Heterotopic muqueuse procédure de greffe de médicaments Livraison directe au cerveau chez les souris

Summary

Un modèle de souris de la reconstruction de la base du crâne humain endoscopique a été développé qui crée une interface semi-perméable entre le cerveau et le nez en utilisant des greffes muqueuses nasales. Cette méthode permet aux chercheurs d'étudier à la livraison du système nerveux central de la thérapeutique de haut poids moléculaire qui sont par ailleurs exclus par la barrière hémato-encéphalique lorsqu'il est administré par voie systémique.

Abstract

Livraison d'agents thérapeutiques dans le cerveau est entravée par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui restreint le passage de composés polaires et de haute masse moléculaire et de la circulation sanguine dans le tissu cérébral. Certains succès de livraison directe chez l'homme a été atteint par l'implantation de cathéters transcrânienne; Cependant cette méthode est très invasive et associée à de nombreuses complications. Une alternative moins invasive consiste à doser le cerveau à travers un implanté chirurgicalement, la membrane semi-perméable telle que la muqueuse nasale qui est utilisé pour réparer des défauts de la base du crâne après la chirurgie endoscopique transnasale tumorale d'élimination chez les humains. transfert des médicaments bien que cette membrane serait effectivement contourner la BBB et diffuser directement dans le cerveau et le liquide céphalorachidien. Inspiré par cette approche, une approche chirurgicale chez la souris a été développée qui utilise une membrane muqueuse septale donneur greffé sur un défaut chirurgical Bureau extra. Ce modèle a été démontré efficacementpermettre le passage de composés de haut poids moléculaire dans le cerveau. Depuis de nombreux médicaments candidats sont incapables de traverser la BHE, ce modèle est utile pour effectuer des essais précliniques de nouveaux traitements pour les maladies neurologiques et psychiatriques.

Introduction

Le traitement d'une maladie neurologique ou psychiatrique est gravement entravée par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui empêche plus de 95% de tous les agents pharmaceutiques potentiels d'atteindre le système nerveux central ^1-3. Par exemple, il a été démontré dérivé des cellules gliales facteur neurotrophique (GDNF) pour être efficace dans le traitement de la maladie de Parkinson lorsqu'il est injecté directement dans le cerveau, mais est inefficace lors de la livraison systémique parce qu'il ne peut pas pénétrer dans le ^4-6 du Bureau.

Nombreux approché ont été développées pour tenter de contourner ce problème. L'amélioration de l'administration systémique de neurotheraputics a été démontrée à l'aide de conjugués médicament contenant des anticorps sélectifs pour des protéines de transport situés sur l'endothélium capillaire cérébral; Mais cette méthode n'a pas été montré pour être applicable à une large gamme de produits pharmaceutiques ^7,8. En outre, l'ouverture osmotique du Bureau a été utilisé cliniqueallié, mais ce procédé souffre d'un dosage systémique du médicament, par opposition à une livraison plus direct vers la région du cerveau d'intérêt ^9. Des efforts considérables ont été mis en optimisation de la prestation transnasal dans l'espoir de cibler directement le cerveau ^10-12. Bien que certains succès ont été réalisés, des résultats probants ont été obtenus seulement pour les médicaments qui possèdent des récepteurs endogènes, tels que l'insuline ^13,14. En outre, le mécanisme de livraison transnasal a été controversée des preuves suggérant entrée indirecte dans le cerveau via l'absorption de neurone olfactif ou par la circulation sanguine ^11. , Livraison transcrânienne directe en utilisant des cathéters implantables ont été réalisés, mais cette procédure est très invasive et associée à de nombreuses complications ^15,16. A ce jour, il n'existe pas de méthode générale, peu invasive pour délivrer des composés de poids moléculaire élevé dans le cerveau.

Présenté ici est une procédure chirurgicale murinqui crée une interface semi-perméable avec le cerveau. Ceci est réalisé en greffant un explant de membrane muqueuse ¹⁷ sur un défaut de craniotomie chirurgicale chez une souris. En utilisant cette procédure, il a été montré que les composés solubles allant jusqu'à 500 kDa peuvent être délivrés dans le système nerveux central (directement dans le parenchyme du cerveau ainsi que dans le liquide céphalo-rachidien) à la fois dans le temps et d'une manière dépendante de la masse moléculaire ^18. Cette méthode de contourner le Bureau est un modèle pour les réparations de défauts de la base du crâne chez l'homme qui utilise des greffons vascularisés muqueuses pour réparer les trous dans le crâne après la chirurgie endoscopique transnasal ^19,20.

Protocol

Avant la chirurgie assurez-vous que toutes les procédures à effectuer sont approuvés par IACUC et des autorités éthiques ou juridiques supplémentaires et utilisent des pratiques de traitement sans cruauté des animaux. Cela comprend l'utilisation des conditions de chirurgie stériles, anesthésier la souris en utilisant IACUC méthode approuvée, la lubrification des yeux de souris avec une pommade vétérinaire pendant la chirurgie, et fournir des soins post-opératoires. Ne pas procéder à une chirurgie s'il ya une question de savoir si les aspects de la procédure sont approuvés. Toutes les procédures effectuées ici ont été approuvés par l'Université institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité Boston.

1. Préparation des animaux et fournitures chirurgicales

1. Autoclave tout instrument chirurgical qui sera utilisé au cours de la chirurgie.
2. Assurez-vous que toutes les techniques qui doivent être effectués sont approuvés par les organismes de réglementation animaux.

2. Récolte de la muqueuse du greffon

1. Choisissez une souris génétiquement identiques du même âge quela souris expérimentales et euthanasier dans une méthode IACUC approuvé (ici: l'asphyxie isoflurane suivie par dislocation cervicale).
2. Avec des ciseaux chirurgicaux, enlever la peau autour de la région nasale de la tête de la souris exposer le crâne.
3. Avec une perceuse pneumatique, marque avec trois lignes de deux qui flanquent latéralement la région nasale et une troisième en ligne avec les yeux qui relie les deux lignes perpendiculairement.
4. Forer vers le bas sur le ventre, afin de séparer la cloison nasale du tissu environnant. Un chemin plus large permettra d'éviter des dommages à la membrane de la muqueuse mais il sera également plus difficile d'isoler la membrane. Une coupe étroite près de la ligne médiane est recommandé.
5. Utilisez des ciseaux pour couper la cloison libre de tout tissu adhéré et le stocker dans une solution saline stérile. A cette époque, la greffe peut être nettoyé pour enlever les tissus connecté. La situation idéale est d'avoir des membranes muqueuses endommagées exposés des deux côtés de la cloison cartilagineuse. Un grarrière peut fournir membrane pour deux souris à condition que la surface de la membrane est suffisant pour couvrir les sites de craniotomie. Il est recommandé que la greffe est utilisée le plus rapidement possible et le chercheur passe à l'étape 3 dès que le greffon est isolé.

3. L'implantation chirurgicale de greffe muqueuse

1. Utilisant des procédures standard, aseptiques murins chirurgicales, anesthésier et monter une souris dans le cadre stéréologique. Utilisez environ 2% d'isoflurane dans de l'oxygène pur à l'aide d'une machine d'anesthésie rongeur.
2. Immobiliser la souris dans un appareil stéréotaxique avec des barres d'oreille et un support de nez. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux et frotter le cuir chevelu avec de la bétadine et 75% d'éthanol pendant trois tours. Utilisation de ciseaux ou une tondeuse à cheveux, enlever la fourrure sur la tête. Exposer le crâne avec une lame de rasoir et le niveau de la tête. Effectuer une craniotomie au-dessus de l'emplacement du cerveau qui sera dosé. Par exemple, lorsque vous ciblez le striatum couper un 1,25 mmdiamètre trou circulaire dans le crâne (centré à l'AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) à l'aide d'un marteau-piqueur. Mouiller la zone percée avec une solution saline stérile et utiliser une lame de rasoir pour enlever le crâne.
3. Retirez délicatement la durée à l'aide de la pointe d'une aiguille. En outre, ceci peut être accompli par l'application d'une quantité minimale de colle pour tissus de la surface durale humide. Une fois que cette couche a durci, le déplacement latéral d'une pointe de lame de rasoir peut être utilisé pour retirer la membrane.
4. Placer la membrane de la muqueuse au-dessus de la surface du cerveau en prenant soin extrême afin de maintenir le côté tourné à l'opposé de l'épithélium de la plaie. Ceci est mieux fait en transférant la totalité de la cloison sur la surface du crâne à proximité du site de craniotomie avec des pincettes. Avec la pointe d'une paire de ciseaux chirurgicaux, tirez la membrane hors du cartilage et sur la surface du crâne et du cerveau. Ne laissez pas dessécher la membrane ou de toucher avec n'importe quel matériau absorbant. La greffe devrait généreusement chevaucher tous les bords osseux de la craniotomie site.
5. Couvrir la greffe d'un morceau stérile de nitrile. Ceci agit de façon à empêcher l'adhérence de la peau pour la greffe au cours de la guérison. Le nitrile doit être suffisamment large pour couvrir la totalité de la membrane de la muqueuse. Coupez membrane excessive si nécessaire. Éviter tout mouvement du nitrile une fois qu'il est entré en contact avec le greffe.
6. Fermer la peau avec un 5-0 suture stérile course et laissez la souris récupérer pendant 3-7 jours avant de passer à l'étape suivante. Prenez soin de ne pas perturber la barrière de nitrile ou la greffe de muqueuse lors de la fermeture de la peau.

4. Administration de dosage Solution

1. Après avoir assuré la souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique, couper le fil de suture avec des ciseaux et enlever l'excès de peau autour du crâne.
2. Retirer la barrière de nitrile et de nettoyer la surface du crâne. Utilisez salines et des cotons-tiges stériles pour nettoyer la zone jusqu'à ce que le greffon est visible. Il peut être nécessaire de couper la greffe avec un rasoir si a augmenté plus grande que la desired surface.
3. Si l'expérience sera de plus de quelques jours, il est sage d'implanter au moins deux vis de crâne de renforcer l'implant de la tête.
4. Placer le puits au-dessus de la greffe de sorte que les bords sont en contact avec le crâne. Appliquer l'adhésif à base de cyanoacrylate à la jonction entre le puits et le crâne. Remplir le puits avec une solution saline stérile et assurez-vous qu'il n'y a pas de fuites. Les puits sont fabriqués à partir des aiguilles de seringues coupées.
5. Appliquer la colle d'os sur le crâne d'assurer le bien en place.
6. Retirer la solution saline à partir du puits avec une pipette. Laver les puits à plusieurs reprises pour vérifier que la colle n'a pas divulgué po Ajouter la solution désirée; dans ce cas, 50 pi de dextran fluorescent est utilisé. On s'attend à ce que les composés solubles dans l'eau d'une polarité similaire se comporteront les mêmes que le dextrane. Délivrance de composés hydrophobes ou de suspensions n'a pas été explorée avec cette méthode.
7. Boucher le haut du puits à l'aide d'un morceau circulaire de nitrile obtenu à l'haut avec de la colle cyanoacrylate. Assurez-vous que la colle n'entre pas en contact avec le contenu des puits.

5. Analyse des transmuqueuse

1. Après que la quantité désirée de temps s'est écoulé, anesthésier les souris et échanger les contenus des puits avec une solution de colorant bleu d'Evan. Ce colorant est utilisé pour vérifier que la greffe était intact.
2. Après 30 min, anesthésier la souris lourdement, enlever la solution de colorant, et euthanasier par décapitation.
3. Supprimer manuellement l'implant et retirer le cerveau à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Veillez à maintenir la greffe en place.
4. Une fois retiré, le flash-geler le cerveau dans une solution d'isobutane refroidi dans un bain de glace sèche.
5. Incluez le cerveau dans Optimal Cutting Temperature (OCT) solution et tranche à 50 um.
6. Placer les tranches souhaités directement sur une lame de microscope.
7. L'image de la tranche en utilisant un microscope à fluorescence dès que la solution PTOM ne s'est séché.

Representative Results

L'obtention d'un assez grand cloison nasale explant est crucial pour les étapes ultérieures. Ceci peut être réalisé par perçage à l'emplacement sur ​​le crâne de la souris donneuse représenté sur la figure 1a. Coupant le long de ce chemin va produire un explant de la taille suffisante comme le montre la Figure 1b. Si la profondeur de perçage n'est pas assez profond, la greffe sera tronquée et il sera difficile d'obtenir une membrane suffisamment grande pour couvrir la surface du cerveau. Forage plus latéralement que le chemin proposé n'est pas conseillé, car plus de tissu restera sur la cloison nasale, et la prochaine étape sera plus difficile. Avant le transfert de la membrane de la muqueuse, la surface de la cloison doit être nettoyé de tout excès de tissu conjonctif. Une fois cela fait, la membrane muqueuse doit être visible sur la surface du cartilage. Figure 1c montre que le tissu ressemble après le nettoyage.

Avant de transférer la membrane, une craniotomie et durotomie doivent être effectuées afin d'exposer la surface du cerveau. Seulement après la saignée post-durotomie a cessé de la membrane peut être transféré. Figure 2a montre que le site de la chirurgie devrait ressembler avant de continuer à l'étape suivante. Le transfert de la membrane muqueuse du cartilage sur la surface du cerveau est l'étape la plus difficile techniquement de toute la procédure chirurgicale et doit être effectuée avec soin. Si le septum récoltée est suffisamment grande, l'aire de surface de la greffe de muqueuse doit être suffisamment grande pour couvrir la surface du cerveau. Une fois transféré, la zone chirurgicale devrait ressemble à celle de la figure 2b. Il est important de veiller à ce que le côté de la membrane qui est en contact avec le cartilage est le même que celui qui est en contact avec la surface du cerveau. Si la membrane se retourné ou replié sur lui-même, il doit être jeté et une autre doit être utilisé. Une fois que cette étape est terminée, le cuir chevelu peut être suturéede sorte que la souris peut récupérer et le greffon peut guérir. Afin d'éviter les effets indésirables de la greffe à venir en contact avec la surface interne du cuir chevelu, un morceau de nitrile de protection doit être placé au-dessus sur le site chirurgical. Comme le montre la figure 2c, la pièce insérée devrait être suffisant pour couvrir la membrane grande mais pas assez grand pour empêcher la suture la peau fermé.

Au cours de la période de récupération, les tissus en croissance substantielle se produit du périoste environnant qui doit être enlevé avant l'administration de la membrane. Après réouverture du cuir chevelu, des tampons de coton stérile et une solution saline devront être utilisés pour nettoyer le site jusqu'à ce qu'il semble similaire à celle de la figure 3a. Nous n'avons pas observé de réponse immunitaire importante; Mais cela n'a pas été confirmé histologiquement. Le greffon peut être nécessaire de découper avec une lame de rasoir si elle est passée à travers la surface du crâne. A ce stade du puits pour contenir la solution de dosagetion devrait être implantée au-dessus de la greffe. Plusieurs vis du crâne peuvent être mis en à cette étape si la stabilité mécanique à long terme de l'implant est une préoccupation. Assurez-vous que le puits est positionné de telle sorte qu'il ne touche pas la greffe. Une fois en place, l'adhésif à base de cyanoacrylate peut être appliqué à coller sur le crâne. Pour empêcher l'adhésif de venir en contact avec la greffe elle doit être appliquée à la surface du puits et poussé vers le bas pour sceller l'interstice. Une fois que le bien est sécurisé, il doit être comblé de façon temporaire avec une solution saline à la fois hydrate la greffe et vérifier les fuites. Le bien adhéré devrait ressembler à celle de la figure 3b et la solution doit être clair indiquant qu'il ne contient aucune colle. Toute fuite sera évident parce que le niveau de fluide dans le puits va baisser. Si les fuites sont trouvées, ils doivent être fixés avec plus d'adhésif. Le puits est ensuite renforcé avec du ciment osseux. A ce stade, la solution saline dans le puits peut être éliminé avec une pipette etremplacée par la solution de dosage souhaitée. En couvrant le bien avec un morceau de soins de nitrile devraient être prises pour s'assurer que l'adhésif ne touche pas la solution dans le puits. A la fin de la procédure, la tête de la souris devrait ressembler à celle de la figure 3c. Le ciment osseux est donc légèrement translucide si le contenu du puits sont sensibles à la lumière, un colorant ou une encre peuvent être ajoutés à la surface du ciment en poudre ou au mélange de ciment pour éviter la photodégradation du contenu des puits.

Après la période désirée de temps d'attente, le cerveau doit être analysé pour découvrir les effets de l'administration. Le cerveau doit être traité différemment en fonction de ce qui est en cours d'examen. Si le but de la procédure est d'analyser la présence de tout produit chimique ajouté au puits, (tel que décrit dans la section du protocole ci-dessus), alors il est recommandé d'effectuer une congélation flash du cerveau pour préserver les composés administrés. Figure 4 > Affiche un résultat représentatif de l'utilisation de cette approche. La prise avec un polymère fluorescent 40 kDa (dextrane conjugué tetramethyrhodamine) pendant 24 heures montre diffusion notable dans le tissu cérébral. Nos résultats précédents avec spectacle diffusion dextran dans le tissu cérébral est à la fois le temps et le poids moléculaire dépend ^18. Les petites molécules diffusent dans le parenchyme du cerveau dans une plus grande mesure que les plus grandes, et un plus grand temps de résultats de dosage d'une quantité plus importante de diffusion pour tous les poids moléculaires que nous avons testées. Si la congélation instantanée est fait, il est important de monter les diapositives après la coupe et ne pas les exposer à une solution. Tout liquide se solubiliser le composé administré et de le diffuser à travers la surface de la tranche de cerveau. Si l'immunohistochimie doit être exécutée sur le cerveau, il est recommandé de perfuser la souris pour fixer le tissu cérébral.

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Figure 1. Images de la cloison nasale procédure de récolte. A) L'emplacement du site de forage sur le crâne d'une souris euthanasiées. Les lignes pointillées indiquent le périmètre à percer. B) La cloison nasale directement après l'ablation chirurgicale. C) La cloison nasale après avoir enlevé l'excès de tissu. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2. Des images chirurgicales du processus de prise de la greffe. A) Le site chirurgical suivant craniotomie et durotomie. L'image est représentatif de ce que le crâne devrait ressembler avant de placer la greffe sur elle. B) Placement de la greffe de muqueuse sur le site de craniotomie. La ligne en pointillés indique le périmètre de la greffe. L'image montre la surface spécifique souhaitée de la greffe. C) Implantation de la barrière de nitrile de protection. La taille de la matière comme le montre est suffisant pour couvrir la greffe grande mais pas assez grand pour interférer avec suture. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3. Des images chirurgicales du processus médicament de dosage. A) Un exemple de ce que la greffe de muqueuse guéri ressemble après un nettoyage rigoureux du site chirurgical. B) de l'image de bien attaché au crâne. L'interface du crâne et bien est fixéavec de la colle cyanoacrylate et le puits est rempli avec une solution saline stérile. Le niveau de solution stable indique aucune fuite provenant du puits et de la clarté de la solution indique une absence de contamination de la solution avec l'adhésif. C) L'image de la chirurgie terminée. Le puits contient la solution de dosage, et est solidement coiffé avec une barrière de nitrile. Le ciment osseux est en place pour rigidifier l'implant de puits. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4. L'image du microscope à fluorescence d'une tranche de cerveau de souris après muqueuses dosage avec 40 kDa tétraméthylrhodamine dextran conjugué pendant 24 heures. L'tranche a été prise à -1,06 mm bregma avec une épaisseur de 501; m. La greffe de muqueuse est visible sur la surface du cerveau. Bar = 1 mm. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Discussion

L'étape la plus difficile de la procédure décrite ici est la réussite du transfert d'une membrane muqueuse de taille adéquate sur la surface du cerveau. Cette étape est faite beaucoup plus facile si la cloison nasale récolté est assez grand et bien nettoyée. Si la partie ventrale de la cloison est tronqué, une nouvelle greffe devrait être obtenu. L'angle de perçage doit être perpendiculaire à la tête de la souris pour faire en sorte que la membrane de la muqueuse n'est pas endommagé par le foret. Si un chemin de perçage plus large que celle recommandée est prise, il sera beaucoup plus difficile de retirer le tissu supplémentaire qui est relié à la cloison. Les gros morceaux de tissu conjonctif doivent être enlevés avec des coupes de ciseaux pointus plutôt que de tenter de les tirer lâche. Les petits morceaux de tissu peuvent être enlevées par raclage avec les pointes des ciseaux fourni le tissu n'est pas relié à la membrane de la muqueuse. A la fin de l'opération de nettoyage, la surface du cartilage avec la membrane doit toujours attaché à être exposé. Occaprovisoirement le cartilage de septum peut se détacher de l'os qui est connecté à au bord dorsal. Si cela arrive, il est encore possible de l'utiliser dans l'étape suivante, il est cependant plus difficile pour deux raisons. L'os est une poignée pratique pour maintenir l'expiant lors du nettoyage et de la transférer. Une fois retiré, il est plus difficile à manœuvrer la feuille de cartilage plus délicate. Deuxièmement, la jonction cartilage-os est où la membrane muqueuse est la plus épaisse et la plus facile à obtenir lorsque l'enlever du cartilage. Si l'os est séparée de la portion de cartilage cette membrane est perdue.

Une fois le greffage du septum a été nettoyé et la craniotomie et durotomie ont été effectués, la membrane de la muqueuse peut être placé au-dessus de la surface exposée du cerveau. Le mieux est accompli en positionnant l'explant adjacente au site de craniotomie. La membrane peut alors être tiré à partir de cartilage, sur le crâne, et sur le cerveau. Beaucoup de choses peuvent mal se passer au cours de ce procèss. La membrane peut se dessécher, se déchirer, plier sur elle-même, ou en bouquet. En outre la membrane recouvrant l'autre côté de la cloison peut être endommagé de frotter contre le crâne. Il est également possible que, dans la tentative de retirer la membrane de la muqueuse tournée vers le haut, on enlève les membranes des deux côtés en même temps. Afin d'éviter tous ces problèmes, il est crucial pour déplacer la membrane lentement et toujours observer les deux côtés de la cloison. La meilleure stratégie est d'utiliser les pointes des ciseaux pour déloger la membrane de la feuille de cartilage avant d'essayer de le faire glisser hors. Si une partie de la membrane reste fixée, il est possible que l'élasticité du tissu se rétracte après avoir tiré sur elle. En utilisant de petits mouvements tiraillements de la membrane peut être détachée de la cloison. C'est alors seulement qu'il glisser facilement hors tension. La membrane est trop mince pour pouvoir être manipulé avec des pincettes; il ne peut être tiré d'une surface à l'autre. Si elle est retourné ou replié sur lui-même, ildoit être mis au rebut et une autre doit être obtenue.

Si la greffe recouvre toute la zone de surface exposée du cerveau, le procédé a réussi et le cuir chevelu peut être suturée de façon que le site de la chirurgie peut guérir. Une barrière de nitrile doit être mis en place afin que la peau n'entre pas en contact avec la membrane. Des précautions doivent être prises pour que la pression n'est pas exercée sur le nitrile lors de la suture par ailleurs la position de la greffe peut se déplacer. Prenez également soin de ne pas suturer en nitrile. La meilleure façon de s'assurer que le matériau obéit est de le garder humide avec une solution saline et s'assurer qu'il reste stable tout au long de la suture.

Une fois que la greffe a guéri (3-7 jours), le puits contenant la solution de dosage peut être fixé sur le crâne au-dessus de la greffe. Il peut être fixé temporairement sur le crâne avec de la colle et la colle de façon permanente par du ciment osseux. Une fois que le ciment osseux est appliqué, il ne sera pas possible d'apporter des corrections à la position de bien therefore tout l'optimisation doit être effectuée avant son application. Une fois que le puits est en position et maintenu en place avec de la colle cyanoacrylate, il doit être rempli avec une solution saline stérile. Si la procédure a été effectuée avec succès le niveau de liquide ne changera pas et la solution doit être limpide. S'il y a une fuite, le niveau va baisser et la localisation de l'endroit où l'eau s'est échappé doit être visible. Après l'application de plus d'adhésif sur le site de la fuite, et plus saline doit être ajouté pour vérifier que la fuite a été scellé. Si l'adhésif contamine la solution de bien, un film translucide sera visible en haut du niveau de fluide. Si cela se produit, le bien doit être lavé plusieurs fois avec une solution saline jusqu'à ce que la solution est claire. En outre, un tampon de coton peut être utilisé pour retirer le film en le touchant à la surface du liquide. Ce n'est que lorsque la solution est bien stable et claire doit être appliquée le ciment. Lorsque le ciment est sec, la solution saline à partir du puits peut être retirée et remplacée par la solution de dosage. Il faut veiller àpas endommager la membrane lors du pipetage dans et hors du puits. Une fois rempli, le haut du puits doit être fermé avec un morceau de nitrile en utilisant un adhésif à base de cyanoacrylate. Il est important que l'espace est laissé entre la surface de la solution et la partie supérieure du puits. Cela garantira que la colle ne touche pas la solution lors de la mise à la barrière de nitrile.

Une fois qu'il est temps d'analyser l'effet de la procédure de dosage, le cerveau doit être enlevé et imagée. Si l'immunohistochimie doit être effectuée, et la perfusion d'anticorps coloration standard peut être fait. Si l'emplacement du composé dosé doit être déterminée, il est recommandé à clignoter geler le cerveau dans une solution de glace / isobutane sec. Cela permet de s'assurer que l'emplacement du composé dans les tranches de cerveau est le même que celui immédiatement avant l'euthanasie.

Le protocole décrit ci-après décrit une méthode pour étudier l'administration de médicaments au cerveau de la souris au moyen d'un chirurgicalementgreffé membrane semi-perméable ¹⁸ de la muqueuse. Ceci est analogue à l'issue de l'opération de suppression de tumeur transnasale chez l'homme dans lequel des défauts de la base du crâne sont réparées avec une membrane muqueuse nasale ^19,20 vascularisée. En utilisant ce modèle de souris, il est désormais possible d'étudier comment ces greffes muqueuses sont capables de contourner la BBB et permettant une délivrance directe de haut poids moléculaire du médicament au cerveau. Nous avons maintenant effectué cette procédure plus de 100 fois. Crucial de cette procédure est la récolte d'une greffe réussie du septum nasal à partir d'une souris donneuse et le transfert de la membrane muqueuse de la greffe sur la souris d'essai. Cette procédure, pour la première fois, permet le test préclinique de la thérapeutique de haut poids moléculaire pour une variété de troubles neurologiques et psychiatriques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice