Summary
이종 발현 및 낭포 성 섬유증 막 관통 전도 조정기 (CFTR)의 정제는 중요한 과제이며, 낭성 섬유증을위한 약물 요법의 개발에 제한 요소. 이 프로토콜은 구조와 기능 연구에 적합 CFTR의 밀리그램 수량의 분리를위한 두 가지 방법을 설명합니다.
Abstract
낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)의 결함 단백질 낭성 섬유증 (CF), 현재 시대의 <사십년에 환자의 평균 수명을 제한하는 상 염색체 열성 질환의 원인이됩니다. CFTR의 활성을 복원하는 새로운 약물 분자의 개발은 CF 치료에 중요한 목표이고, 기능적으로 활성 CFTR의 격리는 이러한 목표를 달성하는 방향 유용한 공정이다.
우리는 진핵 이종 발현 시스템, S.에서 CFTR의 정화하는 두 가지 방법을 설명 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 원핵 생물 시스템과 마찬가지로, S. cerevisiae의 급속 저비용으로 실험실에서 성장 될 수 있고, 또한 트래픽 및 posttranslationally 대형 막 단백질을 수정할 수있다. 가용화 및 정제를위한 세제의 선택은 임의의 세포막 단백질의 정제에 중요한 단계이다. 여러 세제에 CFTR의 용해도에 대한 검사를하는 데, 우리는 두 개의 공동 선택한최종 CFTR 준비가 이후에 계획된 실험에 맞게 할 수 있도록 정화에 사용하기 위해 세제를 ntrasting.
이 방법에서는, 우리는 도데 실-β-D-말토에서 CFTR의 정화 (DDM)과의 비교를 제공하는 1-테트라 데카 노일-SN-글리세로 -3 - 포스 포 - (1,1 - 라 세미 글리세롤) (LPG-14). 이 방법으로 DDM 정제 단백질 기능 분석에 ATPase의 활동을 보여줍니다. LPG-14에서 정제 된 단백질은 순도 및 수율은, 번역 후 변형을 연구하기 위해 이용 될 수있는 도시하고, 그러한 소각 X-선 산란 및 전자 현미경과 같은 구조의 방법에 사용될 수있다. 그러나 그것은 상당히 낮은 ATPase의 활동을 표시합니다.
Introduction
낭포 성 섬유증 (CF)은 2,500 명당 약 1의 부각과 함께 유럽과 북미에서 가장 흔한 유전 질환이다. CF가 발생할 때 낭포 성 섬유증 막 관통 전도 레귤레이터 (CFTR) 상피 세포 하나의 원형질막에 그 기능의 단백질 유실 돌연변이. 이 결함의 가장 심각한 결과는 연령 2,3 <사십년에 환자의 수명을 단축 돌이킬 수없는 폐 손상입니다.
CFTR은 이온 채널 1,4되기 위해 진화하고있다 ATP 결합 카세트 (ABC) 트랜스입니다. 세포의 세포막에있는 그것 상당히 변경 기능에도 불구하고, 그것은 여전히 다른 ABC 수송차와 상당한 서열 상 동성을 보유한다. 흥미롭게도, CFTR (즉, 규제 지역과 N-및 C-말단)의 전문적인 부분은 다른 후생 동물 ABC 트랜스 포터와 유의 한 서열의 유사성을 공유하지, 따라서 일까지로 아무런 단서가 없다CFTR에서 이러한 시퀀스의 전자 기원. 그 기본 구조에 기초하여, CFTR은 ABC 트랜스 포터 가족의 C-가족으로 분류하지만,이 하위 제품군에 잔류 기능 연계에 대한 강력한 증거가되지 않습니다. 다른 보고서가 감소 된 글루타티온 오히려 보여주는 것보다, CFTR ATPase의 활성을 억제 수 있다는 것을 제안하지만, 다른 C-가족 8,9의 역할과 일치 할, CFTR 5-7 글루타티온 수송 활동의 몇몇보고가 있었다 ABC 트랜스 포터 10의 특성을 기판에 의한 자극. 이온 전도도의 측정은 단일 CFTR 분자의 채널 활동이 하나를 공부하고 CFTR 채널 특성은 시간의 함수, 온도, ATP 농도, 막 전위 및 인산화 상태뿐만 아니라 같이 모니터링 된 허용하기에 충분히 민감 작은 분자 억제제, 강화제, 그리고 수정의 호스트의 존재. 이들연구는 또한 ABC 트랜스 포터가 작동하는 방법에 대한 우리의 지식에 크게 추가했습니다. 그럼에도 불구하고, 상당한 양 및 그 이후의 정화 CFTR의 표현은 특히 도전과 성공은 몇 실험실 10-13로 제한 한 것으로 입증되었습니다.
보다 효과적인 약물을 개발하기위한 필요성이 가압되어, 아직이 프로세스는 작은 분자를 스크리닝 정제 CFTR의 부족에 의해 방해되었다. CFTR 발현과 정제 문제를 해결하는 것은 CF의 기본 결함을 수정하기위한 높은 처리량 약물 검사를 활성화 것 또한 합리적 약물 설계를 알려주는 고해상도 구조 연구를위한 길을 열 것입니다. 또한, 이러한 기능적 올리고머 상태와 단백질, 상호 작용하는 단백질과 ATPase의 활동도 상대적으로 기본적인 생화학 적 특성이 제대로 특징으로 남아있다. 우리는 이전에 GFP - 그의 - 태그 쥐 CFTR의 대규모 발현을위한 프로토콜을보고있다S.에 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (14)는 이제 더 CFTR의 정화를위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 예를 들어 닭 CFTR의 정화를위한 다섯 CFTR의 orthologues,와 현재의 데이터를 정화하기 위해 이러한 방법을 사용했습니다. 가용화 및 정제를위한 세제의 선택은 임의의 세포막 단백질의 정제에 중요한 단계이다. 여러 세제에 CFTR의 용해도에 대한 검사를하는 데, 우리는 정화에 사용하기위한 두 가지 대조적 인 세제를 선택했습니다. 도데 실-β-D-말토 (DDM)을 광범위하게 막 단백질 15-21 모두 구조 및 기능 연구에 사용 된 비이 온성 세제입니다. 온성 세제 일-테트라 데카 노일-SN-글리세로 -3 - 포스 포 - (1'-RAC-글리세롤) (LPG-14), CFTR의 가용화에 매우 효율적이며, 이전에 기능적 막 단백질 (10)의 정제에 사용되고 S.에서 CFTR의 정화를 포함하여 22, 23, 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (24). </ P>
Protocol
버퍼 1. 준비
- 단백질 분해 효소 억제제의 100 배 주식을 만들려면 (PI) 칵테일 96 밀리그램 AEBSF, 3.5 밀리그램 chymostatin, 10 ㎎ E64, 16.5 밀리그램 펩틴, 16.5 밀리그램의 펩 스타틴, 348 밀리그램의 PMSF, 20 ㎖의 DMSO에 bestatin 4 MG를 해산. -20 ℃에서 1 ㎖ 씩 분주하고 저장을 벤즈 아미 딘의 100 배 주식을하려면 (720) 20 ㎖ 초순수의 MG (DDH 2 O)와 -20 ℃에서 1 ㎖ 분량 씩 매장을 용해 이 수량은 한 정화에 충분하다. 모든 버퍼에서, PI 및 벤즈 아미 딘 주식은 1:100 희석에 사용됩니다.
- 'MPIB'(0.3 M 트리스 산도 8, 0.3 M 자당, 2 mM의 DTT)와 'CFTR'준비 (50 MM 트리스 산도 8, 20 % (V / V) 글리세롤, 1 mM의 DTT) 4 ° C에 버퍼 및 오한 . 사용 전에, 프로테아제 억제제 칵테일의 1:100 더해 MPIB의 양에 따라 1:100 벤즈 아미 딘은 (예를 들어 350 ㎖의 MPIB의 총 부피 3.5 ㎖의 PI 및 3.5 ml의 벤즈 아미 딘을 사용) 세포 펠렛을 재현 탁하는데 사용.
- 의 준비olubilization 버퍼. 리소 - 포스파티딜 글리세롤-14 (LPG) 가용화 버퍼 (50 MM 트리스 산도 8, 10 % (V / V) 글리세롤, 50 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT, 단백질 분해 효소 억제제 (PI는) 4 % (W / V) LPG) 도데 실 말토 (DDM) 가용화 버퍼 (50 MM 트리스 산도 8, 20 % (V / V) 글리세롤, 1 M의 NaCl, 1 mM의 DTT, 단백질 분해 효소 억제제, 4 % (W / V) DDM). 이 거품을 만들어으로 버퍼, 세제의 분산을 지원하지만, 혼합물을 텍싱 방지하기 위해 초음파 분쇄기 목욕 (35 W, 40 kHz에서)에서 초음파 처리 할 수 있습니다. 사용하기 전에 4 ° C에 침착 해.
- LPG 정화용 CFTR 정화 완충액은 50 mM 트리스, 10 % (v / v) 글리세롤, 50 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT, 0.1 % (w / v) LPG-14 및 프로테아제 억제제이다. 이 버퍼의 350 ML, 같은 버퍼에 1을 더한 M 이미 다졸 150 ㎖를 준비합니다. 8 양쪽 모두의 버퍼의 산도를 조정합니다.
- DDM의 정화를위한 버퍼 50 MM 트리스 산도 8, 20 % (V / V) 글리세롤, 1 M의 NaCl, 1 mM의 DTT, 0.1 % (W / V) DDM 구성되어 있습니다. 이 버퍼 350 ml의 동일한 완충액 150 ㎖ + 1 M 이미 다조 준비르. 8 양쪽 모두의 버퍼의 산도를 조정합니다.
- LPG를 포함하는 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC) 버퍼, 50 mM 트리스 pH를 8, 10 % (v / v) 글리세롤, 50 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT, 0.05 % (w / v)-LPG (14)를 준비한다. DDM을 사용하여 GPC는 50 MM 트리스 산도 8, 20 % (V / V) 글리세롤, 1 M의 NaCl, 1 mM의 DTT, 0.1 % (W / V) DDM의 버퍼를 준비합니다. GPC 컬럼에 사용 된 모든 버퍼와 DDH 2 O 여과 (0.2 μm의 필터) 및 사용하기 전에 가스를 제거해야합니다.
- SDS-PAGE 샘플 버퍼 (작업 농도를 2 배) : 50 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 5 % (v / v) 글리세롤, 5 mM의 EDTA, 0.02 % (w / v) 브로 모 페놀 블루. -20 ℃에서 700 μL 씩 분주하고 저장을 사용 전에, 20 %의 200 μL (w / v) 도데 실 황산나트륨 (SDS) 및 신선한 0.5 M DTT 100 μL를 추가한다. 젤에로드하기 전에 상온에서 샘플 적어도 10 분 동안 품어. 가열하지 마십시오; 이 GFP를 변성하고 CFTR 집계 될 수 있습니다.
- 재구성을위한 지질 주식을 만들려면, E.의 4:1 (w / w) 혼합물을 용해 대장균 지질D 클로로포름 및 메탄올 중 콜레스테롤 (2 : V / v), 및 지질 막을 형성이 시간 동안 N 2 가스 하에서 유리 바이알에서 건조. ML 40 ㎎ /의 지질 농도 (아무 NaCl로) GPC 버퍼를 추가하고 솔루션을 명확히하기 위해 반복 소용돌이로 교반과 초음파 (35 W, 40 kHz에서)를 사용합니다.
- ATPase의 분석을 위해, DDH 2 O 1 M에 DMSO, NaSCN 1 mm로 SCH28080을 용해하고 100 %에서 2.5 밀리미터 (V / V) 에탄올 oligomycin ATP 아제 억제제의 100 배 주식을 준비합니다. -20 ° C에서 분주에 보관 50 MM 트리스 산도 7.4, 150 MM의 NH 4 망할 CIA, 5 mM의 망초 0.02 % (W / V) NaN의 3 ATPase의 버퍼의 100 mL로한다. 이를 상온에서 보관하고 여러 분석에 사용될 수있다. 사용하고 얼음에 보관 직전에 5 mM의 ATP 재고를 준비합니다. (NB 사용 범위 나 2 ATP는 분석에서 인산에서 과도한 백그라운드 신호를 방지하기 위해). SDS 정지 용액 (12 % (W / V) DDH에서 SDS 2 O)을 준비합니다.
- Chifflet 검출을위한 W (A (3 % 버퍼 준비/ v) 아스 코르 베이트, 0.5 % (w / v) 몰리브덴 산 암모늄, 0.5 M 염산) 사용 직전 및 B 버퍼 (2 % (w / v) 시트르산 나트륨, 2 % (w / v) 소듐 메타 아비산, 2 % (v / v) 아세트산).
효모의 소포체의 2. 격리
- 오라이언 등의 설명에 따라 닭 CFTR를 표현 S. cerevisiae의 재배된다. (2012) 14. 최대 6 개월 -80 ° C에서 두 개의 분량 씩 20 L 발효에서 자료를 저장합니다.
- 빠르게 셀 중 하나 나누어지는 해동 세포의 그램 당 3 ㎖ 냉장 MPIB에 재현 탁.
- 425-600 μm의 직경의 유리 구슬을 사용하여 비드 밀에서 세포를 중단. 1 분의 휴식 시간에 의해 분리 세포 파괴의 다섯 1 분 기간을 사용합니다. (나머지 기간은 세포가 분열하는 동안 가열되지 않도록하는 것이 필수적입니다.)
- 비드 밀에서 세포 용 해물의 1 ㎖ 샘플의 원심 분리하여 세포 분열을 모니터링합니다. 벤치 톱 원심 원심 분리기 (12,000 XG, 4 ° C에서 5 분)ifuge. 베트에 MPIB에 1:50 상층 액을 희석하고 (380)를 측정합니다. 380> 0.1, 또는 여러 반복 비드 박동주기에도 불구하고 증가 중지 된 경우, 다음 단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우, 2.3-2.4를 반복합니다.
- 전체 세포 용 해물 (12,000 X를 원심 분리기 g, 4 ° C에서 20 분). 뜨는을 유지합니다. (손상되지 않은 세포와 미토콘드리아를 포함) 펠렛을 폐기하지만, 세포 파괴의 효율성에 대한 의문 (2.4 참조)가있는 경우, 다음 또한 펠릿을 유지합니다.
- 이전 단계 (20 만 XG, 4 ° C, 1.5 시간)에서 상층 액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 CFTR 버퍼에 펠렛 미세 소체 세포막을 재현 탁. 마이크로 솜을 사용하여 정제 DDM을위한 경우, 1 M NaCl로 CFTR 버퍼를 보충.
- 10 × (재현 탁 막 분획의 원심 분리를 반복 g, 4 ° C에서, 1 시간) 상층 액을 버린다.
- 펠렛 마이크로 솜에서 재현 탁CFTR 버퍼의 최소량 (최종 부피 15 ㎖의 총 미소 체 단백질 70-200 mg)을 얻었다. 브래드 포드 분석은 마이크로 솜 단백질 (25)의 전체 농도를 결정하기 위해 사용될 수있다. 또한 세포막의 형광 발광 스펙트럼을 측정한다 (여기 = 485 nm의 발광 = 500-600 NM)와 별개의 GFP 형광 피크 (512 ㎚에서 최대)를 가져야한다. CFTR 구체적으로 GFP 형광 조건 스캔 SDS-PAGE 겔 (도 1)에서 검출 될 수있다.
- 플래시 동결 액체 질소으로 급락하여 재현 탁 마이크로 솜 및 -80 ° C에서 보관, 또는 3 단계로 진행합니다.
마이크로 솜의 3. 가용화
- 냉동 경우, 즉시 10 ° C로 설정 수조에 사용하기 전에 마이크로 솜 해동
- 멤브레인의 가용화, 최종 세제 농도를 수득 관련 가용화 완충액 (단계 1.3)의 동량 소포체 희석2 % (W / V) 및 미세 소체 단백질 농도 5 ㎎ / ㎖. 교반과 함께 4 °의 C (튜브 회전)에서 1 시간 동안이 혼합물을 품어. 분석을 위해 200 μl를 유지합니다.
- 혼합물 (100,000 XG, 4 ° C, 45 분)을 원심 분리기. 가용화 된 막 단백질을 포함하는 상층 액을 제거, 0.45 μm의 주사기 필터를 통해 통과하고 얼음에 저장합니다. (단계 2.8에서와 같이) 상층 액의 형광을 측정한다.
- 1 %의 불용성 분획 가용 분획과 동일 부피 (w / v) SDS 용액을 재현 탁. 이 부분에서 형광을 측정하고 SDS-PAGE 분석을위한 50 μL의 분취 량을 유지합니다.
CFTR 4. 니켈 친화력 정화
- 시리즈의 링크 두 5 ㎖ 니켈 파로스 열. 다음 1 M 이미 다졸을 포함, (1.4-1.5 단계) 용해 버퍼의 2 CV와 열을 씻어 DDH 2 O 2 CV 다음에 (V / V) 에탄올, 2 열 볼륨 (CV)와 20 %를 씻으십시오. solubilizat 2 CV와 반복이온은 이미 다졸을 부족 버퍼.
- 가용화 된 물질 (단계 2.8)에 5 mM의 최종 농도로 이미 다졸 추가 및 자동화 액체 크로마토 그래피 장치를 사용하면 수동 칼럼 상 또는 시료 루프에 재료를로드.
- 0.5 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼에 가용화 된 물질을로드하고, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 동일한 유속 이미 다졸 결여 완충액이 CV로 세척 하였다. 50 ML 팔콘 튜브에 분수를 수집합니다.
- 제 워쉬 들어, 1 ml / 분의 유속으로 40 mM의 이미 다 졸로 정화 버퍼 세 CV를 사용한다. 2 ㎖ 분수를 수집합니다.
- 두 번째 세척의 경우, 100 mM의 이미 다졸과 정화 버퍼의 3 CV를 사용합니다. 2 ㎖ 분수를 수집합니다.
- 400 mM의 이미 다졸과 정화 버퍼의 3 CV와 HisTrap 열에서 용출 CFTR. 2 ㎖ 분수를 수집합니다.
- 용출 분획 (2.8 단계)에 형광을 모니터링합니다.
- SDS-PAGE 분석을위한 피크 분수 분주을 유지합니다. 플래시 동결 나머지 피크 Fraction 샘플 및 저장 -80 ° C에서, 또는 다음 정제 단계를 계속합니다.
CFTR의 5. 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC) 정화
- 1.2 CV GPC 버퍼 다음에 1.2 CV DDH 2 O와 열 (수퍼 로즈 6 3백분의 10 GL)을 평형.
- 단계 5.1 동안 4 ℃에서 10 MWCO 원심 필터를 사용하여 가장 높은 GFP의 형광과 니켈 친 화성 정제 분수를 집중 DDM의 정화는이 중요한 샘플 손실이 발생할 것으로 0.3 ㎎ / ㎖의 단백질의 단백질 농도를 위의 샘플을 집중하지 않도록합니다. 10 X에 집중하고 원심 분리기에서 잔류 물을 제거 큰 입자를 펠렛 4 ° C에서 30 분 동안 g.
- 칼럼에이 샘플을 주입하고 1.2 CV GPC 버퍼의 등용 매 그라데이션 용출. 0.5 ㎖의 분수를 수집합니다.
- CFTR을 함유하는 분획을 식별하기 위해 2.8 절에서와 같이 GFP의 형광을 측정한다. 작은 볼륨을 유지 (예를 들어 </ EM> SDS-PAGE에 의해 분석을 위해 각각 50 μL).
- -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에있는 분수를 동결
CFTR의 6.의 재구성
- 지질에 단백질 비율 100:1 (W / W)에서 정제 된 CFTR에 지질 (단계 1.8)을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 알을 품다. 마찬가지로 GPC 버퍼의 동일한 볼륨으로 정제 된 단백질을 대체 지질 전용 컨트롤을 설정합니다.
- 소수성 흡착제 비드를 사용하여 단백질 / 지질 혼합물에서 세제를 제거합니다. 5 CV DDH 2 O, 5 CV 70 % (V / V) 에탄올, 5 CV DDH 2 O, 세제 부족 5 CV GPC 버퍼에 흡착제 구슬을 씻으십시오. 정제 된 단백질의 ML 당 세척 흡착제 구슬 200 밀리그램을 추가하고 교반과 함께 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
- 얇은 종단 피펫 팁을 사용하여 새로운 튜브에 흡착 구슬에서 재구성 샘플을 수집합니다.
ATPase의 활동 7. 측정
- CFT의 속도를 결정96 - 웰 플레이트 형식으로 변경됨 Chifflet 분석 26,27을 이용하여 R-ATPase의 특정 활동. 인산 나트륨 원액으로 (0.65 mM)을 기준으로 50 μL의 최종 볼륨에서 0 ~ 20 nmol의 인산을 준비합니다. 인산 주식을 희석 CFTR 버퍼와 ATPase의 버퍼의 1:1 혼합물을 사용합니다.
- 10 분 동안 얼음에 1:100 (v / v)의 ATP 아제 억제제 (단계 1.9)로 재구성 CFTR 빈 리포솜 모두를 품어. 재구성 CFTR의 적어도 5 μg을 사용합니다.
- 2 mm의 최종 농도로 ATP (단계 1.9)을 추가하고 1 시간 동안 25 ° C에서 알을 품다. (표준 포함) 각 웰 (W / V) SDS (1.9 단계) 10 %의 40 μl를 추가하여 반응을 중지합니다.
- 버퍼 100 μl를 추가 (1.10 단계) 및 10 분 동안 품어. 각 웰에 100 μL 버퍼 B (1.10)을 추가하고 96 - 웰 플레이트 호환 UV / 힘 분광 광도계 800 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.
- 사용 유리 된 인산의 양으로 800 nm에서 흡광도를 변환인산 표준. 백그라운드 신호 (리포솜 전용 웰)을 뺀 후 ATP 가수 분해의 속도를 계산한다.
- 비 재구성 CFTR의 배경 판독을위한 CFTR 버퍼를 사용하여 동일한 프로토콜을 따릅니다.
Representative Results
상기 프로토콜은 조질 소포체의 세포 파손 및 준비 (도 1) 중에 CFTR의 거의 완벽한 회복 CFTR 부화 마이크로 솜을 분리하는 효과적인 수단이다. 기타 세포 파괴 방법이 효과적으로 사용될 수있다. 우리는 동일한 효율로 프랑스 압력 세포 및 기타 high-pressure/cavitation 장치 (또한 루비 대상에 영향을 미치는와 함께)을 사용했다. 편의 및 장비의 낮은 초기 비용을 위해, 우리는 비드 치는 방법에게 최선을 찾을 수 있습니다.
CFTR을 용해하고 정화하는 LPG를 사용하여> 90 % 순도 (그림 2)에서 80 μg 단백질 / L의 문화를 얻었다. 높은 수율로 인해 LPG (그림 2b, 레인 2와 4를 비교)하여 CFTR 효율적으로 가용화했다. 또한, 효율적이고 열에 바인딩 꽉 최소한의 언 바운드 분수에서 CFTR의 손실과 세척 분수에서 CFTR의 부재 (그림 2, 레인 3, 5의 결과, 그리고6). 용출 된 단백질을 쿠마시 염색 된 SDS-PAGE 겔에 의해 추정하고 CFTR 및 오염물 밴드 농도계를 사용하여,> 90 %의 순도를 갖는다. 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)은 저 분자량의 오염 물질을 정제하여 LPG-CFTR (도 4, 하부 패널)로 분리.
DDM을 사용하여 CFTR 정화를위한 프로토콜은 약 60 %와 약 50 ㎍ / L의 수익률 (그림 3)의 순도를 제공합니다. 약 10 ㎖ (도 4)에서 용출하는 GPC에서 부정적으로 더러워 분획의 전자 현미경 (EM)은 DDM-정제하여 CFTR 20-30 nm의 직경의 응집체뿐 아니라 10 ㎚ 직경 (데이터는 도시되지 않음)의 작은 입자가 포함되어 있음을 보여 주었다. 그것은 작은 집계 가역적 EM-감지 집계를 제거하는 데 실패 연결하고 1 MDA 차단 필터, 한외으로 해리 할 수있다. LPG 정제 된 물질은 따라서 흠 분수의 극저온-EM에 의해 연구 된, 글로우 방전 계통에 흡착하지 않았다. 이 나타났다비교적 작은 크기의 매우 균일 한 입자 인구 (6-8 nm의 직경, 데이터는 도시하지 않음).
마지막으로, 정제 된 단백질의 ATP 아제 활성 (도 5)를 측정 하였다. ABC 단백질 가족의 일원으로서, CFTR는 ATP 결합 및 / 또는 가수 분해 할 수있는 두 개의 염기 결합 도메인 (NBDS)가 있습니다. 데이터는 정제 된 단백질은 LPG-가용화 상태로 ATP를 가수 분해 할 수 없습니다 및 DDM의 존재 (그림 5, 채워지지 않은 바)에 약한 ATPase의 활동을 보여 주었다는 것을 나타냅니다. 지질, 세제 및 제거의 첨가 후, ATPase의 활성은 DDM (13 nmol의 ATP / 분 / mg의 단백질)로 정제되었다 샘플 4 배 높았다. 지질 및 LPG를 사용하여 격리했다 CFTR에 LPG와 유사하게 복원 활동의 제거 만의 추가 DDM - 정제 및 재구성 재료보다 최종 낮은 비율 (1.5 nmol의 ATP / 분 / MG 단백질)와 함께.
그림 1. 세포 용 해물의 닭 CFTR (CL)의 모니터링 수준, 상층 액 (S)와 미크로 분리 및 세척에 사용되는 다양한 원심 분리 단계에서 펠릿 (P). SDS-PAGE 젤은 GFP의에서 젤 형광을 사용하여 시각되었습니다 태그입니다. 14,000 XG에 세포의 파손 및 원심 분리 후 상층 액 (해산물 포함) 거의 모든 CFTR이 포함되어 있습니다. 전체 전체 길이 CFTR은 상층의 일부 조각을 떠나는 20 만 XG 퇴적물에서 초 원심. 소금 세척 미립 알약 몇 가지 추가로 조각을 제거하는 거의 모든 CFTR의 10 XG에 원심 분리.
고정 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피에 의한 LPG의 닭 CFTR의 그림 2. 정제. 분수 쿠마시 염색 (상단 패널)와 GFP 태그 (아래 패널)의 형광 검출 뒤에 SDS-PAGE에 의해 분석 하였다. 트랙 : (1) 마이크로 솜. (2) LPG-가용화 소포체. (3) 약속 소재. (4) 불 용해성 물질. (5) 및 (6) (40) 및 100 mM의 이미 다졸 씻어. (7) 자료는 400 mM의 이미 다졸 용출.
고정 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피에 의한 DDM에있는 닭 CFTR의 그림 3. 정화. 분수 쿠마시 염색 뒤에 SDS-PAGE에 의해 분석 하였다. 왼쪽 패널은 이전의 용출에 분수를 보여줍니다. 여러 연속 용출 분획에서 CFTR와 오른쪽 패널에 표시됩니다화살표로 dicated. 나중에 분획 리보솜 단백질 L3로 질량 분석에 의해 확인 된 40 kDa의 오염 물질에 충실.
겔 투과 크로마토 그래피에 의한 닭 CFTR의도 4. 정제는 니켈 친 화성 크로마토 그래피로 정제 하였다. CFTR 농축하고 GPC 컬럼에 적용 하였다. CFTR (상단 패널)에 대한 용출 프로파일은 LPG-14 (실선) 또는 DDM (점선)를 겹쳐서 포함하는 버퍼에 정제. SDS-PAGE (하단 패널) CFTR 8 및 11 ㎖의 사이에 용출 된 것으로 나타났다.
그림 5. ATP 아제의 activitDDM 또는 LPG 정제 Y 정제 닭 CFTR 분획. 단백질은 F-, P-및 V 형 ATPases (채워지지 않은 막대에서 모든 배경 ATPase의 활성을 제거하는 ATP 아제 억제제의 칵테일 존재 하에서 개질 Chifflet 분석 (26)를 사용하여 측정 하였다 ). ATP 가수 분해의 속도는 세제 및 제거 지질 또 (채워진 막대) 후에 측정 하였다. 플롯은 평균과 표준 편차를 나타낸다 (N = 3). 평균 존재와 지질의 부재에서 ATPase의 활동에 대한 값 및 DDM 및 LPG 활동의 차이의 차이는 P <0.05에 중요합니다.
Discussion
우리는 이전 뮤린 CFTR (14)의 과잉 발현을위한 방법을 설명 하였다. 해당 프로토콜의 출판 이후, 우리는 동일한 시스템을 사용하여 CFTR의 여러 가지 orthologs을 표현하고 정제했다. DDM 정화 다른 orthologs에서 더 많은 변화 (데이터가 표시되지 않음)을 보여 주었다 동안 테스트 한 모든 orthologs 지금까지, LPG 세제에서 잘 정제. 이러한 유연성은 효모 접근의 힘을 예시한다 : 그것은 특정 목적의 하나를 선택하기 위해 상대적으로 많은 구조 인텔리 스크린 할 수있다.
1 M의 NaCl 전에 청소기 미크로 준비 DDM 결과와 가용화 및 이후 단계에서 오염 물질을 감소하기 위해 포함 된 버퍼와 효모의 소포체를 세척. 최종 CFTR 샘플 미크로 세척없이> 90 % 순수로이 단계는 LPG 프로토콜에 필요하지 않습니다. 또한, DDM에있는 정화는 가용화를위한 버퍼에 몇 가지 변화가 필요합니다차 정화, 여분의 글리세롤과 소금, 즉 추가. 함께, 이러한 추가는 상당히 열에 DDM - 용해 단백질의 결합을 증가 시켰습니다.
DDM 정화 방법은 개선을 위해, 특히 질량 분석에 의해 판단, 40 kDa의 주요 오염 물질의 제거, 니켈 수지 고유의 선호도가 나타납니다 효모 리보솜 소단위 L3에 의한 범위를 가지고 있습니다. 이 L3 단백질에서 명백한 polyHis 서열은 없지만, 리보솜에 결합 할 때의 3 차원 구조의 검사 (PDB = 1FFK)이 절첩 L3 소단위는 잠재적 polyHis 클러스터 있음을 보여준다. 이 밴드는 LPG-정제 된 물질에 덜 문제가되는 가혹한 LPG 세제에 기인 할 수있다.
DDM의 정화가 LPG에 비해 나쁜 것으로 보인다 있지만, 이러한 DDM 같은 온화한 세제 구조와 기능 분석에 더 잘 호환 될 수 있으며, 이미 여러 X-선 crystall에 사용되었습니다막 단백질 15-21의 ographic 연구. 또한, 우리의 결과는 LPG의 사용은 DDM의 정화에 CFTR 상대적으로 ATPase의 기능의 손실로 연결 것으로 나타났다. 따라서 우리는 번역 후 변형의 특성과 같은 응용 프로그램의 예를 들어, 또는 항체의 생성에, LPG 기반의 프로토콜이 선택 될 것, 순도가 매우 중요합니다 CFTR의 생성에 LPG 기반의 정화 프로토콜을 추천 할 것입니다 . 단백질의 활동을 완전히 네이티브 상태가 필수적인 응용 프로그램에서 다른 한편으로, 우리는 더 나은 옵션으로 DDM 기반 프로토콜을 제안한다.
결론적으로,이 프로토콜은 양쪽이 온성 세제 LPG-14 또는 비 이온 세제 DDM에서 CFTR의 분리를위한 재생 가능한 방법을 설명합니다. 따라서 그 이전에 10-13을보고 한 것보다 CFTR에 대한 정화 조건의 큰 범위를 나타냅니다. 부가 밀리그램의 정제 CFTR의 수량이 될 수 있습니다이러한 20 L 발효조 등 6 L 저속 원심 분리기 회 전자로 고용량 전지 수확 시스템으로 높은 볼륨 효모의 성장 시스템과 결합 할 때이 절차를 사용하여 얻을. 얻어진 CFTR은 다양한 생화학 및 생물 물리학 적 분석에서 단백질을 쉽게 모니터링 할 수있는 분해 가능한 GFP 태그가 있습니다.
이 원고 (닭 CFTR 함유 플라스미드 또는 냉동 효모 세포)에 설명 된 시약은 낭포 성 섬유증 재단 (USA)를 통해 얻을 수있다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해도이 작품에 대한 다른 이해 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 그 CFTR 3D 구조의 컨소시엄을 통해 미국 낭포 성 섬유증 재단 (CFF)에 의해 투자되었다. TR은 영국 BBSRC 학생이기 의해 UK CF 신뢰 재학 및 NC에 의해 투자되었다. 우리는 그들의 도움과 조언 및 코돈 최적화 된 닭 CFTR 순서 및 정화 태그의 디자인에 대한 CFF CFTR 3 차원 구조 컨소시엄에서 우리의 동료를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 | |
| 2 ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 | |
| 50 ml sterile Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| Gel imaging system | BioRad | 170-808 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| E. coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Fisher | 65017 | |
| HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 | |
| Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| SCH28080 | Sigma-Aldrich | S4443 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 | |
| Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 | |
| Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 | |
| Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 | |
| Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |
References
- Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel. Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).
- Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003. EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).
- O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373, 1891-1904 (2009).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245, 1059-1065 (1989).
- Kariya, C., et al. A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).
- Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung. Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).
- Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates. Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).
- Cole, S. P., et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258, 1650-1654 (1992).
- Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters. Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).
- Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).
- O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. , (2012).
- Oldham, M. L., Chen, J. Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).
- Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter. Science. 315, 373-377 (2007).
- Dawson, R. J. P., Locher, K. P. Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature. 443, 180-185 (2006).
- Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter. Science. 321, 246-250 (2008).
- Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).
- Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation. Science. 321, 250-253 (2008).
- Aller, S. G., et al. Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding. Science. 323, 1718-1722 (2009).
- Koehler, J., et al. Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids. Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).
- Tian, C., et al. Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases. Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).
- Rothnie, A., et al. The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence. Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).
