Summary
Um modelo do rato de reconstrução endoscópica da base do crânio humano foi desenvolvido que cria uma interface semipermeável entre o cérebro eo nariz com enxertos mucosas nasais. Este método permite que os investigadores a estudar a libertação no sistema nervoso central de terapêutica de elevado peso molecular, que são de outro modo excluídos pela barreira sangue-cérebro, quando administrado sistemicamente.
Abstract
A entrega de agentes terapêuticos para o cérebro é impedida pela presença da barreira sangue-cérebro (BBB), o que restringe a passagem de compostos polares e de elevado peso molecular a partir da corrente sanguínea e no tecido cerebral. Algum sucesso entrega direta em seres humanos tem sido alcançado através de implantação de cateteres transcraniana; no entanto, este método é altamente invasivo e associado a várias complicações. Uma alternativa menos invasiva seria a dose do cérebro através de um implantado cirurgicamente, membrana semi-permeável, tal como a mucosa nasal, que é usado para reparar defeitos da base do crânio seguinte cirurgia endoscópica tumor remoção em humanos. Transferência da droga que esta membrana seria efectivamente desviar o BBB e difundem directamente no cérebro e no fluido cerebrospinal. Inspirado por essa abordagem, uma abordagem cirúrgica em ratos foi desenvolvido que utiliza uma membrana mucosa septal doador enxertada sobre um defeito extracraniana BBB cirúrgico. Este modelo tem sido demonstrado eficazpermitir a passagem de compostos de alto peso molecular para o cérebro. Desde inúmeros candidatos a fármacos são incapazes de atravessar a certificação, este modelo é valiosa para a realização de testes pré-clínicos de novas terapias para doenças neurológicas e psiquiátricas.
Introduction
O tratamento da doença neurológica e psiquiátrica é severamente impedida pela presença da barreira sangue-cérebro (BBB), que impede que mais de 95% de todos os potenciais agentes farmacêuticos de atingir o sistema nervoso central 1-3. Por exemplo, factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) foi demonstrado ser eficaz no tratamento da doença de Parkinson, quando injectado directamente no cérebro, no entanto, não é eficaz quando entregues sistemicamente porque não pode penetrar a BBB 4-6.
Numerosos abordado foram desenvolvidas para tentar ultrapassar este problema. Melhoria na administração sistémica de neurotheraputics foi demonstrada usando conjugados de medicamentos contendo anticorpos selectivos para as proteínas de transporte localizados no endotélio capilar cerebral; no entanto, este método não tem sido mostrado para ser aplicável a uma ampla gama de produtos farmacêuticos 7,8. Além disso, a abertura osmótica da BHE foi usado clínicaaliado, no entanto, este método sofre de dosagem sistémica de fármacos, em oposição a uma distribuição mais directa para a região do cérebro de interesse 9. Esforço considerável tem sido posta em otimização de entrega transnasal na esperança de atacar directamente o cérebro 10-12. Embora tenha sido alcançado algum sucesso, resultados conclusivos só foram obtidos para as drogas que possuem receptores endógenos, como a insulina 13,14. Além disso, o mecanismo de entrega transnasal tem sido controversa com indícios de entrada indireta para o cérebro por meio de captação de neurônio olfativo ou através da corrente sanguínea 11. A entrega directa, transcraniana utilizando cateteres implantados tem sido conseguida, no entanto este processo é altamente invasivo e associada a numerosas complicações 15,16. Até à data, não existe um método geral, minimamente invasiva para entregar os compostos de elevado peso molecular para o cérebro.
Aqui apresentada é um procedimento cirúrgico murinoque cria uma interface semipermeável com o cérebro. Isto é conseguido por um enxertando explante membrana mucosa 17 ao longo de um defeito craniotomia cirúrgica em um rato. Usando este procedimento, tem sido demonstrado que os compostos solúveis de até 500 kDa pode ser entregue no sistema nervoso central (directamente no parênquima cerebral, assim como em fluido cerebrospinal), em ambos tempo e um peso molecular dependente da forma 18. Este método de contornar o BBB é um modelo para reparos de defeitos da base do crânio em seres humanos, que utiliza enxertos vascularizados da mucosa para reparar buracos no crânio após a cirurgia endoscópica transnasal 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Antes da cirurgia certificar-se de todos os procedimentos a serem feitas são aprovados pelo IACUC e quaisquer autoridades éticas ou legais adicionais e utilizar práticas de tratamento de animais sem crueldade. Isso inclui o uso de cirurgia condições estéreis, anestesiar o mouse usando o método IACUC aprovado, lubrificando ratos olhos com pomada veterinário durante a cirurgia, e prestação de cuidados pós-cirúrgico. Não prossiga com a cirurgia se houver qualquer questão de saber se os aspectos do processo são aprovados. Todos os procedimentos aqui realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional Universidade Animal Care e Use o Boston.
1. Preparação de Animais e suprimentos cirúrgicos
- Autoclave todo instrumento cirúrgico que será usado durante a cirurgia.
- Certifique-se de todas as técnicas que estão a ser realizadas são aprovados pelas agências reguladoras de animais.
2. Colheita da mucosa Graft
- Escolheu um rato geneticamente idênticos da mesma idade comoo mouse experimental e sacrificá-lo em um método IACUC aprovado (aqui: asfixia isoflurano seguido por deslocamento cervical).
- Usando uma tesoura cirúrgica, retire a pele ao redor da região nasal de cabeça de rato expondo o crânio.
- Com um martelo pneumático, marca com três linhas de dois dos quais lateralmente ladeiam a região nasal e um terceiro em linha com os olhos que conecta as duas linhas perpendiculares.
- Broca para baixo ventralmente, a fim de separar o septo nasal a partir do tecido circundante. Um caminho mais largo, evitará danos à membrana mucosa no entanto, também vai tornar mais difícil para isolar a membrana. Um corte estreito mais perto da linha média é recomendado.
- Use a tesoura para cortar o septo livre de qualquer tecido aderido a ele e armazená-lo em uma solução salina estéril. Neste momento, o enxerto pode ser limpa para remover qualquer tecido ligado. O ideal é ter membranas mucosas intactas exposta em ambos os lados da cartilagem do septo. Um grré pode fornecer membrana para dois ratinhos desde que a área da superfície da membrana é suficiente para cobrir os locais craniotomia. Recomenda-se que o enxerto é utilizada tão depressa quanto possível e o investigador prossegue para o passo 3, logo que o enxerto é isolado.
3. Implantação cirúrgica de mucosa Graft
- Usando procedimentos padrão, assépticas murino cirúrgicos, anestesiar e montar um mouse no quadro estereológica. Use cerca de 2% de isoflurano em oxigênio puro através de um aparelho de anestesia de roedores.
- Imobilizar o mouse em um aparelho estereotáxico com barras de ouvido e um suporte de nariz. Aplicar pomada oftálmica para os olhos e esfregue o couro cabeludo com betadine e álcool 75% por três rodadas. Usando qualquer uma tesoura ou um aparador de cabelo, retire a pele na cabeça. Exponha o crânio com uma lâmina de barbear e nível da cabeça. Realizar uma craniotomia sobre o local do cérebro que vai ser administrado. Por exemplo, quando visando o striatum cortar 1,25 milímetrosdiâmetro do furo circular no crânio (centrado no AP: 1.00 mm; ML: 0,88 mm) usando um martelo pneumático. Molhar a área perfurada com solução salina estéril e utilizar uma lâmina de barbear para remover o crânio.
- Remova cuidadosamente a dura usando a ponta de uma agulha. Além disso, isto pode ser conseguido pela aplicação de uma quantidade mínima de adesivo para o tecido da superfície da dura-máter húmido. Uma vez que esta camada tenha endurecido, com um movimento lateral da ponta da lâmina de barbear pode ser usado para remover a membrana.
- Colocar a membrana mucosa acima da superfície do cérebro, tendo cuidado para manter o lado epitelial virada para fora da ferida. Isto é melhor realizado por transferência de todo o septo sobre a superfície do crânio adjacente ao local da craniotomia com pinças. Com a ponta de um par de tesouras cirúrgicas, puxar a membrana fora da cartilagem e para a superfície do crânio e no cérebro. Não deixe que a membrana secar ou tocá-lo com qualquer material absorvente. O enxerto deve sobrepor-se generosamente todas as extremidades ósseas da craniotomia site.
- Cubra o enxerto com um pedaço estéril de borracha nitrílica. Isto actua de modo a evitar a aderência da pele no enxerto durante a cicatrização. O nitrilo precisa de ser grande o suficiente para cobrir toda a membrana mucosa. Apare membrana excessiva, se necessário. Evite qualquer movimento do nitrilo, uma vez que tenha entrado em contato com o enxerto.
- Feche a pele com um 5-0 sutura estéril correndo e deixar o mouse recuperar para 3-7 dias antes de prosseguir para a próxima etapa. Tome cuidado para não perturbar a barreira nitrílica ou o enxerto gengival durante o fechamento da pele.
4. Administração da Solução de Dosagem
- Depois de garantir o rato anestesiado no quadro estereotáxico, corte a sutura com uma tesoura e retire o excesso de pele ao redor do crânio.
- Retirar a barreira nitrilo e limpar a superfície do crânio. Use soro fisiológico e cotonetes estéreis para limpar a área até que o enxerto é visível. Pode ser necessário cortar o enxerto com uma lâmina de barbear se tem crescido muito mais do que a desired área de superfície.
- Se a experiência será mais longo do que alguns dias, é sábio para implantar pelo menos dois parafusos crânio para reforçar o implante cabeça.
- Colocar o bem acima do enxerto, de modo que as extremidades estão em contacto com o crânio. Aplique cola de cianoacrilato na junção entre o bem eo crânio. Encha o bem com solução salina estéril e verifique se não há vazamentos. Wells são feitos de agulhas de corte de seringa.
- Aplicar cimento ósseo no crânio para garantir o bem no lugar.
- Remover a solução salina a partir do poço com uma pipeta. Lavar as bem várias vezes para verificar que o adesivo não vazou dentro Adicionar a solução desejada; neste caso, 50 ul de dextrano fluorescente é usado. Espera-se que os compostos solúveis em água de uma polaridade semelhante que se comportam da mesma como dextrano. Entrega de compostos hidrofóbicos ou suspensões não foi explorada com este método.
- Tapar o topo do poço, usando um pedaço circular de nitrilo fixada aotopo usando adesivo de cianoacrilato. Certifique-se de que o adesivo não entra em contacto com o conteúdo também.
5. Análise de entrega transmucosa
- Depois da quantidade desejada de tempo tiver passado, anestesiar o rato e trocar o conteúdo do poço com uma solução de corante azul de Evan. Este corante é usado para verificar que o enxerto estava intacta.
- Após 30 min, anestesiar o rato fortemente, remover a solução de corante, e a eutanásia através de decapitação.
- Manualmente remover o implante e retire o cérebro usando uma tesoura cirúrgica. Tenha cuidado para manter o enxerto no lugar.
- Uma vez removido, flash congelar o cérebro em solução de isobutano arrefecido em um banho de gelo seco.
- Incorporar o cérebro em solução (OCT) e fatia de 50 mm Temperatura ideal de corte.
- Coloque as fatias desejadas diretamente em uma lâmina de microscópio.
- Imagem da fatia utilizando um microscópio de fluorescência, logo que a solução tenha secado outubro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A obtenção de um grande o suficiente explante septo nasal é fundamental para as etapas subseqüentes. Isto pode ser conseguido através da perfuração no local no crânio do rato doador mostrada na Figura 1a. Corte ao longo deste caminho irá produzir um explante de tamanho suficiente, como mostrado na Figura 1b. Se a profundidade da perfuração não é profundo o suficiente, o enxerto será truncado e será difícil obter uma grande membrana suficiente para cobrir a superfície do cérebro. Perfuração mais lateralmente do que o caminho sugerido não é aconselhável, porque mais tecido permanecerá no septo nasal, eo próximo passo será mais difícil. Antes da transferência da membrana mucosa, da superfície do septo precisa de ser limpa de todo o tecido em excesso. Uma vez feito isso, a membrana mucosa deve ser visível na superfície da cartilagem. Figura 1c mostra que o tecido parece após a limpeza.
Antes de transferir o membRane, uma craniotomia e durotomy precisa ser realizada para expor a superfície do cérebro. Somente depois que o sangramento pós-durotomy parou pode membrana ser transferido. Figura 2a mostra o que o local da cirurgia deve ser semelhante, antes de continuar para a próxima etapa. Transferir a membrana mucosa da cartilagem na superfície do cérebro é o passo mais tecnicamente desafiadora de todo o procedimento cirúrgico e deve ser feito com cuidado. Se o septo colhida é suficientemente grande, a área da superfície da mucosa do enxerto deve ser suficientemente grande para cobrir a superfície do cérebro. Uma vez transferido, a área cirúrgica deve parece semelhante à da Figura 2b. É importante ter a certeza de que o lado da membrana que está em contacto com a cartilagem é a mesma que está em contacto com a superfície do cérebro. Se a membrana fica virado ou dobrada sobre si mesma, deve ser descartado e outro deve ser usado. Uma vez que este passo está completa, o couro cabeludo pode ser suturadapara que o rato pode se recuperar e enxerto pode curar. A fim de impedir quaisquer reacções adversas a partir do enxerto de entrar em contacto com a superfície interna do couro cabeludo, um pedaço de nitrilo de protecção deve ser colocado por cima do local da cirurgia. Conforme mostrado na Figura 2c, a peça inserida deve ser suficientemente grande para cobrir a membrana, mas não suficientemente grande para impedir a sutura da pele fechada.
Durante o período de recuperação, o tecido em crescimento substancial ocorre do periósteo circundante, que tem de ser removida antes da administração da membrana. Após a reabertura do couro cabeludo, cotonetes estéreis e solução salina terá de ser utilizado para limpar o local até que parece semelhante à da Figura 3a. Não observamos nenhuma resposta imune substancial; no entanto, isto não foi confirmada histologicamente. O enxerto pode ser cortados com uma lâmina de barbear se cresceu em toda a superfície do crânio. Nesta fase, o poço que contém a solução de dosagemção deve ser implantado acima do enxerto. Vários parafusos crânio pode ser colocado em neste passo, se a estabilidade mecânica de longa duração do implante é uma preocupação. Certifique-se de que o poço é posicionada de modo que não toca no enxerto. Uma vez no lugar, o adesivo de cianoacrilato pode ser aplicada a cola que para o crânio. Para evitar que o adesivo entre em contacto com o enxerto deve ser aplicada sobre a superfície do poço e empurrada para baixo para vedar a abertura. Uma vez que o bem é seguro, ele deve ser preenchido temporariamente com soro fisiológico para hidratar tanto o enxerto e verificar se há vazamentos. O bem aderida deverá ser parecido com o da Figura 3b eo solução Deve ser claro, indicando que ele não contém qualquer adesivo. Qualquer vazamento será evidente, porque o nível de fluido no poço vai cair. Se os vazamentos são encontrados eles precisam ser corrigidos com mais adesiva. O poço é então reforçado com cimento ósseo. Neste ponto, a solução salina na cavidade pode ser removido com uma pipeta esubstituída com a solução de dosagem desejada. Ao cobrir o poço com um pedaço de cuidados de nitrilo deverá ser feita para garantir que o adesivo não entra em contacto com a solução no poço. No final de todo o procedimento, a cabeça do rato deve ser semelhante a da Figura 3-C. O cimento ósseo é ligeiramente translúcida, por conseguinte, se os conteúdos do poço são sensíveis à luz, de corante ou tinta pode ser adicionado à superfície do cimento seco ou com a mistura de cimento para evitar a fotodegradação dos conteúdos dos poços.
Após o desejado período de tempo de espera, o cérebro devem ser analisadas para descobrir os efeitos da dosagem. O cérebro deve ser tratado de forma diferente, dependendo do que está sendo examinada. Se o objectivo do processo é o de analisar a presença de qualquer produto químico adicionado ao poço, (tal como descrito na secção de protocolo acima), então recomenda-se a fazer um congelamento de inflamação do cérebro para preservar os compostos administrados. Figura 4 > Mostra um resultado representativo de usar essa abordagem. A administração com um polímero fluorescente de 40 kDa (dextrano conjugado tetramethyrhodamine) durante 24 horas mostra difusão visível no tecido cerebral. Os resultados anteriores com dextrano mostra a difusão para dentro do tecido cerebral, é o tempo eo peso molecular dependente 18. Moléculas menores difundem-se para o parênquima cerebral numa maior extensão do que as maiores e uma maior dosagem de tempo resulta em uma quantidade maior de difusão para todos os pesos moleculares que nós testamos. Se o congelamento flash é feito é importante para montar os slides após o corte e não expô-los a qualquer solução. Qualquer líquido vão solubilizar o composto administrado e difundi-la através da área de superfície da fatia de cérebro. Se imuno-histoquímica é para ser realizado sobre o cérebro, então é recomendado para perfundir o rato para fixar o tecido cerebral.
iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Figura 1. Imagens do procedimento de colheita de septo nasal. A) A localização do local de perfuração no crânio de um rato sacrificados. As linhas pontilhadas indicam o perímetro para perfurar. B) O septo nasal logo após a remoção cirúrgica. C) O septo nasal após a remoção de excesso de tecido. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Imagens cirúrgicas do processo de enxerto. A) O local de intervenção cirúrgica após craniotomia e durotomy. A imagem é representativo do que o crânio deve ser parecido antes de colocar o enxerto em cima dele. B) Colocação do enxerto mucosa no site craniotomia. A linha a tracejado indica o perímetro do enxerto. A imagem mostra a área de superfície desejada do enxerto. C) Implantação da barreira protectora de nitrilo. O tamanho do material, conforme mostrado é grande o suficiente para cobrir o enxerto, mas não grande o suficiente para interferir com a sutura. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Imagens cirúrgicas do processo de dosagem de drogas. A) Um exemplo do que o enxerto da mucosa parece curado após limpeza rigorosa do local da cirurgia. B) Imagem do bem ligado ao crânio. A interface do crânio e assim é garantidocom cianoacrilato e do poço é preenchido com uma solução salina estéril. O nível da solução estável indica que não há vazamento do poço e a claridade da solução indica a ausência de contaminação da solução com adesivo. C) A imagem da cirurgia completa. O poço contém a solução de dosagem e é firmemente tapado com uma barreira de borracha nitrílica. O cimento ósseo está no local para enrijecer o bem implante. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. Imagem de microscópio fluorescente de uma fatia de cérebro de rato após a administração transmucosa de 40 kDa com tetrametilrodamina conjugado com dextrano durante 24 horas. A fatia foi tirada a -1,06 mm do bregma, com uma espessura de 501; m. O enxerto da mucosa é visível sobre a superfície do cérebro. Bar = 1 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A etapa mais difícil do processo aqui descrito é o sucesso da transferência de uma membrana mucosa de tamanho adequado para a superfície do cérebro. Este passo é feita significativamente mais fácil se o septo nasal colhido é suficientemente grande e bem limpos. Se a porção ventral do septo é truncado, um novo enxerto deve ser obtida. O ângulo de perfuração deve ser perpendicular à cabeça de rato para assegurar que a membrana da mucosa não é danificado pela broca. Se um caminho mais largo do que a perfuração é feita recomendada será muito mais difícil de retirar o tecido extra que está ligado ao septo. Quaisquer grandes pedaços de tecido conjuntivo devem ser retirados com cortes de tesoura afiada ao invés de tentar puxá-los soltos. Pequenos pedaços de tecido pode ser removido por raspagem com a ponta de uma tesoura, desde que o tecido não está ligado à membrana da mucosa. No final do processo de limpeza, a superfície da cartilagem com a membrana ainda ligado deve ser exposto. Occanalmente a cartilagem do septo pode soltar-se a partir do osso que está ligado a no bordo dorsal. Se isso acontecer, ainda é possível utilizá-lo na fase seguinte no entanto, é mais difícil por dois motivos. O osso é um identificador conveniente para segurar o explante durante a limpeza e transferi-lo. Uma vez removido, é mais difícil de manobrar a folha de cartilagem mais delicada. Em segundo lugar, a junção cartilagem-osso é o local onde a membrana mucosa é mais grossa e mais fácil de obter ao removê-lo a partir da cartilagem. Se o osso é cortado a partir da cartilagem esta porção de membrana perde-se.
Uma vez que o enxerto tenha sido limpa do septo e a craniotomia e durotomy ter sido realizada, a membrana mucosa pode ser colocado sobre a superfície exposta do cérebro. Este é melhor conseguido através do posicionamento do explante adjacente ao local da craniotomia. A membrana pode então ser puxado a partir de cartilagem, para o crânio, e sobre o cérebro. Muitas coisas podem dar errado durante este process. A membrana pode secar, se rasgado, dobre em cima de si, ou Monte. Além disso, a membrana que cobre o outro lado do septo pode ser danificado pelo atrito contra o crânio. É também possível que, na tentativa de remover a membrana da mucosa voltada para cima, um remove as membranas a partir de ambos os lados ao mesmo tempo. A fim de evitar todos esses problemas é crucial para mover a membrana lentamente e sempre observar ambos os lados do septo. A melhor estratégia é usar as pontas de uma tesoura para retirar a membrana da folha de cartilagem antes de tentar deslizar para fora. Se alguma parte da membrana permanece ligada, é possível que a elasticidade do tecido irá retrair depois puxando-o. Usando pequenas, puxando movimentos da membrana pode ser isolada a partir do septo. Só então ele prontamente escorregar. A membrana é muito fina e de ser capaz de ser manipulado com uma pinça; isto só pode ser puxado a partir de uma superfície para outra. Se ele fica virado ou dobrado sobre si mesmo,deve ser descartado e outro deve ser obtida.
Se o enxerto cobre toda a superfície do cérebro exposto, o processo foi bem sucedido e do couro cabeludo pode ser suturada, para que o local da cirurgia pode curar. Uma barreira nitrílica devem ser postas em prática para que a pele não entrar em contato com a membrana. Cuidados devem ser tomados para que a pressão não é exercida sobre o nitrilo ao suturar caso contrário, a posição do enxerto pode mover. Também tome cuidado para não suturar na nitrílica. A melhor maneira de certificar-se o material obedece é mantê-lo úmido com solução salina e certifique-se que fique plana em todo o sutura.
Uma vez que o enxerto tenha curado (3-7 dias), a cavidade contendo a solução de dosagem pode ser ligado ao crânio acima do enxerto. Ele pode ser fixado temporariamente ao crânio com cola adesiva e permanentemente com cimento ósseo. Uma vez que o cimento ósseo é aplicada, não será possível fazer as correções para o bem therefo posiçãore tudo otimização deve ser feito antes de sua aplicação. Uma vez que o poço está em posição e mantido no lugar com uma cola de cianoacrilato, deve ser preenchida com uma solução salina estéril. Se o procedimento foi realizado com sucesso o nível do líquido não vai mudar ea solução será clara. Se houver uma fuga, o nível irá cair e o local de onde a água escapou deve ser visível. Após a aplicação de mais adesivo sobre o local da fuga, mais salina deve ser adicionado para verificar o vazamento foi selado. Se o adesivo contamina a solução assim, um filme translúcido será visível na parte superior do nível do líquido. Se isto ocorrer, o poço deverá ser lavado várias vezes com solução salina, até a solução é clara. Além disso, uma troca de algodão podem ser utilizados para remover o filme de tocar a superfície do líquido. Apenas quando a solução é estável e bem claro que o cimento deve ser aplicado. Quando o cimento é seca, a solução salina do poço pode ser removido e substituído com solução de dosagem. Cuidados devem ser tomados paranão danificar a membrana ao pipetar para dentro e para fora do poço. Uma vez preenchido, o topo do poço deverá ser selada com um pedaço de nitrilo utilizando cola de cianoacrilato. É importante que o espaço restante entre a superfície da solução e a parte superior do poço. Isto irá assegurar que o adesivo não entre em contacto a solução ao colocar a barreira de nitrilo.
Uma vez que é o tempo para analisar o efeito do procedimento de dosagem, o cérebro deve ser removido e fotografada. Se imunohistoquímica para ser executada, a perfusão e o anticorpo padrão de coloração pode ser realizado. Se a localização do composto administrado deve ser determinada, é recomendável a piscar congelar o cérebro em solução de gelo / isobutano seco. Isto irá assegurar que a localização do composto nas fatias do cérebro é o mesmo que foi imediatamente antes da eutanásia.
O protocolo aqui descrito descreve um método para investigar a entrega da droga para o cérebro do rato através de um cirurgicamenteenxertado semipermeável da membrana mucosa 18. Isto é análogo ao resultado da cirurgia de remoção do tumor transnasal em humanos em que os defeitos da base do crânio são reparados com uma membrana mucosa nasal vascularizado 19,20. Usando este modelo de rato, agora é possível estudar como esses enxertos mucosas são capazes de contornar o BBB e permitindo a entrega da droga direto de alto peso molecular para o cérebro. Temos agora realizado este procedimento mais de 100 vezes. Crucial para este procedimento é a colheita bem sucedida de um enxerto de septo nasal de um ratinho dador e a transferência da membrana mucosa do enxerto sobre o rato de teste. Este procedimento, pela primeira vez, permite que testes pré-clínicos de terapêuticas de peso molecular elevado para uma variedade de distúrbios neurológicos e psiquiátricos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Benjamin S. Bleier MD é inventor liderança de métodos provisórias de administração de medicamentos para o sistema nervoso central de cobertura de patentes.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pela Fundação Mcihael J. Fox para Pesquisa 2011 Innovations Resposta Rápida de Parkinson Awards Program. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
| Drill bit | |||
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
| Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
| Eye ointment | |||
| Electric shaver | |||
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
| Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
| 5-0 Nylon suture thread | |||
| Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
| Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
| Dry ice |
References
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
