsos negativos.

A seqüência do peptídeo de ligação entre luciferase / YFP ea proteína de interesse também pode afetar a eficiência de transferência de energia de ressonância. O ligante deve ser suficientemente longo para permitir que a luciferase / YFP e a proteína de interesse a dobrar, sem obstáculo. Um ligante mais longo vai conferir uma maior flexibilidade para o polipéptido na junção entre luciferase / YFP e a proteína de interesse, o que pode aumentar a eficiência BRET, facilitando o alinhamento dos doadores e aceitadores de dipolos. No entanto, a eficiência BRET pode diminuir se houver muita flexibilidade no ligante. Nas experiências aqui, a clonagem de proteínas de interesse para os sítios da expressão vec BamHI e Xbaltores resultou num ligante de ácido 23-amino, tal como mostrado na Figura 1. Este ligante tem sido bem sucedida para a detecção de interacções entre os vários pares de proteínas.

Antes de prosseguir para Bret experimentos deve assegurar-se que as proteínas de fusão manter a atividade biológica normal. O funcionamento da YFP pode ser avaliada por visualização directa utilizando um microscópio de fluorescência. O funcionamento da luciferase pode ser testada utilizando kits disponíveis comercialmente. O efeito de fusão sobre a localização subcelular de proteínas de interesse pode ser avaliado por imunocoloração, ou no caso da YFP fusões, por visualização directa. O efeito de fusão sobre a função da proteína de interesse pode ser investigada através de ensaios específicos de proteína de - por exemplo, para um factor de transcrição pode ser apropriado para ensaiar a actividade de ligação do ADN. Note que as medições de luminescência feitas durante o experimento fornecer conveniente confirmar em ensaioção de actividade de luciferase.

É importante considerar que as construções de controlo adequadas para a sua proteína de interesse. YFP e luciferase são predominantemente citoplasmática e são, por conseguinte, os controlos apropriados, quando as proteínas de interesse são citoplasmática. No entanto, quando as proteínas de interesse são localizadas para outros compartimentos celulares que pode ser desejável para modificar a luciferase e YFP com sinais peptídicos para dirigir o seu tráfico para o compartimento em causa. Aqui, as proteínas de interesse foram factores de transcrição que estão localizadas ao núcleo, por conseguinte, a luciferase e YFP foram modificados pela adição de um sinal de localização nuclear. Especificamente, um péptido incluindo o sinal de localização nuclear do antigénio T grande de SV40 (CGYGPKKKRKVGGLDN) foi acrescentada ao terminal-C da luciferase e YFP por ligação de oligonucleótidos de cadeia dupla sintéticos entre os sítios de BamHI e de Xbal the pluc e pYFP vetores. A adição deste sinal causado uma significativa redistribuição de proteína para o núcleo (Figura 4B).

Incluindo os controles apropriados é crucial para a interpretação de experimentos de BRET. Um controle de mock-transfecção utilizando um plasmídeo carga inerte é essencial para estabelecer níveis de luminescência e fluorescência resultante do ruído luminometer e discriminação independente de enzima de substrato de fundo. Com luminômetros modernas e substratos luciferase níveis de luminescência de fundo são geralmente muito baixa. A transfecção com a luciferase de controlo apropriado construir na ausência de uma construção de YFP é importante estabelecer a proporção de emissão de luciferase que é detectada no intervalo de emissão de YFP, na ausência de um aceitador de BRET. A transfecção com a luciferase de controle e controle YFP constrói fornece o sinal de BRET base resultante da interação Luc-YFP. Para vésperary par de proteínas que são testados para a interacção, é importante para transfectar cada um sozinho, com a construção de controlo apropriado, tal como ilustrado na Figura 3B, para controlar qualquer interacção não específica entre as proteínas a ser testadas e da luciferase / YFP. Particularmente quando se realiza um ensaio BRET, pela primeira vez, é importante incluir uma proteína de fusão Luc-YFP como controlo positivo para assegurar que um sinal de BRET é observável na sua configuração experimental. Aqui, a sequência de codificação da YFP foi clonado płuc nos locais BamHI e Xbal para gerar uma proteína de fusão em que YFP é fundida com o terminal C da luciferase.

No protocolo aqui descrito, a composição da mistura de ADN para a transfecção foi calculada com o pressuposto de que o tamanho médio da expressão da proteína de fusão Luc / YFP constrói não é superior a 7,5 kb. Se a expressão de construçãots são significativamente maiores do que isso, em seguida, o número de moles de cada construção de expressão adicionado à mistura de transfecção pode ter que ser reduzida de modo que a quantidade total de DNA na mistura não excede o máximo permitido pela quantidade de reagente de transfecção. Em alternativa, a quantidade de reagente de transfecção e a quantidade de DNA em todas as misturas de transfecção pode ser aumentada de acordo com directrizes do fabricante. Manipulação experimental de placas de 96 poços é facilitada pelo uso de pipetas multicanal e aspiradores. É desejável minimizar a variação entre as amostras no período de tempo de incubação da mistura de transfecção após a adição do DNA à mistura reagente médio / transfecção isento de soro, por conseguinte, começa a adição de mistura de transfecção às células, logo que a primeira mistura de incubação foi de 10 min . Porque as proteínas aceitadoras BRET são fusões YFP, é possível avaliar a eficácia de transfecção por microscopia de fluorescência ou através da medição de fluorescência em um re microplacaAder. O sucesso de um experimento BRET depende de um bom nível de transfecção, por isso é aconselhável assegurar que a transfecção é satisfatória, antes de proceder à adição do substrato e medição do sinal BRET. A tag YFP também permite a quantificação dos níveis de expressão de proteína aceitadora com um leitor de microplacas. A quantificação dos níveis de proteína receptor pode ser útil para a otimização e resolução de problemas de experimentos BRET.

As células devem ser incubadas durante pelo menos 2 horas com substrato de luciferase antes de medir o sinal de BRET para assegurar que foi conseguido um sinal estável. Também é aceitável a incubar as células com substrato durante até 24 horas. Neste caso, as contagens totais de luminescência será mais baixa, mas as proporções de BRET se mantenham inalteradas. Incubações mais longas, com substrato pode ser mais conveniente (por exemplo, durante a noite) e também permitir a medição de sinais de BRET antes e depois de uma tal manipulação experimentalcomo a adição de um composto farmacêutico. O ideal é otimizar a densidade de semeadura de células, de modo que as células a confluência em torno do tempo de medição. Se a densidade de células é superior óptimo, então pode ser vantajoso medir o sinal BRET num ponto de tempo mais cedo para evitar o crescimento excessivo de células. Se estiver usando um tipo de célula que não HEK293, certifique-se de otimizar as condições de cultura de células e de transfecção. BRET experiências também foram realizados com sucesso em células HeLa, utilizando o protocolo aqui descrito.

Nas experiências aqui descritas, as contagens de luminescência foram medidas à temperatura ambiente, que é a temperatura óptima para a actividade da luciferase de Renilla. Se a execução de uma experiência ao longo do tempo, no luminómetro, é preferível ajustar a temperatura a 37 ° C. Realizamos os mesmos experimentos em temperatura ambiente e a 37 ° C e não houve diferença significativa nos resultados foi observada. Se a realização de experimentos em temperatura ambiente, the placa deve ser deixada a equilibrar 10 minutos no interior do luminimetro antes da medição para permitir a estabilização da actividade da luciferase de Renilla. Aqui, os sinais de luminescência foram integradas ao longo de 10 segundos, o que normalmente proporciona uma elevada sensibilidade, especialmente para proteínas com baixos níveis de expressão. No entanto, os sinais podem ser integradas ao longo de períodos de tempo mais curtos, se esta proporciona uma sensibilidade suficiente. Devido à estabilidade do sinal de luminescência produzida pelo substrato de luciferase em células vivas, que é aceitável para medir até 10 segundos por poço em cada comprimento de onda.

Uma interacção entre duas proteínas de interesse é confirmado pelo ensaio BRET quando o sinal da condição de teste excede significativamente os sinais das condições de controlo relevantes. A ausência de um sinal BRET não é, necessariamente, a confirmação de que uma interacção não ocorre. No caso de um resultado inesperado ou negativa, a luminescência total e fluorescênciacontagens nce deve ser examinado para assegurar que todos os poços foram transfectadas correctamente.

O sinal BRET também é afectada pela proporção dos níveis de expressão de proteína, portanto, é útil para examinar os níveis de expressão relativa das duas proteínas de interesse, comparando as contagens de fluorescência a partir de poços transfectadas com YFP fusões das duas proteínas (ou as contagens de luminescência poços transfectadas com as fusões de luciferase). Quando uma proteína de fusão expressa mais fortemente do que o outro, os melhores resultados são susceptíveis de ser obtido se a proteína com o nível de expressão mais baixo é fundida com a luciferase, o que foi o caso com Foxp2 e CtBP1 nas experiências aqui apresentadas. Também é possível manipular os níveis de proteína, ajustando a proporção molar de plasmídeos de expressão na mistura de transfecção. A transferência de energia entre certos pares de proteínas de fusão podem ser muito ineficiente devido à geometria do complexo de proteína. Em taiscasos, pode valer a pena tentar fundir as proteínas de interesse para o términos alternativa de luciferase / YFP.

É necessário confirmar que o sinal BRET representa uma interacção proteína-proteína fisiológico e não é simplesmente devido à sobre-expressão da proteína. Por esta razão, é importante para evitar a sobre-expressão de proteínas bruto. A especificidade de uma interacção proteína-proteína no sistema BRET pode ainda ser confirmado através da introdução de mutações em proteínas que são conhecidos para reduzir a afinidade da interacção, como demonstrado aqui, utilizando a variante de Foxp2 DE400. As proteínas mutantes podem ser ainda utilizados em ensaios de competição e BRET de ligação de saturação. Num ensaio de competição, as concentrações de dador e aceitador de proteínas de fusão são mantidas constantes, enquanto o aumento da concentração de uma versão não marcado de um dos parceiros de interacção como um competidor. Untagged proteína de tipo selvagem deve competir com o v marcadoersão para se ligar ao seu parceiro de interacção, resultando num decréscimo no sinal BRET, enquanto que a proteína mutante deve apresentar uma reduzida capacidade de competir com a interacção. Num ensaio de ligação de saturação, a concentração da proteína de fusão dador é mantido constante, enquanto que o aumento da concentração do receptor. Para uma interação específica do sinal BRET deve eventualmente planalto como todas as moléculas se tornam doadores saturado com o receptor. Para uma interacção não-específica, o sinal BRET tipicamente mostram um pequeno aumento linear devido a um aumento das colisões acidentais entre as moléculas de dador e aceitador. Na prática, para interacções de afinidade moderada entre proteínas solúveis, pode ser difícil de alcançar um elevado aceitador suficiente: proporção doador observar saturação, mantendo simultaneamente um nível suficiente de proteína de dador para a detecção de sinal.

Devem ser tomadas precauções na interpretação dos differences entre razões de BRET. O ensaio BRET não fornece uma medida quantitativa da afinidade de uma interacção proteína-proteína, pois a eficiência de transferência de energia é influenciada por outros do que a força da interacção proteína-proteína factores. Tais factores incluem a relação entre os níveis das proteínas de fusão no interior da célula, a geometria da interacção, e as taxas de associação e dissociação do complexo. As relações obtidas com dois pares diferentes de proteínas, por conseguinte, não pode necessariamente ser comparadas, mas as comparações podem ser possível entre as diferentes variantes da mesma proteína, tal como com o de tipo selvagem e variantes de ΔE400 Foxp2 mostrados aqui. Ocasionalmente, os rácios de BRET ligeiramente negativos podem ser observados. Os rácios negativos podem resultar a partir do erro na medição da relação de linha de base em células transfectadas apenas com o vector płuc-controlo. Muito elevados rácios são muitas vezes indicativo de agregação da proteína, que pode ser confirmada pela observação de ce transfectadaslls com um microscópio de fluorescência. Deve ser determinado se a agregação é biologicamente relevante ou um artefato de superexpressão da proteína.

Em conclusão, o ensaio BRET descrito aqui é uma abordagem poderosa para investigar interacções proteína-proteína em células vivas. A aplicação de BRET foi demonstrada durante os fins de validar interagentes candidatos a partir de estudos de triagem de proteômica, identificação de resíduos específicos envolvidos em interações proteína-proteína, e avaliar os efeitos das mutações encontradas no DNA do paciente. Porque as interacções são detectados em tempo real sem a necessidade de lise celular, o sinal BRET pode ser medido antes e depois de um tratamento, tal como a adição de um composto farmacêutico ou ligando ^7. O ensaio BRET mostra uma grande promessa para uso em pesquisa genômica funcional para avaliar a relevância biológica de variantes genéticas descobertas através de seqüenciamento de próxima geração.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.