Summary
نحن هنا وصف الأدوات والأساليب للكشف عن جزيئات البروتين وحيد fluorescently المسمى-التفاعل مع جزيء DNA واحدة معلقة بين اثنين المجهرية المحاصرين بصريا.
Introduction
جزيء واحد (SM) التقنيات تطورت بشكل كبير خلال السنوات الثلاثين الماضية للرد على الحاجة إلى التغلب على بعض قيود التقليدية، والقياسات حل السائبة 1-3. وقد خلق التلاعب جزيئات بيولوجية واحدة فرصة لقياس الخواص الميكانيكية لل4 البوليمرات الحيوية والتحكم في عوامل الميكانيكية من البروتين البروتين 5 والتفاعلات DNA البروتين 6،7. SM كشف مضان، من ناحية أخرى، يمثل أداة مرنة بشكل لا يصدق لدراسة نشاط البروتين في المختبر وفي الجسم الحي، مما يؤدي إلى إمكانية توطين وتتبع الجزيئات واحدة مع الدقة نانومتر. من خلال تركيب الصك نقطة الانتشار وظيفة للصورة SM، في الواقع، يمكن للمرء تحقيق توطين بدقة اعتمادا أساسا على نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وصلت إلى حد من حوالي 8،9 نانومتر. هذه المنهجيات تجد قويةتطبيقات في دراسة ديناميات بروتينات المحركات، وكذلك من عمليات الانتشار الكامنة وراء الهدف البحث في البروتينات الحمض النووي ملزم. القدرة على تحديد الثوابت نشرها بوصفها وظيفة من تسلسل الحمض النووي، وزمن البقاء على الهدف وبدقة قياس طول الحمض النووي استكشافها خلال نشر الأحداث ذات البعد الواحد، تمثل أداة قوية لدراسة ديناميكيات التفاعل بين البروتين والحمض النووي للتحقيق آليات البحث هدف محدد.
في الآونة الأخيرة، أنتجت مجموعة من هذه التقنيات اثنين جيل جديد من الاجهزة التجريبية 10-14 تمكين التلاعب المتزامن لالركيزة البيولوجية (على سبيل المثال على خيوط الأكتين أو جزيء DNA) والكشف / توطين انزيم شريك التفاعل (على سبيل المثال أو الميوسين بروتين ملزمة DNA). مزايا هذه التقنيات الراحة بشكل رئيسي على إمكانية ممارسة السيطرة الميكانيكية على البوليمر المحاصرين، وبالتالي ENAبلينغ دراسة ديناميات التفاعل مقابل القوات أو عزم الدوران. أيضا، منهجية تتيح قياس التفاعلات الكيميائية الحيوية بعيدا عن السطح، وتجنب واحدة من القيود الرئيسية للطرق SM الكلاسيكية، أي الحاجة إلى الشلل في الجزيئات قيد الدراسة على سطح (شريحة زجاجية أو المجهرية).
الجمع بين اثنين من التقنيات الجزيئات واحدة يتطلب التغلب على العديد من الصعوبات التقنية، والتي تنشأ أساسا من متطلبات الاستقرار الميكانيكية وSNR الكافي (وخصوصا عندما تتطلب توطين بدقة نانومتر) 15. خصوصا، عندما اقتران SM كشف مضان مع ملاقط بصرية، والحد من الضوضاء وphotobleaching من أشعة الليزر تحت الحمراء من 16 محاصرة والسيطرة على مخازن البيوكيميائية لتجميع المجمعات البيولوجية وأداء القياسات التجريبية 11 ذات أهمية قصوى. هنا، نحن تصف الأساليب لأداء ناجحةالقياسات في محاصرة المزدوج / SM الإسفار الإعداد الترجمة. ويتضح منهجية مع المثال من البروتين قامع اللاكتوز (اسي) fluorescently المسمى (مع Atto532) والكشف عن أنها تربط لجزيء الحمض النووي (محاصرين بين اثنين من ملاقط بصرية) التي تحتوي على متواليات محددة ملزمة اسي (أي المشغلين). نحن إثبات فعالية هذه الطريقة في الكشف عن ملزم من الحمض النووي لاسي ونشرها على طول كفاف في عملية البحث المستهدفة. هذه الطريقة تنطبق على أي مزيج من تسلسل الحمض النووي والبروتينات الحمض النووي ملزم، فضلا عن النظم الأخرى (الأنابيب الدقيقة أو خيوط الأكتين والبروتينات محرك التفاعل معهم).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الإعداد الملقط البصرية مع نانومتر الاستقرار
الإعداد التجريبية يجب أن توفر اثنين من ملاقط بصرية لافتا مع الاستقرار على مستوى النانومتر وشدة التقلبات الليزر محاصرة أقل من 1٪. سوف مزيج من هذه الشروط ضمان الاستقرار نانومتر من الدمبل في ظل التوتر نموذجي (1 السندات الإذنية - بضع عشرات من PN)، فخ صلابة (0.1 السندات الإذنية / نانومتر) وعرض نطاق القياس (صورة معدل اكتساب 20 ثانية -1). وصفت مخطط من الإعداد التجريبية في الشكل 1.
- تصميم بصري ملاقط والبناء 15،17:
- تركيب جهاز تجريبي في جدول بصري مع العوازل الفعالة للحد من الاهتزازات الميكانيكية. جبل الهيكل المجهر على عوازل مطاطية لامتصاص الضجيج والرنين الميكانيكية للهيكل المجهر.
- إدراج المعزل البصرية في مسار الليزر محاصرة، بالقرب من مصدر ليزر، لصاستنبط تقلبات السعة العشوائية بسبب ردود الفعل البصري.
- تقليل طول مسار الليزر محاصرة قدر الإمكان وإحاطة المسار كله في مربع مختومة للحد من تقلبات مشيرا الليزر بسبب التيارات الهوائية والاضطراب.
- خلق ملاقط بصرية مزدوجة طريق تقسيم القريب من الأشعة تحت الحمراء مصدر ليزر واحد (الثانية: YAG الليزر، 1،064 نانومتر الطول الموجي) إلى شعاعين مع الاستقطابات متعامدة. لا تستخدم الفخاخ تقاسم الوقت لأنها تسبب التذبذب من الدمبل في ظل التوتر 12.
- استخدام انحراف صوتية البصرية (AODs) مدفوعا المباشر مزج الرقمية (DDSS) للسماح للحركات غرامة من (على الأقل) واحد فخ والتنظيم الدقيق للتوتر DNA. DDSS سماح الاستقرار فخ أفضل من مؤشرات التذبذب التي تسيطر عليها الجهد (VCOs).
- إدراج اثنين فوتوديوديس كاشف رباعي (QDPs) في المستوى البؤري الخلفية المكثف للكشف عن موقف حبات المحاصرين مع دقة نانومتر الفرعي.
- تأكد من أن شدة وluctuations الليزر محاصرة عند مدخل المجهر هي أقل من 1٪ باستخدام الضوئي مع عرض النطاق الترددي أكبر من معدل الحصول على الصور.
- مشيرا تحقق الاستقرار اثنين من الليزر محاصرة:
- إعداد حبات السيليكا في العازلة الفوسفات: تمييع 20 ميكرولتر من الخرز السيليكا (1.54 ميكرون، و 10٪ مواد صلبة) في 1 مل من الاسيتون، يصوتن 30 ثانية، ودوامة لفترة وجيزة، وأجهزة الطرد المركزي 2 دقيقة في 19،000 ز س. resuspend في 1 مل الأسيتون وتكرار غسل. resuspend في 1 مل من 50 ملي العازلة الفوسفات، وغسل 2 مرات، و resuspend أخيرا في 100 ميكرولتر من 50 ملي العازلة الفوسفات.
- معايرة ملاقط بصرية مع حبات السيليكا: إعداد الخلية التدفق عن طريق ربط ساترة على شريحة المجهر باستخدام شريط مزدوج لزجة (حوالي 60 ميكرون سميكة). تدفق 1 ملغ / مل BSA وانتظر 3 دقائق. تدفق حبات السيليكا المخفف 1 / 1،000 في العازلة الفوسفات وختم الغرفة مع تدفق الشحوم السيليكون. فخ حبة واحدة في كل فخ ومعايرة الفخاخ باستخدام طريقة طيف الطاقة 18. إعداد حبات السيليكا في خلات pentyl والنيتروسليلوز: تمييع 20 ميكرولتر من الخرز السيليكا (1.54 ميكرون، و 10٪ مواد صلبة) في 1 مل من الاسيتون، يصوتن 30 ثانية، ودوامة لفترة وجيزة، وأجهزة الطرد المركزي 2 دقيقة في 19،000 ز س. resuspend في 1 مل الأسيتون وتكرار غسل. resuspend في 1 مل من خلات pentyl ويغسل 2 مرات. أخيرا و resuspend لهم في خلات pentyl مع 0.1٪ النيتروسليلوز الذائبة في خلات pentyl.
- نشر 2 ميكرولتر من الخرز السيليكا 1.54 ميكرون قطر حلت في خلات pentyl + 0.1٪ النيتروسليلوز على سطح ساترة (24 × 24 مم) باستخدام ساترة الثانية (24 × 60 مم). إرفاق ساترة لشريحة المجهر باستخدام قطعتين من الشريط على الوجهين لإنشاء خلية التدفق. ملء خلايا تدفق مع العازلة الفوسفات 50 ملي وختم ذلك مع الشحوم السيليكون.
- صورة السيليكا حبة واحدة في المجهر brightfield في 2،000X التكبير. يجب أن يكون مجال الرؤية 7 × 5 ميكرون المكتسبة في 768 × 576 بكسل، حتى أن صورة حبة التي يبلغ قطرها 190 صixels. تعويض الانجرافات الحرارية مع برنامج التغذية المرتدة التي، كما في المرجع 17، يحسب موقف س ص من النقطه الوسطى صورة و z من حلقات حيود ويصحح الانجرافات تتحرك مرحلة بيزو مع نانومتر دقة أو أفضل منه.
- تتداخل مركز فخ غادر مع مركز حبة (مستويات إشارة س ص من QDP يجب أن تكون هي نفسها خلال قياس المعايرة) وقياس الضوضاء موقف والانحراف المعياري لها من QDP. تكرار القياس لفخ الصحيح.
2. واحدة جزيء التعريب مع نانومتر دقة
- تصميم مضان المجهري و15،19 البناء
- استخدام كفاءة عالية ونوعية CCD-تضاعف الإلكترون للوصول إلى ارتفاع إشارة إلى الضجيج نسب اللازمة لدقة النانومتر الترجمة.
- اختيار البصريات للحصول على صورة بكسل حجم ~ 80 نانومتر (على سبيل المثال، تكبير الصورة ~ 200X مع حجم بيكسل من 16 ميكرون). هذا هو suffiصغيرة بشكل كاف لإهمال الخطأ التعريب بسبب البيكسيلاشن 8، ولكن كبيرة بما فيه الكفاية لجمع عدد كبير من الفوتونات لكل بكسل.
- كمصدر الإثارة، واستخدام ضوء الليزر التي هي غير مستقطب (عن طريق تمرير من خلال الألياف البصرية المحافظة غير القطبية) أو الاستقطاب دائري (عن طريق تمرير من خلال λ / 4 waveplate) لتحقيق أقصى قدر من الإثارة chromophores واحدة، بغض النظر عن ميولهم.
- اختيار مرشحات ممر الموجة الانبعاثات التي قطع بكفاءة سواء الإثارة ومحاصرة أضواء الليزر. ملاحظة: في تجاربنا نحن البروتين المسمى لدينا مع Atto532 الصبغة واستخدام ممر الموجة مرشح الانبعاثات تركزت في 600 نانومتر 100 نانومتر مع عرض النطاق الترددي.
3. على microfluidics
لتحقيق مراقبة دقيقة الصرف العازلة والتجميع 'الدمبل "، أي ترسيخ جزيء DNA واحد بين اثنين المجهرية المحاصرين بصريا، تدفق الصفحي متعددة مبنية خصيصايجب تطوير النظام. وتتكون هذه من قبل غرفة التدفق، وعلى خزان الضغط ونظام مراقبة ضغط (الشكل 2).
- إعداد خلية تدفق
ملاحظة: غرفة تدفق المستخدمة في التجارب واحد جزيء DNA على التفاعل البروتين ويفضل أن يكون لها 4 مداخل ومخرج 1، للسماح تصل إلى 4 تدفقات عازلة متوازية، كل منها تحتوي على واحد من المكونات المختلفة اللازمة للتجربة: الخرز، والحمض النووي، fluorescently المسمى البروتين، وعازلة التصوير. فصل المكونات في قنوات التدفق يسمح التجميع الفعال للالدمبل. وعلاوة على ذلك، قناة التصوير مفيدة لتجنب مضان الخلفية من البروتينات نشرها وتحقيق نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء المطلوبة لتوطين بروتين الحمض النووي ملزم مع دقة من أجل من بضعة نانومتر.- حفر ثقوب قطرها 1 ملم في الشريحة المجهر (76 × 76 × 1 ملم) مع طرف الماس، من أجل خلق 4 مداخل ومخرج واحد.
- عشر نظيفةالمجهر الشرائح الإلكترونية مع الإيثانول وتتركز الميناء مع يا الدائري إدراج وعصابة لاصقة في الشريحة المحيطة الثقوب الوصول. فمن الأساسي لارتداء القفازات خلال هذه الخطوة لتجنب بصمات الأصابع، والتي من شأنها أن تعكر صفو عملية الإلتصاق.
- المشبك NanoPorts إلى الشريحة، ووضعها في فرن محمى على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح المرفقات كاملة.
- رسم الخطوط العريضة لنمط الخلية التدفق على قطعة من الورق. يجب أن تكون القنوات ~ 3 مم واسعة وتطابق موقف الثقوب على شريحة المجهر.
- وضع رسم على أعلى من قطعتين من parafilm، ومع مشرط إجراء تخفيضات حادة ومستمرة على طول الخطوط العريضة مرسومة. إزالة أي نتوء تشكيلها. تجاهل Parafilm طبقة أقل، والذي يستخدم فقط لضمان دعم نظيفة.
- وضع شريحة المجهر تحتوي على NanoPorts تعلق رأسا على عقب في دعم معدنية.
- محاذاة بعناية غرفة مخطط Parafilm مع الثقوب، والتأكد من عشرفي parafilm لا obtrude مداخل ومخرج من الغرفة.
- تغطية مع ساترة المجهر تنظيف (62 × 56 × 0.15 مم) وإزالة بعناية Parafilm الزائد المحيطة الغرفة.
- وضع اثنين من كتل الحرارة، يسخن سابقا عند 120 درجة مئوية، وعلى رأس خلية تدفق لتطبيق الضغط المستمر على ذلك. السماح للParafilm تذوب لحوالي 25 دقيقة.
- خزان الضغط وحاويات عازلة
وينبغي بذل خزان ضغط زجاجي (أو ما شابه) والسماح الإقامة من ستة حاويات عازلة. احتمال وجود اثنين على الأقل حاويات عازلة إضافية يحسن مرونة الصك. لاحظ أن حاويات شفافة وأنابيب مساعدة بشكل كبير في معالجة تدفق النظام واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من فقاعات الهواء المحتبسة. بالتركيبة العقيمة والمحاقن المتاح قفل طرف (2.5 مل)، والتي من الغطاسون قد أزيلت سابقا، هي حاويات عازلة جيدة وتسمح للاتصال سهلة مع أنابيب مدخل. تأكد من أنإجمالي حجم السائل صغير مقارنة مع حجم الهواء داخل خزان الضغط، وهو شرط أساسي للحصول على تدفق سلس ومستقر.- ربط صمامات للإيقاف في الخروج من حاويات عازلة لتحويل تدفق عازلة أو إيقاف تشغيله أثناء التجارب.
- تركيب الخلية تدفق على المسرح المجهر. ربط صمامات للإيقاف لمداخل غرفة التدفق مع أنابيب polyetheretherketone (القطر الداخلي ~ 150 ميكرون) والتجهيزات flangeless. إضافة ~ 3 سم من المفلورة الإيثيلين بروبيلين أنابيب (القطر الداخلي ~ 500 ميكرون)، والربط بين الأنابيب والمجالس NanoPort الخلية التدفق. هذه الخطوة ضرورية للحد من تدفق عازلة عند مدخل الغرفة لتجنب الكسر للخلية تدفق أو NanoPort مفرزة من الزجاج. استخدام أنابيب كبيرة القطر الداخلي وحده، من ناحية أخرى، يتطلب كميات هائلة من العينات البيولوجية.
- قم بتوصيل منفذ غرفة التدفق إلى أنبوب فالكون مفتوحة في الضغط الجوي. هذاكما يخدم أنبوب التخلص من المخزن المؤقت المتدفقة من غرفة التدفق.
- نظام مراقبة ضغط
- بناء نظام مراقبة ضغط قادرة على ضبط دقة ضغط الهواء داخل خزان الضغط. ويمكن القيام بذلك عن طريق استخدام اثنين من صمامات الملف اللولبي الكمبيوتر التي تسيطر عليها، واحدة متصلة مصدر الضغط +0.5 أجهزة الصراف الآلي (ضاغط) وثانية واحدة إلى الضغط الجوي. يتم فتح الملف اللولبي الصمامات مرارا وتكرارا لحوالي 7 ميللي ثانية لزيادة أو تقليل الضغط في الخط حتى يتم الوصول إلى القيمة المطلوبة. ملاحظة: تم تكييفها هذا النهج من كارلوس بوستامانتي 20، وانه يعطي تدفق أكثر سلاسة من استخدام محرك خطوة حقنة مضخة 21.
- إضافة محول الضغط التي تسيطر عليها برامج مكتوبة مخصصة لمراقبة ضغط فعال المبذولة على خزان الضغط. ضغوط العمل النموذجية هي في حدود 20 ميللي بار لتجميع دمبل و 200 ميللي بار لغسل مكونات نظام التدفق.
4. DNA مع التعقب المعقدة البيروكسيديز Deoxycytidine ثلاثي الفوسفات (البيوتين-dCTP)
يجب أن يكون جزيء DNA أطول من 1 ميكرومتر لتسهيل امتداده تحت التدفق وترسيخ لحبات المحاصرين. وعلاوة على ذلك، فإن الحمض النووي طويل منع محاصرة ضوء الأشعة تحت الحمراء من إلقاء الضوء على بروتين ملزمة DNA. وهذا هو ذات أهمية خاصة بسبب امتصاص الضوء الأشعة تحت الحمراء من النتائج حامل اللون متحمس في زيادة photobleaching من. ملاحظة: في هذه الدراسة، كان جزيء DNA 3.7 ميكرومتر طويلة. يحتوي جزيء ثلاث نسخ من المشغل الأساسي O1 ونسخة واحدة من كل اثنين من مشغلي المساعدة، وO2 O3. وقد تم إدراج هذه المتتاليات في منتصف جزيء، مما أدى مسافة واحدة تقريبا من الخرز المحاصرين وأشعة الليزر تحت الحمراء.
- مزيج 1 بمول من الحمض النووي الخطية 3'نهايات مع 60 بمول من البيوتين-14-dCTP، 4 ميكرولتر من 5X محطة deoxynucleotidyl ترانسفراس (TDT) العازلة (1 CA M البوتاسيومcodylate، 125 ملي تريس، 0.05٪ (V / V) تريتون X-100، 5 ملي كوكلي 2 (درجة الحموضة 7.2 عند 25 ° C)) و 1.5 ميكرولتر من TDT وDDH 2 O إلى إجمالي حجم 20 ميكرولتر. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. هذا سوف يؤدي إلى إضافة ما يصل إلى 60 النيوكليوتيدات في أقصى DNA. لاحظ أن الحمض النووي وتيل 3'-يتدلى مع كفاءة أعلى من راحة أو نهايات حادة.
- تنقية DNA الذيل مع الأعمدة تدور أو الفينول / استخراج الكلوروفورم والإيثانول هطول احق لإزالة كوكلي 2 من رد فعل العازلة TDT.
- بعد تنقيتها، DNA يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع أو في -20 درجة مئوية لفترات أطول ولكن تجنب الذوبان المتكررة وإعادة تجميد.
5. صفها البروتين المجموعات ثيول مع ATTO532
وصفها من خلال تعديل بقايا السيستين يجب أن لا يغير من نشاط البروتين. للتغلب على هذه المشكلة، استخدمنا اسي متحولة، LacIQ231C، حركتيح يحمل السيستين واحد فقط في مونومر في موقف 231. هذا المسخ يحافظ على نفس الخصائص من النوع البري والتعديلات الكيميائية في موقف 231 وقد ثبت أن لا تتداخل مع استقرار البروتين 22. ملاحظة: نحن البروتين المسمى مع ATTO532 maleimide.
- ضمان أن البروتين يذوب في منطقة عازلة مع درجة الحموضة تتراوح 7،0-7،5 ومع تركيز تتراوح من 2 إلى 10 ملغ / مل. ملاحظة: في هذه التجارب، تم حل اسي في فوسفات البوتاسيوم 0.3 M، 5٪ الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.5 (العازلة A).
- حل Tris- (2-carboxyethyl) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP) إلى تركيز النهائي من 100 ملغ / مل في H 2 O. يجب أن يكون مستعدا حل TCEP الطازجة قبل استخدامها.
- مزيج 100 ميكرولتر من البروتين مع TCEP 3 ميكرولتر ودوامة بعناية.
- حل الصبغة في N، N -dimethylformamide (DMF) إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل العمل في حالة الإضاءة الخافتة. دوامة حتى يذوب تماما.
- ميل رد فعلس: إضافة 33 ميكرولتر من صبغ لبروتين + TCEP ودوامة بعناية. تدور سريع لجمع أكبر قدر من حل ممكن.
- احتضان مزيج التفاعل لمدة 2 ساعة في شاكر (8،000 دورة في الدقيقة) عند 20 درجة مئوية (أو على 4 درجات CO / N)، محمية من الضوء.
- حل L-الجلوتاثيون مخفضة (GSH) إلى تركيز النهائي من 100 ملغ / مل في H 2 O. إضافة 3 ميكرولتر إلى خليط التفاعل واحتضان على شاكر في 8،000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. سوف GSH وقف رد الفعل من خلال منع التفاعل من جماعات ثيول.
- تنقية البروتين المسمى باستخدام أعمدة الترشيح هلام القياسية، غسيل الكلى أو مركزات زيادة ونقصان. ملاحظة: في هذه التجارب، تم تنقيته وصفت اسي باستخدام 10 كيلو دالتون مركزات قطع زيادة ونقصان.
- تمييع خليط التفاعل مع ما يصل إلى 12 مل من العازلة A، تطبيقه على الجهاز المكثف، وذلك في أجهزة الطرد المركزي 8،000 x ج، 1 ساعة، 4 درجات مئوية. وبالتالي يتركز اسي المسمى إلى الحجم النهائي من حوالي 500 ميكرولتر والصبغة يمر الغشاء في فلوث من خلال. تجاهل التدفق من خلال وكرر الخطوة 5.8.1 ثلاث مرات على الأقل.
- تقسيم البروتين المسمى إلى مأخوذة الصغيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجنب تكرار تجميد والذوبان.
6. المشتركة اصطياد بصري واحد جزيء التجارب التصوير الإسفار
- إضافة 1 مل من العازلة ألف للحاويات عازلة وتطبيق الضغط 200 ميللي بار لغسل أنابيب يربط والتدفق الخلوي. لتحقيق أقصى قدر من الانتشار للبروتين ملزمة على الحمض النووي، وهنا في الخطوات التالية، العازلة ويمكن استبدال مع انخفاض عازلة قوة الأيونية. ملاحظة: في هذه التجارب، كنا 0.5X TBE.
- تحقق من وجود فقاعات الهواء، والتي قد تعطل تدفق نعومة. سوف نفض الغبار لطيف على أنبوب منفذ يساعد على إزالة أي فقاعات المتبقية.
- تخفيف الضغط إلى 20 ميللي بار والتحقق من أن جميع القنوات والأنابيب واضحة من فقاعات الهواء وتدفقات المخزن المؤقت مع سرعات مماثلة في جميع القنوات.
- إعداد العينات إلى الحجم النهائي من 300 ميكرولتر: الخرز البوليسترين streptavidin المغلفة 1.87 ميكرون. 20 من مساء DNA الخطي، والمعقدة البيروكسيديز على كلا الأطراف وفقا للمادة (4)؛ 300 من مساء اسي tetramer المسمى مع ATTO532 وفقا للمادة 5.
- إضافة إلى كل عينة واحدة من حاويات المحاقن بالترتيب التالي: الخرز في القناة الأولى، DNA في الثانية، القناة الثالثة مع المخزن المؤقت التصوير فقط (عازلة نظام A + زبال الأوكسجين) والبروتين المسمى في القناة الرابعة.
- تحويل تدفق على 200 ميللي بار في لمدة 3 دقائق للسماح للعينات تصل داخل قناة التدفق. ثم خفض الضغط إلى 20 ميللي بار.
- بينما التصوير القناة الأولى تحت إضاءة ساطعة المجال، والتبديل على اثنين من ملاقط بصرية وقبض على حبة البوليسترين في كل فخ.
- التحرك بسرعة على القناة الثانية لتجنب أن حبات أخرى الوقوع في الفخاخ. لاحظ أن الوصول إلى القناة DNA هو ملحوظ بسهولة بنهاية تدفق حبة.
- باستخدام سشمال شرق AOD، نقل فخ واحد (حبة) ذهابا وإيابا في القرب من حبة أخرى للسماح المرفق من الحمض النووي الموسعة في تدفق بين اثنين حبات المحاصرين بصريا. عندما يتم تشكيل الدمبل DNA، حبة ثابتة تبدأ بعد حركة حبة أن يتم نقل بنشاط ذهابا وإيابا من الفخ.
- التحرك بسرعة لقناة العازلة وإيقاف تدفق العازلة. إجراء تحليل منحنى القوة تمديد 4،23-25 للتحقق من وجود جزيء DNA واحد. إذا جزيء أكثر من واحد موجود (أي enthalpic، ورفع مرحلة من منحنى القوة تمديد يحدث بطول أقصر من طول كفاف DNA)، ونبذ الدمبل والبدء من جديد من الخطوة 6.7.
- مرة واحدة يتم الحصول على الدمبل DNA واحد، بدوره على تدفق مرة أخرى ونقل الدمبل إلى القناة البروتين. التحول إلى واسعة المجهري مضان ميدانية لرصد تفاعل المسمى اسي مع DNA. إيقاف تدفق والبدء في الاستحواذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تجربة ناجحة، واحد (أو أكثر) البروتينات المسمى الخضوع ملزمة / نشر غير ملزم و / أو monodimensional على طول جزيء الحمض النووي (الشكل 3A). توطين البروتينات على طول جزيء الحمض النووي يسمح الكمي من المعلمات الحركية بوصفها وظيفة من تسلسل الحمض النووي. عندما يتم تطبيق شروط عازلة مما تسبب في نشر 1D، فمن الممكن أن تتبع مسارات البروتين، وتحديد، على سبيل المثال، معامل الانتشار D 1D.
الموقف الدقيق للبقعة واحدة، في كل إطار، يمكن تحديدها من خلال تركيب وظيفة نقطة انتشار (PSF) مع وظيفة جاوس bidimensional أو، بدلا من ذلك، عند التعامل مع مجموعة البيانات الكبيرة، مع خوارزمية أسرع، التي نشرت مؤخرا (شعاعي مركز التماثل، RSC) 26،27. يحدد الأسلوب الأخير وجهة القصوى التماثل شعاعي للصورة، وتحقيق دقة الترجمة يمكن مقارنتها عادة مع تركيب جاوس. في بوالحالات عشر، لا يمكن أن يتحقق من خلال تتبع الروتين MATLAB التي يمكن الوصول إليها بحرية 27.
ويبين الشكل 3A على مخطط التموج من تجربة نموذجية التي جزيء اسي واحد ينشر على طول تسلسل الحمض النووي غير محددة بينما جزيء آخر اسي لا بد خصيصا لمشغل واحد، وتقع في وسط جزيء DNA. يبين الشكل 3B موقف اثنين جزيئات اسي (الحصول عليها باستخدام RSC) على طول اتجاه ربط مراكز الفخاخ اثنين (خ)، بوصفها وظيفة من الزمن. من موقع الجزيء نشرها على طول جزيء DNA، حسبنا متوسط ميدان الإزاحة (MSD) في فترات زمنية مختلفة وفقا للمعادلة التالية:
(1)
حيث N هو العدد الإجمالي لمواقف قياس وn هو و مؤشر قياس ذاهب ROM 1 إلى N. في حالة نقية نشر البراونية ذات بعد واحد، وMSD هو يتناسب طرديا مع ن Δt (Δt هو الفاصل الزمني بين إطارين متتالية، و 100 ميللي ثانية في تجاربنا)، مع انحدار يساوي معامل الانتشار مرتين (MSD (ن، N) = 1 nΔt 2D). الشكل 4 يوضح MSD مقابل nΔt مؤامرة لنشرها على طول جزيء DNA. معامل انتشار البروتين يمكن الحصول عليها بسهولة من نوبة الخطي من المؤامرة MSD مقابل nΔt. كما نلاحظ أن ن الزيادات، وعدد من النقاط لحساب MSD من المعادلة. 1 بناء على ذلك النقصان. الخطأ في تقييم MSD بالتالي يزيد مع ن. لهذا السبب، اخترنا للحد من تحليلنا إلى N = N / 4. على أي حال هذا هو قيمة كبيرة جدا مقارنة N / 10 تستخدم من قبل العديد من المختبرات.
tp_upload / 51446 / 51446fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 1. يتكون الإعداد التجريبية من: مصباح الهالوجين (H)، المكثف (C)، (S) عينة والمترجمين بيزو (س ص و z)، الهدف (O)، وكاميرا التكبير المنخفض (CCD 200X) وعالية الكاميرا، تكبير (CCD 2،000X) المستخدمة لردود الفعل نانومتر الاستقرار (BS هو 50:50 شعاع الخائن مكعب). يتم إدراج ملاقط بصرية مزدوجة واستخراج من المحور البصري للالمجهر من خلال المرايا مزدوج اللون (D2 و D3) و تشمل: الثانية: YAG الليزر (1،064 نانومتر)، المعزل البصرية (OI)، λ / 2 waveplates، استقطاب مكعبات شعاع الخائن (PBS)، انحراف صوتية البصرية (AOD)، 1،064 مرشحات متداخلة نانومتر (F1 و F2)، كاشف رباعي فوتوديوديس (QDP). وقد التقط إشارات من QDPs من خلال التناظرية إلى الرقمية تحويل (ADC) وضعت مع لوحة FPGA. اثنين من تخليق الرقمية المباشرة مبنية خصيصا (DDS) قاد AODs للسيطرة على الموقف الفخاخ. لوحة التحكم الرقمي المدخلات والمخرجات (DIO) والفتحة اثنين من صمامات الملف اللولبي (V1 و V2) متصلة ضاغط (+0.5 ATM) والضغط المحيط (+0 ATM)، على التوالي. وهناك برامج ابفيف مراقبة الضغط داخل خزان الضغط (C1) من خلال الضغط متر (PM) وفتح تلقائيا واحدة من صمامات اثنين ليصل إلى مستوى الضغط المطلوب. وقدمت الإثارة مضان من قبل تكرار الثانية: YAG الليزر (532 نانومتر) والصورة المسقطة على الإلكترون ضرب الكاميرا (EMCCD). M هو مرآة المنقولة، F3 عامل تصفية الانبعاثات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. (A) نظام تدفق الرسم التخطيطي. ويتألف نظام مراقبة ضغط بواسطة مقياس الضغط (PM) واثنين من صمامات الملف اللولبي V1 و V2 اتصالإد لضاغط في +0.5 أجهزة الصراف الآلي (PRS) والضغط المحيط (ATM)، على التوالي. X1 و X2 تمثل الموصلات 3 في اتجاه. يتم ضبط فتحة الصمامات بدقة للوصول إلى الضغط المطلوب في ضغط المكمن C1 مع 4 حاويات عازلة. ويشمل كل أنبوب مدخل مستقل على / قبالة صمام عند مدخل غرفة التدفق الأقنية. توصيل الأنابيب منفذ إلى C2 حاوية النفايات وضعت في الضغط المحيط. الرسومات ليست على نطاق كبير. (B) تمثيل تخطيطي للغرفة تدفق الأقنية. أربعة تدفقات الصفحي نقل من حدة الخرز البوليسترين بين functionalized، جزيئات الحمض النووي، وعازلة التصوير والبروتينات المسمى. واشتعلت اثنين من الخرز مع ملاقط بصرية مزدوجة وانتقل إلى القناة الحمض النووي DNA للسماح ترسو بينهما. يتم إجراء تحليل DNA قوة التمديد في القناة عازلة للتحقق من وجود جزيء DNA واحد، فقط بعد ذلك، وحضنت الحمض النووي في القناة البروتين. يظهر أقحم على ماغنيfication من التركيبة الجزيئية النهائي، وعلى استعداد للتصوير واحدة جزيء في القناة العازلة. الرسومات ليست على نطاق كبير. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. توطين الجزيئات اسي واحدة تتفاعل مع جزيء DNA متمدد. (A) المحور الرأسي للمخطط التموج يمثل خ تنسيق، بالتوازي مع جزيء DNA، في حين أن المحور الأفقي هو الزمن (100 مللي ثانية اكتساب الوقت). (B ) X موقف جزيء اسي مقابل الوقت. تم تحديد موقف من الجزيئات بواسطة RSC. تم الحصول على الصور 100 ميللي ثانية زمن التعرض و 1.25 × 10 -2 W سم -2 exciكثافة الليزر الكساء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. مؤامرة من MSD مقابل الوقت لجزيء واحد اسي نشرها على طول جزيء DNA متمدد. يتم احتساب MSD من السجل موقف ممثلة في الشكل 3B (الحمراء). معامل الانتشار D 1D، تم الحصول عليها من الانحدار الخطي للبيانات يصور في الشكل، هو 0.030 ± 0.002 ميكرون 2 ثانية -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في العقد الماضي، شهدت التلاعب وتقنيات التصوير جزيء واحد تقدما كبيرا من حيث القرار المكانية والزمانية. الجمع بين تقنيات التصوير والتلاعب هو في القاعدة من الأدوات القوية التي تسمح الآن لسيطرة الظروف الميكانيكية للبوليمر بيولوجي واحد، مثل DNA، RNA أو هيكل الخلية خيوط، وتوطين المتزامن من البروتينات واحدة تتفاعل مع نفس البوليمر . السيطرة على الأوضاع الميكانيكية للبوليمر المحاصرين هو موضع اهتمام خاص. في الواقع، في الخلايا الحية، الأحماض النووية تشهد باستمرار الضغط الميكانيكي الناجم عن تفاعل الانزيمات والبروتينات. وبالمثل، شبكة معقدة من التفاعل البروتينات والمحركات الجزيئية ينظم التوتر على خيوط هيكل الخلية. من ناحية أخرى، وإمكانية لكشف وتوطين بالضبط البروتينات التي تتفاعل مع الأحماض النووية، ويسمح قياس التفاعلات الجزيئية بوصفها وظيفة من ا همشعية على طول تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي.
الجمع بين تقنيات التصوير التلاعب واحد جزيء يتطلب تصميم دقيق للالإعداد التجريبية والبنى البيولوجية. يجب الفخاخ البصرية توفر دعم مستقر، وضمان الاستقرار على مستوى نانومتر من البوليمر مع وقف التنفيذ. ويمكن الوصول إلى هذا الاستقرار من خلال العزلة متأنية للجهاز تجريبي من مصادر عديدة من الضوضاء الميكانيكية والتقليل مشيرا الليزر والتقلبات السعة. وتتحقق دقيقة (نانومتر الفرعي) تحركات الفخاخ البصرية باستخدام AODs يقودها DDSS. هنا، يتضح أننا بروتوكول خطوة بخطوة لتحسين وتحقق الاستقرار ملاقط بصرية "على مستوى نانومتر.
يستخدم بسيط واسعة المجال المجهري مضان برنامج التحصين الموسع بالإضافة إلى كاميرا EMCCD في توطين chromophores واحدة التفاعل مع البوليمر مع وقف التنفيذ. لدينا فحص التجريبي يقتصر على الحمض النووي طويلة أو جزيئات الحمض النووي الريبي (≥6 KBP) لضمان رهان الانفصال المكانيوين لمحاصرة شعاع الليزر والتحقيق الفلورسنت. في الواقع، فإن تراكب القريب من الأشعة تحت الحمراء ليزر محاصرة مع الليزر الإثارة مرئية تؤدي إلى photobleaching من تعزيز للchromophores بسبب امتصاص الضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء في حين أن حامل اللون هو في حالة مثارة 16. التجمع الدمبل هو إجراء صعبة أخرى يتم الحصول عليها بشكل أفضل باستخدام الأقنية تدفق الخلايا، والتي قدمنا وصفا مفصلا. أشرنا كيفية تحسين تدفق العازلة وكيفية تجنب فقاعات الهواء، والتي يمكن خلاف ذلك يضر على نحو خطير التجارب. وصفنا بروتوكولات لوصفها الأطراف DNA مع البيوتين، وهو مطلوب لتجميع الدمبل باستخدام الخرز streptavidin المغلفة، وبروتوكولات لوضع العلامات البروتين. وأخيرا، فإننا مصورة خطوة بخطوة عمليات لإجراء التجارب التي الربط ونشر جزيء واحد قامع اللاكتوز على جزيء DNA امتدت وكميا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر جيس Wuite، إروين JG بيترمان، وبيتر الإجمالي للمساعدة مع على microfluidics وأليسيا Tempestini للمساعدة في إعداد العينات. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7 / 2007-2013) تحت اتفاقية المنحة رقم 284464 والإيطالية من وزارة التعليم والجامعات والبحوث FIRB 2011 RBAP11X42L006، فوتورو في يسر كل من Ricerca RBFR13V4M2 2013، وفي إطار الرائد مشروع NANOMAX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
