Summary
Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.
Introduction
Molécula única (SM) técnicas têm muito desenvolvido ao longo dos últimos 30 anos para responder à necessidade de superar algumas das limitações dos tradicionais, as medições da solução a granel 1-3. A manipulação de moléculas biológicas únicas criou a oportunidade para medir as propriedades mecânicas de biopolímeros 4 e controlar as propriedades mecânicas da proteína-proteína 5 e interacções proteína-ADN 6,7. Detecção de fluorescência SM, por outro lado, representa uma ferramenta extremamente versátil para estudar a actividade da proteína in vitro e in vivo, conduzindo a possibilidade de localizar e rastrear as moléculas individuais com uma precisão nanométrica. Através da montagem do instrumento de ponto de espalhamento de função para a imagem SM, na verdade, pode-se realizar com uma precisão de localização, dependendo principalmente da razão sinal-para-ruído (SNR) e atingir um limite de cerca de 8,9 um nanómetro. Estas metodologias encontrar poderosoaplicações no estudo da dinâmica das proteínas de motor, bem como dos processos de difusão subjacentes alvo em busca de proteínas de ligação de ADN. A capacidade de determinar constantes de difusão como uma função da sequência de DNA, o tempo de residência no alvo e medir com precisão o comprimento do DNA explorado durante os eventos de difusão unidimensional, representam uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de interacção proteína-ADN e para a investigação dos mecanismos de busca alvo específico.
Recentemente, a combinação destas duas técnicas produziu uma nova geração de montagens experimentais 10-14, permitindo a manipulação simultânea de um substrato biológico (por exemplo, um filamento de actina ou uma molécula de ADN) e detecção / localização de um parceiro de interacção enzima (por exemplo miosina ou uma proteína de ligação ao ADN). As vantagens destas técnicas descansar principalmente na possibilidade de se exercer um controlo mecânico sobre o polímero aprisionada, assim enaBling o estudo da dinâmica de interação contra forças ou torques. Além disso, a metodologia permite a medição de reacções bioquímicas longe da superfície, evitando uma das principais limitações dos métodos clássicos SM, isto é, a necessidade de imobilização das moléculas em estudo sobre uma superfície (lâmina de vidro ou microesferas).
A combinação de duas técnicas únicas moléculas requer superar várias dificuldades técnicas, principalmente decorrente das exigências de estabilidade mecânica e SNR adequada (principalmente quando houver a necessidade de localização com precisão nm) 15. Em particular, quando o acoplamento detecção de fluorescência SM com pinças ópticas, a redução do ruído e fotodegradação dos lasers infravermelhos armadilhas 16 eo controle de buffers bioquímicos para a montagem dos complexos biológicos e realização das medidas experimentais 11 são de suma importância. Aqui, descrevemos os métodos para a realização bem-sucedidamedições em uma configuração de localização trapping / SM fluorescência dupla. A metodologia é ilustrada com o exemplo da proteína do repressor da lactose (LacI), marcado por fluorescência (com Atto532) e detectada, uma vez que se liga a uma molécula de ADN (presa entre duas pinças ópticas), contendo sequências de ligação LacI específicos (isto é, os operadores). Nós demonstrar a eficácia do método em detectar a ligação de Lacl ao ADN e ao longo do seu contorno difusão no processo de busca de alvo. O método é aplicável a qualquer combinação de sequências de ADN e de proteína de ligação de ADN, bem como para outros sistemas de microtúbulos (ou os filamentos de actina e proteínas que interagem com eles a motor).
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Protocol
1 Pinças Ópticas instalação com nanômetro Estabilidade
A configuração experimental deve fornecer duas pinças ópticas com apontando estabilidade a nível nanométrico e intensidade flutuações do laser de aprisionamento abaixo de 1%. Combinação dessas condições vai garantir estabilidade nanômetros do haltere sob tensão normal (1 PN - algumas dezenas de pn), rigidez armadilha (0,1 PN / nm) e largura de banda de medição (taxa de aquisição de imagem de 20 seg -1). Um esquema da montagem experimental é mostrada na Figura 1.
- Projeto pinças ópticas e de construção 15,17:
- Monte o aparato experimental em uma mesa óptica com isoladores de ativos para reduzir as vibrações mecânicas. Montar a estrutura microscópio sobre isoladores elastoméricos para absorver o ruído acústico e ressonâncias mecânicas da estrutura microscópio.
- Inserir um isolador óptico no percurso do laser aprisionamento, perto da fonte de luz laser, para reduce flutuações de amplitude aleatórias devido a realimentação óptica.
- Reduza o comprimento do caminho do laser armadilhas, tanto quanto possível e coloque todo o caminho em uma caixa selada para reduzir as flutuações do laser apontadores devido às correntes de ar e turbulência.
- Criar pinças ópticas duplas dividindo uma única fonte de laser infravermelho próximo (Nd: YAG, 1064 nm de comprimento de onda) em dois feixes com polarizações ortogonais. Não use armadilhas compartilhada em tempo, pois causam oscilação do haltere sob tensão 12.
- Use defletores óptico-acústico (EDAO) impulsionado por sintetizadores digitais Diretos (DDSS) para permitir movimentos finos de (pelo menos) uma armadilha e regulação precisa da tensão DNA. DDSs permitir uma melhor estabilidade armadilha de osciladores de tensão controlada (VCOs).
- Inserir dois fotodiodos detector quadrante (QDPs) no plano focal posterior do condensador para detectar a posição dos grânulos presas com precisão sub-nm.
- Verifique se a intensidade fluctuations do laser de aprisionamento na entrada microscópio são inferiores a 1%, utilizando um fotodiodo, com uma largura de banda maior do que a taxa de aquisição de imagem.
- Verifique apontando estabilidade dos dois lasers de captura:
- Preparar grânulos de sílica em tampão fosfato: Diluir 20 uL de esferas de sílica (1,54 ^ M, 10% de sólidos) em 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, vortex brevemente, e centrifugar 2 min a 19.000 x g. Ressuspender em 1 ml de acetona e lavagem repetida. Ressuspender em 1 ml de tampão fosfato 50 mM, lavar duas vezes, e finalmente ressuspender em 100 ul de 50 mM de tampão de fosfato.
- Calibrar pinças ópticas com contas de sílica: preparar uma célula de fluxo, anexando uma lamela para uma lâmina de microscópio utilizando fita dupla adesiva (cerca de 60 mm de espessura). Fluxo de 1 mg / ml de BSA e esperar 3 min. Fluxo de grânulos de sílica diluído 1/1000 em tampão de fosfato e vedar a câmara de fluxo com massa de silicone. Armadilha uma pérola em cada armadilha e calibrar as armadilhas, utilizando o método de espectro de potência 18. Preparar grânulos de sílica em acetato de pentilo e nitrocelulose: Diluir 20 ul de pérolas de sílica (1,54 uM, 10% de sólidos) em 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, vortex brevemente, e centrifugar 2 min a 19.000 x g. Ressuspender em 1 ml de acetona e lavagem repetida. Ressuspender em 1 ml de acetato de pentilo e lavar duas vezes. Finalmente ressuspender los em acetato de pentilo com 0,1% de nitrocelulose, dissolvido em acetato de pentilo.
- Espalhe 2 ul de esferas de sílica 1,54 um de diâmetro dissolvidos em acetato de pentilo + 0,1% de nitrocelulose sobre a superfície de uma lamela (24 x 24 mm), utilizando uma segunda lamela (24 x 60 mm). Fixe a lamela para uma lâmina de microscópio, usando dois pedaços de fita dupla face para criar uma célula de fluxo. Encha a célula de fluxo com tampão fosfato 50 mM e selá-lo com graxa de silicone.
- Imagem de um talão de sílica em microscopia de campo claro com ampliação 2,000X. O campo de visão deve ser de 7 x 5 mm adquirido em 768 x 576 pixels, para que a imagem do grânulo tem um diâmetro de 190 pixels. Compensar desvios térmicas com um software de feedback que, tal como na ref. 17, calcula a posição xy partir do centro da imagem e z a partir dos anéis de difracção e corrige desvios que se deslocam com uma fase de piezo-nm ou melhor precisão.
- Sobrepor ao centro da armadilha esquerda com o centro da pérola (os níveis de sinal xy do QDP deve ser a mesma medida durante a calibração) e medir o ruído e a sua posição de desvio padrão da QDP. Repita a medição para a armadilha direita.
2. Single Molecule localização com nanômetro Precisão
- Projeto de microscopia de fluorescência e construção 15,19
- Use uma alta eficiência quântica e CCD multiplicou-elétron para alcançar os altos índices necessários para a precisão nanométrica localização sinal-ruído.
- Escolha óptica para obter uma imagem de pixel de tamanho ~ 80 nm (por exemplo, uma ampliação da imagem ~ 200X com um tamanho de pixel de câmara de 16 mm). Este é suficientemente pequena a negligenciar erro de localização devido a pixelização 8, mas suficientemente grande para recolher um número considerável de fótons por pixel.
- Como fonte de excitação, que utilizam a luz do laser é não polarizada (por passagem através de uma fibra óptica não mantendo-polarização), ou polarizada circularmente (passando através de um λ / 4 waveplate) para maximizar a excitação de cromóforos únicos, independentemente da sua orientação.
- Escolha filtros de banda de emissão que eficiência de corte tanto excitação e armadilhas luzes de laser. Nota: Em nossos experimentos, rotulado nossa proteína com corante Atto532 e utilizado um filtro passa-banda de emissão centrada em 600 nm com largura de banda de 100 nm.
3. microfluídica
Para conseguir um controlo preciso de troca de tampão e a montagem "haltere", isto é, a fixação de uma única molécula de ADN entre as duas microesferas opticamente armadilhados, um fluxo laminar multicanal integrado personalizadosistema tem de ser desenvolvido. Este é composto por uma câmara de fluxo, uma pressão do reservatório e um sistema de controlo de pressão (Figura 2).
- Preparação da célula de fluxo
NOTA: A câmara de fluxo usado para experiências de molécula única a interacção ADN-proteína tem de preferência quatro entradas e uma saída, para permitir que até quatro fluxos de tampão em paralelo, cada uma contendo um dos diferentes elementos necessários para a experiência: grânulos, ADN, proteína, e tampão de imagiologia por fluorescência marcado. A separação dos componentes dos canais de fluxo permite uma montagem eficiente de haltere. Além disso, o canal de imagem é útil para evitar a fluorescência de fundo, a partir de proteínas de difusão e atingir a elevada relação de sinal-para-ruído necessário para a localização da proteína de ligação a DNA com uma precisão da ordem de alguns nanómetros.- Faça furos de 1 mm de diâmetro na lâmina do microscópio (76 x 76 x 1 mm) com um diamante-ponta, a fim de criar 4 entradas e uma saída.
- Limpe ªe lâminas de microscópio com etanol e o centro da porta com o anel de vedação inserido e o anel de adesivo na corrediça circundante dos orifícios de acesso. É fundamental o uso de luvas durante este passo para evitar impressões digitais, o que pode perturbar o processo de colagem.
- Fixe as NanoPorts para o slide, e colocá-lo no forno pré-aquecido a 180 ° C por 1 hora para permitir a ligação completa.
- Desenhar o padrão do contorno da célula de fluxo de um pedaço de papel. Os canais devem ser ~ largura de 3 mm e corresponder à posição de orifícios na lâmina de microscópio.
- Coloque o desenho por cima de dois pedaços de Parafilm e com um bisturi afiado e fazer cortes contínuos ao longo do contorno desenhada. Remova qualquer protuberância formada. Descarte a camada inferior Parafilm, que é usado apenas para garantir um suporte limpo.
- Colocar a lâmina do microscópio contendo o NanoPorts ligados de cabeça para baixo no suporte metálico.
- Alinhe cuidadosamente o contorno câmara Parafilm com os orifícios, certificando-thno parafilme não obtrude as entradas e saída da câmara.
- Cubra com lâminas de microscópio limpa (62 x 56 x 0,15 milímetros) e retire cuidadosamente o excesso de Parafilm torno da câmara.
- Colocar dois blocos de calor, previamente aquecido a 120 ° C, na parte superior da célula de fluxo para aplicar pressão constante sobre ele. Deixe o Parafilm derreter por aproximadamente 25 min.
- Reservatório de pressão e recipientes de tampão
O reservatório de pressão deve ser feita de Plexiglas (ou semelhante) e permitir a acomodação de seis recipientes de tampão. A possibilidade de dispor de, pelo menos, dois recipientes de tampão adicional melhora a flexibilidade do instrumento. Note que os recipientes transparentes e tubos ajudam consideravelmente na manipulação do sistema de fluxo e solução de problemas de bolhas de ar presas. Luer estéril e descartável seringas lock-ponta (2,5 ml), a partir do qual os êmbolos foram removidos, são recipientes tampão boas e permitem uma fácil ligação com o tubo de entrada. Certifique-se de queo volume total de fluido é pequena em comparação com o volume de ar no interior do reservatório de pressão, uma condição essencial para se obter um fluxo suave e estável.- Conecte válvulas de corte na saída dos recipientes tampão para transformar o fluxo tampão ligado ou desligado durante os experimentos.
- Montar a célula de fluxo na platina do microscópio. Ligue as válvulas de corte para as entradas de câmara de fluxo com tubos polieteretercetona (diâmetro ~ 150 um interno) e acessórios sem flange. Adicionar ~ 3 cm da tubagem de etileno propileno fluorado (~ 500 mm de diâmetro interno) como uma ligação entre o tubo e os conjuntos NanoPort da célula de fluxo. Este passo é essencial para reduzir o fluxo de tampão na câmara de entrada para evitar a ruptura da célula de fluxo ou NanoPort descolamento do vidro. O uso de tubos de grande diâmetro interno sozinho, por outro lado, iria exigir grandes volumes de amostras biológicas.
- Ligue a saída da câmara de fluxo para um tubo Falcon aberto à pressão atmosférica. Estetubo serve como disposição para o buffer que sai da câmara de fluxo.
- Sistema de controle de pressão
- Construir um sistema de controlo de pressão capaz de ajustar com precisão a pressão de ar no interior do reservatório de pressão. Isto pode ser feito por meio de duas válvulas solenóides controladas por computador, que está ligado a uma fonte de pressão de 0,5 atm (compressor) e o segundo à pressão atmosférica. As válvulas solenóides são repetidamente aberto durante aproximadamente 7 mseg para aumentar ou diminuir a pressão na linha até que o valor desejado seja alcançado. NOTA: esta abordagem foi adaptada de Carlos Bustamante 20, e produz um fluxo mais suave do que usar uma bomba de seringa motor de passo 21.
- Adicionar um transdutor de pressão controlada por um software de escrita à medida para monitorizar a pressão efectiva exercida sobre o reservatório de pressão. Pressões típicas de trabalho são da ordem de 20 mbar para montagem haltere e 200 mbar para lavar os componentes do sistema de fluxo.
4. ADN Tailing com biotinilado Desoxicitidina trifosfato (biotina-dCTP)
A molécula de DNA deve ser maior do que 1 pm a facilitar a sua extensão e sob fluxo de ancoragem para os grânulos de presas. Além disso, um ADN de comprimento vai evitar que a luz IR aprisionamento de iluminar a proteína de ligação de ADN. Isto tem uma importância especial, pois a absorção de luz IR de um cromóforo animado resulta em aumento da fotodegradação. NOTA: No presente estudo, a molécula de DNA foi de 3,7 mM de comprimento. A molécula continha três cópias do operador principal O1 e uma cópia de cada um dos dois agentes auxiliares, O2 e O3. Estas sequências foram inseridos no meio da molécula, o que resulta, portanto, aproximadamente equidistantes entre as esferas presos e raios laser infravermelhos.
- Misture 1 pmol de DNA extremidades 3 'lineares com 60 pmol de biotina-14-dCTP, 4 l de 5x Terminal deoxynucleotidyl Transferase tampão (TdT) (1 ca M de potássiocodylate, Tris 125 mM, 0,05% (v / v) de Triton X-100, 5 mM de CoCl2 (pH 7,2 a 25 ° C)) e 1,5 ul de TdT e ddH2O para um volume total de 20 ul. Incubar a mistura a 37 ° C durante 15 min. Isto resultará na adição de até 60 nucleótidos por cada extremidade do ADN. Note-se que o DNA 3'-saliências são atados com maior eficiência do que as extremidades de recesso ou cega.
- Purificar DNA atados com colunas de spin ou fenol / clorofórmio e posterior precipitação etanol para remover CoCl 2 do tampão de reação TdT.
- Após a purificação, o ADN pode ser armazenado a 4 ° C, durante várias semanas, ou a -20 ° C durante períodos mais longos, mas evitar o descongelamento repetidos e recongelação.
5. de marcação de proteínas com grupos tiol Atto532
Rotular através da modificação de resíduos de cisteína não deve alterar a atividade de proteínas. Para ultrapassar este problema, usamos LacI mutante, LacIQ231C, um which transporta apenas uma cisteína por monómero na posição 231 Este mutante preserva as mesmas características do tipo selvagem e as modificações químicas na posição 231 foram mostradas para não interferir com a estabilidade da proteína 22. NOTA: Nós marcado a proteína com ATTO532 maleimide.
- Certifique-se de que a proteína é dissolvida num tampão com um pH variando de 7,0 a 7,5 e com uma concentração variando de 2 a 10 mg / ml. NOTA: nestas experiências, LacI foi dissolvido em fosfato de potássio 0,3 M, glicose a 5%, pH 7,5 (tampão A).
- Dissolve-se Tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP) a uma concentração final de 100 mg / ml em H 2 O. TCEP solução deve ser preparada antes da utilização.
- Misturar 100 mL da proteína com TCEP e 3 ul de vórtice cuidadosamente.
- Dissolve-se o corante em N, N-dimetilformamida (DMF) a uma concentração final de 10 mg / ml de trabalho em condições de pouca luz. Vortex até dissolver completamente.
- Reação mix: Adicionar 33 mL de corante à proteína + TCEP e vortex cuidadosamente. Rotação rápida para recolher o máximo de solução possível.
- Incubar a mistura de reacção durante 2 horas num agitador (8000 rpm) a 20 ° C (ou a 4 ° CO / N), ao abrigo da luz.
- Dissolver L-glutationa reduzida (GSH) a uma concentração final de 100 mg / ml em H 2 O. Adicionar 3 mL da mistura de reacção e incuba-se com o agitador a 8000 rpm durante 15 min. GSH irá parar a reacção por bloquear a reactividade dos grupos tiol.
- Purifica-se a proteína marcada usando colunas de filtração em gel, padrão de diálise ou concentradores de spin. NOTA: Nestas experiências, marcado LacI foi purificado por meio de 10 kDa concentradores de corte de rotação.
- Dilui-se a mistura de reacção com um máximo de 12 ml de tampão A, aplicá-lo ao dispositivo concentrador, e centrifuga-se que em 8000 xg, 1 hora, 4 ° C. O LacI assim marcado é concentrada até um volume final de cerca de 500 mL e o excesso de tinta passa a membrana na flow-through. Descarte o flow-through e repita o passo 5.8.1, pelo menos, três vezes.
- Dividir a proteína marcada em pequenas alíquotas e armazenam-se a -80 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido.
6. combinada óptica Trapping e única molécula Experimentos imagens de fluorescência
- Adicionar 1 mL de tampão A para os recipientes de tampão e aplicar pressão de 200 mbar para lavar as tubagens de ligação e célula de fluxo. Para maximizar a difusão da proteína de ligação de ADN, aqui e nos passos seguintes, Um tampão pode ser substituída com um tampão de baixa força iónica. NOTA: Nestes experimentos, foram utilizados 0,5 x TBE.
- Verificar a presença de bolhas de ar, o que pode afectar a suavidade do fluxo. Um movimento suave no tubo de saída vai ajudar a eliminar as bolhas restantes.
- Diminuir a pressão de 20 mbar e verificar que todos os canais e tubos estão livres de bolhas de ar eo buffer flui com velocidades semelhantes em todos os canais.
- Preparar as amostras para um volume final de 300 uL: esferas de poliestireno revestidas com estreptavidina, 1,87 m; 20 pM de DNA linear, biotinilado em ambas extremidades, de acordo com o ponto 4; 300 pM de LacI tetramer marcado com Atto532 de acordo com a seção 5.
- Adicionar a cada amostra para um dos recipientes de seringa, na seguinte ordem: Os grânulos no primeiro canal, o DNA no segundo terço do canal, com o tampão de imagem apenas (sistema de tampão A + eliminador de oxigénio) e a proteína marcada no quarto canal.
- Ligue o fluxo em 200 na mbar durante 3 minutos para permitir que as amostras chegam no interior do canal de fluxo. Em seguida, reduzir a pressão de 20 mbar.
- Enquanto a imagem do primeiro canal sob iluminação de campo claro, ligar as duas pinças ópticas e pegar um talão de poliestireno em cada armadilha.
- Mova-se rapidamente para o segundo canal para evitar que outras esferas caem nas armadilhas. Note-se que a chegada do canal de ADN é facilmente perceptível pela extremidade do rebordo de fluxo.
- Usando one AOD, mover uma armadilha (cordão) para trás e para a frente na proximidade do outro cordão para permitir a fixação do ADN estendido de fluxo entre as duas esferas opticamente armadilhados. Quando um haltere de ADN é formado, o talão estático começa a seguir o movimento da esfera que está activamente deslocado para trás e para a frente através da armadilha.
- Mova-se rapidamente para o canal de buffer e desligar o fluxo de buffer. Realizar uma análise da curva da força de extensão de 4,23-25 para verificar a presença de uma única molécula de DNA. Se mais do que uma molécula está presente (isto é, a entalpia, levantando fase da curva de força-de extensão ocorre em um comprimento mais curto do que o comprimento do contorno do DNA), descartar o haltere e começar de novo a partir do passo 6.7.
- Uma vez que um único haltere DNA é obtido, ligue o fluxo de novo e mover o haltere para o canal de proteína. Mudar para a microscopia de fluorescência de campo grande para monitorar a interação do rótulo LacI com DNA. Desligue o fluxo e começar a aquisição.
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Representative Results
Em uma experiência positiva, uma (ou mais) proteínas marcadas passam por ligação / desligação de difusão e / ou unidimensional ao longo da molécula de DNA (Figura 3A). A localização de proteínas ao longo da molécula de ADN permite a quantificação dos parâmetros cinéticos, como uma função da sequência de ADN. Quando são aplicadas as condições do tampão que causam a difusão 1E, é possível seguir trajectórias de proteína, e determinar, por exemplo, o coeficiente de difusão D 1E.
A posição precisa de um único local, em cada quadro, podem ser determinados através do ajuste da Função de Espalhamento Pontual (FEP) com uma função de Gauss bidimensional ou, em alternativa, o manuseamento de um grande conjunto de dados, com um algoritmo mais rápido, recentemente publicado (radial Simetria Center, RSC) 26,27. Este último método consiste em determinar o ponto de máximo de simetria radial da imagem, atingir uma precisão de localização, que é tipicamente comparável com a montagem de Gauss. Em both casos, o acompanhamento pode ser alcançado através de rotinas MATLAB que podem ser acessados livremente 27.
A Figura 3A mostra uma kymogram de uma experiência típica em que uma única molécula de Lacl se difunde ao longo sequências não específicas de ADN, enquanto uma outra molécula LacI está especificamente ligada a um operador, situada no centro da molécula de DNA. Figura 3B mostra a posição dos dois moléculas LacI (obtido utilizando RSC) ao longo da direcção que liga os centros das duas armadilhas (x), como uma função do tempo. A partir da posição da molécula de difusão ao longo da molécula de DNA, calculou-se a média quadrada Displacement (MSD) em diferentes intervalos de tempo de acordo com a seguinte equação:
(1)
onde N é o número total de posições de medida e n é o índice de medição f indo rom 1 a N. Em caso de pura difusão browniano unidimensional, a MSD é diretamente proporcional ao n Dt (Dt é o intervalo de tempo entre dois quadros consecutivos, 100 ms, em nossos experimentos), com uma inclinação igual a duas vezes o coeficiente de difusão (MSD (n, N) = 2D 1 nΔt). Figura 4 mostra o gráfico MSD vs nΔt por difusão ao longo da molécula de DNA. O coeficiente de difusão da proteína pode ser facilmente obtido a partir de um ajustamento linear da trama MSD nΔt vs. Note-se que à medida que n aumenta, o número de pontos para o cálculo da MSD Eq. 1 consequentemente diminui. O erro na avaliação da MSD, portanto, aumenta com n. Por esta razão, optamos por limitar a nossa análise para n = N / 4. Este é um valor de qualquer modo muito grandes em comparação com o N / 10 usado por muitos laboratórios.
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Figura 1 A configuração experimental é composto por: lâmpada halógena (H), condensador (C), da amostra (S), os tradutores piezo (XY e Z), objetivo (O), uma câmera de baixa ampliação (CCD 200X) e um alto -magnification câmara (CCD 2,000X) utilizado para a realimentação nm-estabilização (BS é um divisor de feixe cubo 50:50). pinças ópticas duplas são inseridos e extraiu-se a partir do eixo óptico do microscópio através de espelhos dicróicos (D2 e D3) e compreendem: Nd: YAG (1064 nm), isolador óptico (OI), λ / 2 waveplates, polarizando cubos divisor de feixe (PBS), defletores óptico-acústico (AOD), 1064 nm filtros interferenciais (F1 e F2), detector de quadrante fotodiodos (QDP). Sinais de QDPs foram adquiridos através de um conversor analógico-digital (ADC) e elaborado com uma placa FPGA. Dois sintetizadores digitais diretas custom-built (DDS) levou os gestores orçamentais delegados para controlar a posição "armadilhas. A placa de entrada-saída digital (DIO) controlou oAbertura de duas válvulas de solenóide (V1 e V2), ligados a um compressor (0,5 atm) e a pressão ambiente (0 atm), respectivamente. Um software Labview monitorada a pressão no interior do reservatório de pressão (C1) através de um medidor de pressão (PM) e abre-se automaticamente uma das duas válvulas de atingir o nível de pressão desejado. Fluorescência de excitação foi fornecido por um duplicado laser Nd: YAG (532 nm) e da imagem projetada de um elétron multiplicado câmera (EMCCD). M é um espelho móvel, F3 um filtro de emissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura diagrama 2 (A) sistema Flow. O sistema de controlo de pressão é constituído por um medidor de pressão (PM) e duas válvulas de solenóide V1 e V2 ligared para um compressor a 0,5 atm (PRS) e a pressão ambiente (ATM), respectivamente. X1 e X2 representam conectores de 3 vias. A abertura das válvulas é finamente ajustados para atingir a pressão desejada no reservatório de pressão com quatro recipientes C1-tampão. Cada tubo de entrada inclui uma válvula independente / desligar na entrada da câmara de fluxo multicanal. O tubo de saída está ligado ao recipiente de resíduos C2 colocada à pressão ambiente. Os desenhos não estão à escala. (B) Representação esquemática da câmara de fluxo multicanal. Quatro fluxos laminares translocam separadamente contas funcionalizados de poliestireno, as moléculas de DNA, tampão de imagem e proteínas marcadas. Duas esferas são pegos com pinças ópticas duplas e se mudou para o canal de DNA para permitir a ancoragem DNA entre eles. A análise do DNA de força de extensão é realizada em tampão do canal para verificar a presença de uma única molécula de ADN e, só depois, o DNA é incubado no canal de proteína. A inserção mostra uma magnificação da construção molecular final, pronto para uma única molécula de imagem no canal buffer. Os desenhos não estão em escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 A localização de moléculas individuais LacI interagindo com uma molécula de ADN esticadas. (A) O eixo vertical do kymogram representa a coordenada x, paralela à molécula de DNA, enquanto que o eixo horizontal é o tempo (tempo de aquisição de 100 ms). (B ) Posição X da molécula LacI vs tempo. A posição das moléculas foi determinada pelo RSC. As imagens foram adquiridas em 100 ms de tempo de exposição e 1,25 x 10 -2 W cm -2 excitação intensidade do laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 Lote da MSD vs tempo para uma única molécula de LacI difundir ao longo de uma molécula de ADN esticadas. A MSD é calculada a partir do registo posição representada na Figura 3B (vermelho). O coeficiente de difusão D 1E, obtido a partir de uma regressão linear dos dados representados na figura, é de 0,030 ± 0,002 mM 2 seg -1.
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Discussion
Na última década, as técnicas simples de manipulação de imagem e de moléculas houve um grande progresso em termos de resolução espacial e temporal. A combinação das técnicas de manipulação de imagem e está na base de poderosos instrumentos que agora permitem o controlo das condições mecânicas de um único polímero biológico, tal como ADN, ARN ou filamentos do citoesqueleto, a localização e simultânea de proteínas individuais de interagir com o mesmo polímero . Controlando as condições mecânicas do polímero de presa é de particular interesse. De facto, em células vivas, os ácidos nucleicos são continuamente submetidos a tensão mecânica provocada por enzimas e proteínas de interagir; de forma semelhante, uma rede complexa de proteínas que interagem e motores moleculares modula a tensão sobre os filamentos do citoesqueleto. Por outro lado, a possibilidade de detectar e localizar com precisão as proteínas que interagem com os ácidos nucleicos, permite a medição de interacções moleculares em função da sua posição ao longo da sequência de ADN ou ARN.
Combinando técnicas de manipulação e de imagem única molécula requer um projeto cuidadoso da configuração experimental e as construções biológicas. Armadilhas ópticas deve fornecer um suporte estável, garantindo a estabilidade de nível nm do polímero suspenso. Essa estabilidade pode ser alcançada através do isolamento cuidadoso do aparato experimental das inúmeras fontes de ruídos mecânicos e minimizando apontar laser e flutuações de amplitude. Precisos (sub-nm) movimentos das armadilhas ópticas são alcançados usando EOA conduzidos por DDSs. Aqui, ilustramos um protocolo passo a passo para otimizar e verificar a estabilidade "pinças ópticas no nível nm.
A microscopia de campo amplo simples epi-fluorescência acoplado a uma câmara EMCCD é usada para localizar os cromóforos individuais que interagem com o polímero em suspensão. O nosso ensaio experimental está limitado ao longo de ADN ou moléculas de ARN (≥6 kpb) para assegurar uma separação espacial apostaween o feixe de laser e prendendo a sonda fluorescente. De facto, o laser superposição de aprisionamento de infravermelho próximo com o laser de excitação visível levaria a fotobranqueamento melhorada dos cromóforos, devido à absorção de luz no infravermelho próximo, enquanto o cromóforo está no estado animado 16. Montagem Dumbbell é outro procedimento complicado que é melhor obtida usando uma célula de fluxo multicanal, para o qual forneceu uma descrição detalhada. Foi indicado como otimizar o fluxo de buffer e como evitar as bolhas de ar, que podem de outra forma comprometer seriamente as experiências. Descrevemos protocolos para marcação das extremidades de ADN com biotina, o qual é necessário para a montagem de haltere usando esferas revestidas com estreptavidina, e os protocolos para marcação de proteínas. Finalmente, as operações ilustradas passo-a-passo para realizar experiências em que a ligação de difusão e de uma única molécula do repressor de lactose numa molécula de ADN é estirado quantificados.
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Acknowledgments
Agradecemos Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross para ajudar com a microfluídica e Alessia Tempestini para obter ajuda com a preparação da amostra. Esta pesquisa foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de subvenção n ° 284464 e do Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro em Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e no âmbito da Projeto Nanomax Flagship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
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