Summary
인간의 내시경 두개골 바닥 재건의 마우스 모델은 코 점막 이식을 사용하여 뇌와 코 사이의 반투과성 인터페이스를 만듭니다 개발되었다. 이 방법은 연구자가 체계적으로 관리, 그렇지 않으면 혈액 - 뇌 장벽에 의해 제외되는 고 분자량 치료제의 중추 신경계에 전달을 연구 할 수 있습니다.
Abstract
뇌에 치료제의 전달은 혈액으로부터 뇌 조직으로 극성 및 고 분자량 화합물의 통과를 제한하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)의 존재에 의해 방해된다. 인간의 일부 직접 배달 성공은 두개의 카테터 주입을 통해 달성되었다; 그러나이 방법은 고도의 침략과 수많은 합병증과 관련이 있습니다. 보다 적게 침략적인 대안은 인간의 내시경 transnasal 종양 제거 수술 후 두개골 바닥 결함을 수리하는 데 사용되는 코 점막 등의 이식 수술, 반투막을 통해 뇌를 투약하는 것입니다. 하지만 약물 전달이 막 효과적으로 BBB를 무시하고 뇌와 중추 신경계에 직접으로 확산 될 것이다. 이 방법에 의해 영감을, 마우스의 수술 방법은 extracranial 수술 BBB 결함에 접목 기증자 중격 점막을 사용하는 개발되었다. 이 모델은 효과적으로 표시되었습니다뇌에 고 분자량 화합물의 통과를 허용한다. 많은 약물 후보가 BBB를 횡단하는 능력이 있기 때문에,이 모델은 신경 및 정신 질환에 대한 새로운 치료법의 전임상 시험을 수행 할 가치가있다.
Introduction
신경 및 정신 질환의 치료는 심각한 중추 신경계 1-3에 도달하는 모든 잠재적 약제의 95 % 이상을 방지 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)의 존재에 의해 방해된다. 예를 들어, 신경교는 신경 친 화성 인자 (GDNF)를 파생은 BBB 4-6을 관통 할 수 없기 때문에 전신적 전달되는 경우에는 비효율적이다, 뇌에 직접 분사하면 파킨슨 병의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다.
수많은 접근이 문제를 회피하는 것을 시도하기 위해 개발되었다. neurotheraputics의 전신 배달의 개선은 뇌의 모세 혈관 내피 세포에있는 수송 단백질에 대한 선택적인 항체를 포함하는 약물 접합체를 사용하여 증명되었다; 그러나이 방법은 의약품 7,8의 광범위한 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 또한, BBB의 삼투압 개방 병원에 사용 된또한 9의 뇌 영역에 대한보다 직접 배달에 반대 동맹, 그러나이 방법은 전신 약물 투여에서 겪고있다. 상당한 노력이 직접 뇌 10-12을 대상으로의 희망에 transnasal 전달을 최적화에 투입되었습니다. 약간의 성공이 달성되었지만, 결정적인 결과는 인슐린의 13, 14 등의 내생 적 수용체를 가지고 의약품에 대한 얻어졌다. 또한 transnasal 전달의 메커니즘은 후각 신경 세포의 흡수를 통해 또는 혈류 (11)를 통해 뇌에 간접적 인 항목을 제안 증거가 논란이되었습니다. 이식 카테터를 사용하여 직접, 두개 배달 그러나이 절차가 매우 침략과 수많은 합병증 (15, 16)와 연결되어, 달성되었습니다. 지금까지 뇌에 고분자 화합물을 제공하는 일반적인 침습적 방법이 없다.
쥐의 수술은 여기에 있습니다 발표즉, 뇌와 반투과성 인터페이스를 만듭니다. 이것은 마우스의 수술 적 개두술의 결함을 통해 점막 이식편 17 engrafting하여 수행됩니다. 이 절차를 사용하여 500 kDa의 최대 가용성 화합물은 시간과 분자량 의존적 (18) 모두에서 중추 신경계 (직접 뇌 실질에뿐만 아니라 뇌척수액에)에 전달 될 수있는 것으로 나타났습니다. BBB를 우회하는이 방법은 transnasal 내시경 수술 19, 20 다음의 두개골에 구멍을 복구하는 혈관 점막 이식을 사용하여 인간의 두개골 바닥의 결함 수리를위한 모델이다.
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Protocol
수술에 앞서 수행되는 모든 절차가 IACUC 및 추가 윤리적 또는 법적 당국의 승인을 인간 동물의 치료 방법을 사용하고 있는지 확인합니다. 이것은 불임 수술 조건을 사용하여 IACUC이 방법을 승인하여 마우스를 마취, 수술하는 동안 의사의 연고와 마우스의 눈을 윤활 및 수술 후 관리를 제공하는 단계를 포함한다. 절차의 측면이 승인 여부를 질문이있는 경우에 수술을 진행하지 마십시오. 여기에 수행 된 모든 절차는 보스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 동물의 준비 및 외과 용품
- 수술 중에 사용되는 모든 수술 악기를 압력솥.
- 수행 할 수있는 모든 기술이 동물 규제 기관에 의해 승인되어 있는지 확인하십시오.
점막 이식의 2. 수확
- 로 비슷한 나이의 유 전적으로 동일한 마우스를 선택했다실험 마우스 (여기 : 자궁 경부 전위 다음에 이소 플루 란 질식) IACUC 승인 된 방법에 안락사.
- 외과 용 가위를 사용하여 두개골을 노출 마우스 머리의 코 지역 주위의 피부를 제거합니다.
- 옆으로 코 지역과 수직으로 두 줄을 연결하는 눈 라인의 세 번째 측면에 두 세 가지의 라인 공압 드릴, 마크.
- 주변 조직에서 비중격을 분리하기 위해 배쪽으로 드릴 다운. 넓은 경로, 그러나 그것은 또한 더 어렵게 멤브레인을 분리 할 것이다 점막의 손상을 방지 할 것이다. 가까운 중간 선에 좁은 컷을 권장합니다.
- 여기에 부착 된 모든 조직에서 무료로 격막을 절단하고 멸균 식염수에 저장하기 위해 가위를 사용합니다. 이 때 수술이 연결된 조직을 제거하는 청소 할 수 있습니다. 이상적인 상황은 피해 점막 멤브레인 연골 격벽의 양측에 노출하는 것이다. 한 GR선미는 멤브레인의 표면적이 개두 사이트를 커버하기에 충분한 제공이 생쥐위한 멤브레인을 공급할 수있다. 그것은 이식이 가능한 한 빨리 사용하고 연구자가 즉시 이식이 격리로 3 단계로 진행하는 것이 좋습니다.
점막 이식 3. 외과 이식
- 표준, 무균 쥐의 수술 절차를 사용하여, 마취 및 stereological 프레임에 마우스를 탑재합니다. 쥐의 마취 기계를 사용하여 순수한 산소에 약 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 사용합니다.
- 귀 바, 코 홀더 정위 장치에 마우스를 고정시킨다. 눈에 안과 연고를 적용하고 3 라운드에 대한 베타 딘 75 % 에탄올로 두피를 문질러. 가위 나 머리 트리머를 사용하여, 머리에 모피를 제거합니다. 면도날 두개골을 드러내고 헤드 수평. 투여 할 뇌의 위치 위의 개두술을 수행합니다. 예를 들어, 선조체를 타겟팅은 1.25 mm 컷공기 드릴을 사용 :; (0.88 mm ML 1.00 mm AP를 중심으로) 두개골 직경 원형 구멍. 멸균 식염수로 드릴 된 영역을 적시고 두개골을 제거하기 위해 면도날을 사용합니다.
- 조심스럽게 바늘의 끝 부분을 사용하여 경질을 제거합니다. 또한,이 촉촉한 경막 표면 조직 접착제의 최소량을 적용함으로써 달성 될 수있다. 이 층은 경화되면 면도날 팁의 수평 방향 운동은 멤브레인을 제거하는데 사용될 수있다.
- 멀리 상처에 직면 상피면을 유지하기 위해 극도의주의를 복용 뇌 표면 위의 점막을 놓습니다. 이것은 가장 핀셋 개두술 사이트에 인접한 두개골의 표면에 전체 격막을 전송하여 수행됩니다. 수술 가위의 끝 부분을 사용하여 연골의 할인 및 두개골과 뇌 표면에 막을 당겨. 막 건조 또는 흡수 물질과 접촉하지 마십시오. 이식 아낌없이 개두술의 S의 모든 뼈 가장자리를 오버랩한다ITE.
- 니트릴의 살균 조각으로 이식을 커버. 이것은 치유 중에 그래프트에 피부의 부착을 방지하는 역할을한다. 니트릴은 전체 점막을 커버 할만큼 커야 할 필요가있다. 필요한 경우 과도한 막 트림. 그것은 이식과 접촉되면 니트릴의 움직임을 피하십시오.
- 실행 5-0 멸균 봉합사로 피부를 닫고 마우스가 다음 단계로 진행하기 전에 3~7일에 복구 할 수 있습니다. 피부 폐쇄하는 동안 니트릴 장벽 또는 점막 이식을 교란하지 않도록주의하십시오.
분배 솔루션 4. 관리
- 고정대에 마취 된 쥐를 확보 한 후, 가위로 봉합을 잘라 두개골 주위에 여분의 피부를 제거합니다.
- 니트릴 장벽을 제거하고 두개골의 표면을 청소합니다. 이식이 보일 때까지 지역을 청소하는 멸균 식염수 면봉을 사용합니다. D보다 큰 성장하면 면도칼로 이식을 절단해야 할 수도 있습니다표면적 명령 1.
- 실험이 몇 일 이상이 될 경우, 그것은 머리 이식을 강화하기 위해 적어도 두 개의 두개골 나사를 이식하는 것이 현명하다.
- 가장자리가 두개골과 접촉되도록 이식 위의 잘 놓습니다. 잘와 두개골 사이의 교차점에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 멸균 식염수로 잘 입력하고 확인 누출이 없는지 확인하십시오. 웰스는 컷 주사기 바늘 만들어진다.
- 장소에 잘을 확보하기 위해 두개골에 골 시멘트를 적용합니다.
- 피펫으로 우물에서 염분을 제거합니다. 그 접착제가 원하는 솔루션을 추가 인치 유출되지 확인도 여러 번 세탁; 이 경우 형광 덱스 트란 50 μL가 사용됩니다. 이것은 유사한 극성의 수용성 화합물은 덱스 트란과 동일하게 동작 할 것으로 예상된다. 소수성 화합물 또는 현탁액의 배송이 방법으로 탐구되지 않았습니다.
- 고정 니트릴 원형 조각을 사용하여 웰의 상부 캡시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 맨. 접착제가 아니라 내용에 접촉하지 않도록하십시오.
점막 납품 5. 분석
- 원하는 시간이 경과 한 후, 마우스를 마취하고 에반의 청색 염료의 용액으로 웰 내용물을 교환한다. 이 염료는 이식이 손상되었는지 확인하는 데 사용됩니다.
- 30 분 후, 마우스를 심하게 마취 염료 용액을 제거하고, 잘린 통해 안락사.
- 수동으로 임플란트를 제거하고 수술 가위를 사용하여 두뇌를 제거합니다. 장소에 이식 않도록주의하십시오.
- 일단 제거되고, 플래시 동결 이소 부탄의 용액에 뇌는 드라이 아이스 욕에서 냉각시켰다.
- 최적 절단 온도 50 ㎛에서 (10 월) 솔루션과 조각에 뇌를 포함합니다.
- 현미경 슬라이드에 직접 원하는 조각을 놓습니다.
- 이미지 즉시 OCT의 솔루션은 건조되면서 개화 현미경을 사용하여 조각.
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Representative Results
충분히 큰 비중격 이식편을 얻기 후속 단계에 대한 매우 중요합니다. 이것은도 1a에 도시 된 도너 마우스의 두개골에 위치에 드릴에 의해 달성 될 수있다. 그림 1b에서와 같이이 경로를 따라 절단 충분한 크기의 이식편을 생성합니다. 드릴링 깊이가 깊은 충분하지 않은 경우, 그래프트는 잘리고 그 뇌의 표면을 커버하도록 충분히 큰 막을 얻기 어려울 것이다. 이상의 조직 비중격에 남아 있기 때문에 제안 된 경로가 의뢰되지보다 측방 드릴링, 및 다음 단계는 더 어려울 것이다. 종래 점막의 전사로, 격벽의 표면이 모두 과잉 결합 조직 세정 될 필요가있다. 이 작업이 완료되면 점막은 연골의 표면에 볼 수 있어야합니다. 1C는 조직 청소 후 모습을 보여줍니다.
이전 MEMB 전송에RANE은 개두술 및 durotomy은 뇌의 표면을 노출하기 위해 수행해야합니다. 포스트 durotomy 출혈이 멈춘 후에 만 막을 전송할 수 있습니다. 그림 2a는 수술 사이트가 다음 단계로 진행하기 전에 모양을 보여줍니다. 뇌 표면에 연골 점막을 전송하면 전체 수술 중 기술적으로 가장 어려운 단계이며 신중하게 수행해야합니다. 수확 된 격벽이 충분히 큰 경우, 점막 이식편의 표면적은 뇌의 표면을 커버하기에 충분히 커야한다. 일단 전송, 외과 영역은 그림 2b의 그것과 유사합니다. 이것은 연골과 접촉 막의 측면 뇌 표면과 접촉 한 동일한 것을 확인하는 것이 중요하다. 막이 뒤집거나 자체에 접혀되는 경우 폐기해야하고 또 다른 하나를 사용해야합니다. 이 단계가 완료되면, 두피 봉합 될 수있다마우스를 복구 할 수 및 이식 치유 할 수 있도록. 두피의 내면에 접촉 그라프에서 어떤 부작용을 방지하기 위해, 보호 니트릴 매 수술 부위 위에 배치되어야한다. 도 2c에 도시 된 바와 같이, 삽입 부분은 멤브레인을 커버하기에 충분히 큰하지만 피부 폐쇄 봉합 방해 할 정도로 크지 않다이어야한다.
회복 기간 동안의 성장 실질적인 조직 막을 투여하기 전에 제거되어야 둘러싼 골막으로 발생한다. 두피를 재개 한 후, 멸균 면봉과 식염수는 그림 3a에서와 유사하게 나타납니다 때까지 사이트를 청소하는 데 사용되어야합니다. 우리는 어떤 상당한 면역 반응을 관찰하지 않은; 그러나이 조직 학적으로 확인되지 않았습니다. 이식은 두개골의 표면을 가로 질러 성장하면 면도칼로 절단해야 할 수도 있습니다. 이 단계에서 투약 솔루션이 포함됩니다 잘기의 이식보다 이식해야합니다. 임플란트의 장기적인 기계적 안정성이 우려되는 경우 여러 두개골 나사는이 단계에서 넣을 수 있습니다. 그것은 이식을 만지지 않도록 잘가 배치되어 있는지 확인합니다. 일단 대신에 시아 노 아크릴 레이트 접착제는 두개골에 접착제에 적용 할 수있다. 이 웰의 표면에 도포하고 간극을 밀봉하기 위해 하방으로 밀려되어야 그래프트에 접촉으로부터 접착제를 방지한다. 잘가 안전하면, 그것은 모두 수화물에 식염수 이식으로 일시적으로 채워 누수를 확인해야한다. 접착도는 그림 3b에서 그렇게보고해야 용액 어떤 접착제를 포함하지 않음을 나타내는 명확해야한다. 잘 유체 레벨이 하락하기 때문에 누출은 명백 할 것이다. 누수가 발견되면 그들은 더 많은 접착제로 고정 할 필요가있다. 잘은 다음 골 시멘트로 보강된다. 이 시점에서 잘 식염수 피펫으로 제거 될 수있다원하는 투약 솔루션으로 대체. 니트릴 치료의 장으로 잘 커버 할 때 반드시 접착제가 잘 솔루션을 접촉하지 않도록하기 위해주의해야한다. 전체 절차의 끝에서, 마우스 머리도 3c에 그와 같습니다. 웰의 내용물이 감광성 염료 나 잉크가 아니라 컨텐츠의 광분해를 방지하기 위해 건조 시멘트의 표면 또는 시멘트 혼합물에 첨가 될 수있는 경우 골 시멘트 따라서 약간 반투명하다.
대기 시간의 원하는 기간 후에, 뇌의 투약 효과를 발견하기 위해 분석되어야한다. 뇌 검사를 받고 있는지에 따라 다르게 취급되어야한다. 절차의 목적은 웰에 첨가 어떤 화학 (예 : 상기 프로토콜 절에서 설명 됨)의 존재를 분석하는 경우에는 다음이 투여 화합물을 보존하는 뇌의 플래시 동결 할 것을 권장한다.도 4 >이 방법을 사용하는 대표적인 결과를 보여준다. 24 시간 동안 40 kDa의 형광 고분자 (tetramethyrhodamine 복합 덱스 트란)와 함께 투여하면 뇌 조직에 눈에 띄는 확산을 보여줍니다. 뇌 조직에 덱스 트란 쇼 확산과 함께 우리의 이전의 결과는 18 시간과 분자량 모두 의존한다. 작은 분자는 큰 것보다 더 큰 범위에 뇌 실질 조직으로 확산, 그리고 우리가 테스트 한 모든 분자량에 대한 확산의 큰 양의 큰 투약 시간 결과. 플래시 동결이 완료되면 그것은 절편 후 슬라이드를 탑재하고 솔루션에 노출하지 않는 것이 중요합니다. 모든 액체는 관리 화합물을 용해하고 뇌 조각의 표면 영역에 걸쳐 그것을 확산됩니다. 면역 조직 화학 염색은 뇌에서 수행 될 경우 다음은 뇌 조직을 해결하기 위해 마우스를 perfuse하는 것이 좋습니다.
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그림 1. 비중격 수확 절차의 이미지. A) 마우스를 안락사의 두개골에 드릴링 사이트의 위치. 점선 직접 여분의 조직을 제거한 후 제거 수술. C) 비중격 후. B) 비중격을 드릴 경계를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. engrafting 과정의 수술 이미지. A) 개두술 및 durotomy 다음 수술 부위. 이미지는 두개골 전에 그것을 바탕으로 이식하기에 어떻게 보일지 대표개두술 사이트에 점막 이식. B) 배치. 점선은 이식의 경계를 나타냅니다. 콘텐츠 보호 니트릴 장벽 그래프트. C) 주입 원하는 표면적을 나타낸다. 그림과 같이 재료의 크기는 이식을 커버하기에 충분하지만, 봉합을 방해 할만큼 크지 않습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 약물 투약 과정의 수술 이미지. 치유 점막 이식술은 수술 부위 아니라 두개골에 부착 된의. B) 이미지의 엄격한 청소를 다음과 같습니다 무엇 A) 예. 잘 두개골과의 인터페이스는 고정시아 노 아크릴 레이트 접착제와 잘 멸균 생리 식염수로 가득 차 있습니다로. 안정된 솔루션 수준은 잘에서 누출이 없음을 나타냅니다 및 솔루션의 선명도 접착제. C) 완성 된 수술의 이미지 솔루션의 더 오염을 나타냅니다. 잘은 투약 솔루션을 포함하고 안전하게 니트릴 장벽으로 덮인됩니다. 골 시멘트는 잘 임플란트를 견고하게하는 곳입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 24 시간 40 kDa의의 테트라 메틸 복합 덱스 트란과 점막 투여에 따라 마우스의 뇌 조각의 형광 현미경 이미지. 슬라이스 (50)의 두께로 -1.06 mm의 브레 그마에서 찍은1, m. 점막 이식은 뇌의 표면에 볼 수 있습니다. 바 = 1mm. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본원에 기술 된 과정에 가장 어려운 단계는 뇌 표면에 충분히 크기 점막의 성공적인 전송이다. 수확 비중격가 충분하고 잘 청소하는 경우이 단계는 훨씬 쉬워졌다. 격막의 복부 부분이 잘리는 경우, 새로운 이식을 얻을 수 있어야합니다. 드릴링 각도 점막이 드릴에 의해 손상되지 않도록 마우스 헤드에 수직이어야한다. 추천하는보다 넓은 드릴링 경로 촬영할 경우는 격막에 연결되어 여분의 조직을 제거하는 매우 어렵게 될 것이다. 결합 조직의 큰 조각이 아니라 느슨한 그들을 끌어하려고 시도하는 것보다 날카로운 가위 인하로 제거해야합니다. 조직의 작은 조각은 조직이 점막에 연결되지 제공된 위의 조건으로 긁어서 제거 될 수있다. 세정 처리의 끝에서, 여전히 부착 된 막과 연골 표면이 노출되어야한다. 날, 접대sionally 중격 연골이 지느러미 가장자리에 연결되어있는 뼈에서 분리 될 수 있습니다. 이것은 그 다음 단계에서 사용하는 것이 여전히 가능하지만 이런 경우는 두 가지 이유로 도전적이다. 뼈가 청소를 전송할 때 이식편을 보유 할 수있는 편리한 핸들입니다. 일단 제거, 그것은 더 섬세한 연골 시트를 기동하기 어렵습니다. 점막은 연골에서 분리 할 때 얻을 수 두꺼운 쉬운 곳 둘째, 연골 뼈 접합입니다. 뼈가 연골에서 절단 된 경우 멤브레인의이 부분이 손실됩니다.
중격 그래프트 청소되어 개두술 durotomy이 수행되고 나면, 점막이 노출 뇌 표면 위에 배치 될 수있다. 이것은 가장 개두술 사이트에 인접한 이식편을 위치하여 수행됩니다. 멤브레인은 두개골에, 연골에서 가져온, 뇌를 통해 할 수있다. 많은 것들이이 사전 처리하는 동안 잘못 될 수의. 멤브레인, 건조 할 수 찢어진 자체의 상단, 또는 무리 업에 접습니다. 또한 격벽의 다른 쪽을 덮는 막 두개골 문지르는 손상받을 수있다. 이 위로 향하게 점막 멤브레인을 제거하기에, 하나는 동시에 양쪽에서 세포막을 제거하는 것도 가능하다. 이러한 모든 문제를 방지하기 위하여,이 격막의 양측을 관찰 천천히 항상 막을 이동할 중요하다. 일단 가장 좋은 방법은 미끄러 져하기 전에 연골 시트에서 멤브레인을 제거하기 위해 위의 팁을 사용하는 것입니다. 막의 일부가 부착 상태를 유지하면, 조직의 탄성이 당겨 후 후퇴 할 가능성이있다. 작은 당기는 동작을 이용하여 상기 멤브레인은 격막으로부터 분리 될 수있다. 그런 다음에야 그것은 쉽게 미끄러됩니다. 막을 핀셋으로 처리 할 수있는 것이 너무 얇은; 그것은 오직 하나의 표면에서 다른 당겨질 수있다. 그것은 그 자체에 뒤집어 또는 접힌되는 경우,폐기해야하고 또 다른 하나를 얻을 수 있어야합니다.
그래프트가 노출 뇌의 표면 전체 영역을 커버하는 경우, 처리는 성공 및 수술 사이트를 치료할 수 있도록 두피 봉합 될 수있다. 피부가 막과 접촉하지 않도록 니트릴 장벽 장소에 배치되어야한다. 관리 그렇지 않으면 이식 위치가 이동할 수 봉합 그래서 그 압력이 니트릴에 작용하지 않습니다주의해야합니다. 또한, 니트릴로 봉합하지 않도록주의. 확인 자료가 순종 할 수있는 가장 좋은 방법은 식염수로 습기를 유지하고 있는지 그것을 봉합을 통해 평면 유지하는 것입니다.
이식은 (3-7 일) : 치유되면 잘 먹이지 솔루션을 포함하면 이식 위의 두개골에 부착 될 수있다. 그것은 접착제 접착제로 두개골에 일시적으로 고정하고 영구적으로 골 시멘트로 할 수 있습니다. 골 시멘트가인가되면, 잘 위치 therefo 어떤 수정을 할 수 없으므로다시 모든 최적화는 이전의 응용 프로그램으로 수행해야합니다. 잘은 위치와 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 장소에서 개최되어 후에는 멸균 식염수로 가득해야합니다. 절차가 성공적으로 수행 된 경우, 액체 레벨은 변경되지 않으며, 용액을 명백 할 것이다. 누출이있는 경우에, 레벨이 하락되며 물이 탈출 곳의 위치는 볼 수 있어야한다. 누출 사이트에서 더 많은 접착제를 도포 한 후, 더 많은 염분 누설 밀봉되었는지 확인하기 위해 추가해야합니다. 접착제가 아니라 용액을 오염 시키면, 반투명 막을 오일 레벨의 상단에 표시 될 것이다. 이 경우 용액이 깨끗해질 때까지 잘 염수로 수회 세척한다. 또한,면 스왑은 액체 표면에 접촉하여 필름을 제거하는데 사용될 수있다. 잘 용액이 안정하고 명확한 때만 시멘트가 적용되어야한다. 시멘트가 건조되면 잘로부터 염분이 제거 및 투약 용액으로 대체 될 수있다. 케어에주의해야한다에와 밖으로 잘 피펫 팅 할 때 막에 손상을주지. 일단 못, 우물의 정상은 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용 니트릴의 조각으로 밀봉해야한다. 그것은 공간이 용액의 표면과 웰의 상부 사이에 남아있는 것이 중요하다. 이 니트릴 장벽에 넣어 때 접착제가 솔루션을 만지지 않도록합니다.
이 투약 절차의 효과를 분석하기 위해 시간 후에 뇌를 제거하고 묘화되어야한다. 면역 조직 화학이 수행 될 경우, 표준 관류 및 항체 염색 할 수있다. 투여 된 화합물의 위치가 결정되어야하는 경우, 드라이 아이스 / 이소 부탄 용액에 뇌 동결 플래시 추천. 이것은 뇌 조각의 화합물의 위치는 안락사 직전이었던 것에 동일한 지 확인한다.
본원에 기재된 프로토콜은 수술을 통해 마우스의 뇌에 약물 전달을 조사하는 방법을 설명반투과성 점막 (18)을 그래프트. 이것은 두개골 바닥 결함이 혈관 비강 점막 19,20으로 수리되는 인간 transnasal 종양 제거 수술의 결과와 유사하다. 이 마우스 모델을 이용하여, 이러한 점막 이식편이 BBB를 우회하고 뇌에 직접 고 분자량 약물 전달을 허용 할 수있다 방법을 연구하는 것이 가능하다. 우리는 지금의 100 배 이상이 절차를 수행했습니다. 이 절차에 중요한 기증자 마우스의 코 중격 이식의 성공적인 수확 및 테스트 마우스 상에 이식에서 점막의 전송이다. 이 절차는, 처음, 신경 및 정신 장애의 다양한 고 분자량 치료제의 전임상 시험을 가능하게한다.
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Disclosures
벤자민 S. 같은 Bleier MD는 중추 신경계에 약물 전달의 임시 특허 취재 방법의 리드 발명가입니다.
Acknowledgments
이 연구는 파킨슨 병의 연구 2011 신속 대응 혁신 상 프로그램에 대한 Mcihael J. 폭스 재단에 의해 투자되었다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
| Drill bit | |||
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
| Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
| Eye ointment | |||
| Electric shaver | |||
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
| Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
| 5-0 Nylon suture thread | |||
| Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
| Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
| Dry ice |
References
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
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