Summary
已开发人力内镜颅底重建的小鼠模型，会使用鼻腔粘膜移植大脑和鼻子之间的半透界面。这种方法使研究人员能够研究发货到全身给药时，被排除在外，否则由血脑屏障高分子量治疗中枢神经系统。
Abstract
递送治疗剂进入脑是通过血 - 脑屏障（BBB）的制约的极性和高分子量化合物从血液进入脑组织的通道的存在阻碍。一些直接交付的成功在人类已通过经颅导管植入已经实现;然而，这种方法具有很强的侵袭，并与众多的并发症。侵入性较低的替代办法是通过外科手术植入，半透膜如用于下列在人类鼻内镜切除肿瘤手术，以修复颅底缺损鼻黏膜剂量的大脑。药物传递虽然这种膜能有效地绕过血脑屏障，并直接扩散到脑和脑脊液。通过这种方法的启发，在小鼠的手术方法的开发，使用捐赠者间隔粘膜栽种了一个多颅外手术血脑屏障的缺陷。该模型已被证明能有效地允许的高分子量化合物的通路进入大脑。由于众多的候选药物都无法穿越血脑屏障，这种模式是对神经系统和精神疾病进行的新疗法临床前试验的价值。
Introduction
神经和精神疾病的治疗中是受到严重的血-脑屏障（BBB），防止所有潜在的药物制剂的95％以上到达中枢神经系统1-3的存在阻碍。例如，神经胶质源性神经营养因子（GDNF）已被证明可有效地治疗帕金森氏病时，直接注射到大脑，交付时全身性，因为它不能穿透血脑屏障4-6不过是无效的。
众多走近已经发展到试图绕过这个问题。改善全身递送neurotheraputics的已证实通过使用含有抗体的选择性为位于脑毛细血管内皮转运蛋白药物结合物;然而这种方法并没有被证明是适用于范围广泛的药物7,8。此外，血脑屏障渗透性开放已经临床使用盟友，但这种方法从全身用药剂量患有而不是一个更直接的传递到感兴趣的9大脑区域。大量的努力已投入在优化直接针对大脑10-12的希望鼻交付。虽然有些已经取得成功的，结论性的结果只获得针对药物具有内源性受体，如胰岛素13,14。此外鼻交付机制一直存在争议证据通过嗅觉神经元摄取或通过血液11暗示间接进入大脑。使用植入导管直接的，经颅传递已经实现，但这一程序具有很强的侵袭，并与众多的并发症15,16关联。迄今为止，不存在一般的微创方法，以提供高分子量的化合物进入脑。
本文中所呈现的是一种鼠的外科手术创建与大脑半透界面。这是通过移植粘膜外植体17以上的小鼠外科开颅缺陷来实现的。使用此程序它已经表明，可溶性化合物高达500 kDa的可递送到中枢神经系统（直接进入脑实质以及进入脑脊液）在两个时间和分子量依赖性方式18。绕过血脑屏障这种方法是一款型号为颅底缺损修复的人类，它使用血管黏膜瓣下鼻内镜手术19,20修复颅骨孔。
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Protocol
手术前一定要完成所有的程序是由IACUC和任何其他道德或法律部门批准，并使用人性化的动物治疗的做法。这包括使用无菌手术条件下，采用IACUC批准的方法麻醉小鼠，在手术过程中润滑老鼠的眼睛兽医药膏，并提供术后护理。不进行手术，如果有程序方面是否批准的任何问题。在此进行的所有程序批准了美国波士顿大学实验动物管理和使用委员会。
动物1。制备和手术用品
- 高压灭菌的所有外科手术器械，将在手术过程中使用。
- 确保所有要被执行的技术由动物监管机构的批准。
对黏膜移植2。收获
- 之所以选择年龄相仿的基因相同的鼠标实验小鼠和安乐死它在IACUC批准的方法（这里：异氟醚窒息颈椎脱位）。
- 用手术剪，去掉周围的鼻鼠标头部露出头骨区域的皮肤。
- 用风钻，标记与三行其中的两个横向侧接鼻区域和三分之一在与垂直于连接两个线对眼睛线。
- 以鼻中隔与周围组织分开向下钻取腹侧。较宽的路径将防止损坏粘膜然而它也将使其更难以分离的膜。窄馏分接近中线建议。
- 用剪刀剪开隔膜免于粘附到它的任何组织，并将其存储在无菌含盐溶液。此时的接枝可以被清理以除去任何已连接的组织。理想的情况是有完好的粘膜暴露在软骨隔膜的两侧。一克船尾可以提供膜为两只小鼠中提供的隔膜的表面积是足以覆盖开颅手术位点。建议接枝用于尽可能快地和研究者进行到只要接枝分离步骤3。
黏膜移植的3。手术植入
- 使用标准的无菌鼠外科手术，麻醉和挂载鼠标在体视框。用啮齿动物麻醉机在纯氧约2％异氟醚。
- 固定鼠标在耳酒吧和鼻子座立体定位仪。适用眼药膏眼睛和擦洗头皮与优碘和75％乙醇三轮。无论是使用剪刀或剪的头发，去掉头上的皮毛。暴露颅骨用刀片及平头。进行开颅上面将要给药的脑的位置。例如，当针对纹状体切1.25毫米直径圆孔的颅骨（集中在美联社：1.00毫米; ML：0.88 MM）使用风钻。用无菌生理盐水湿润钻孔区域，使用刀片来去除颅骨。
- 小心地用针的尖端去除硬脑膜。此外，这可以通过应用组织粘合剂的最小量的湿润硬脑膜表面来实现。一旦该层硬化后，用剃刀刀片尖端的横向运动可以用来除去该膜。
- 将粘膜上述脑表面采取特别小心，以保持上皮面朝远离伤口。这最好通过将整个隔膜上以相邻的开颅手术现场用镊子颅骨的表面进行。使用一对外科手术剪刀的尖端，拉膜断软骨和到颅骨和脑表面。不要让膜变干，或与任何吸收材料去碰它。移植物应该慷慨地重叠开颅S的所有骨边缘伊特。
- 覆盖移植物用无菌一块腈。这个作用是防止皮肤的密合性的接枝愈合过程。腈需要足够大以覆盖整个粘膜。如果需要修剪过度膜。避免腈的任何运动，一旦它接触到的接枝接触。
- 收与正在运行的5-0无菌缝合皮肤和让鼠标在进行下一步骤之前恢复3-7天。小心不要扰乱皮肤缝合过程中腈障碍或黏膜移植。
给药溶液4。管理
- 确保麻醉鼠标在立体框架后，切开缝合用剪刀除去周围的头骨多余的皮肤。
- 除去腈屏障和清洁颅骨的表面上。用无菌生理盐水和棉签来清洁该部位，直到移植是可见的。它可能需要削减接枝用剃刀如果已经成长比d大esired表面积。
- 如果实验将超过几天时间，这是明智的植入至少两个骷髅头螺丝，以加强头部植入物。
- 将接枝上面的井，使得边缘与颅骨接触。应用氰基丙烯酸酯粘合剂在井和颅骨之间的交界处。填井用无菌生理盐水和检查，以确保没有泄漏。井从切口注射器针头制成。
- 取适量涂抹于颅骨骨水泥来固定准备就绪。
- 从井用吸管除去盐水。洗好几次，以确认粘合剂不被泄露。添加所需的解决方案;在这种情况下，加入50μl荧光葡聚糖的使用。预期类似的极性的水溶性化合物会表现一样葡聚糖。递送疏水性化合物或悬浮液尚未探索用这种方法。
- 通过使用一块圆形腈固定在盖上井的顶部页首使用氰基丙烯酸酯胶粘剂。确保粘接不来与良好的内容接触。
5，分析粘膜递送的
- 经过所需的时间量已经过去，麻醉小鼠，并用伊文思蓝染料的溶液交换以及内容。这种染料是用来验证该接枝是完整的。
- 30分钟后，麻醉小鼠重，除去染料溶液，并且通过断头安乐死。
- 手动移除植入物及手术用剪刀取出大脑。请小心将移植物到位。
- 一旦去除，闪光冻结大脑中的异丁烷的溶液冷却在干冰浴中。
- 嵌入在大脑最佳切削温度（OCT）解决方案和切片在50微米。
- 直接将所需的切片在显微镜载玻片上。
- 图片只要华侨城解决方案已经干涸使用荧光显微镜切片。
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Representative Results
获得足够大的鼻中隔外植体是用于随后的步骤是至关重要的。这可以通过在该位置上， 如图1a中所示的供体小鼠的颅骨钻孔来完成。沿着这条路径切割将产生足够大小的外植体， 如图1b所示 。如果钻孔深度不够深，移植将被截断，这将是很难获得足够大的膜覆盖大脑表面。多钻横向比建议的路径是不妥当的，因为更多的组织会留在鼻中隔，下一个步骤将是更加困难。之前粘膜的转移，需要清洁所有过量结缔组织的隔膜的表面上。一旦这样做，粘膜应该是可见的软骨表面上， 图1c示出什么样的组织的样子清洗后。
在此之前转移MEMBRANE，开颅手术和durotomy需要被执行以暴露脑表面。只有在后durotomy出血停止可将膜转移。 图2a显示手术部位应该是什么样子继续下一步骤之前。从软骨转移粘膜上脑表面是技术上最有挑战性的步骤在整个手术过程中，应该仔细地进行。如果收获的隔膜是够大，粘膜移植物的表面面积应足够大，以覆盖大脑表面。一旦被转移，手术区应该看起来类似于在图2b。以确保其是与软骨接触该膜的一侧是同一个，其与脑表面接触是很重要的。如果膜被翻转或折叠在本身，它应该被丢弃，另一个应该被使用。当这一步完成后，头皮可缝合使鼠标可以恢复和移植可以治愈。为了防止从接枝来与头皮的内表面接触的任何不良反应，一块保护腈应放在上面到外科手术部位。 如图2c所示 ，该插入件应当足以覆盖膜大，但不能大到足以阻碍缝合皮肤闭合。
在恢复期间，在增长的实质组织发生周围的骨膜有加药膜之前被删除的。重启头皮后，无菌棉签和盐溶液将需要用来清洁站点，直到它看起来类似于在图3a。我们还没有观察到任何实质性的免疫反应;然而，这还没有得到证实组织学。接枝，可能需要用剃刀切割，如果它已在整个颅骨的表面生长。在这个阶段将包含给药溶液井tion应上面的移植植入。几个骷髅头螺丝可以放在这一步，如果植入物的长期机械稳定性是一个问题。确保良好的定位使得它不接触接枝。一旦到位，氰基丙烯酸酯粘合剂可应用于它粘附到颅骨。为了防止粘合剂从即将与应施加到井的表面，并且向下推，以密封间隙的接枝接触。一旦井是安全的，应该暂时用生理盐水既水合物移植物填充，并检查是否有泄漏。附着以及看起来应该像图3b和 解 应该清楚的表明它不包含任何粘合剂。任何泄漏将是显而易见的，因为在阱中的液位会下降。如果发现泄漏，他们需要被固定更胶粘剂。井，然后用骨水泥加固。此时，在阱的盐水可以用移液管去除和与所需的给药溶液代替。当用一块腈关心的覆盖良好，应采取以确保粘合剂不会接触在孔中的溶液。在整个过程结束时，鼠标头部看起来应该像图3c所示。骨水泥稍半透明，因此，如果良好的内容是光敏感的，染料或墨水，可以加入到干燥的水泥的表面，或在水泥混合物中，以防止井内容降解。
的等待时间的所需时间后，大脑进行分析，发现该剂量的影响。大脑应该区别对待根据什么加以审查。如果该程序的目的是分析向孔中加入任何化学品，（如在上面的协议部分中所述）存在下，那么建议做脑的闪光冷冻保存给药的化合物， 图4 >示出了使用这种方法的有代表性的结果。具有40 kDa的荧光聚合物（tetramethyrhodamine结合的葡聚糖），24小时给药显示进入脑组织明显的扩散。我们以前的结果与葡聚糖显示扩散进入脑组织是在时间和分子量依赖性18。更小的分子扩散到脑实质在更大程度上比大的和一个较大的给药时间的结果在扩散量越大对于我们测试了所有的分子量。如果急速冷冻是为了安装幻灯片切片后，而不是将其暴露在任何解决方案是非常重要的。任何液体会溶解施用化合物和整个脑切片的表面区域扩散它。如果免疫组化，以对脑部进行，那么建议灌注小鼠固定脑组织。
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图1。鼻中隔收获过程的图像。 a）钻井工地上的安乐死鼠标头骨的位置。虚线表示的周长后直接手术切除。c）去除多余的组织后，鼻中隔钻B）的鼻中隔。 点击这里查看大图。
图2的移植过程中外科图像。 A）在手术部位以下的开颅手术和durotomy。该图像代表整个颅骨应该是什么样子后，它把移植前到开颅手术部位的黏膜移植物B）放置。虚线表示的接枝的周长。该图像显示了保护屏障腈的移植。C）植入所需的表面积。该材料作为显示的大小足以覆盖移植大，但没有大到足以干扰缝合。 点击这里查看大图。
图3的药物给药方法的手术图像。什么样的愈合黏膜移植看起来像下面的手术部位B）以及附着在头骨图像的严格清洗A）的一个例子。头骨和良好的接口固定用氰基丙烯酸酯类粘合剂和阱充满无菌生理盐水。的稳定的溶液级表示没有从井泄漏和溶液的澄清度表示没有混入粘合剂。℃）完成手术的图象的溶液。阱包含给药溶液和牢固地封端的丁腈屏障。骨水泥在地方僵化井注入。 点击这里查看大图。
图4。小鼠脑切片下列经粘膜给药具有40 kDa的四甲基罗丹明标记的葡聚糖24小时的荧光显微镜图像。切片采取了-1.06毫米囟门的厚度为501，M。粘膜接枝是可见的脑的表面上。巴= 1毫米。 点击这里查看大图。
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Discussion
本文所描述的过程中最困难的步骤是一个足够大的粘膜的成功转移到脑表面。这一步是由显著容易，如果收获的鼻中隔足够大，打扫好。如果隔膜的腹侧部分被截断，应获得一个新的移植物。钻孔角度应垂直于鼠标头，以确保粘膜不被钻头损坏。如果宽度大于推荐钻孔通道被接便更难除去，其连接到该隔膜的额外的组织。任何大块的结缔组织应该用锋利的剪刀割伤，而不是试图拉他们松被删除。较小的部分，组织可以通过与所提供的组织是不连接到所述粘膜的剪刀的尖端刮削除去。在清洁过程结束时，软骨表面仍然附着在膜予以曝光。 OCCAsionally鼻中隔软骨可能成为从它连接到在背边缘的骨分离。如果发生这种情况，仍然有可能使用于下一步骤但是它是有两个原因更具挑战性。骨是一种方便的把手清洗和转移它何时举行外植体。一旦取消，这是很难操纵更加细腻的软骨片。其次，软骨，骨交界处，是那里的黏膜是最厚和最简单的软骨取出时获得。如果骨是由软骨切断膜的这一部分会丢失。
一旦隔接枝已清洗和开颅和durotomy已经执行，粘膜可以被放置在暴露的脑表面。这最好通过将相邻的开颅手术现场的外植体来实现的。膜然后可以从软骨拉动时，到头骨，并在大脑中。很多事情都可以在这个PROCES出问题秒。该膜可以干出，得到撕裂，褶皱之上的，或是聚成一团。也膜覆盖隔膜的另一侧可以从摩擦头骨被损坏。它也有可能是在试图取出朝上的粘膜，1删除从两侧的膜在同一时间。为了防止这些问题的关键是要移动的膜慢慢地和经常观察隔膜的两侧。最好的策略是使用剪刀的技巧，试图将其滑出前由软骨板打跑膜。如果膜的任何部分仍然附着，这是可能的，组织的弹性将拉动它之后缩回。通过使用小型，揪着运动的膜可以从隔分离。只有这样，很容易滑落。膜过薄，以便能够利用镊子进行处理;它只能拉出从一个表面到另一个。如果它被翻转或折叠的本身，它应该被丢弃，并应得到另一个。
如果接枝覆盖暴露脑的整个表面区域，该方法是成功的，头皮可缝合，以使手术部位可以治愈。丁腈屏障，必须落实到位，使肌肤不来与膜接触。必须注意，这样的压力对丁腈缝合，否则移植物位置可以移动时不会产生。另外要注意不要缝合成腈。以确保材料服从的最好方法是用生理盐水保持湿润，并确保它在整个缝合保持平坦。
一旦接枝已经愈合（3-7天）以及含有该给药方案可以附着在移植物上面的头骨。它可以暂时用骨水泥固定与粘接胶的头骨，久治不愈。一旦骨粘固剂被应用，这将是不可能进行任何修改到井位置therefo重新优化都必须事先到其应用程序来完成。一旦井是在位置和就位用氰基丙烯酸酯粘接剂，保持，它应该充满无菌生理盐水。如果该过程已成功完成的液面不会改变，该解决方案将被清除。如果有泄漏，水平就会下降和那里的水逃脱的位置应该是可见的。在泄漏部位施加更多的粘合剂后，更盐水应加以验证泄漏密封。如果粘合剂污染了良好的解决方案，一个半透明的薄膜将是可见的液面的上方。如果发生这种情况，以及应洗涤数次，用盐水，直至溶液澄清。另外，棉交换可以使用它触及到液体表面以除去膜。只有当井溶液是稳定的，应明确的水泥被应用。当水泥干后，从井中的盐水可以去掉并用给药溶液代替。应注意，以当移液流入和流出的井不会损坏该膜。一旦充满，井的顶部应密封使用氰基丙烯酸酯胶粘剂一块腈。重要的是，空间保留在溶液的表面和良好的顶部之间。这将确保对丁腈屏障将在粘接剂不接触解决方案。
一旦它的时间来分析计量过程的影响，大脑必须拆除并成像。如果免疫组化将被执行，标准灌注和抗体染色可以做到的。如果给药的化合物的位置将被确定，则建议闪烁冻结脑在干冰/异丁烷溶液。这将确保在脑切片的化合物的位置，因为它是前立即安乐死相同。
本文所描述的协议描述了一种方法，通过外科手术来调查药物递送到小鼠的大脑嫁接半透粘膜18。这类似于在人类鼻腔肿瘤切除手术，其中颅底缺陷被修复带血管鼻腔粘膜19,20的结果。利用这种小鼠模型，现在可以研究这些黏膜瓣如何能够绕过血脑屏障，并允许直接超高分子量药物输送到大脑。现在我们已经完成这个过程了100倍。至关重要的这个过程是从供体小鼠一鼻中隔移植物的成功的收获和粘膜的从接枝转移到测试小鼠。此过程中，第一次，使高分子量的治疗剂用于各种神经和精神障碍的临床前试验。
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Disclosures
本杰明·S. Bleier博士是药物输送到中枢神经系统的临时专利覆盖方法铅的发明者。
Acknowledgments
这项研究是由该Mcihael J.福克斯基金会帕金森研究2011年快速响应创新奖励计划。资助者在研究设计，数据收集和分析，发布的决定，或准备稿子没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
| Drill bit | |||
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
| Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
| Eye ointment | |||
| Electric shaver | |||
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
| Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
| 5-0 Nylon suture thread | |||
| Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
| Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
| Dry ice |
References
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