Summary
Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.
Abstract
Algen worden beschouwd als uitstekende kandidaten voor hernieuwbare energiebronnen, door de natuurlijke lipiden opslag mogelijkheden. Krachtige systemen van algen fermentatieprocessen en screening op nieuwe olierijke stammen vereist een snelle en betrouwbare protocol voor de bepaling van intracellulaire lipidegehalte. Huidige praktijken grotendeels aangewezen op gravimetrische methoden om het oliegehalte te bepalen, technieken ontwikkeld decennia geleden die tijdrovend zijn en grote steekproef volumes vereisen. In dit document, Nile Red, een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de aanwezigheid van lipide organen in tal van soorten organismen identificeren, wordt opgenomen in een eenvoudige, snelle en betrouwbare protocol voor de neutrale lipiden van Auxenochlorella protothecoides, een groene alg. De methode maakt gebruik van ethanol, een relatief mild oplosmiddel, aan de celmembraan voor kleuring en 96 goed micro-plaat monstercapaciteit in fluorescentie-intensiteit metingen toenemen doorlaatbaar. Het ontwerp ised met de specifieke toepassing van het toezicht bioproces prestaties. Eerder gedroogde monsters en levende monsters van een groeiende kweek kan worden gebruikt in de test.
Introduction
Vanwege hun vermogen om lipiden organen opslaan onder bepaalde stresscondities algen hebben veel aandacht in de afgelopen jaren als potentiële duurzame brandstofbron 1,2. Neutrale lipiden kan goed zijn voor meer dan 60% van de cel drooggewicht onder geschikte groeiomstandigheden 3. Toch is de industrie niet over een eenvoudige, schone, snelle en betrouwbare gestandaardiseerd protocol om vetgehalte van algen cellen te kwantificeren om goed te monitoren bioproces prestaties, culturen te analyseren, en het scherm voor nieuwe stammen.
De Bligh-Dyer gravimetrische methode ontwikkelde zo'n 50 jaar geleden blijft een van de meest voorkomende technieken die vandaag de dag 4,5 gebruikt. Hoewel deze procedure is eenvoudig, betrouwbaar en eenvoudig uit te voeren, is tijdrovend, vereist grote monstervolumes, en maakt gebruik van toxische oplosmiddelen. Het is niet praktisch voor het analyseren van vele samples van een fermentatie run of screening voor nieuwe olie-rijke stammen. Andere methoden bEEN-ontwikkeld, maar meestal vereisen geavanceerde apparatuur en zijn niet gestandaardiseerd 6.
Een alternatief dat heeft vergaard een grote belangstelling is de Nijl Rode vlek. Nile Red, een kleurstof die fluoresceert bij voorkeur in niet-polaire omgevingen is gebruikt om lipide organen in verschillende organismen, waaronder nematoden 7, gist 8, 9 bacteriën en algen 10-19 identificeren of kwantificeren. Initial technieken met Nile Red waren meestal kwalitatieve of semi-kwantitatieve, het combineren van de vlek met single-cuvette spectrofotometrie of flowcytometrie. Bovendien zijn sommige soorten algen zoals groene algen dikke celputjes die meestal ondoorlaatbaar kleurstof, die het bereik van de techniek 10 beperkt.
Recente verbeteringen aan de Nijl Rode kleuringsmethode gemeld dat de aanvankelijke tekortkomingen van het protocol 10,11 omzeilen. Kleuring van de cellen in de aanwezigheid van een carrier oplosmiddel zoals DMSO 10 of ethanol 10,11 linearizes de relatie tussen oliegehalte en absorptie, waardoor betrouwbare kwantitatieve metingen. Het oplosmiddel helpt permeabilize het celmembraan, zodat de Nijl Rode moleculen kan passeren. Daarnaast is het opnemen van een spectrofotometer met micro-plaat leesmogelijkheid zorgt voor een hoge doorvoersnelheid protocollen geschikt voor kwantitatieve analyse.
In dit artikel gedetailleerd een eenvoudige werkwijze voor het meten oliegehalte van algen cellen door kleuring culturen Nijl Rood in aanwezigheid van ethanol, een mild oplosmiddel. Om zo goed mogelijk rekening te houden achtergrondruis in de metingen wordt een standaardcurve correleren fluorescentie intensiteit oliegehalte ontwikkeld met algen bekende oliesamenstelling. De methode is een bewerking van eerder gepubliceerde protocollen 10,11. Door een 96-putjes spectrofotometer, men in staat om dezelfde hoeveelheid te analyseren in een uur that zou dagen duren om te controleren door gravimetrische methoden. Bovendien, door het kalibreren met behulp van representatieve monsters van de gewenste algensoorten deze methode levert relatief nauwkeurige metingen die direct interpreteerbaar. Er bestaan vele protocollen, waarin de methoden van kleuring algen met Nile Red geoptimaliseerd voor verschillende stammen en toepassingen; het protocol hier gepresenteerde werd oorspronkelijk ontwikkeld door de la Hoz Siegler et al.. 11 voor Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus en Scenedesmus obliquus, hoewel het waarschijnlijk is geschikt voor veel meer soorten en klassen. Het is ontworpen met de specifieke toepassing van het toezicht bioprocess prestaties en het werkt even goed voor eerder gedroogde monsters en natte monsters van een groeiende cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van droge biomassa van de algen worden gebruikt als standaarden voor fluorescentie Readings
- Verwijder een monster volume van de groeiende algencultuur dat ten minste 200 mg van droge biomassa zal bieden, 400-600 mg de voorkeur.
- Centrifugeer monster bij 4 ° C gedurende 10 min bij 10.000 x g. Verwijder het supernatant en was de pellet met een gelijk volume fosfaatbuffer volgens dezelfde pH als groeimedium.
- Herhaal stap 1.2 voor een totaal van 3 stappen wassen.
- Resuspendeer de pellet in gedeïoniseerd water en breng over naar een vooraf gewogen weeg schaal. Laten drogen bij 50 ° C gedurende 48 uur. OPMERKING: Drogen onder vacuüm zal droogtijd afnemen en drogen van de cultuur bij temperaturen boven 50 ° C kan resuspensie bemoeilijken.
- WINKEL algenculturen gedroogd bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik.
2. Gravimetrische Kwantificering van neutrale lipiden door hexaanextractie (Aangepast van Bligh en Dyer 4)
- Meet ongeveer 50 mg van droge biomassa van de algen in een weeg schaal. OPMERKING: Missen variërend 40-80 mg kan zonder verlies van reproduceerbaarheid worden gebruikt.
- Breng de biomassa naar een mortier pre-gewassen met hexaan. Indien nodig, was het wegen schaal met een kleine hoeveelheid (1 ml) hexaan Met een Pasteur-pipet om de biomassa volledig overdragen aan de mortel. OPMERKING: Hexaan is een zeer vluchtige en giftige stof. Het moet in de zuurkast met de juiste beschermende kleding worden behandeld.
- Maal de biomassa van de algen gedurende 5 minuten met behulp van een stamper. Begin met zachte slijpen en langzaam de intensiteit verhoogt. Maal de biomassa in een fijne en gladde pasta in de periode van 5 minuten. Als overmaat hexaan wordt gebruikt bij het overbrengen van de biomassa naar de mortel, het het beste om te wachten op de hexaan verdampen voordat slijpen.
- Voeg enkele ml hexaan om de mortel en meng de verkregen suspensie met de stamper totdat het wordt gehomogeniseerd. Zorg ervoor dat alle celbrokstukken gehandeld op de muren van de morteer zijn gratis klopte en opgehangen in de vloeistof.
- Breng de hexaan-celmassa mengsel in een centrifugebuis. OPMERKING: De centrifugebuis moet ofwel glas of een geschikt polymeer verenigbaar met hexaan zoals Teflon zijn.
- Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 totdat alle biomassa is overgedragen aan de centrifugebuis (3-5x).
- Centrifugeer het monster bij 4 ° C gedurende 20 min bij 10.000 x g.
- Pipet de bovenstaande vloeistof voorzichtig in een vooraf gewogen metalen wegen schotel. Bewaren in de zuurkast.
- Voer een 2e hexaan extractie door toevoeging van 3 ml hexaan om de pellet en vortexen krachtig gedurende 1 minuut.
- Herhaal de stappen 2.7 en 2.8. Voer indien nodig de monsters gedurende 30 minuten in de centrifuge tijdens de tweede extractie, zodat alle celdebrie volledig afwikkelt. Bepaal de massa van olie gravimetrisch gewonnen na hexaan volledig is verdampt.
3. Fluorometrische Kwantificering van neutrale lipiden gebruik Nile Red (zo VERSLAted door de la Hoz Siegler et al.. 11)
OPMERKING: alleen 10 gl van een algen suspensie bij 5 g / L is nodig voor de fluorescentie lezen. Algemeen isolatie van droge biomassa algen van 1.5 ml kweekbouillon is meer dan voldoende. Ook kan de lichtsterkte van de lamp in de spectrofotometer na verloop van tijd. Aanbevolen normen omvatten in elk experiment zodat variaties in het instrument geen onnodige fout aan de metingen.
- Bereid een Nile Red oplossing met een concentratie van 10 ug / ml opgelost in alcohol reagenskwaliteit ethanol. Bewaar deze oplossing in het donker bij 4 ° C.
- Bereid een 30% (v / v) ethanol oplossing in gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid alle algen monsters op hetzelfde biomassaconcentratie (5 g / L wordt aanbevolen) en op dezelfde wijze als de normen die in de meting. Doe dit door een opschorting vooraf gedroogde monsters in de juiste hoeveelheidfosfaatbuffer (0,6 g / L kaliumfosfaat dibasisch, 1,4 g / l monobasisch kaliumfosfaat), en aanpassingen van de concentratie van een groeiende algen kweek tot 5 g / L met fosfaatbuffer na het meten van de troebelheid. OPMERKING: metingen uitgevoerd op levende algenculturen zullen vaak groter foutenbronnen bij deze afhankelijk van de precisie van de troebelheid kalibratiecurve. Resuspenderen gedroogde monsters kan het gebruik van een homogenisator volledig dispergeren van de biomassa nodig.
- Voor elk monster, meng 80 pl van 30% ethanol-oplossing, 10 ul van de Nijl Rode oplossing en 10 gl algen suspensie in een enkel putje van een 96-wells plaat. Om goed rekening te houden met de variabiliteit van de fluorescentie meting uitvoeren 5 herhalingen van elk monster.
- Voer een twee punts kalibratie curve met normen eerder bereid om rekening te houden voor de dag-tot-dag variaties in het instrument en voorbereiding. Bereid de normen voor fluorescentie meting met behulp van de same procedure als de monsters. OPMERKING: algemeen twee punten voldoende herkalibratie van het instrument kunnen drie punten worden uitgevoerd om lineariteit verifiëren.
- Voer de fluorescentiemetingen in een multi-put plaatlezer spectrofotometer. De volgende condities werden gevonden om de meest consistente resultaten 11 opleveren:
- Schudden bij 1200 rpm, baan 3 mm, voor 30 sec.
- Incubeer bij 40 ° C gedurende 10 minuten.
- Schudden bij 1200 rpm, baan 3 mm, voor 30 sec.
- Record fluorescentie, excitatie bij 530 nm, emissie bij 604 nm.
- Zet de fluorescentiemetingen olie-inhoud met de resultaten van de interne standaarden.
4. Fluorescentiemicroscopie Techniek
OPMERKING: De kleuringsprotocol beschreven in hoofdstuk 3 is ontworpen voor kwantitatieve analyse, maar het kan ook nuttig zijn om visuele representaties van vlek-gebaseerde technieken voor educatieve en illustratieve pu zijnrposes. Om beelden van het monster fluorescentie een produceren vereist een optische microscoop met traditionele transmissie en extra epifluorescentie verlichting bronnen. Excitatie en emissie licht filters in de 530 nm (groen) en 604 nm (rood) bereik, respectievelijk, die nodig zijn voor de Nijl Rode vlek evenals een microscoop gemonteerde camera met bijbehorende software. De in deze studie aangetoond (figuur 1) beelden werden verkregen met behulp van een helder veld microscoop uitgerust met een camera en Monochrome naar RGB converter unit. De procedure voor het produceren van Nile Red fluorescentiebeelden gebruik van deze tools wordt hieronder beschreven:
- Bereid een cultuur monster met de Nijl Rode vlek volgens paragraaf 3 van het protocol. OPMERKING: een monster in de 5 g / L concentratiegebied produceert slides van adequate celdichtheid zonder overbevolking.
- Na het voltooien van stap 3.6 van de kleuringsprotocol Bereid een microscoopglaasje van het verwerkte monster volgens standaard laboratoriumprocedures.
- Te beginnen met de microscoop in de transmissie mode, laadt de bereide dia in de microscoop, en zoek de cellen op de gewenste vergroting (de afbeeldingen in dit artikel zijn overgenomen met de 100X doelstelling).
- Zodra gericht, schakelt de microscoop van transmissie naar epifluorescentie verlichting mode. De lichtbron moet nu rechtstreeks uit de objectieflens (dit kan visueel worden bevestigd door het observeren van de ruimte tussen de slede en de objectieflens).
- Steek een groene excitatiefilter in de lichtbron en een rode emissie filter in de observatie lichtpad; de fluorescentie van de gekleurde cellen moet nu direct zichtbaar door het oculair.
- Schakel de microscoop observatie-modus van het oculair van de camera gemonteerd en gebruik viewing software om een beeld van de fluorescerende cellen vast te leggen. Afhankelijk van de gevoeligheid van de camera, kan het monster niet in eerste instantie weergegeven in het voorbeeldvenster (dwz het scherm zalzwart zijn); om dit te verhelpen, past u de belichtingstijd en de winst van de camera tot een niveau waarop de cellen zichtbaar zijn. Specifieke instellingen zal variëren met instrumenten, apparatuur en celtypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve algen cellen gekleurd met Nile Red kleurstof in figuur 1. Delen A en B van figuur 1 tonen afbeeldingen van A. protothecoides gegroeid dan stikstof, wat leidt tot zeer lage intracellulaire lipide accumulatie. In de delen C en D, de monsters van A. protothecoides onder stikstof beperking gekweekt getoond. Onder transmissieverlichting, kan de lipide organen van de cel worden gevisualiseerd met zorgvuldige inspectie van figuur 1C, waar ze als glanzende ronde structuren en vormen de meerderheid van het celvolume. De in figuur 1A cellen die werden gekweekt in de stikstof, slechts 5% olie drooggewicht en geen significante niveaus van lipide lichamen vertonen.
Wanneer getoond onder de juiste lichtomstandigheden, zijn de verschillen in deze monsters vergroot. De olie-arme cellenverschijnen als fluorescerende ringen met donkere lichamen (Figuur 1B), terwijl de olie-rijke cellen vertonen een fel oranje-rode gloed waar ze lipide lichamen (figuur 1D) hebben opgebouwd. In figuur 1D is het moeilijker om de zwakke fluorescentie van de celmembraan en andere celstructuren bekijken. Nile rood fluoresceren in de aanwezigheid van niet-polaire eiwitten en lipiden, daarom de celmembraan en andere cellulaire structuren bieden een achtergrondniveau van fluorescentie gedurende de spectrofotometer metingen.
Onder de geoptimaliseerde condities van de test, kalibratiecurven met R2-waarden groter dan 0.980 zijn gemakkelijk haalbaar (Figuur 2A). De relatie tussen cel oliegehalte en fluorescentie wordt niet-lineaire als de cellen worden gekleurd met een oplossing ontbreekt een drager oplosmiddel zoals ethanol. De in figuur 2B data met de R2 van 0.395 werden 60, verkregen door het uitvoeren van het protocol in een 0% ethanol-oplossing (gedemineraliseerd water).
Figuur 1. Afbeeldingen van A. protothecoides gekleurd met Nile Red. Een olie-lean monster (4.4% oliegehalte drooggewicht) wordt opgenomen onder A) doorgelaten licht microscopie en B) epifluorescente verlichting met groene excitatiefilter (510 nm). De lipide lichamen gekleurd met Nile Red fluoresceren bij 604 nm. Een olie-rijke steekproef (54,7% oliegehalte drooggewicht) wordt weergegeven in C) en D) onder dezelfde uitgezonden en epifluorescentie lichtomstandigheden als A) en B), respectievelijk.nk "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. IJkcurves correleren van het oliegehalte van A. protothecoides intensiteit fluorescentie. In A), werden monsters bereid volgens het beschreven protocol. In B), werden monsters bereid in een 0% ethanol-oplossing (gedemineraliseerd water). Verticale foutbalken geven de standaardafwijking van vijf herhalingen in de spectrofotometer. Horizontale error bars rapporteren de standaardafwijking van ten minste drie herhalingen van de gravimetrische kwantificering van neutrale lipiden. Klik hier voor grotere afbeelding.
| Chemisch | Vennootschap | Concentratie |
| KH 2 PO 4 | Fisher Scientific | 2,8 g · L -1 |
| K 2 HPO 4 | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| MgSO4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| FeSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ Td> | 48 mg · L -1 |
| H 3 BO 3 | Fisher Scientific | 11.6 mg · L -1 |
| CaCl2 · 2H 2 O | Fisher Scientific | 10 mg · L -1 |
| MnCl2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7,2 g · L -1 |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 0,88 mg · L -1 |
| CUSO4 · 5H 2 O | Fishaar Wetenschappelijke | 0.32 mg · L -1 |
| Na 2 MoO 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0,12 mg · L -1 |
| thiaminewaterstofchloride | Fisher Scientific | 40 ug · L -1 |
| glucose | Fisher Scientific | 30 g · L -1 |
| glycine | Fisher Scientific | 0,2-2,0 g · L -1 |
Tabel 1. Culture media recept. Alle reagentia waren van analytische kwaliteit.Oplossingen werden bereid met behulp van gedemineraliseerd water. De concentratie glycine werd gebruikt om de koolstof-stikstof-verhouding in de cultuur bijgevolg de uiteindelijke olie gehalte van de algen te bestrijden en. Cellen variërend van 8,5% tot 55% neutraal lipide gehalte gewicht (droge basis) werden gebruikt om de standaardkromme te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De algen in de standaardcurve moet dezelfde soort gekweekt onder dezelfde experimentele omstandigheden als die gemeten. Significante veranderingen in de samenstelling van het materiaal, teelttechniek en kleuringsprotocol kan invloed hebben op de intensiteit van de fluorescentie lezen. Hexaanextractie (in de punten 1 en 2 beschreven) werd gebruikt om de neutrale vetgehalte van de monsters die in de standaard curve te bepalen. Voor nauwkeurige fluorescentie-intensiteit metingen moeten alle monsters worden geanalyseerd op dezelfde biomassaconcentratie (5 g / L werd in deze studie). Olieniveau dan gemakkelijk worden bepaald door vergelijking met de standaardkromme. Bij dit protocol werden algen in schudkolven gekweekt onder heterotrofe omstandigheden (28 ° C, 100 rpm) met glucose als koolstofbron (30 g / L) en glycine als stikstofbron (0,2-2,0 g / L). Voor een uitgebreide media-recept, zie tabel 1.
Een belangrijke overweging bij de uitvoering van deprotocol is aan de voorwaarden voor het drogen van de natte biomassa van de algen bij het opstellen van de standaard curve. Een vacuümoven bij 45 ° C wordt aanbevolen. Een conventionele oven bij 45-50 ° C zal ook zolang extra tijd is toegestaan om volledig drogen van de monsters (24-48 uur) volstaan. Temperaturen boven 50 ° C kan de biomassa samensmelten of vormen een ondoordringbare korst die niet direct ofwel resuspenderen in fosfaatbuffer. Resuspensie worden geholpen door het gebruik van een homogenisator. Chemische additieven zoals oppervlakteactieve stoffen of een sterke base moet worden vermeden, omdat deze gewoonlijk beïnvloeden de fluorescentie lezen. Gedroogde culturen kunnen worden opgeslagen voor maximaal 6 maanden in een gesloten verpakking, zonder het ervaren aanzienlijke lipide degradatie. Merk op dat de metingen uitgevoerd op levende algenculturen vaak hebben grotere foutenbronnen bij deze afhankelijk van de precisie van de troebelheid kalibratiecurve.
Een andere overweging is de ethanol concentratie gebruikt om de samp draaienles in de micro-plaat lezer. Ethanol als drager fungeert oplosmiddel, vergemakkelijkt het transport van Nile Red moleculen in de cel. Bij lage concentraties (<30%) het verband tussen oliegehalte en fluorescentie wordt niet-lineaire vanwege slechte diffusie door het celmembraan (figuur 2B). Bij hogere concentraties ethanol, verbetert lineariteit verkregen ten koste van verminderde fluorescentie-intensiteit (Figuur 2A). Voor Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus en Scenedesmus obliquus, een ethanolconcentratie van 30% bleek de optimale compromis geven tussen verbeterde lineariteit en verminderde fluorescentie-intensiteit 11. Het kan nodig zijn de ethanolconcentratie aanpassen om optimale resultaten voor andere organismen.
Het kiezen van de juiste excitatie en emissie golflengtes voor het lezen van de fluorescentie in de algen monsters cruciaal ensure alleen neutrale lipiden worden opgenomen in de meting. Nile Red fluorescentie-intensiteit varieert bij verschillende golflengten afhankelijk van de polariteit van het milieu 11,13. Voor A. protothecoides, de emissie piek voor neutrale lipiden waargenomen bij 590 nm; een tweede piek die meer polaire lipiden kunnen worden waargenomen bij 645 nm 11. Bijgevolg fluorescentie-intensiteit metingen die in deze procedure werd uitgevoerd met een 530 nm excitatie-filter met halve bandbreedte = 10 nm en een emissie-filter 604 nm met een halve bandbreedte = 10 nm. Keuze van excitatie en emissie golflengte moet worden gecontroleerd voor elke algen stam getest.
Aangezien Nile Red fluoresceren in een niet-polaire omgeving, zal celstructuren naast lipide organen worden gedetecteerd door de spectrofotometer (zie figuur 1B). Dit feit, in combinatie met de inherente heterogeniteit van biomassa leidt tot een niet-lineaire relatie tussenbiomassa en fluorescentie 11. Dit probleem wordt opgelost door te zorgen voor alle monsters bereid bij een constante droge stof (5 g / L aanbevolen). Bij verdunde concentraties het signaal zwak wordt en de trends zijn moeilijk te onderscheiden. Bovendien kan het fluorescentiesignaal lawaaierig vanwege cel-cel variaties en deeltjesvormige suspensies in de media. Bijgevolg 5 replicaten van elk monster worden aanbevolen voor betrouwbare resultaten 11.
Sommige protocollen gebruiken een olie standaard zoals trioleïne om de meting 10,20,21 kalibreren. Hoewel deze techniek is gemeld met succes voor bepaalde soorten algen, zoals Bacillariophyceae en Dinophyceae, is het minder geschikt voor dikwandige algen zoals Chlorella door diffusie beperkingen over het celmembraan. Bovendien kan de toevoeging van trioleine de verdeling van Nile Red moleculen tussen de standaard en de lipide organen leiden t verstoreno onnauwkeurige schattingen van het oliegehalte. Met behulp van algen monsters van bekende oliegehalte als standaarden vermijdt deze potentiële tekorten en is goed voor de achtergrond fluorescentie veroorzaakt door de biomassa en groeiomstandigheden.
De in deze studie protocol een eenvoudige, goedkope en snelle werkwijze voor het kwantificeren van neutrale lipiden in algen monsters. Door het gebruik van een multi-well plaat, zijn veel monsters doorvoersnelheden bereikt met aanzienlijke tijdwinst ten opzichte van andere kleuringsprotocollen. Bovendien zijn de voorwaarden van de test is geoptimaliseerd om reproduceerbare lineaire trends opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada bedanken voor het verlenen van financiële steun voor dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
