Summary
Een muis model van menselijke endoscopische schedelbasis reconstructie is ontwikkeld dat een semi-permeabel interface tussen de hersenen en de neus met behulp van nasale mucosale enten creëert. Deze methode staat onderzoekers aflevering aan het centrale zenuwstelsel van hoogmoleculaire geneesmiddelen die anders zijn uitgesloten door de bloed-hersenbarrière bij systemisch toegediend bestuderen.
Abstract
Levering van geneesmiddelen in de hersenen wordt belemmerd door de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB) die de doorgang van polaire en hoog molecuulgewicht uit de bloedbaan en in het hersenweefsel beperkt. Sommige directe levering succes bij mensen is bereikt via de implantatie van transcraniële katheters; maar deze methode is zeer invasief en geassocieerd met talrijke complicaties. Een minder invasief alternatief zou zijn om de hersenen te doseren via een chirurgisch geïmplanteerde, semipermeabel membraan zoals neusslijmvlies die wordt gebruikt om schedelbasis gebreken te herstellen na endoscopische transnasal tumorverwijdering chirurgie in mensen. Geneesmiddeloverdracht hoewel dit membraan zou effectief omzeilen de BBB en diffuse direct in de hersenen en de cerebrospinale vloeistof. Geïnspireerd door deze aanpak, een chirurgische benadering in muizen ontwikkeld die een donor septum slijmvlies geënt op een extracraniale chirurgische BBB defect gebruikt. Dit model is aangetoond effectieflaten de passage van verbindingen met hoog molecuulgewicht in de hersenen. Aangezien vele kandidaat-geneesmiddelen zijn in staat die de BBB, dit model is waardevol voor preklinisch testen van nieuwe therapieën voor neurologische en psychiatrische ziekten.
Introduction
De behandeling van neurologische en psychiatrische ziekten wordt ernstig belemmerd door de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB) dat meer dan 95% van alle mogelijke farmaceutische middelen voorkomt bereiken het centrale zenuwstelsel 1-3. Bijvoorbeeld, gliale afgeleide neurotrofe factor (GDNF) is effectief gebleken bij de behandeling van de ziekte van Parkinson als rechtstreeks geïnjecteerd in de hersenen te zijn, maar werkt niet als systemisch afgegeven, omdat deze niet kan doordringen de BBB 4-6.
Talrijke benaderde zijn ontwikkeld om te proberen dit probleem te omzeilen. Verbetering van systemische toediening van neurotheraputics is aangetoond met geneesmiddel conjugaten met antilichamen selectief voor transporteiwitten op de hersenen capillaire endotheel; deze werkwijze echter niet aangetoond toepasbaar voor een breed scala van geneesmiddelen 7,8 te zijn. Daarnaast heeft osmotische opening van de BBB gebruikt kliniekally, maar deze methode lijdt aan systemische dosis van het geneesmiddel in tegenstelling tot een gerichte aflevering aan de hersenen interessegebied 9. Aanzienlijke inspanningen werden in het optimaliseren transnasal levering in de hoop direct gericht op de hersenen 10-12 zetten. Hoewel enig succes is geboekt, zijn overtuigende resultaten alleen verkregen voor geneesmiddelen met endogene receptoren, zoals insuline 13,14 bezitten. Verder is het mechanisme van transnasal levering is controversieel met aanwijzingen indirecte binnenkomst in de hersenen via olfactorische neuron opname of via de bloedbaan 11 geweest. Direct transcraniële productietijd middels implanteerbare katheters is bereikt, maar deze procedure is zeer invasief en geassocieerd met talrijke complicaties 15,16. Tot op heden is er geen algemeen minimaal invasieve methode hoog molecuulgewicht leveren in de hersenen.
Die hierin is een muizen chirurgische ingreepdat zorgt voor een halfdoorlaatbare interface met de hersenen. Dit wordt bereikt door enten een slijmvlies explantaat 17 via een chirurgische craniotomie defect in een muis. Met deze procedure is aangetoond dat oplosbare verbindingen tot 500 kDa in het centrale zenuwstelsel (direct in het hersenparenchym en in cerebrospinale vloeistof) zowel tijd molecuulgewicht afhankelijke wijze 18 worden geleverd. Deze methode van het omzeilen van de BBB is een model voor schedelbasis defect reparaties bij mensen die vascularized mucosale enten gebruikt om gaten in de schedel te herstellen volgende transnasal endoscopische chirurgie 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voorafgaand aan de operatie te zorgen dat alle procedures die moeten worden gedaan zijn goedgekeurd door IACUC en eventuele aanvullende ethische of juridische autoriteiten en gebruik humane behandeling van dieren praktijken. Dit omvat het gebruik van steriele operatie voorwaarden, verlamming van de muis met behulp van IACUC goedgekeurde methode, smeren muizen ogen met dierenarts zalf tijdens de operatie, en het verstrekken van postoperatieve zorg. Ga niet verder met een operatie als er een vraag of aspecten van de procedure zijn goedgekeurd. Alle procedures die hierin uitgevoerd werden goedgekeurd door de Boston University Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van de dieren en Chirurgische Supplies
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten die worden gebruikt tijdens de operatie.
- Zorg ervoor dat alle technieken die worden uitgevoerd zijn goedgekeurd door de regelgevende instanties dier.
2. Het oogsten van het mucosale Graft
- Koos voor een genetisch identieke muizen van dezelfde leeftijd alsde experimentele muis en euthanaseren het in een IACUC goedgekeurde methode (hier: isofluraan stikken gevolgd door cervicale dislocatie).
- Met behulp van chirurgische schaar, verwijder de huid rond de neus regio muis hoofd blootstellen van de schedel.
- Met een pneumatische zaaimachine, teken met drie lijnen waarvan er twee zijdelings flankeren de nasale gebied en een derde overeenkomstig de ogen die de twee lijnen loodrecht verbindt.
- Drill down ventraal om het neustussenschot scheiden van het omringende weefsel. Een breder pad schade aan het slijmvlies vermijden maar het zal ook moeilijker om het membraan te isoleren. Een smalle snit dichter bij middellijn wordt aanbevolen.
- Gebruik een schaar om het septum vrij gesneden van elk weefsel vastgehouden aan het en bewaar het op een steriele zoutoplossing. Op dit moment is het transplantaat kan worden schoongemaakt om alle aangesloten weefsel te verwijderen. De ideale situatie is om onbeschadigd mucosale membranen blootgesteld aan weerszijden van het kraakbeen septum. Een grachterschip leveren membraan voor twee muizen ontvangen het oppervlak van het membraan is voldoende om de craniotomie sites hebben. Aanbevolen wordt het implantaat zo snel mogelijk gebruikt waarbij de onderzoeker door naar stap 3 zodra het transplantaat wordt geïsoleerd.
3. Chirurgische Implantatie van Mucosal Graft
- Met behulp van standaard, aseptische muizen chirurgische procedures, verdoven en monteer een muis in de stereological frame. Gebruik ongeveer 2% isofluraan in zuivere zuurstof met behulp van een knaagdier anesthesieapparatuur.
- Immobiliseer de muis in een stereotaxische apparaat met oor bars en een neus houder. Solliciteer oogzalf om de ogen en wrijf de hoofdhuid met betadine en 75% ethanol voor drie rondes. Met behulp van een schaar of een tondeuse, verwijder de vacht op het hoofd. Expose de schedel met een scheermesje en het niveau van de kop. Voer een craniotomie boven de plaats van de hersenen die worden gedoseerd. Wanneer bijvoorbeeld gericht op het striatum gesneden 1,25 mmdiameter rond gat in de schedel (gecentreerd op LD: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) met behulp van een pneumatische boor. Bevochtig de geboorde gebied met een steriele zoutoplossing en gebruik een scheermesje om de schedel te verwijderen.
- Verwijder de dura voorzichtig met de punt van een naald. Bovendien kan dit worden bereikt door een minimale hoeveelheid weefsel lijm op de vochtige durale oppervlak. Zodra deze laag is uitgehard kan laterale beweging met een scheermesje tip gebruikt worden om het membraan te verwijderen.
- Plaats het slijmvlies boven de hersenen oppervlak nemen uiterste zorg aan de epitheliale zijde houden geconfronteerd weg van de wond. Dit kan het beste gebeuren door de overdracht van de gehele septum op het oppervlak van de schedel naast het craniotomie site met pincet. Gebruik de punt van een paar chirurgische schaar, trek het membraan af van het kraakbeen en op de schedel en de hersenen oppervlak. Laat je niet door het membraan uitdrogen of aanraken met enig absorberend materiaal. De ent moet goed overlappen alle benige randen van de craniotomie site.
- Bedek het transplantaat met een steriel stuk nitril. Dit dient om de hechting van de huid tijdens heling voorkomen het transplantaat. De nitril moet groot genoeg zijn om het gehele slijmvlies te dekken. Trim overmatige membraan indien nodig. Vermijd beweging van het nitril zodra het in contact komt met het implantaat is gekomen.
- Sluit de huid met een lopende 5-0 steriele hechtdraad en laat de muis te herstellen voor 3-7 dagen voordat u verder gaat met de volgende stap. Verzorgen het nitril barrière of de mucosale ent tijdens sluiting huid niet te verstoren.
4. Toediening van Doseren Solution
- Na het veiligstellen van de verdoofde muis in het stereotaxisch frame, snijd de hechtdraad met een schaar en verwijder de overtollige huid rond de schedel.
- Verwijder het nitril barrière en reinig het oppervlak van de schedel. Gebruik steriele zoutoplossing en wattenstaafjes om het gebied schoon totdat het transplantaat zichtbaar. Het kan nodig zijn om het transplantaat snijden met een scheermesje of groter dan d gegroeidesired oppervlakte.
- Als het experiment langer dan een paar dagen zal zijn, is het verstandig om te implanteren minstens twee schedel schroeven aan het hoofd implantaat versterken.
- Plaats de ruim boven het implantaat zodat de randen in contact met de schedel. Solliciteer cyaanacrylaatlijm op de kruising tussen de put en de schedel. Vul het goed met een steriele zoutoplossing en controleer of er geen lekken zijn. Putten zijn gemaakt van gesneden injectienaalden.
- Solliciteer botcement op de schedel naar de bron vast te zetten.
- Verwijder de zoutoplossing uit de put met een pipet. Was het ook een paar keer om te controleren of lijm heeft niet gelekt inch Voeg de gewenste oplossing; in dit geval 50 pl fluorescerende dextran wordt gebruikt. Verwacht wordt dat water oplosbare verbindingen met een soortgelijke polariteit gelijk dextran zal gedragen. Levering van hydrofobe verbindingen of suspensies niet onderzocht met deze methode.
- Cap de bovenkant van de put met een cirkelvormig stuk nitril bevestigd aan deboven het gebruik van cyaanacrylaatlijm. Controleer de lijm niet in contact met de inhoud goed.
5. Analyse van Transmucosale Levering
- Nadat de gewenste hoeveelheid tijd is verstreken, verdoven de muis en wisselen de inhoud goed met een oplossing van blauwe kleurstof Evan's. Deze kleurstof wordt gebruikt om te controleren of het transplantaat was intact.
- Na 30 min, verdoven de muis zwaar, verwijder de kleurstof oplossing, en euthanaseren via onthoofding.
- Handmatig verwijderen van het implantaat en verwijder de hersenen met behulp van chirurgische schaar. Wees voorzichtig om de graft op zijn plaats te houden.
- Na verwijdering flash-bevriezen de hersenen in een oplossing van isobutaan gekoeld in een droog ijsbad.
- De hersenen in te bedden in Optimal Cutting Temperatuur (oktober) oplossing en plak bij 50 micrometer.
- Plaats de gewenste segmenten direct op een microscoopglaasje.
- Afbeelding de plak met behulp van een fluorescentie microscoop zodra LGO oplossing gedroogd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het verkrijgen van een voldoende grote neustussenschot explantaat is cruciaal voor de volgende stappen. Dit kan worden bereikt door het boren ter plaatse van de donor muis schedel figuur 1a. Snijden langs dit pad een explantaat voldoende de grootte te produceren zoals getoond in figuur 1b. Wanneer de boordiepte niet diep genoeg is, zal het transplantaat afgekapt en het zal moeilijk zijn om een voldoende grote membraan naar de hersenen bedekken verkrijgen. Boren meer lateraal dan de voorgestelde pad niet wordt geadviseerd omdat er meer weefsel aan het neustussenschot zal blijven, en de volgende stap zal het moeilijker zijn. Voorafgaand aan de overdracht van het slijmvlies, het oppervlak van het septum moet worden ontdaan van alle overtollig bindweefsel. Zodra dit gebeurt, moet het slijmvlies zichtbaar zijn op het oppervlak van het kraakbeen. Figuur 1c toont hoe het weefsel eruit ziet na reiniging.
Voorafgaand aan de overdracht membrane een craniotomie en durotomie moeten worden uitgevoerd om het hersenoppervlak bloot. Pas na de post-durotomie bloeden is gestopt kan het membraan worden overgebracht. Figuur 2a toont wat plaats van de operatie eruit moet zien voordat u verder gaat met de volgende stap. Het overbrengen van de slijmvlies van het kraakbeen op de hersenen oppervlak is de meest technisch uitdagende stap van het gehele chirurgische procedure en moet zorgvuldig gebeuren. Indien de geoogste septum groot genoeg is, dient het oppervlak van de mucosale transplantaat groot genoeg om het hersenoppervlak dekken. Eenmaal overgebracht, moet het operatiegebied soortgelijk aan die kijkt in figuur 2b. Het is belangrijk ervoor te zorgen dat de zijde van het membraan dat in contact is met het kraakbeen is hetzelfde als dat in contact met het hersenoppervlak. Wanneer het membraan wordt gekanteld of gevouwen over zichzelf moet worden verwijderd en een andere worden gebruikt. Zodra deze stap is voltooid, kan de hoofdhuid worden gehechtzodat de muis kan herstellen en het transplantaat kan genezen. Om bijwerkingen van het transplantaat in contact met het binnenoppervlak van de hoofdhuid te voorkomen, moet een stuk beschermend nitril boven om de operatieplaats geplaatst. Zoals getoond in figuur 2c, zal de ingevoegde stuk groot genoeg is om het membraan bedekken, maar niet groot genoeg hechten van de huid gesloten te verkleinen.
Tijdens de herstelperiode, substantiële weefsel-groei optreedt van de omliggende periost die vóór het membraan dosering moet verwijderd worden. Na heropening van de hoofdhuid, zal steriele wattenstaafjes en zoutoplossing moeten worden om de locatie schoon totdat het lijkt op die in figuur 3a. We hebben niet waargenomen substantiële immuunrespons; maar dit is niet histologisch bevestigd. Het transplantaat moet worden gesneden met een scheermes indien gegroeid over het oppervlak van de schedel. In dit stadium het goed dat de dosering oplossing bevattie moet boven het transplantaat worden geïmplanteerd. Verschillende schedel schroeven kan in worden gezet bij deze stap over als mechanische stabiliteit van het implantaat op lange termijn is een punt van zorg. Zorg ervoor dat het goed is zo, dat er niet het transplantaat te raken. Eenmaal op zijn plaats, kan cyaanacrylaatlijm worden toegepast om het te lijmen aan de schedel. Om te voorkomen dat de lijm in contact komt met het implantaat moet worden aangebracht op het oppervlak van de put en naar beneden geduwd om het gat te dichten. Zodra het goed is beveiligd, moet tijdelijk worden gevuld met een zoutoplossing om zowel hydrateren het transplantaat en controleer op lekkage. De gehandeld goed eruit zou moeten zien dat in figuur 3b en de oplossing duidelijk moeten aangeven dat het geen lijm bevat. Eventuele lekkage zal duidelijk zijn omdat de vloeistof in de put zal dalen. Indien lekken worden gevonden moeten ze worden bevestigd met meer lijm. De put wordt dan versterkt met botcement. Op dit punt de zoutoplossing in de put kan worden verwijderd met een pipet envervangen door de gewenste doseringsoplossing. Wanneer die de put met een stuk nitril zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de lijm niet contact op met de oplossing in de put. Aan het einde van de gehele procedure, moet de muis hoofd eruit dat in figuur 3c. Het botcement is licht doorschijnend dus als de inhoud van de put zijn lichtgevoelig, kleurstof of inkt kan worden toegevoegd aan het oppervlak van de gedroogde cement of de cement mengsel afbraak van de inhoud goed te voorkomen.
Na de gewenste periode wachttijd dient de hersenen worden geanalyseerd om de effecten van de toediening te ontdekken. De hersenen anders moeten worden behandeld, afhankelijk van wat wordt onderzocht. Als het doel van de procedure is om de aanwezigheid van chemische aan het putje toegevoegd (zoals in het protocol hierboven beschreven afmeting) analyseren dan is het raadzaam om een flash bevriezing van de hersenen alsnog de toegediende verbindingen behouden. Figuur 4 > Toont een representatief resultaat van deze aanpak. Toediening van een 40 kDa fluorescerende polymeer (tetramethyrhodamine geconjugeerde dextran) voor 24 uur toont merkbaar diffusie in het hersenweefsel. Onze eerdere resultaten met dextran tonen diffusie in het hersenweefsel is zowel tijd en het molecuulgewicht afhankelijk 18. Kleinere moleculen diffunderen in het hersenparenchym grotere mate dan grotere en grotere doseertijd resulteert in een grotere hoeveelheid diffusie voor alle molecuulgewichten die wij getest. Als flash bevriezing wordt gedaan is het belangrijk om de dia's te monteren na het snijden en ze niet bloot aan oplossing. Vloeistof zal de toegediende verbinding oplosbaar en diffunderen deze over het oppervlak van de hersenen slice. Als immunohistochemie moet worden uitgevoerd op de hersenen dan is het raadzaam om de muis doortrekken naar het hersenweefsel te lossen.
iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Figuur 1. Beelden van het neustussenschot oogsten procedure. A) De locatie van de boorlocatie op de schedel van een muis gedood. De stippellijnen geven de omtrek aan. B) Het neustussenschot boren direct na chirurgische verwijdering. C) Het neustussenschot na het verwijderen van overtollige weefsel. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Chirurgische beelden van de enting proces. A) De chirurgische plaats volgende craniotomie en durotomie. De afbeelding is representatief voor wat de schedel eruit moet zien voorafgaand aan het plaatsen van het implantaat daarop. B) Plaatsing van de mucosa transplantaat op de craniotomie plaats. De stippellijn geeft de omtrek van de graft. De afbeelding toont het gewenste oppervlak van het transplantaat. C) Implantatie van het nitril beschermende barrière. De grootte van het materiaal zoals is groot genoeg om het implantaat te dekken, maar niet groot genoeg is om de hechten. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Chirurgische beelden van de dosering van geneesmiddelen proces. A) Een voorbeeld van wat het genezen mucosale ent eruit ziet na een zorgvuldige reiniging van de operatiewond. B) Afbeelding van goed bevestigd aan de schedel. De interface van de schedel en goed is beveiligdmet cyaanacrylaatlijm en de put is gevuld met een steriele zoutoplossing. De stabiele oplossing niveau geeft geen lekken uit de put en de helderheid van de oplossing geeft geen verontreiniging van de oplossing met lijm. C) Het beeld van de voltooide operatie. De well bevat de doseringsoplossing en stevig afgesloten met een nitril barrière. Botcement is op zijn plaats om het goed implantaat verstijven. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Fluorescentiemicroscoop beeld van muizenhersenen plak na transmucosale toediening van 40 kDa tetramethylrhodamine geconjugeerd dextraan voor 24 uur. Het schijfje werd genomen bij -1,06 mm bregma met een dikte van 501; m. De mucosale transplantaat is zichtbaar op het oppervlak van de hersenen. Bar = 1 mm. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lastigste stap van de hierin beschreven werkwijze is de succesvolle overdracht van een voldoende groot slijmvlies op het hersenoppervlak. Deze stap wordt aanzienlijk vergemakkelijkt indien het geoogste neustussenschot is groot genoeg en goed schoongemaakt. Als het ventrale gedeelte van het septum wordt afgekapt, moet een nieuw implantaat worden verkregen. De boorhoek moet loodrecht op de muis zijn hoofd dat de mucosale membraan niet beschadigd door de boor. Indien een groter dan aanbevolen boorbaan genomen zal het veel moeilijker om extra weefsel dat is verbonden met het septum te verwijderen. Grote stukken bindweefsel moeten worden verwijderd met een scherpe schaar snijdt in plaats van te proberen om ze te trekken los. Kleinere stukjes weefsel kan worden verwijderd door schrapen met de toppen van de schaar mits het weefsel niet verbonden met het slijmvlies. Aan het einde van het reinigingsproces moet het kraakbeen oppervlak met het membraan nog aan worden blootgesteld. Occavoorlopig het septum kraakbeen los van het bot dat is aangesloten op de dorsale rand geworden. Als dit gebeurt is het nog mogelijk om het in de volgende stap is het echter moeilijker om twee redenen. Het bot is een handig handvat om de explantatie te houden bij het reinigen en over te dragen. Eenmaal verwijderd, is het moeilijker om de meer delicate kraakbeen vel manoeuvreren. Ten tweede, de kraakbeen-bot junctie waar de mucosale membraan dikste en gemakkelijkst te verkrijgen bij het verwijderen uit het kraakbeen. Als het bot wordt gescheiden van het kraakbeen dit gedeelte van het membraan verloren gaat.
Zodra het septum implantaat is gereinigd en de craniotomie en durotomie uitgevoerd, kan het slijmvlies via blootgestelde hersenen oppervlak worden geplaatst. Dit wordt het beste bereikt door het zo explantaat naast de craniotomie plaats. Het membraan kan dan worden uitgenomen uit het kraakbeen, op de schedel en op de hersenen. Veel dingen mis kan gaan tijdens dit process. Het membraan kan uitdrogen, krijgen gescheurd, vouw op de top van zichzelf, of stelletje omhoog. Ook het membraan die de andere kant van het septum kan beschadigd raken door wrijving tegen de schedel. Het is ook mogelijk dat in een poging het opwaarts gerichte slijmvlies te verwijderen, verwijdert men de membranen van beide kanten tegelijk. Om al deze problemen te voorkomen is het cruciaal om het membraan langzaam en altijd bewegen waarnemen beide zijden van het septum. De beste strategie is om de uiteinden van de schaar gebruiken om het membraan los van het kraakbeen plaat voordat je probeert om het te glijden. Als enig deel van het membraan verbonden blijft, is het mogelijk dat de elasticiteit van het weefsel te schuiven na te trekken. Door kleine, trekken bewegingen het membraan kan worden losgemaakt van het septum. Alleen dan zal het gemakkelijk glijden. Het membraan te dun kunnen met pincet worden behandeld; het kan alleen worden getrokken van het ene oppervlak naar het andere. Als het wordt omgedraaid of gevouwen over zichzelf, hetmoeten weggegooid en ander te worden verkregen.
Indien het transplantaat bedekt het gehele oppervlak van de blootgestelde hersenen, het proces succesvol was en de hoofdhuid kan worden gehecht zodat de operatie plaats kan genezen. Een nitril barrière moet worden ingevoerd, zodat de huid niet in contact komen met het membraan. Zorg moet worden genomen, zodat druk wordt niet uitgeoefend op het nitril bij het hechten anders de transplantaat positie kan bewegen. Ook zorg niet te hechten in de nitril. De beste manier om ervoor te zorgen dat het materiaal gehoorzaamt is om het vochtig te houden met een zoutoplossing en zorg ervoor dat het plat blijft gedurende het hechten.
Zodra het transplantaat (3-7 dagen) is genezen het goed de dosering oplossing die kan aan de schedel boven het transplantaat worden bevestigd. Het kan tijdelijk naar de schedel te lijmen met botcement vast en permanent. Zodra het botcement wordt toegepast, zal het niet mogelijk zijn om eventuele correcties op de goed positie therefo makenre alle optimalisatie moet worden gedaan voorafgaand aan de toepassing ervan. Als de put in positie en plaats gehouden met cyanoacrylaat lijm, moet worden gevuld met een steriele zoutoplossing. Als de procedure succesvol is uitgevoerd het vloeistofniveau niet veranderen en de oplossing helder is. Als er een lek is, zal het niveau dalen en de locatie waar het water ontsnapte moet zichtbaar zijn. Na het aanbrengen van meer lijm op het lek, moet zouter worden toegevoegd om te controleren het lek werd verzegeld. Wanneer de lijm vervuilt de put oplossing, een doorschijnende film zichtbaar bovenaan het vloeistofniveau. Als dit gebeurt de put moet meerdere malen gewassen met zoutoplossing totdat de oplossing helder is. Bovendien kan een wattenstaafje worden gebruikt om de film te verwijderen door erop te drukken om het vloeistofoppervlak. Pas als de bron oplossing is en duidelijk moet het cement worden toegepast. Wanneer het cement droog is, kan de zoutoplossing uit de put verwijderd en vervangen door de doseringsoplossing. Zorg moeten worden genomen omhet membraan niet beschadigen bij het pipetteren in en uit de put. Eenmaal gevuld, moet de bovenkant van de put wordt afgesloten met een stukje nitril met cyanoacrylaat kleefmiddel. Het is belangrijk dat ruimte overblijft tussen het oppervlak van de oplossing en de bovenkant van de put. Dit zal ervoor zorgen dat de lijm de oplossing niet raakt bij het aantrekken van de nitril barrière.
Als het tijd is om het effect van de dosering procedure analyseren moet de hersenen worden verwijderd en afgebeeld. Als immunohistochemie wordt uitgevoerd, kunnen standaard perfusie en antilichaamkleuring gedaan. Als de locatie van de verbinding gedoseerd moet worden bepaald, wordt aanbevolen flash de hersenen bevriezen in een droogijs / isobutaan oplossing. Dit zal ervoor zorgen dat de locatie van de verbinding in de hersenenplakken gelijk is onmiddellijk voorafgaande aan euthanasie.
De hierin beschreven protocol beschrijft een werkwijze voor geneesmiddelafgifte om muizenhersenen onderzoeken door een chirurgischgeënte halfdoorlaatbare slijmvlies 18. Dit is analoog aan het resultaat van transnasal tumorverwijdering chirurgie in mensen waarbij schedelbasis defecten worden gerepareerd met een gevasculariseerde nasale slijmvlies 19,20. Met dit muismodel, is het nu mogelijk te onderzoeken hoe deze mucosale enten kunnen omzeilen BBB en waardoor directe hoog molecuulgewicht geneesmiddelafgifte aan de hersenen. We hebben nu uitgevoerd deze procedure meer dan 100 keer. Essentieel voor deze werkwijze is de succesvolle oogsten van een nasale septale transplantaat van een donor muis en de overdracht van de mucosale membraan van het implantaat op de test muis. Deze procedure, voor het eerst, zodat preklinische testen hoog molecuulgewicht therapeutica voor een verscheidenheid van neurologische en psychiatrische stoornissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Benjamin S. Bleier MD is lood uitvinder van voorlopige octrooi voor methoden van drug delivery aan het centrale zenuwstelsel.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door de Mcihael J. Fox Foundation voor onderzoek 2011 Rapid Response Innovations Parkinson Awards Program. De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
| Drill bit | |||
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
| Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
| Eye ointment | |||
| Electric shaver | |||
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
| Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
| 5-0 Nylon suture thread | |||
| Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
| Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
| Dry ice |
References
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
