Heterotopisk Mucosal Engrafting Förfarande för direkt Drug Delivery till hjärnan hos möss

Summary

En musmodell av mänskliga endoskopisk skallbasen rekonstruktion har utvecklats som skapar ett semipermeabelt gränssnitt mellan hjärnan och näsan med hjälp av nasala mucosal transplantat. Denna metod gör det möjligt för forskare att studera leverans till det centrala nervsystemet av högmolekylära terapeutika som annars är uteslutna genom blod-hjärnbarriären när den administreras systemiskt.

Abstract

Leverans av läkemedel in i hjärnan hämmas genom närvaron av blod-hjärnbarriären (BBB), som begränsar passagen av polära och högmolekylära föreningar från blodet och in i hjärnvävnad. Några direkta leverans framgång hos människor har uppnåtts genom implantation av transkraniell katetrar; men denna metod är mycket invasiva och associerade med många komplikationer. En mindre invasiv alternativ skulle vara att ge läkemedlet till hjärnan genom en kirurgiskt implanterad, semipermeabla membran, såsom näsans slemhinna, som används för att reparera skallbasen defekter efter endoskopisk transnasal tumorborttagning kirurgi på människor. Drug överföring även om detta membran skulle effektivt kringgå BBB och diffundera direkt in i hjärnan och ryggmärgsvätska. Inspirerad av detta tillvägagångssätt, var en kirurgisk metod i möss utvecklade som använder en givare septal slemhinna engrafted över en extrakraniell kirurgisk BBB defekt. Denna modell har visat sig effektivtmedge passage av högmolekylära föreningar in i hjärnan. Eftersom ett stort antal läkemedelskandidater är oförmögna att korsa BBB, är denna modell värdefullt för att utföra preklinisk testning av nya terapier för neurologiska och psykiatriska sjukdomar.

Introduction

Vid behandling av neurologiska och psykiatriska sjukdomar är allvarligt hindras av förekomsten av blod-hjärnbarriären (BBB), som förhindrar över 95% av alla potentiella farmaceutiska medel från att nå det centrala nervsystemet ^1-3. Exempelvis Glial härledd neurotrofisk faktor (GDNF) har visat sig vara effektiv vid behandling av Parkinsons sjukdom när den injiceras direkt in i hjärnan, men är ineffektiva när de levereras systemiskt eftersom den inte kan tränga igenom BBB ^4-6.

Numerous närmade har utvecklats för att försöka kringgå detta problem. Förbättring av systemisk tillförsel av neurotheraputics har demonstrerats genom att använda läkemedelskonjugat innefattande antikroppar som är selektiva för transportproteiner belägna på hjärnans kapillära endotelet; Men denna metod inte har visat sig vara tillämplig för ett brett sortiment av läkemedel ^7,8. Dessutom har osmotiska öppnandet av BBB använts klinikally, men detta förfarande lider av systemisk läkemedelsdosering i motsats till en mer direkt leverans till hjärnan regionen av intresse ^9. Betydande ansträngningar har lagts ner på att optimera transnasal leverans i hopp om att det direkta målet hjärnan ^10-12. Även om vissa framsteg har gjorts, har avgörande resultat endast erhållits för läkemedel som har endogena receptorer, såsom insulin ^13,14. Dessutom mekanismen för transnasal leverans har varit kontroversiell med belägg indirekt inträde i hjärnan via luktsinnet neuron upptag eller genom blodomloppet ^11. Direct, transcranial leverans använder implanterbara katetrar har uppnåtts, men detta förfarande är mycket invasiva och associerade med ett stort antal komplikationer ^15,16. Till dags dato finns det ingen allmän, minimalt invasiv metod för att leverera högmolekylära föreningar in i hjärnan.

Presenterad häri är en murin kirurgiskt ingreppsom skapar en semipermeabel gränssnitt med hjärnan. Detta åstadkommes genom att engrafting en slemhinna explantatet ¹⁷ över ett kirurgiskt kraniotomi defekt i en mus. Med användning av detta förfarande har det visat sig att lösliga föreningar upp till 500 kDa kan levereras in i det centrala nervsystemet (direkt in i hjärnans parenkym och i cerebrospinalvätska) i både en tids-och molekylviktsberoende sätt ^18. Denna metod för att kringgå BBB är en modell för skallbasen defekt reparationer hos människor som använder vascularized slemhinnor transplantat för att reparera hål i skallen efter transnasal endoskopisk kirurgi ^19,20.

Protocol

Före operation se till att alla förfaranden som skall göras är godkända av IACUC och eventuella ytterligare etiska eller juridiska myndigheter och använda humana djurbehandlingspraxis. Detta inkluderar användning av sterila kirurgi förhållanden, anesthetizing musen med hjälp IACUC godkänd metod, smörj möss ögon med veterinär salva under operation, och ge postkirurgisk vård. Fortsätt inte med operation om det finns någon fråga om aspekter av förfarandet är godkända. Alla ingrepp häri godkändes av Boston University Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Beredning av djur och kirurgiska tillbehör

1. Autoklav alla kirurgiska instrument som kommer att användas under operationen.
2. Se till att alla tekniker som ska utföras är godkända av djur tillsynsmyndigheter.

2. Skörd av Mucosal Graft

1. Valde en genetiskt identisk mus i samma ålder somden experimentella musen och avliva den i en IACUC godkänd metod (här: isofluran kvävning följt av halsdislokation).
2. Med hjälp av kirurgisk sax, ta bort huden runt näsan regionen mus huvudet exponera skallen.
3. Med en tryckluftsborr, märket med tre linjer varav två i sidled flankerar den nasala området och en tredje i linje med ögonen, som förbinder de två linjer vinkelrätt.
4. Borra ner ventralt i syfte att separera nässkiljeväggen från den omgivande vävnaden. En bredare väg kommer att förhindra skador på slemhinnan men det kommer också att göra det svårare att isolera membranet. En smal snitt närmare mittlinjen rekommenderas.
5. Använd en sax för att klippa septum fri från vävnad följt den och förvara den i en steril koksaltlösning. Vid denna tid kan rengöras transplantatet upp för att ta bort eventuella anslutna vävnad. Den ideala situationen är att ha oskadade slemhinnor exponeras på båda sidorna av brosk septum. En grakterut kan leverera membran för två möss förutsatt ytan av membranet är tillräckligt för att täcka kraniotomi webbplatser. Det rekommenderas att transplantatet används så snabbt som möjligt och forskaren fortsätter till steg 3 så snart som graften isoleras.

3. Kirurgisk implantation av Mucosal Graft

1. Med hjälp av standardiserade, aseptiska murina kirurgiska ingrepp, söva och montera en mus i stereologisk ram. Använd ca 2% isofluran i rent syre med hjälp av en gnagare anestesimaskin.
2. Immobilisera musen i en stereotaktisk apparat med örat barer och en näsa hållare. Applicera oftalmologiska salva för ögonen och skrubba hårbotten med Betadine och 75% etanol i tre omgångar. Använda antingen sax eller en hår trimmer, ta bort pälsen på huvudet. Exponera skallen med ett rakblad och plana huvudet. Utför en kraniotomi ovanför platsen för hjärnan som ska doseras. Till exempel, när du riktar striatum skär en 1,25 mmdiameter cirkulärt hål i skallen (centrerat på AP: 1,00 mm, ML: 0,88 mm) under användning av ett pneumatiskt borr. Blöt borrade området med steril koksaltlösning och använda ett rakblad för att ta bort skallen.
3. Avlägsna försiktigt dura hjälp av spetsen på en nål. Dessutom kan detta åstadkommas genom applicering av en minimal mängd av vävnad lim på den fuktiga durala ytan. När detta skikt har härdat, kan sidorörelse med ett rakblad spetsen användas för att avlägsna membranet.
4. Placera slemhinna ovanför hjärnytan tar mycket försiktig för att hålla den epiteliala sidan vänd bort från såret. Detta görs bäst genom att överföra hela septum på ytan av skallen intill kraniotomi platsen med pincett. Med användning av spetsen av ett par av kirurgiska saxar, dra membranet bort av brosk och på skallen och hjärnans yta. Låt inte membranet torka ut eller röra den med något absorberande material. Transplantatet bör frikostigt överlappa alla beniga kanter kraniotomi site.
5. Täck transplantatet med en steril bit av nitril. Detta verkar för att förhindra vidhäftning av huden för transplantatet under läkning. Nitrilen behöver vara tillräckligt stor för att täcka hela slemhinnan. Trim drivet membran om nödvändigt. Undvik att någon rörelse av nitrilen när den har kommit i kontakt med transplantatet.
6. Stäng huden med en kör 5-0 steril sutur och låter musen återhämta sig under 3-7 dagar innan du går vidare till nästa steg. Se till att inte störa den nitril barriären eller mucosal transplantat under huden stängning.

4. Administration av doseringslösning

1. Efter att ha säkrat den sövda mus i stereotaktisk ram, klipp suturen med en sax och ta bort överflödig hud runt skallen.
2. Ta av nitril barriären och rengör ytan av skallen. Använd sterila koksaltlösning och bomullspinnar för att rengöra området tills transplantatet är synlig. Det kan vara nödvändigt att skära transplantatet med ett rakblad om har blivit större än desired ytarea.
3. Om försöket blir längre än några dagar, är det klokt att implantera minst två skallen skruvar för att förstärka implantat i huvudet.
4. Placera väl över transplantatet så att kanterna är i kontakt med skallen. Applicera cyanoakrylatlim vid förbindelsen mellan brunnen och skallen. Fyll väl med steril koksaltlösning och kontrollera att det inte läcker. Brunnar är tillverkade av snitt kanyler.
5. Applicera bencement på skallen för att fästa väl på plats.
6. Ta ut saltlösning från väl med en pipett. Tvätta väl flera gånger för att kontrollera att limmet har inte läckt in till den önskade lösningen; i detta fall 50 fil av fluorescerande dextran användes. Man förväntar sig att vattenlösliga föreningar av en liknande polaritet kommer att bete sig på samma sätt som dextran. Leverans av hydrofoba föreningar eller suspensioner har inte undersökts med denna metod.
7. Cap toppen av brunnen med hjälp av ett cirkulärt stycke av nitrilen är fäst vidtop använda cyanoakrylatlim. Kontrollera att limmet inte kommer i kontakt med brunnens innehåll.

5. Analys av transmukosal tillförsel

1. Efter önskad tid har gått, söva musen och utbyta väl innehållet med en lösning av Evans blå färg. Detta färgämne används för att verifiera att transplantatet var intakt.
2. Efter 30 min, söva musen tungt, avlägsna färgämneslösningen, och avliva genom halshuggning.
3. Manuellt ta bort implantatet och ta bort hjärnan med kirurgisk sax. Var noga med att hålla transplantatet på plats.
4. Efter uttagningen flash-frysa hjärnan i en lösning av isobutan kyldes i ett torris-bad.
5. Bädda in hjärnan i Optimal Cutting Temperature (oktober)-lösning och skiva vid 50 um.
6. Placera önskad segment direkt på ett objektglas.
7. Bild segmentet med hjälp av en fluorescensmikroskop så snart oktober lösningen har torkat.

Representative Results

Att få en tillräckligt stor nässkiljeväggen Explantation är avgörande för de följande stegen. Detta kan åstadkommas genom att borra vid läget på givarens musens skalle visas i fig 1a. Cutting på denna väg kommer att producera ett explantat av tillräcklig storlek som visas i figur 1b. Om borrdjupet är inte djupt nog, kommer transplantatet bli stympade och det kommer att bli svårt att få ett tillräckligt stort membran för att täcka hjärnans yta. Borrning mer i sidled än den föreslagna vägen inte rekommenderas därför att mer vävnad kvar på näsans skiljevägg, och nästa steg kommer att bli svårare. Före överföringen av slemhinnan, varvid ytan hos skiljeväggen behöver rengöras av allt överskott av bindväv. När detta är gjort, bör slemhinnan vara synliga på ytan av brosket. Figur 1c visar vad vävnaden ser ut efter rengöring.

Före överföring av membrane, en kraniotomi och durotomy behöver utföras för att exponera hjärnytan. Först efter det att post-durotomy blödningen har upphört kan membranet överförs. Figur 2a visar vad operationsstället ska se ut innan det fortsätter till nästa steg. Överföra slemhinnan från brosk på hjärnans yta är det mest tekniskt utmanande steget i hela kirurgiska ingrepp och bör göras noggrant. Om den skördade septum är tillräckligt stor, bör ytarean av den mukosala transplantatet vara tillräckligt stor för att täcka hjärnans yta. När förts, bör det kirurgiska området ser liknande den i figur 2b. Det är viktigt att se till att den sida av membranet som är i kontakt med brosk är samma en som är i beröring med hjärnans yta. Om membranet blir vänt över eller viks över sig själv, ska det kasseras och en annan en bör användas. När detta steg är slutförd kan hårbottnen sysså att musen kan återhämta sig och transplantat kan läka. För att förhindra eventuella negativa reaktioner från transplantatet som kommer i kontakt med den inre ytan av hårbotten, bör en bit skyddande nitril placeras ovan till operationsområdet. Såsom visas i figur 2c, bör det införda stycket vara tillräckligt för att täcka membranet stora men inte tillräckligt stor för att hindra suturering av huden stängdes.

Under återhämtningsperioden, kraftig vävnad i-tillväxt sker i den omgivande periostet som måste avlägsnas före dosering membranet. Efter att åter öppna hårbotten, kommer sterila bomullstoppar och koksaltlösning måste användas för att rengöra platsen tills det ser liknande den i figur 3a. Vi har inte observerat någon betydande immunsvar; men detta har inte bekräftats histologiskt. Transplantatet kan behöva skäras med ett rakblad, om den har vuxit över ytan av skallen. I detta skede den brunn som innehåller doseringslösningning skall implanteras ovanför transplantatet. Flera skallen skruvarna kan sättas in i detta steg om långsiktig mekanisk stabilitet av implantatet är ett bekymmer. Kontrollera att den väl är placerad så att den inte vidrör transplantatet. Väl på plats kan cyanoakrylatlim appliceras limma den mot skallen. För att förhindra bindemedlet från att komma i kontakt med transplantatet bör anbringas på ytan av brunnen och trycks nedåt för att täta mellanrummet. När det väl är säker, ska den fyllas temporärt med koksaltlösning för att både hydrat transplantatet och leta efter läckor. Den följs väl ska se ut som i figur 3b och lösning bör vara tydligt indikerande att den inte innehåller något bindemedel. Eventuella läckor är uppenbart eftersom vätskenivån i brunnen kommer att sjunka. Om läckage upptäcks måste de fästas med mer lim. Borrningen är därefter förstärkt med bencement. Vid denna punkt saltlösning i brunnen kan avlägsnas med en pipett ochersättas med den önskade doseringslösning. När täcker väl med en bit av nitril försiktighet bör vidtas för att se till att limmet inte kommer i kontakt med lösningen i brunnen. I slutet av hela förfarandet, bör musen huvudet ser ut som i figur 3c. Bencementen är något genomskinligt därför om innehållet i brunnen är ljuskänsliga, färgämnet eller bläck kan tillsättas till ytan av den torkade cement eller cementblandning för att förhindra ljusnedbrytning av brunnsinnehåll.

Efter den önskade perioden av väntetiden bör hjärnan analyseras för att upptäcka effekterna av dosering. Hjärnan bör behandlas på olika sätt beroende på vad som undersöks. Om syftet med förfarandet är att analysera förekomsten av någon kemisk till brunnen, (som beskrivs i protokollet avsnittet ovan) är det rekommenderat att göra en flash frysning av hjärnan för att bevara de administrerade föreningar Figur. 4 > Visar ett representativt resultat av att använda denna metod. Dosering med en 40 kDa-fluorescerande polymer (tetramethyrhodamine konjugerat dextran) under 24 timmar visar märkbar diffusion in i hjärnvävnaden. Våra tidigare resultat med dextran show diffusion in i hjärnvävnaden är både tids-och molekylvikt beroende ^18. Mindre molekylerna diffunderar in i hjärnparenkymet i större utsträckning än de större och större doseringstiden resulterar i en större mängd av diffusion för samtliga molekylvikter som vi testade. Om flash frysning görs är det viktigt att montera bilderna efter snittning och inte utsätta dem för någon lösning. All vätska kommer att solubilisera den administrerade föreningen och diffundera den över ytan av hjärnan slice. Om immunohistokemi skall utföras på hjärnan så är det rekommenderat att BEGJUTA musen för att fixera hjärnvävnaden.

iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Figur 1. Bilder av nässkiljeväggen skörd förfarande. A) Placeringen av borrplats på skallen av ett avlivas mus. De streckade linjerna anger omkretsen att borra. B) nässkiljeväggen direkt efter kirurgiskt avlägsnande. C) nässkiljeväggen efter att ta bort överflödig vävnad. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Kirurgiska bilder av engrafting processen. A) I operationsområdet efter kraniotomi och durotomy. Bilden är representativt för vad skallen ska se ut innan produkten släpps transplantatet på den. B) Placering av slemhinnan transplantat vidare till kraniotomi platsen. Den streckade linjen visar omkretsen på transplantatet. Bilden visar den önskade ytan av transplantatet. C) Implantation av den skyddande nitril barriär. Storleken på materialet som visas är tillräckligt för att täcka transplantatet stor men inte tillräckligt stor för att störa suturering. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Kirurgiska bilder av läkemedelsdoseringsprocessen. A) Ett exempel på vad det läkt mucosal transplantat ser ut efter noggrann rengöring av operationsområdet. B) Bild väl fäst vid skallen. Gränssnittet av skallen och väl är fästmed cyanoakrylatlim och brunnen är fylld med steril koksaltlösning. Den stabila lösningen nivån indikerar några läckor från brunnen och tydligheten i lösningen indikerar ingen förorening av lösningen med lim. C) Bilden av avslutad kirurgi. Borrningen innehåller doseringslösningen och är ordentligt tillsluten med en nitril barriär. Bencement är på plats för att förstyva implantatet väl. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Fluorescerande mikroskop bild av en mus hjärna skiva efter transmucosal dosering med 40 kDa tetrametylrodamin konjugerat dextran under 24 timmar. Segmentet togs på -1,06 mm bregma med en tjocklek av 501, m. Den mukosala transplantat är synliga på ytan av hjärnan. Bar = 1 mm. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Det svåraste steget i det förfarande som beskrivs häri är framgångsrik överföring av en tillräcklig storlek slemhinna på hjärnans yta. Detta steg görs betydligt enklare om den skördade nässkiljeväggen är tillräckligt stor och väl rengjorda. Om den ventrala delen av skiljeväggen är stympad, bör en ny graft erhållas. Borrvinkeln skall vara vinkelrät mot den mus huvudet för att säkerställa att slemhinnan inte skadas av borren. Om en mer omfattande än rekommenderad borrvägen tas kommer det att bli mycket svårare att ta bort den extra vävnad som är ansluten till membranet. Alla stora bitar av bindväv bör tas bort med vassa sax skär snarare än att försöka dra loss dem. Små bitar av vävnaden kan avlägsnas genom skrapning med spetsarna på sax tillhandahålls vävnaden är inte ansluten till slemhinnan. Vid slutet av reningsprocessen bör broskytan med membranet fortfarande fäst exponeras. Occaprovisoriskt den septal brosk kan lossna från det ben som den är ansluten till på den dorsala kanten. Om detta inträffar är det fortfarande möjligt att använda den i nästa steg men det är mer utmanande för två skäl. Benet är ett bekvämt handtag att hålla Explantation vid rengöring och överföra den. Efter uttagningen är det svårare att manövrera mer känsliga brosk blad. För det andra är det brosk-ben korsning där slemhinnan är tjockast och lättast att få när du tar bort det från brosket. Om benet avskiljs från brosket detta parti av membranet är förlorad.

När septal transplantat har rengjorts och kraniotomi och durotomy har utförts, kan slemhinnan placeras över den exponerade hjärnytan. Detta uppnås bäst genom att placera explantatet i anslutning till kraniotomi stället. Membranet kan sedan dras ut från brosk, till skallen, och över hjärnan. Många saker kan gå fel under denna proceser. Membranet kan torka ut, få rivas, vik på toppen av sig själv, eller gäng upp. Även membranet som täcker den andra sidan av skiljeväggen kan skadas från gnidning mot skallen. Det är också möjligt att i ett försök att ta bort den uppåt vända slemhinna, tar bort ett av membranen från båda sidor samtidigt. För att undvika alla dessa problem är det viktigt att flytta membranet långsamt och alltid iaktta båda sidor av membranet. Den bästa strategin är att använda spetsarna på en sax för att få bort membranet från broskbladet innan du försöker dra bort det. Om någon del av membranet förblir fäst, är det möjligt att elasticiteten hos vävnaden dras automatiskt in efter att dra i den. Genom att använda små, tugging motioner membranet kan avlägsnas från septumet. Först då blir det lätt att glida av. Membranet är för tunn för att kunna hanteras med pincett; den kan endast dras ut från en yta till en annan. Om det blir vänt över eller vikta över sig själv, detska kasseras och en annan en bör erhållas.

Om transplantatet täcker hela ytarean av den exponerade hjärnan, processen var lyckad och hårbotten kan sutureras så att operationsstället kan läka. En nitril barriären skall införas så att huden inte kommer i kontakt med membranet. Man måste vara försiktig så att tryck inte utövas på nitril vid suturering annars transplantatet läget kan röra sig. Var också noga med att inte sy in i nitril. Det bästa sättet att se till att materialet lyder är att hålla den fuktig med koksaltlösning och se till att den håller sig platt hela suturering.

När graftet har läkt (3-7 dagar) i brunnen innehållande doseringslösningen kan fästas till skallen ovanför transplantatet. Det kan fästas tillfälligt till skallen med självhäftande lim och permanent med bencement. När bencement tillämpas kommer det inte att vara möjligt att göra några korrigeringar av bra läge therefore alla optimering måste göras innan dess tillämpning. När den väl är i läge och hålls på plats med cyanoakrylatlim, bör den vara fylld med steril koksaltlösning. Om förfarandet utfördes framgångsrikt vätskenivån inte kommer att förändras, och lösningen blir klar. Om det finns en läcka, kommer nivån sjunka och var där vattnet flydde ska vara synligt. Efter tillämpning mer lim på läckan plats, bör saltare sättas för att kontrollera läckan förseglades. Om limmet kontaminerar väl lösningen kommer en genomskinlig film vara synlig på den övre delen av vätskenivån. Om detta inträffar brunnen skall tvättas flera gånger med koksaltlösning till dess att lösningen är klar. Dessutom kan en bomullstops användas för att avlägsna filmen genom att trycka på det till vätskeytan. Endast när väl lösningen är stabil och klar bör cementen appliceras. När cementen är torr, kan saltlösningen från brunnen tas bort och ersättas med doseringslösning. Försiktighet bör vidtas för attinte skada membranet vid pipettering in i och ut ur brunnen. När fyllda, bör toppen av brunnen förseglas med ett stycke av nitrilen med användning av cyanoakrylatlim. Det är viktigt att utrymmet som är kvar mellan ytan på lösningen och den övre delen av brunnen. Detta kommer att säkerställa att limmet inte kommer i kontakt med lösningen när du sätter på nitril barriären.

När det är dags att analysera effekten av doseringsförfarandet måste hjärnan avlägsnas och avbildas. Om immunohistokemi är som skall utföras, kan standard perfusion och antikroppsfärgning ske. Om placeringen av föreningen doseras skall fastställas, rekommenderas att blinka frysa hjärnan i en torris / isobutan lösning. Detta kommer att säkerställa att placeringen av föreningen i hjärnan skivor är det samma som det var omedelbart före eutanasi.

Protokollet som beskrivs häri, beskriver en metod för att undersöka läkemedelstillförsel till mushjärnan genom ett kirurgisktympad semipermeabla slemhinnan ^18. Detta är analogt med resultatet av transnasal tumör avlägsnande kirurgi i människor där skallen bas defekter repareras med en vaskulariserad nasal slemhinna ^19,20. Med hjälp av denna musmodell, är det nu möjligt att studera hur dessa slemhinnor transplantat är kapabla att kringgå BBB och möjliggör direkt hög vikt läkemedelstillförsel till hjärnan molekylära. Vi har nu utfört denna procedur över 100 gånger. Avgörande för detta förfarande är den lyckade skörden av en nasal septal transplantat från en donator mus och överföringen av slemhinna från transplantatet på prov musen. Detta förfarande, som för första gången gör det möjligt för preklinisk testning av högmolekylära terapi för en rad olika neurologiska och psykiatriska sjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice