Summary
En musemodell for human endoskopisk skallegrunnoppbyggingen har blitt utviklet som gir en semipermeabel grensesnitt mellom hjernen og nesen ved hjelp av nasale slimhinne grafts. Denne metoden gjør det mulig for forskere å undersøke levering til sentralnervesystemet av høy molekylvekt terapeutiske midler som ellers er utelukket ved blod-hjerne-barrieren når de administreres systemisk.
Abstract
Levering av terapeutiske midler inn i hjernen blir hindret ved tilstedeværelse av blod-hjerne-barrieren (BBB) som begrenser passasjen av polare og høy-molekylære forbindelser fra blodet og inn i hjernevevet. Noen direkte levering suksess hos mennesker er oppnådd via implantasjon av transkranial katetre; Imidlertid er denne metoden meget inngripende og forbundet med mange komplikasjoner. En mindre påtrengende alternativ ville være å dosere hjernen gjennom en implantert, semipermeabel membran slik som neseslimhinnen som brukes til å reparere skallen basisfeil etter transnasal endoskopisk fjerning av svulster kirurgi hos mennesker. Drug overføring selv om denne membranen effektivt ville omgå BBB og diffundere direkte inn i hjerne-og spinalvæske. Inspirert av denne tilnærmingen, ble et kirurgisk tilnærming i mus utviklet som anvender en donor septal-slimmembranen over en innpodet ekstrakraniell kirurgisk BBB defekt. Denne modellen har vist seg å effektivttillater passering av høy-molekylære forbindelser til hjernen. Siden mange stoffet kandidater er i stand til å krysse BBB, er denne modellen verdifullt for å utføre preklinisk testing av nye behandlingsformer for nevrologiske og psykiatriske sykdommer.
Introduction
Ved behandling av neurologiske og psykiatriske sykdommer er sterkt hindret av tilstedeværelsen av blod-hjerne-barrieren (BBB), som hindrer at over 95% av alle potensielle farmasøytiske midler fra å nå det sentrale nervesystemet 1-3. For eksempel, glial avledet neurotrofisk faktor (GDNF) har vist seg å være effektiv i behandling av Parkinsons sykdom når det injiseres direkte i hjernen, men er ineffektive når levert systemisk fordi det ikke kan trenge inn i BBB 4-6.
Tallrike nærmet har blitt utviklet for å forsøke å omgå dette problemet. Forbedring i systemisk levering av neurotheraputics har blitt demonstrert ved hjelp av medikament konjugater inneholdende antistoffer som selektive for transportproteiner som ligger på hjerne kapillær endotel; Men denne metoden har ikke blitt vist å være anvendelig for et bredt spekter av farmasøytiske 7,8. I tillegg har osmotiske åpning av BBB blitt brukt klinikkenally, men denne metode lider av systemisk medikamentdosering i motsetning til en mer direkte tilførsel til hjernen region av interesse 9.. Betydelig innsats har blitt lagt i å optimalisere transnasal levering i håp om direkte rettet mot hjernen 10-12. Selv om en viss suksess er oppnådd, er konkluderende resultater bare blitt oppnådd for medikamenter som besitter endogene reseptorer, slik som insulin 13,14. Videre mekanismen av transnasal levering har vært kontroversielt med bevis som tyder indirekte inntreden i hjernen via lukte nevron opptak eller gjennom blodet 11. Direkte, transcranial levering ved hjelp av implanterbare katetre har blitt oppnådd, men denne fremgangsmåten er meget invasiv og forbundet med mange komplikasjoner 15,16. Til dags dato er det ikke generelt minimal invasiv metode for å levere høy-molekylære forbindelser til hjernen.
Presenteres her er et mus kirurgisk prosedyresom skaper et semipermeabelt grensesnitt med hjernen. Dette oppnås ved poding en mukosal membran eksplantering 17 over et kirurgisk kraniotomi defekt i en mus. Ved hjelp av denne fremgangsmåten har det vist seg at oppløselige forbindelser opp til 500 kDa kan bli levert inn i det sentrale nervesystemet (direkte i hjernen parenchyma, så vel som inn i cerebrospinalvæsken) i både tid og molekylvektavhengig måte 18. Denne metoden for å omgå BBB er en modell for skallebasis defekt reparasjon hos mennesker som bruker vascularized slimhinne grafts å reparere hull i hodeskallen etter transnasal endoskopisk kirurgi 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før operasjonen sørge for at alle prosedyrer som skal gjøres er godkjent av IACUC og eventuelle andre etiske eller juridiske myndigheter og bruke humane dyr behandling praksis. Dette inkluderer bruk av sterile kirurgiske tilstander, anesthetizing musen med IACUC godkjent metode, smøre muse øyne med veterinær salve under operasjonen, og gi postsurgical omsorg. Ikke gå videre med kirurgi hvis det er noen spørsmål om aspekter av prosedyren er godkjent. Alle prosedyrer utført her ble godkjent av Boston University Institutional Animal Care og bruk komité.
En. Utarbeidelse av Dyr og kirurgisk utstyr
- Autoklaver all kirurgisk instrument som skal brukes under operasjonen.
- Kontroller at alle teknikker som skal utføres er godkjent av de dyretilsynsorganer.
2. Høsting av Mucosal Graft
- Valgte en genetisk identiske mus av samme alder somden eksperimentelle mus og avlive den i en IACUC godkjent metode (her: isofluran kvelning fulgt av cervical dislokasjon).
- Ved hjelp av kirurgisk saks, fjerne hud rundt nese regionen musehode utsette skallen.
- Med en pneumatisk drill, mark med tre linjer hvorav to lateralt flankerer nasal og regionen en tredjedel i tråd med de øynene som forbinder de to linjer vinkelrett.
- Drille ned ventralt for å skille nasal septum fra omkringliggende vev. Et bredere bane vil hindre skade på slimhinnemembranen, men den vil også gjøre det mer vanskelig å isolere membranen. Et smalt kutt nærmere midtlinjen er anbefalt.
- Bruk saks til å klippe septum fri fra alle vev levd opp til det og lagre det i et sterilt saltvann. På dette tidspunkt transplantatet kan bli renset for å fjerne alle tilkoblede vev. Den ideelle situasjon er å ha uskadde mukosale membraner utsettes på begge sider av brusk septum. En graft kan forsyne membranen i to mus, forutsatt at overflatearealet av membranen er tilstrekkelig til å dekke de områder kraniotomi. Det anbefales at transplantatet brukes så raskt som mulig, og forskeren fortsetter til trinn 3 så snart transplantatet er isolert.
Tre. Kirurgisk Implantasjon av Mucosal Graft
- Ved hjelp av standard, aseptiske murine kirurgiske prosedyrer, bedøve og montere en mus i stereological rammen. Bruk omtrent 2% isofluran i ren oksygen ved hjelp av en gnager anestesiapparat.
- Immobilisere musen i en stereotaxic apparat med øret barer og en nese holderen. Påfør ophthalmic salve til øynene og skrubbe hodebunnen med betadine og 75% etanol i tre runder. Ved hjelp av enten saks eller et hår trimmer, fjerne pels på hodet. Expose skallen med et barberblad og vatre hodet. Utfør en kraniotomi ovenfor plasseringen av hjernen som skal doseres. For eksempel, når du målretter striatum kutte en 1,25 mmdiameter sirkulært hull i skallen (sentrert på AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) ved hjelp av en pneumatisk drill. Fukt boret området med sterilt saltvann og bruke et barberblad for å fjerne skallen.
- Fjerne dura forsiktig ved hjelp av spissen på en kanyle. I tillegg kan dette oppnås ved å bruke en minimal mengde av vev klebemiddel til den fuktige dural overflate. Når dette lag er herdet, kan sideveis bevegelse med et barberblad spissen brukes til å fjerne membranen.
- Plasser slimhinnemembranen over hjerneoverflaten tar ekstrem forsiktighet for å holde den epiteliale side som vender bort fra såret. Dette gjøres best ved å overføre hele septum på overflaten av skallen ved siden av kraniotomi stedet med pinsett. Ved hjelp av spissen av et par kirurgiske sakser, trekker membranen ut av brusk og inn på skallen og hjerneoverflaten. Ikke la membranen tørke ut eller ta den med noen absorberende materiale. Transplantasjonen bør sjenerøst overlappe alle benete kanter av craniotomy sITE.
- Dekk transplantatet med et sterilt stykke nitril. Dette tjener til å hindre adhesjon av huden for å pode under helbredelsen. Den nitril må være stor nok til å dekke hele mukosamembranen. Trim dreven membran hvis det er nødvendig. Unngå enhver bevegelse av nitrilet når det har kommet i kontakt med transplantatet.
- Lukk huden med en løpende 5-0 sterile sutur og la musa gjenopprette for 3-7 dager før du går videre til neste trinn. Pass på ikke å forurolige nitrilformen barriere eller slimhinnene pode under huden nedleggelse.
4. Administrasjon av Dosering Solution
- Etter å ha sikret bedøvet mus i stereotaxic rammen, kutte sutur med saks og fjerne overflødig hud rundt skallen.
- Fjern nitril barriere og rengjør overflaten av skallen. Bruk sterilt saltvann og bomullspinner for å rense området til transplantatet er synlig. Det kan være nødvendig å kutte transplantatet med et barberblad hvis er blitt større enn desired areal.
- Hvis forsøket vil være lenger enn noen få dager, er det lurt å implantere minst to skallen skruer å forsterke hodet implantatet.
- Plasser godt over transplantatet, slik at kantene er i kontakt med hodeskallen. Påfør cyanoacrylate limet i krysset mellom godt og skallen. Fyll godt med sterilt saltvann og sjekke at det ikke er noen lekkasjer. Wells er laget av kutt sprøyte nåler.
- Påfør beinsement på skallen for å feste godt på plass.
- Fjern saltvann fra brønnen med en pipette. Vask godt flere ganger for å bekrefte at limet har ikke lekket i. Tilsett ønsket løsning; i dette tilfelle 50 pl av fluorescerende dekstran anvendes. Det er forventet at vannoppløselige forbindelser med en lignende polaritet vil oppføre seg på samme måte som dekstran. Levering av hydrofobe forbindelser eller suspensjoner er ikke blitt undersøkt med denne metoden.
- Et lokk på toppen av brønnen ved hjelp av et sirkulært stykke av nitril festet tiltoppen ved hjelp av cyanoakrylat lim. Pass på at limet ikke kommer i kontakt med brønn innholdet.
5. Analysis of transmukosal avlevering
- Etter at den ønskede mengden av tid som har gått, anesthetize mus og utveksle brønninnholdet med en oppløsning av Evans blått fargestoff. Dette fargestoff er brukt til å verifisere at transplantatet var intakt.
- Etter 30 min anesthetize mus tungt, fjerne fargestoff-oppløsning og avlive ved dekapitering.
- Manuelt fjerne implantatet og fjerne hjernen ved hjelp av kirurgisk saks. Vær nøye med å holde pode på plass.
- Når den er fjernet, flash-fryse hjernen i en løsning av isobutan avkjølt i et tørris-bad.
- Legge hjernen i Optimal Cutting Temperatur (OCT) løsning og skive på 50 mikrometer.
- Plasser de ønskede stykker direkte på et objektglass.
- Bilde-stykket ved hjelp av et mikroskop florescence så snart oktober oppløsningen har tørket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innhenting av en stor nok nasal septum eksplantering er avgjørende for de etterfølgende trinn. Dette kan oppnås ved å bore på stedet på donor-mus skalle vist i Figur 1a. Skjære langs denne bane vil produsere en eksplantering av tilstrekkelig størrelse, som vist på figur 1b. Dersom boredybden ikke er dypt nok, vil transplantatet være avkortet og det vil være vanskelig å oppnå en stor nok membran for å dekke hjernens overflate. Boring mer sidelengs enn den foreslåtte banen ikke er anbefalt fordi mer vev vil forbli på nasal septum, og neste skritt vil være vanskeligere. Før overføring av slimhinnene, må overflaten av septum som skal renses av alt overflødig bindevev. Når dette er gjort, må slimhinnemembranen bli synlig på overflaten av brusken. Figur 1c viser hva vevet ser ut etter rengjøring.
Før overføring av medl.rane, en kraniotomi og durotomy må utføres for å avdekke hjernens overflate. Først etter den post-durotomy blødningen har stoppet kan membranen bli overført. Figur 2a viser hva kirurgi området skal se ut før du fortsetter til neste trinn. Overføring av slimhinnemembranen fra brusk på hjerneoverflaten er det mest teknisk krevende trinn av hele kirurgisk prosedyre, og bør gjøres forsiktig. Dersom høstet septum er stor nok, bør overflatearealet av mukosal graft være stor nok til å dekke hjernens overflate. Når overføres, bør det kirurgiske område ligner det i Figur 2b. Det er viktig å sørge for at den side av membranen som er i kontakt med en brusk er den samme som er i kontakt med hjerneoverflaten. Dersom membranen blir snudd eller foldet over seg selv, bør det kastes og en annen brukes. Når dette trinnet er fullført, kan hodebunnen sutureresslik at musen kan gjenopprette og pode kan helbrede. For å hindre eventuelle uønskede reaksjoner fra transplantatet som kommer i kontakt med den indre flate av hodebunnen, bør et stykke av beskyttende nitril plasseres over til operasjonsfeltet. Som vist i figur 2c, bør det innsatte stykket være stor nok til å dekke membranen, men ikke stor nok til å hindre suturing huden lukket.
Under restitusjonsperiode, forekommer betydelig vev-vekst av den omkringliggende periosteum, som må fjernes før dosering membranen. Etter gjenåpningen i hodebunnen, vil sterile bomullspinner og saltoppløsning må brukes til å rengjøre området før det ser lik som i figur 3a. Vi har ikke observert noen vesentlig immunrespons; men dette har ikke blitt bekreftet histologisk. Transplantatet kan trenge å bli kuttet med et barberblad hvis den har vokst over overflaten av skallen. På dette stadium i brønnen som skal inneholde doserings løsningensjon bør implantert over graft. Flere skull skruer kan settes inn på dette trinn hvis langvarig mekanisk stabilitet av implantatet er en bekymring. Pass på at brønnen er plassert slik at den ikke berører pode. En gang på plass, kan cyanoacrylate limet påføres lim den til skallen. For å hindre klebemiddelet fra å komme i kontakt med den podede det skal påføres på overflaten av brønnen og skjøvet nedover for å tette gapet. Så snart brønnen er sikkert, bør det være fylt midlertidig med saltvann til både hydrat transplantatet og kontrollere for lekkasjer. Den levd godt skal se ut som i figur 3b og oppløsning skulle være klart indikerer at det ikke inneholder noe klebemiddel. Eventuelle lekkasjer vil være åpenbare, fordi væskenivået i brønnen vil falle. Dersom det oppdages lekkasjer de trenger å bli løst med mer lim. Brønnen blir så forsterket med beinsement. På dette punktet i saltvann i brønnen kan fjernes med en pipette ogerstattes med den ønskede doseringsløsningen. Da dekker den godt med et stykke av nitril omsorg bør tas for å sørge for at limet ikke kommer i kontakt med løsningen i brønnen. Ved slutten av hele fremgangsmåten, bør musehodet se ut som i figur 3c. Den beinsement er litt gjennomskinnelig derfor hvis innholdet i brønnen er lysfølsomme, fargestoff eller blekk kan bli tilsatt til overflaten av det tørkede sement eller sement-blanding for å forebygge fotonedbrytning av brønninnholdet.
Etter at den ønskede periode ventetid, bør hjernen bli analysert for å utforske virkningen av dosering. Hjernen bør behandles ulikt avhengig av hva som blir undersøkt. Dersom hensikten med fremgangsmåten er å analysere tilstedeværelse av en hvilken som helst kjemisk tilsatt til brønnen, (slik som beskrevet i protokollen ovenfor) så er det anbefalt å gjøre en flash-frysing av hjernen for å bevare de administrerte forbindelser. Figur 4 > Viser et representativt resultat av å bruke denne tilnærmingen. Dosering med en 40 kDa fluorescerende polymer (tetramethyrhodamine konjugert dekstran) i 24 timer viser merkbar diffusjon inn i hjernevevet. Våre tidligere resultater med dekstran-vis diffusjon inn i hjernevevet er både tid-og molekylvektavhengig 18.. Mindre molekyler diffunderer inn i hjernen parenchyma i større grad enn større og større doserings tid resulterer i en større mengde av diffusjon for alle molekylvekter som vi har testet. Ved flash-frysing er gjort, er det viktig å montere skinnene etter snitting og ikke utsettes for noen løsning. Enhver væske vil oppløseliggjøre den administrerte forbindelsen og diffus den over overflaten av hjernen skive. Hvis immunhistokjemi skal utføres på hjernen så er det anbefalt å perfuse musen for å feste hjernevev.
iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Figur 1. Bilder av nasal septum høsting prosedyre. A) Plasseringen av borestedet på skallen fra et avlives musen. De stiplede linjene indikerer omkretsen å bore. B) Den nasal septum direkte etter kirurgisk fjerning. C) Den neseskillevegg etter å fjerne overflødig vev. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Kirurgiske bilder av pode prosessen. A) Den kirurgiske området etter kraniotomi og durotomy. Bildet er representativt for hva som hodet skal se ut som før anbringelse av transplantat på den. B) Plassering i slimhinnene graft videre til kraniotomi side. Den stiplede linjen viser omkretsen av pode. Bildet viser det ønskede overflateareal av transplantatet. C) Implantasjon av den beskyttende barriere nitril. Størrelsen av materialet som vist er stort nok til å dekke den podede, men ikke stor nok til å interferere med suturering. for å vise større bilde.
Fig. 3. Kirurgiske bilder av medikamentdosering prosessen. A) Et eksempel på hva det helbredet mucosal graft ser ut som følge omfattende rengjøring av operasjonsstedet. B) Bilde av godt festet til skallen. Grensesnittet av skallen og godt er sikretmed cyanoakrylat lim og brønnen er fylt med sterilt saltvann. Den stabile løsning nivå indikerer ingen lekkasjer fra brønnen og klarhet av løsningen indikerer ingen forurensning av oppløsningen med lim. C) Et bilde av det ferdige kirurgi. Brønnen inneholder doseringsløsning og er godt avkortet med en nitril barriere. Beinsement er på plass for å avstive brønnen implantatet. Klikk her for å se større bilde.
Fig. 4. Fluorescerende mikroskop bilde av en musehjerne skive følgende transmukosal dosering med 40 kDa tetra-konjugert dekstran i 24 timer. Denne skive ble tatt på -1,06 mm bregma med en tykkelse på 501; m. Den mucosal graft er synlig på overflaten av hjernen. Bar = 1 mm. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vanskeligste trinn av fremgangsmåten som er beskrevet heri er en vellykket overføring av en tilstrekkelig størrelse mukosal membran på hjernens overflate. Dette trinnet blir gjort vesentlig lettere dersom høstet nasal septum er stort nok, og renset godt. Hvis den ventrale del av skilleveggen er trunkert, bør et nytt pode oppnås. Borevinkel bør være vinkelrett på mus hodet for å sikre at mukosamembranen ikke skades av drillen. Dersom en bredere enn anbefalte borebanen er tatt vil det være mye vanskeligere å fjerne den ekstra vev som er forbundet med septum. Noen store biter av bindevev bør fjernes med skarpe sakse kutt snarere enn å forsøke å trekke dem løs. Små stykker av vev kan fjernes ved å skrape med spissen av saksen følger vevet er ikke koblet til slimhinnemembranen. Ved slutten av renseprosessen, bør brusk flaten med membranen fortsatt festet bli eksponert. Occaiblant septal brusk kan løsne fra beinet at den er koblet til på dorsal kanten. Hvis dette skjer er det fortsatt mulig å bruke den i neste trinn, men det er mer utfordrende for to grunner. Benet er et praktisk håndtak å holde explant ved rengjøring og overføre det. Når den er fjernet, er det vanskeligere å manøvrere mer delikat brusk arket. Dernest er brusk-bein veikryss hvor slimhinnene er tykkest og lettest å få tak når du fjerner det fra brusk. Hvis benet er kuttet fra brusk denne delen av membranen er tapt.
Når septal graft er blitt renset og kraniotomi og durotomy har blitt utført, kan den slimhinnemembranen bli plassert over de eksponerte hjernens overflate. Dette oppnås best ved å plassere eksplantering tilstøtende til kraniotomi side. Membranen kan deretter trekkes ut av brusk, på skallen, og over hjernen. Mange ting kan gå galt under denne forarbeides. Membranen kan tørke ut, bli revet, brett på toppen av seg selv, eller gjeng opp. Også membranen som dekker den andre siden av skilleveggen kan bli skadet fra å gni mot skallen. Det er også mulig at ved å forsøke å fjerne det oppadvendt mukosal membran, fjerner en membraner fra begge sider samtidig. For å unngå alle disse problemer er det avgjørende for å bevege membranen langsomt og man observere begge sider av skilleveggen. Den beste strategien er å bruke tuppen av saksen til å løsne membranen fra brusk ark før du prøver å skyve den av. Hvis noen del av membranen forblir festet, er det mulig at elastisiteten av vevet vil trekkes etter å trekke på den. Ved hjelp av små, slite bevegelser membranen kan bli løsrevet fra septum. Først da vil det lett gli av. Membranen er for tynn til å kunne håndteres med pinsett; det bare kan trekkes fra en overflate til en annen. Hvis det blir snudd eller foldet over seg selv, detskal kastes og en annen skal innhentes.
Ved pode dekker hele overflatearealet av den eksponerte hjernen, ble prosessen vellykket og hodebunnen kan sys, slik at operasjonen området kan gro. Et nitril barriere må settes på plass slik at huden ikke kommer i kontakt med membranen. Det må utvises forsiktighet slik at trykket ikke utøves på nitrilet ved å sy ikke annet pode stilling kan bevege seg. Også tar seg ikke å sy inn i nitril. Den beste måten å sørge for at materialet adlyder er å holde det fuktig med saltvannsoppløsning og sørg for at den holder seg flat i hele suturering.
Når transplantatet er leget (3-7 dager) i brønnen inneholdende doseringsløsningen kan festes til hodeskallen ovenfor transplantatet. Det kan fikses midlertidig til skallen med fliselim og permanent med beinsement. Når beinsement er brukt, vil det ikke være mulig å foreta eventuelle korrigeringer til godt posisjon therefore all optimalisering må skje forut for dens anvendelse. Når brønnen er i posisjon og holdes på plass med klebemiddel cyanoakrylater, bør den være fylt med sterilt saltvann. Ved fremgangsmåten ble utført med hell væskenivået ikke vil endre seg, og oppløsningen blir klar. Hvis det er en lekkasje, vil nivået synke og plasseringen av hvor vannet unnslapp skal være synlig. Etter å ha søkt mer lim på lekkasjestedet, bør saltere legges til verifisere at lekkasjen ble tettet. Hvis limet forurenser brønnen løsning, vil en gjennomskinnelig film være synlig på toppen av fluidnivået. Hvis dette skjer brønnen skal vaskes flere ganger med saltvann inntil løsningen er klar. I tillegg kan en bomullsbytte benyttes til å fjerne filmen ved å trykke på den til væskeoverflaten. Bare når brønnen løsningen er stabil og klar skal sementen anvendes. Når sementen er tørr, kan det saltløsning fra brønnen bli fjernet og erstattet med den doseringsløsning. Forsiktighet bør utvises for åikke skade membranen ved pipettering inn i og ut av brønnen. Når de er fylt, skal toppen av brønnen tettes med et stykke av nitril ved hjelp av cyanoakrylat lim. Det er viktig at plassen som er igjen mellom overflaten av løsningen og toppen av brønnen. Dette vil sikre at klebemidlet ikke kommer i berøring med oppløsningen når man setter på nitrilet barriere.
Når det er tid for å analysere effekten av doseringsprosedyren må hjernen fjernes og avbildes. Hvis immunhistokjemi skal utføres, kan standard perfusjon og antistoffarging gjøres. Hvis plasseringen av forbindelsen dosert skal bestemmes, er det anbefalt å blinke fryse hjernen i et tørris / isobutan-løsning. Dette vil sikre at plasseringen av forbindelsen i hjerneskiver er den samme som den var umiddelbart før eutanasi.
Protokollen beskrevet heri beskriver en fremgangsmåte for å undersøke for levering av legemidler til musehjerne gjennom et kirurgiskpodet halvgjennomtrengelig mukosamembranen 18. Dette er analogt til utfallet av transnasal svulst fjerning kirurgi hos mennesker der skallebasis defekter repareres med en vaskularisert nasal mukosamembranen 19,20. Ved hjelp av denne musemodellen, er det nå mulig å studere hvordan disse slimhinne grafts er i stand til å omgå BBB og tillater for direkte høy molekylvekt for levering av legemidler til hjernen. Vi har nå utført denne prosedyren over 100 ganger. Avgjørende for denne fremgangsmåten er den vellykkede høsting av en nasal septal graft fra en donor mus og overføring av slimhinnemembranen fra transplantat mot test mus. Denne fremgangsmåten, for første gang, kan preklinisk testing av høy molekylvekt terapeutiske midler for en rekke neurologiske og psykiatriske forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Benjamin S. Bleier MD er bly oppfinneren av foreløpige patent som dekker metoder for levering av legemidler til sentralnervesystemet.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av Mcihael J. Fox Foundation for Parkinson-forskning 2011 Rapid Response Innovations Awards Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
| Drill bit | |||
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
| Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
| Eye ointment | |||
| Electric shaver | |||
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
| Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
| 5-0 Nylon suture thread | |||
| Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
| Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
| Dry ice |
References
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
