Introduction
Одной молекулы методы (SM) значительно разработаны в течение последних тридцати лет, чтобы реагировать на потребности преодоления некоторых ограничений традиционных, измерений объемных решений 1-3. Манипулирование отдельными биологическими молекулами создал возможность измерить механические свойства биополимеров 4 и контролировать механические параметры белок-белок 5 и взаимодействий белок-ДНК 6,7. С.М. оценки флуоресценции, а с другой стороны, представляет собой чрезвычайно универсальный инструмент для исследования активности белка в пробирке и в естественных условиях, что приводит к возможности локализации и отслеживания одиночных молекул с нанометровой точностью. Посредством установки прибора точечного распространения-функции к изображению SM, на самом деле, этого можно добиться локализации с точностью в зависимости, главным образом, на сигнал-шум (SNR) и достигнув предела порядка нанометра 8,9. Эти методологии найти мощныйприложения в изучении динамики моторных белков, а также процессов диффузии, лежащие в основе целевой поиск в ДНК-связывающих белков. Возможность определения диффузионных констант в зависимости от последовательности ДНК, время пребывания на мишени и точного измерения длины ДНК изучены в ходе одномерных диффузионных событий, представляют собой мощный инструмент для исследования динамики белок-ДНК взаимодействия и для исследования механизмов конкретной целевой категории.
Недавно, сочетание этих двух методов привело к появлению нового поколения экспериментальных установок 10-14 позволяющих одновременное манипулирование биологического субстрата (например актин нить или молекулу ДНК) и обнаружения / локализацию взаимодействующего партнера фермента (например миозина или ДНК-связывающего белка). Преимущества этих методов в основном опираются на возможности оказывать механическое контроль над захваченного полимера, таким образом, ENAшику изучение динамики взаимодействия против сил или крутящих моментов. Кроме того, методология позволяет измерять биохимические реакции далеко от поверхности, избегая одним из главных ограничений классических методов СМ, т.е. необходимость для иммобилизации молекул изучаемых на поверхности (стекло или микросфер).
Сочетание двух отдельных методов молекул требует преодоления ряда технических трудностей, в основном, вытекающие из требований механической устойчивости и адекватной SNR (особенно, когда требующих локализации с точностью нм) 15. В частности, при соединении SM обнаружение флуоресценции с оптического пинцета, снижения шума и фотообесцвечиванию от прилипания инфракрасных лазеров 16 и контролем биохимических буферов для сборки биологических комплексов и выполнении экспериментальных измерений 11 имеют первостепенное значение. Здесь мы опишем методы для выполнения успешнойизмерения в установке двойного локализации захват / SM флуоресценции. Методология иллюстрируется на примере лактозы репрессор белка (LacI) флуоресцентно меченого (с Atto532) и обнаруженного как он связывается с молекулой ДНК (находящуюся между двумя оптического пинцета), содержащий конкретные Лачи связывающие последовательности (например, операторами). Мы демонстрируем эффективность метода в определение связывания LacI с ДНК и диффузии вдоль его контура в процессе целевой поиск. Метод применим к любой комбинации ДНК-последовательности и ДНК-связывающего белка, а также к другим системам (микротрубочек или актиновых филаментов, и двигатель белков, взаимодействующих с ними).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
