Summary
Heterolog expression och rening av den cystisk fibros transmembran-(CFTR) är en betydande utmaning och begränsande faktorer vid utvecklingen av drogterapier för cystisk fibros. Detta protokoll beskriver två metoder för isolering av milligrammängder av CFTR lämpliga för funktionella och strukturella studier.
Abstract
Defekter i cystisk fibros transmembran (CFTR) protein orsakar cystisk fibros (CF), en autosomal recessiv sjukdom som för närvarande begränsar den genomsnittliga förväntade livslängden för de drabbade att <40 år. Utvecklingen av nya läkemedelsmolekyler för att återställa aktiviteten av CFTR är ett viktigt mål i behandlingen CF, och isoleringen av funktionellt aktiva CFTR är ett viktigt steg mot att uppnå detta mål.
Vi beskriver två metoder för rening av CFTR från en eukaryot heterolog expressionssystem, S. cerevisiae. Liksom prokaryota system, S. cerevisiae kan snabbt vuxit i labbet till en låg kostnad, men kan också trafik-och posttranslationellt modifiera stora membranproteiner. Valet av tvättmedel för solubilisering och rening är ett kritiskt steg i reningen av varje membranprotein. Efter att ha screenas för lösligheten av CFTR i flera rengöringsmedel, har vi valt två contrasting rengöringsmedel för användning vid rening som gör att det slutliga CFTR preparat som skall anpassas till den senare planerade experiment.
I denna metod tillhandahåller vi jämförelse av reningen av CFTR i dodecyl-β-D-maltosid (DDM) och 1-tetradekanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14). Protein renas i DDM med denna metod visar ATPas aktivitet i funktionella analyser. Protein renades i gasol-14 visar hög renhet och utbyte, kan användas för att studera posttranslationella modifieringar, och kan användas för strukturella metoder såsom små vinklar röntgenspridning och elektronmikroskopi. Den visar dock betydligt lägre ATPas aktivitet.
Introduction
Cystisk fibros (CF) är den vanligaste genetiska sjukdomen i Europa och Nordamerika med en incidens av cirka 1 i 2.500 levande födda. CF uppträder när mutationer i cystisk fibros transmembran-(CFTR)-proteinet orsaka förlust av dess funktion vid plasmamembranet av epitelceller 1. Den allvarligaste konsekvensen av detta fel är irreversibel lungskador, vilket förkortar den förväntade livslängden för de drabbade att <40 år 2,3.
CFTR är ett ATP-bindande kassett (ABC) transportör som har utvecklats till att bli en jonkanal 1,4. Trots sin ganska förändrad funktion i plasmamembranet av celler, behåller det fortfarande signifikant sekvenshomologi med andra ABC-transportörer. Fängslande, de specialiserade delarna av CFTR (dvs. dess reglerande regionen och dess N-och C-terminaler) delar ingen signifikant sekvenslikhet med andra flercelliga ABC transportörer, varför det inte finns några ledtrådar till the ursprunget till dessa sekvenser i CFTR. På grundval av dess primära struktur, är CFTR klassificeras som en C-familjemedlem ABC-transport familjen, men det finns inga starka bevis för en återstående funktionell koppling till denna undergrupp. Det har förekommit några rapporter om glutation transport aktivitet för CFTR 5-7, vilket skulle vara i linje med de roller som andra C-familjemedlemmar 8,9, även om andra rapporter tyder på att reducerad glutation kan hämma CFTR ATPas-aktivitet, snarare än att visa den substrat-inducerad stimulering som karakteriserar ABC-transportörer 10. Mätning av jon konduktans är tillräckligt känslig för att tillåta kanalaktiviteten av enstaka CFTR molekyler som ska studeras en och CFTR kanalegenskaperna har övervakas som en funktion av tid, temperatur, ATP-koncentration, membranpotential och fosforylering tillstånd, såväl som i den närvaron av en mängd små molekyler hämmare, potentiatorer och modifierare. Dessastudier har också lagt avsevärt till vår kunskap om hur ABC transportörer fungerar. Ändå har uttryck av CFTR i betydande mängder och dess efterföljande rening visat sig vara särskilt utmanande och framgångarna har varit begränsade till ett fåtal laboratorier 10-13.
Behovet av att utveckla mer effektiva läkemedel är knapp, men denna process har hindrats av bristen på renat CFTR för screening av små molekyler. Lösa CFTR uttryck och rening problemet skulle möjliggöra hög genomströmning drog screening som syftar till att rätta till den primära defekten i CF och skulle också öppna upp en väg för högupplösta strukturstudier för att informera rationell läkemedelsdesign. Dessutom är även relativt grundläggande biokemiska egenskaperna hos proteinet, såsom dess funktionella oligomera tillståndet, interagerande proteiner och ATPas-aktivitet förblir dåligt karaktäriserade. Vi har tidigare rapporterat ett protokoll för storskalig uttryck av GFP-och His-märkt mus CFTRi S. cerevisiae 14 och nu ytterligare beskriva protokoll för rening av CFTR. Vi har använt dessa metoder för att rena fem ortologer av CFTR, och presentera data för rening av kyckling CFTR som exempel. Valet av tvättmedel för solubilisering och rening är ett kritiskt steg i reningen av varje membranprotein. Efter screening med avseende på lösligheten av CFTR i flera detergenter, har vi valt två kontrasterande detergenter för användning vid reningen. Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) är en icke-jonisk detergent som har i stor utsträckning använts för både strukturella och funktionella studier av membranproteiner 15-21. Den joniska detergent 1-tetradekanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14) är mycket effektiva i solubilisering av CFTR och har tidigare använts vid rening av funktionella membranproteiner 10, 22,23, inklusive rening av CFTR från S. cerevisiae 24. </ P>
Protocol
1. Beredning av buffertar
- För att göra det 100x lager av proteashämmare (PI) cocktail löses 96 mg AEBSF, 3,5 mg chymostatin, 10 mg E64, 16,5 mg leupeptin, 16,5 mg pepstatin, 348 mg PMSF, och 4 mg bestatin i 20 ml DMSO. Gör 1 ml alikvoter och förvara vid -20 ° C. För att göra en 100x lager av benzamidin, lös upp 720 mg i 20 ml ultrarent vatten (DDH 2 O) och förvara i 1 ml alikvoter vid -20 ° C. Denna mängd är tillräcklig för en rening. I alla buffertar är PI och bensamidin lager som används vid en 1:100 spädning.
- Förbered 'mPIB "(0,3 M Tris pH 8, 0,3 M sackaros, 2 mM DTT) och" CFTR "(50 mM Tris pH 8, 20% (volym / volym) glycerol, 1 mM DTT) buffertar och kyla till 4 ° C . Före användning, tillsätt 1:100 av proteasinhibitorcocktail den och 1:100 bensamidin enligt volymen av mPIB användes för att resuspendera cellpelleten (t.ex., använd 3,5 ml PI och 3,5 ml bensamidin i en total volym av 350 ml mPIB).
- Förbered erolubilization buffertar. Lyso-fosfatidylglycerol-14 (LPG) lösliggörande buffert (50 mM Tris pH 8, 10% (volym / volym) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, proteashämmare (PI) och 4% (vikt / volym) LPG) och dodecyl maltoside (DDM) lösliggörande buffert (50 mM Tris pH 8, 20% (volym / volym) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, proteashämmare, 4% (vikt / volym) DDM). Buffert kan sonikeras i ett ultraljudbadet (35 W, 40 kHz) för att hjälpa till med spridning av tvättmedlet, men undvika virvelbildning av blandningen, eftersom detta skapar bubblor. Chill till 4 ° C före användning.
- CFTR rening buffert för gasolen rening är 50 mM Tris, 10% (volym / volym) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (vikt / volym) LPG-14 och proteasinhibitorer. Bered 350 ml av denna buffert, och 150 ml av samma buffert plus 1 M imidazol. Justera pH-värdet för båda buffertarna till 8.
- Bufferten för rening i DDM består av 50 mM Tris pH 8, 20% (volym / volym) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (vikt / volym) DDM. Bered 350 ml av denna buffert, och 150 ml av samma buffert plus 1 M imidazole. Justera pH-värdet för båda buffertarna till 8.
- För gelpermeationskromatografi (GPC)-buffert innehållande LPG, förbereda 50 mM Tris pH 8, 10% (volym / volym) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (vikt / volym) LPG-14. Till GPC med användning av DDM förbereda en buffert av 50 mM Tris pH 8, 20% (volym / volym) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (vikt / volym) DDM. Bör filtreras (0,2 ìm filter) och avgasas före användning Alla buffertar och DDH 2 O används på GPC-kolonnen.
- SDS-PAGE-provbuffert (2x arbetskoncentration): 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5% (volym / volym) glycerol, 5 mM EDTA, 0,02% (vikt / vol) bromfenolblått. Gör 700 l alikvoter och förvara vid -20 ° C. Före användning, tillsätt 200 | il av 20% (vikt / volym) natriumdodecylsulfat (SDS) och 100 | il av färsk 0,5 M DTT. Inkubera i minst 10 minuter med prov i rumstemperatur innan du lägger på gelen. Värm inte; detta kommer att denaturera GFP och kan orsaka CFTR att aggregera.
- För att göra fettlager för beredning, upplösa en 04:01 (vikt / vikt) blandning av E. coli lipider ettd kolesterol i kloroform och metanol (v 2:01 / volym), och torka i en glasflaska under N2-gas under 2 h till att bilda en lipidfilm. Lägg GPC-buffert (utan NaCl) till en lipidkoncentration av 40 mg / ml och använda upprepad virvling och sonikering (35 W, 40 kHz) för att klargöra lösningen.
- För ATPas-analys, bereda 100x lager av ATPas-inhibitorer genom upplösning SCH28080 till 1 mM i DMSO, NaSCN till 1 M i DDH 2 O och oligomycin till 2,5 mM i 100% (v / v) etanol. Lagra i alikvoter vid -20 ° C. Gör 100 ml ATPas-buffert med 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NH4CI, 5 mM MgSO 4 och 0,02% (vikt / volym) NaN3. Detta kan förvaras vid rumstemperatur och används för flera analyser. Förbered en 5 mM ATP lager omedelbart före användning och förvara på is. (OBS Använd Na 2 ATP för att förhindra överdriven bakgrundssignal från fosfat i analysen). Förbered SDS stopplösning (12% (vikt / volym) SDS i DDH 2 O).
- För Chifflet detektion förbereda buffert A (3% (vikt/ V) askorbat, 0,5% (vikt / vol) ammoniummolybdat, 0,5 M HCl) omedelbart före användning och buffert B (2% (vikt / volym) natriumcitrat, 2% (vikt / volym) natrium-meta-arsenit, 2% (v / v) ättiksyra).
2. Isolering av jäst Mikrosomer
- S. cerevisiae som uttrycker kyckling CFTR odlas såsom beskrivits i O'Ryan et al. (2012) 14. Förvara material från en 20 L fermentering i två alikvoter vid -80 ° C i upp till 6 månader.
- Tina upp en alikvot av celler snabbt och återsuspendera i 3 ml kyld mPIB per gram celler.
- Sönderdela cellerna i en kulkvarn med användning av glaspärlor med 425 till 600 ^ m diameter. Använd fem 1 min perioder av avbrott cell separerade med 1 min vila. (De viloperioder är viktigt att se till att cellerna inte är uppvärmd under störningar.)
- Övervaka cellsprängning genom centrifugering av ett 1 ml prov av cellysat från pärlkvarn. Centrifugera (12000 x g, 4 ° C, 5 min) i en bänk centrifuge. Späd supernatanten till 01:50 med mPIB i en kyvett och mäta A 380. Om A 380> 0.1, eller har slutat öka trots flera upprepade pärla ledande cykler, gå vidare till nästa steg. Om inte, upprepa 2,3-2,4.
- Centrifugera det totala cellysatet (12000 x g, 4 ° C, 20 min). Behåll supernatanten. Släng pellet (som innehåller hela celler och mitokondrier), men om det inte finns några tvivel om effektiviteten i cellbrott (se 2.4), sedan behålla pellets också.
- Centrifugera supernatanten från det tidigare steget (200.000 xg, 4 ° C, 1,5 h). Kassera supernatanten och suspendera pelleterade mikrosomala membran i CFTR buffert. Om mikrosomerna är avsedda för rening med användning av DDM, komplettera CFTR-buffert med 1 M NaCl.
- Upprepa centrifugeringen av den återsuspenderade membranfraktion (100.000 x g, 4 ° C, 1 timme) och kassera supernatanten.
- Resuspendera pellet mikrosomer ien minimivolym av CFTR buffert (slutvolym 5-15 ml, totalt mikrosomalt protein 70-200 mg). En Bradford-analys kan användas för att bestämma den totala koncentrationen av mikrosomala proteiner 25. Dessutom bör mätas fluorescensemissionsspektrumet av membranen (excitation = 485 nm, emission = 500 till 600 nm) och bör ha en distinkt GFP fluorescens topp (maximum vid 512 nm). CFTR-specifikt kan detekteras på en SDS-PAGE-gel, avläst enligt GFP-fluorescens betingelser (fig 1).
- Flash-frysa resuspenderade mikrosomer genom att kasta sig in i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C, eller fortsätta till steg 3.
3. Solubilisering av Mikrosomer
- Om fryst, tina mikrosomer omedelbart före användning i ett vattenbad inställt på 10 ° C.
- För solubilisering av membran, späd mikrosomer med en lika stor volym av den relevanta solubiliseringsbuffert (steg 1,3) för att ge en slutlig koncentration av detergent2% (vikt / volym) och ett mikrosomalt protein koncentration 5 mg / ml. Inkubera denna blandning under 1 h vid 4 ° C med omrörning (tub rotator). Behåll 200 ul för analys.
- Centrifugera blandningen (100000 x g, 4 ° C, 45 min). Avlägsna supernatanten innehållande de solubiliserade membranproteiner, passerar den genom ett 0,45 fim sprutfilter och förvara på is. Mät fluorescensen hos supernatanten (som i steg 2.8).
- Resuspendera den olösliga fraktionen i 1% (vikt / volym) SDS-lösning till en volym lika med den lösliga fraktionen. Mät fluorescensen i denna fraktion och kvarhålla en alikvot av 50 ul för SDS-PAGE-analys.
4. Nickel-affinitetsrening av CFTR
- Länk två 5 ml nickel Sepharose kolonner i serie. Tvätta med 2 kolonnvolymer (CV) 20% (v / v) etanol, följt av 2 CV DDH 2 O, sedan tvätta kolonnen med 2 CV av solubiliseringsbuffert (steg från 1,4 till 1,5), innehållande 1 M imidazol. Upprepa med 2 CV av solubilization buffert saknar imidazol.
- Lägg imidazol till en slutlig koncentration av 5 mM till det solubiliserade materialet (steg 2,8), och manuellt ladda materialet på kolonnen eller in i en provslinga om användning av en automatiserad vätskekromatografi enhet.
- Fyll på solubiliserade materialet på kolonnen med en flödeshastighet av 0,5 ml / min, och tvätta med 2 CV av imidazol-saknande buffert vid samma flödeshastighet för att avlägsna obundet material. Samla fraktioner i 50 ml Falcon-rör.
- För den första tvätten, använda 3 CV av rening buffert med 40 mM imidazol vid en flödeshastighet av 1 ml / min. Samla upp 2 ml fraktioner.
- För det andra tvätt, använd 3 CV renings buffert med 100 mM imidazol. Samla upp 2 ml fraktioner.
- Eluera CFTR från HisTrap kolonnen med 3 CV renings buffert med 400 mM imidazol. Samla upp 2 ml fraktioner.
- Övervaka fluorescens i eluerade fraktioner (Steg 2.8).
- Behåll alikvoter av toppfraktioner för SDS-PAGE-analys. Flash frysa återstående topp fdiffraktion prover och förvara vid -80 ° C, eller fortsätta till nästa reningssteg.
5. Gelpermeationskromatografi (GPC) Rening av CFTR
- Jämvikta kolumnen (Superose 6 10/300 GL) med 1,2 CV DDH 2 O, följt av 1,2 CV GPC buffert.
- Under Steg 5,1, koncentrera de Ni-affinitetsrenade fraktioner med den högsta GFP-fluorescens med användning av ett 100.000 MWCO centrifugal filter vid 4 ° C. Om rening i DDM, undvika att koncentrera provet över en proteinkoncentration av 0,3 mg / ml protein eftersom detta kommer att orsaka betydande provförlust. Ta retentatet från anriknings och centrifugera vid 100.000 x g under 30 min vid 4 ° C för att pelletera stora partiklar.
- Injicera detta prov på kolonnen och eluera med en isokratisk gradient av 1,2 CV GPC-buffert. Samla 0,5 ml fraktioner.
- Mät GFP fluorescens som i avsnitt 2.8 för att identifiera de fraktioner som innehåller CFTR. Behåll en liten volym (t.ex. </ Em> 50 ^ il) av varje för analys genom SDS-PAGE.
- Freeze fraktioner i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
6. Rekonstitution av CFTR
- Lägg lipider (steg 1,8) till den renade CFTR på lipid-till-proteinförhållande 100:1 (vikt / vikt) och inkubera vid 4 ° C under 1 timme. På liknande sätt upprätta en lipid-bara styr, varvid det renade proteinet med samma volym av GPC-buffert.
- Ta bort tvättmedel från protein / lipid blandning med hjälp av hydrofoba adsorberande pärlor. Tvätta adsorberande pärlor i 5 CV DDH 2 O, 5 CV 70% (volym / volym) etanol, 5 CV DDH 2 O och 5 CV GPC-buffert som saknar detergent. Addera 200 mg tvättade adsorberande pärlor per ml renat protein och inkubera vid 4 ° C över natt med försiktig skakning.
- Samla rekonstitutionen prov från de adsorberande pärlor i ett nytt rör med användning av en tunn-ended pipettspetsen.
7. Mätning av ATPas-aktivitet
- Bestäm graden av CFTR-specifik ATPas-aktivitet med användning av en modifierad Chifflet assay 26,27 i en 96-brunnars plattformat. Med natriumfosfatstamlösning (0,65 mM) förbereda 0-20 nmol fosfat i en slutlig volym av 50 | il som standarder. Använd en 01:01 blandning av CFTR-buffert och ATPas-buffert för att späda ut fosfatlagret.
- Inkubera både rekonstituerad CFTR och tomma liposomer med 1:100 (v / v) ATPas-hämmare (Steg 1.9) på is i 10 minuter. Använd minst 5 pg av rekonstituerad CFTR.
- Lägg ATP (steg 1,9) till en slutlig koncentration av 2 mM och inkubera vid 25 ° C under 1 timme. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 40 ul av 10% (vikt / vol) SDS (steg 1,9) till varje brunn (inklusive de standarder).
- Addera 100 pl av buffert A (steg 1,10) och inkubera under 10 min. Tillsätt 100 ^ il buffert B (1,10) i varje brunn och mäta absorbansen vid en våglängd av 800 nm i en 96-brunnsplatta som passar UV / Vis-spektrofotometer.
- Konvertera absorbans vid 800 nm i en mängd frigjord fosfat med hjälp avfosfat standarder. Beräkna hastigheten för ATP-hydrolys efter subtraktion bakgrundssignal (liposom-bara brunnar).
- För icke-färdigberedd CFTR följer samma protokoll med hjälp av CFTR buffert för bakgrundsavläsningar.
Representative Results
Protokollet som beskrivs ovan är ett effektivt sätt att isolera CFTR-berikade mikrosomer, med nästan fullständig återvinning av CFTR under cellbrott och beredning av rå mikrosomer (Figur 1). Andra cellbrott metoder kan också användas på ett effektivt sätt. Vi har använt en fransk tryckcell, och andra high-pressure/cavitation anordningar (även i kombination med impac mot en rubin-mål) med samma effektivitet. För bekvämlighet och låg initial kostnad för utrustning, finner vi pärlan misshandel metoden bäst.
Med hjälp av gasol för att lösa och rena CFTR gav 80 mikrogram protein / L kultur på> 90% renhet (Figur 2). Det höga utbytet var på grund av att effektiv solubilisering av CFTR med gasol (jämför figur 2b, spår 2 och 4). Dessutom har en effektiv och stark bindning till kolonnen resulterade i minimal förlust av CFTR i den obundna fraktionen och frånvaron av CFTR i tvättfraktioner (Figur 2, spår 3, 5, och6). Det eluerade proteinet hade en renhet av> 90%, uppskattades genom Coomassie-färgad SDS-PAGE-geler och använda densitometri av CFTR och kontaminerande band. Gelpermeationskromatografi (GPC) separerades LPG renade CFTR från lågmolekylära föroreningar (figur 4, lägre panelen).
Protokollet för CFTR-rening med användning av DDM ger renhet av ca 60% och utbyte på ungefär 50 | ig / l (fig 3). Elektronmikroskop (EM) i negativt färgade fraktioner från GPC elueras vid ca 10 ml (Figur 4) visade att DDM-renat CFTR innehåller aggregat av 20-30 nm i diameter samt mindre partiklar på 10 nm i diameter (data visas ej). Det är möjligt att de små aggregat reversibelt kan associera och dissociera som ultrafiltrering med en 1 MDa cut-off filter misslyckades med att ta bort EM-detekterbara aggregat. LPG-renade materialet inte bindas till en glöd-urladdat galler, därav studerades av Cryo-EM i ofärgade fraktioner. Detta visadeen mycket homogen partikel befolkning på en relativt liten storlek (6-8 nm i diameter, data visas inte).
Slutligen tillsattes ATPas-aktiviteten hos de renade proteinerna mättes (figur 5). Som medlem i ABC-proteinfamiljen, har CFTR två nukleotid-bindande domäner (NBDs) kan binda och / eller hydrolyse ATP. Uppgifterna tyder på att det renade proteinet inte kunde hydrolysera ATP i LPG-upplöst tillstånd och svagt ATPas aktivitet i närvaro av DDM (Figur 5, ofyllda staplar). Efter tillsatsen av lipider och avlägsnande detergent, ATPas-aktivitet var 4-faldigt högre för prover som hade renats i DDM (13 nmol ATP / min / mg protein). Tillägget av lipider och borttagning av gasol på liknande restaurerade aktivitet till CFTR som hade isolerats med hjälp av gasol, men med ett slutligt lägre (1,5 nmol ATP / min / mg protein) än DDM-renade och rekonstituerade material.
Figur 1. Övervaknings nivåer av kyckling CFTR i cellysat (CL), supernatanter (S) och pelletarna (P) under olika centrifugeringssteg används för mikrosom isolering och tvättning. SDS-PAGE-geler synliggjordes med användning av i-gel-fluorescens av GFP taggen. Supernatanten efter cellbrott och centrifugering vid 14.000 xg innehåller så gott som alla CFTR (inklusive nedbrytningsprodukter). Ultracentrifugering vid 200.000 xg sediment alla fullängds CFTR den lämnar några fragment i supernatanten. Ultracentrifugering vid 100.000 xg av salttvättad mikrosomer pellets nästan hela CFTR med att avlägsna ytterligare några fragment.
Figur 2. Rening av kyckling CFTR i gasol genom immobiliserad metalljon-affinitetskromatografi. Fraktioner analyserades genom SDS-PAGE följt av Coomassie-färgning (övre panel) och fluorescensdetektering av GFP-tagg (lägre panelen). Spår: (1) mikrosomer. (2) LPG-upplöst mikrosomer. (3) obundet material. (4) olösligt material. (5) och (6) 40 och 100 mM imidazol tvättar. (7) Material elueras med 400 mM imidazol.
Figur 3. Rening av kyckling CFTR i DDM av immobiliserad metalljon-affinitetskromatografi. Fraktioner analyserades genom SDS-PAGE följt av Coomassie-färgning. Den vänstra panelen visar fraktioner före eluering. Flera elueringsfraktioner rad visas i den högra panelen med CFTR idikeras med pilen. Senare fraktioner anrikas i en 40 kDa kontaminant, som har identifierats genom masspektrometri såsom ribosomalt protein L3.
Figur 4. Rening av kyckling CFTR genom gelpermeationskromatografi. CFTR renades genom Ni-affinitetskromatografi koncentrerades och applicerades på en GPC-kolonn. Elueringsprofilen för CFTR (övre panelen) renades i buffert innehållande LPG-14 (heldragen linje) eller DDM (streckad linje) är överlagrade. SDS-PAGE (undre panelen) avslöjade att CFTR eluerades mellan 8 och 11 ml.
Figur 5. ATPas Verksamhety av renade kyckling CFTR fraktioner. Protein renades i DDM eller gasol analyserades med användning av en modifierad Chifflet assay 26 i närvaro av en cocktail av ATPas-inhibitorer för att eliminera någon bakgrund ATPas-aktivitet från F-, P-och V-typ ATPaser (ofylld barer ). Graden av ATP hydrolys mättes också efter avlägsnande tvättmedel och lipid tillägg (fyllda staplar). Diagrammet visar medelvärdet och standardavvikelsen (n = 3). Skillnader mellan medelvärden för ATPas-aktivitet i närvaro och frånvaro av lipid och skillnaden mellan aktiviteten i DDM och gasol är betydande till p <0,05.
Discussion
Vi har tidigare beskrivit ett förfarande för överexpression av murint CFTR 14. Sedan publiceringen av detta protokoll, har vi uttryckt och renat flera olika ortologer av CFTR med samma system. Alla ortologer testats hittills renas väl i gasol tvättmedel, medan DDM reningen visade mer variation mellan olika ortologer (data visas ej). Denna flexibilitet illustrerar styrkan i jäst strategi: det är möjligt att screena många konstruktioner med relativa snabbhet för att välja en för ett särskilt ändamål.
Att tvätta jästen mikrosomer med buffert innehållande 1 M NaCl före lösningsgörande med DDM ger en renare mikrosomfraktion förberedelse och minskar föroreningar i senare skeden. Detta steg är onödigt i gasolprotokollet som sista CFTR provet är> 90% ren utan mikrosom tvätt. Vidare rening i DDM kräver flera ändringar till buffertarna för görande and rening, nämligen tillsatsen av extra glycerol och salt. Tillsammans ger dessa tillsatser kraftigt ökade bindningen av DDM-solubiliserade proteinet till kolonnen.
Den DDM reningsmetod har utrymme för förbättringar, särskilt avlägsnande av en 40 kDa stor förorening som, bedöms av masspektrometri, beror på jästen subenheten L3, som tycks ha en inneboende affinitet för nickel harts. Det finns ingen uppenbar polyHis sekvens i L3-proteinet, men undersökning av dess 3D-struktur när bundet till ribosomen (PDB = 1FFK) visar att den vikta L3 subenheten har en potential polyHis kluster. Det här bandet är mindre problematiskt i LPG-renade materialet kan bero på den hårdare gasol tvättmedel.
Även om reningen i DDM tycks vara sämre än i gasol, får mildare rengöringsmedel såsom DDM vara mer kompatibel med funktionella och strukturella analyser och har redan använts i flera röntgen crystallographic studier av membranproteiner 15-21. Dessutom är våra resultat visade att användningen av gasol leder till förlust av ATPas funktion i CFTR förhållande till rening i DDM. Hence vi rekommenderar gasolbaserade reningsprotokoll för generering av CFTR där renheten är viktig, till exempel i applikationer såsom karakterisering av posttranslationella modifieringar, eller vid alstring av antikroppar, gasolbaserat protokoll skulle väljas . Å andra sidan är i applikationer där aktiviteten och fullständigt nativa tillstånd av proteinet är nödvändigt, skulle vi föreslå DDM-baserat protokoll som ett bättre alternativ.
Avslutningsvis beskriver detta protokoll en reproducerbar metod för isolering av CFTR i zwitterjoniska tvättmedels LPG-14 eller den icke-joniska tvättmedel DDM. Som sådan visar ett större utbud av reningsvillkor för CFTR än tidigare har rapporterats 10-13. Dessutom milligram kvantiteter av renat CFTR kan varaerhållas med användning av dessa förfaranden när de kombineras med en hög volym jästtillväxt system, såsom en 20 L fermentor och en hög kapacitet cellskörd system, såsom en 6 L låg hastighet centrifugrotor. CFTR erhålles har en klyvbar GFP tagg som möjliggör enkel övervakning av proteinet i olika biokemiska och biofysiska analyser.
Det reagens som beskrivs i detta manuskript (kyckling CFTR-innehållande plasmid eller frysta jästceller) kan erhållas genom cystisk fibros Foundation (USA).
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra motstridiga intressen när det gäller detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av den amerikanska Cystisk Fibros Foundation (CFF) genom dess CFTR 3D Structure Consortium. TR har finansierats av en brittisk CF Lita studentship, och NC av en brittisk BBSRC anställning. Vi erkänner våra kollegor i CFF CFTR 3D struktur konsortium för deras hjälp och råd och för utformningen av kodonoptimerade kyckling CFTR sekvens och renings taggar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 | |
| 2 ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 | |
| 50 ml sterile Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| Gel imaging system | BioRad | 170-808 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| E. coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Fisher | 65017 | |
| HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 | |
| Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| SCH28080 | Sigma-Aldrich | S4443 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 | |
| Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 | |
| Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 | |
| Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 | |
| Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |
References
- Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel. Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).
- Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003. EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).
- O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373, 1891-1904 (2009).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245, 1059-1065 (1989).
- Kariya, C., et al. A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).
- Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung. Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).
- Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates. Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).
- Cole, S. P., et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258, 1650-1654 (1992).
- Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters. Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).
- Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).
- O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. , (2012).
- Oldham, M. L., Chen, J. Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).
- Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter. Science. 315, 373-377 (2007).
- Dawson, R. J. P., Locher, K. P. Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature. 443, 180-185 (2006).
- Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter. Science. 321, 246-250 (2008).
- Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).
- Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation. Science. 321, 250-253 (2008).
- Aller, S. G., et al. Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding. Science. 323, 1718-1722 (2009).
- Koehler, J., et al. Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids. Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).
- Tian, C., et al. Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases. Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).
- Rothnie, A., et al. The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence. Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).
