Introduction
ניטור פעילות עצבית בבעלי חיים ערניים המעורבים באופן פעיל במשימה התנהגותית הוא קריטי להבנת התפקוד והארגון של מערכת העצבים. הקלטה תאית של הפעילות החשמלית מיחידות עצביות אחת כבר זמן רב כלי עיקרי של מדעי מוח ומערכות עדיין נרחב בשימוש כיום. מגוון רחב של סוגי אלקטרודה ותצורות זמינים בהתאם לדרישות המדעיות וטכניות של ניסוי מסוים. כרוני מושתל microdrives או מערכי אלקטרודה משמשים לעתים קרובות בבעלי חיים לנוע בחופשיות, כוללים ציפורים, מכרסמים, ופרימטים שאינם בני אדם 1-4. לחלופין, חדירות חריפות עם microelectrodes מתכת או זכוכית באמצעות micromanipulator חיצוני משמשות לעתים קרובות כדי להקליט מבעלי חיים מורדמים או-מרוסן ראש. יש לי אלקטרודות micropipette זכוכית היתרון שהם יכולים לשמש בjuxtacellular או "תא מצורף" תצורה לבודד באופן חד משמעיפעילות של נוירונים בודדים ללא סיבוכים של ספייק פוסט הוק-מיון 5. אלקטרודות אלה נוספים מאפשרות הקלטה מהתאים או במקומות אנטומית-מזוהים, כפי שהם יכולים להשתמש בהם כדי להזריק פיקדונות קטנים של קליעים נותבים צבע או neuroanatomical, או אפילו כדי למלא את הפרט נרשם תא. תצורה זו יושמה בהצלחה בחולדות, עכברים וציפורים 6-10. הטכניקה המתוארת כיום מתמקדת בניטור juxtacellular ופיקדונות צבע תאיים בכוננות, חולדות-מרוסן ראש. שים לב שתא בודד בניגוד juxtacellular ממלא, פיקדונות צבע אלה אינם מספקים מידע על מורפולוגיה של תאים או תחזיות axonal 11, אבל הם מאפשרים לוקליזציה אנטומי מדויקת לכ -50 מיקרומטר ו, ביקורתי, בעלי תשואה גבוהה באופן משמעותי בבעלי חיים ערניים. מידע בדבר תא בודד juxtacellular ממלא מסופק בכל זאת כאסטרטגיה חלופית לתיוג אנטומיים.
בקיצור,פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים. בשלב הראשון, החולדה התאקלמה לריסון גוף בגרב בד (איור 1) על פני תקופה של 6 ימים. בשלב השני, מנגנון משענת ראש (איור 2) ותא הקלטה מושתל בניתוח כזה שהחולדה יכולה להישמר במטוס stereotaxic במהלך פגישות מרובות שלאחר מכן הקלטה (איור 3); הליך זה מאפשר הנסיין למקד אזורים תת-קליפת המוח מסוימים של המוח למחקר אלקטרו מבוסס על התייחסות סטנדרטית קואורדינטות 12. השלב השלישי כולל הצבת העכברוש בלנענע מתאים לביצוע ניסויים התנהגותיים ואלקטרו (איור 4), בניית האלקטרודה מצינור נימי קוורץ (איור 5), מה שהופך את הקלטות עצביות juxtacellular שבאופן חד משמעי לבודד יחידות בודדות 6-9, ו סימון locati אנטומייםבאתר ההקלטה עם צבע שיקגו סקיי בלו (איורים 6 ו -7). ההקלטות מבוצעות עם ניטור התנהגות בו-זמנית; עם זאת, לפרטים הטכניים של ההתנהגות יהיו תלויים במטרות המדעיות של כל ניסוי ולכן הם מעבר להיקף של פרוטוקול יחיד. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, שניתן לחזור על ימים מרובים, החיה מורדמים. המוח מופק ומעובד על פי טכניקות neuroanatomical סטנדרטיים או באמצעות שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולי ניסוי בוצעו על חולדות נקבות ארוכות אוונס (250-350 גר ') בהתאם להנחיות טיפול בבעלי החיים ושימוש שנקבעו פדרלי ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו.
1. להתאקלם העכברוש לגוף איפוק
הערה: מניחים את החולדה בדיאטה מוגבלת. להאכיל את העכברוש פעם ביום באופן מיידי לאחר כל פגישת טיפול יומית להסתגל החולדה לריסון (שיפורט להלן). לספק מספיק מזון כדי לשמור על בעלי החיים ב- 80% מהמשקל ההתחלתי שלה. סכום זה הנו כ 6 גרם של מזון ליום לחולדה הארוך אוונס 250 נקבת g.
- להסתגל החולדה למטופל על ידי בני אדם. בעדינות לרסן את החולדה ביד לתקופות של כ 5 שניות כל 30 שניות. לעשות את זה במשך 15 דקות ביום על 2 ימים רצופים. לפקח על החולדות יומיות לסימנים של לחץ בתקופת ההכשרה. סימנים כוללים נאבקים iתגובת n לאיפוק, ניקוד, ושיניו נוקשות.
- ביום 3 rd, למקם את העכברוש בגרב בד-מגבילים גוף (איור 1) במשך 15 דקות ביום על שני ימים רצופים.
- ביום ה -5, מניח את החולדה בתוך הגרב, ולמקם את הגרב בתוך צינור נוקשה על לנענע הניסוי (איור 4). השאר את העכברוש בצינור במשך 15 דקות ביום על 2 ימים רצופים.
- להאכיל את העכברים מייד לאחר כל אימון. בסוף הפגישה האחרונה (יום ה 6) לתת גישה חופשית למזון. בחר להשתלה רק אלה חולדות שלא מראים סימנים של לחץ מוגזם על יום האימונים האחרון.
הערה: למרות שהבחירה של חולדות להשתלה היא סובייקטיבי, בידיים שלנו מעל 90% מחולדות נמצאו להיות קשובים להתרגלות ותוכל לעבור השתלה.
2. השתלת מנגנון הקלטת הלשכה וראש-איפוק
- הפוך מחדשference חוט על ידי הלחמה חוט נירוסטה חשופה לפינים. חותך את החוט כך ששרידי 3-5 מ"מ נחשפו על ידי הסיכה. החיטוי חוט ההתייחסות, יחד עם כל הכלים כירורגיים.
- לנהל קטמין / הרדמה xylazine. לנהל 95 מ"ג / קילוגרם קטמין מעורבב עם 5 מ"ג / קילוגרם xylazine intraperitoneally. המינון הראשוני נמשך ½ 1 עד 2 שעות. להשלים את כל ההרדמה דקות 30-45 לאחר מכן, במידת הצורך. לשמן את עיניו של בעל החיים עם משחת עיניים.
- בדוק את רפלקס נסיגת הבוהן כדי לקבוע את המטוס של הרדמה, ולשמור על הרדמה במידת צורך.
- מניחים את החולדה במסגרת החזקת stereotaxic עם ברים אוזן (איור 3 א). לגלח את השיער על הראש ולחטא את הפצע עם אתר povidone- יוד (פתרון של 10%). דואג להכניס את הברים האוזן כראוי, כך שהם לא גורמים נזק לעור התוף. ברים אוזן עם טיפים בוטים עדיפים.
- עושה חתך עם אזמל approxiשל דבר לאורך קו האמצע של הגולגולת מרמת rostro- הזנב של העיניים לחלק האחורי של האוזניים. השתמש במספריים כדי לחתוך ולהסיר רצועת 2-3 מ"מ של עור בכל צד של החתך.
- לגרד מן periosteum לחשוף את פני השטח של הגולגולת לרכסים לרוחב. מכסה את הגולגולת החשופה עם שכבה דקה של דבק מגע.
- לקדוח חור קטן, בקוטר מעט קטן יותר מ0-80 ברגים, באמצעות בר תרגיל ½ מ"מ קוטר (ראה סעיף חומרים). לקדוח החור אחורי מייד למקום שבי תפר גבחת עומד ברכס לרוחב, ובזווית 30-45 מעלות לתוך הגולגולת, כך שהבורג יכול ללכת עם הראש יותר לרוחב מאשר לתחתית.
- לדפוק בבורג 0-80 מכונה בעלת תחתונה לחור (תור כ 3), ב30-45 מעלות זווית. היזהר שלא ידפקו בעמוק מדי כדי למנוע נזק לרקמת המוח הבסיסי.
- חזור על תהליך זה עבור 6 ברגים נוספים בתצורה מוצגים
- הנח מחט מזרק במניפולטור stereotax. מדוד מתפר גבחת, ולעשות שקע בגולגולת עם המחט ליד, אבל מחוץ למיקום craniotomy הרצוי, כסימן הפניה.
הערה: בהפגנה זו, קואורדינטות stereotaxic של הסימן 3 מ"מ אחורי ו -1 מ"מ לרוחב תפר גבחת. - סמן את השקע עם סמן קבע. שים לב לקואורדינטות stereotaxic של הסימן, כפי שהוא ישמש כנקודת התייחסות stereotaxic (איור 3).
- הפוך craniotomy התמקד בקואורדינטות הרצויות (האחורי 3 מ"מ ו -3 מ"מ לרוחב גבחת בדוגמא זו). השאר את מאטר הדורה ללא פגע. מכסה את craniotomy עם נוזל השדרה מוחין מלאכותי שונה (125 מ"מ NaCl, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, 3.1 מ"מ CaCl 2, 1.3 מ"מ MgCl 2, pH 7.4) 13 (איור 3 ג). חותך צינור 0.2 מיליליטר צנטריפוגות - 4, 5 מ"מ באורך, ולנתק את הכובע. מניחים את הצינור על הגולגולת ולמרכז אותו על פתיחת הגולגולת.
- החל מלט שיניים סביב החלק התחתון של הצינור כדי לאטום את הבסיס של הצינור לגולגולת. היזהר שלא ידלפו מלט לפתיחת הגולגולת החשופה (איור 3D).
- לקדוח חור נוסף קטן (כ ½ מ"מ קוטר) בצלחת הגולגולת הנגדית והכנס את חוט ההתייחסות בזהירות. לבנות את חוט ההתייחסות ידי הלחמה פינים ממשקים עם מגבר ההקלטה לקצה של החוט (ראה סעיף ציוד). אל תזיז את חוט התייחסות פעם אחת זה במוח כעלול לגרום לניזק זה.
- החל דבק מגע לחור שבו החוט הוכנס. זה לאטום את הסיכה ותיל במקום באופן זמני.
- מערבבים את שני חלקים של ערכת ג'ל סיליקון (ראה סעיף חומרים) במנות שווה בערך. המתן שתי דקות לערבוב וfill צינור צנטריפוגות כ ⅓ מלא עם ג'ל.
- צרף הודעה זווית מהדק תקין (ראה סעיף חומרים) לבר משענת הראש. צרף את צלחת הראש (איור 2 א) לבר ההחזקה (איור 2) בזווית של 45 מעלות המגרש, כך שהחלק התחתון של הצלחת הוא לכיוון אפו של בעל החיים. זה מועיל להשתמש שיפוע כדי לקבוע את זווית המגרש כדי להתאים את זה של לנענע ניסוי (איור 4).
- צרף את בר ההחזקה לזרוע מניפולטור stereotax כך שהבר מקביל לברים האוזן. מנמיכים את בר וצלחת כך שהצלחת היא אחורית של התפר למבדה וקדמית לזנב ביותר-הבורג.
- לתפוס את ראש הבורג הקדמי (8-32 הרבעה או בורג, ראה סעיף חומרים) בכ -45 ° זווית עם זרוע ותפס ידיים עוזרת, כך שהראש של הבורג פונה כלפי מטה וכיוון הזנב של החיה. מנמיכים את הבורג כך שהוא נוגע בנמליםerior 0-80 ברגים (איור 3F, G).
- לאבטח את הבורג וצלחת במקום עם אקריליק שיניים. החל אקריליק שיניים סביב ראשי בורג עצם, סיכת התייחסות, וסביב הצדדים של צינור צנטריפוגות. חכה כ 10 דקות לאקריליק השיניים לייבוש (איור 3H).
- למרוח שכבה של דבק דנטלי מסביב לקצוות של אקריליק השיניים, מלט העור לשתל. חכה לבטון לייבוש.
- נקוב כמה חורים במכסה של צינור צנטריפוגות, והנח את הכובע על הצינור.
- הסר את מהדק הידיים עוזר. ואז להסיר בזהירות את בר מחזיק את הראש מstereotax, ולאחר מכן להסיר את צלחת ראש משורת (איור 3I).
- הסר את החיה מstereotax ולנהל טיפול ומעקב לאחר ניתוח בהתאם לכל הכללים, תקנות והחוקים החלים (לדוגמא, גבופרנורפין 0.02 / קילוגרם, כל שעה 8-12 למינימום של 24שעה). אם דלקת שמתפתחת סביב הקצוות של השתל, למרוח שכבה דקה של משחה אנטיביוטית לאתר המושפע מדי יום עד נפתר.
3. ניטור Juxtacellular יחידות עצביים
- משוך צינור נימי קוורץ על חולץ micropipette לייזר פחמן דו חמצני (ראה סעיף ציוד) בקטרים קצה של פחות מ 1 מיקרומטר (איור 5 א).
הערה: הפרמטרים החימום ישתנו בהתאם למכשיר המסוים, ושקוטר הצוואר הנדרש ישתנה בהתאם למבנה המוח של עניין. להקלטות בתלמוס חולדה, יש לי micropipettes צוואר החל 5-7 מ"מ. - אבטח את פיפטה במקום תחת מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מצויד ביעדי מרחק עבודה ארוכה. השתמש בפלסטלינה להחזיק פיפטה במקום בשלב של מיקרוסקופ.
- לאט לאט להזיז בלוק זכוכית (0.5-1 סנטימטר עובי; חתיכת הזכוכית המשמשת לMaking סכיני אולטרה microtome נוח) לשדה ראייה עם קצה פיפטה. שימוש micromanipulator השלב, לגעת בעדינות את קצה פיפטה לזכוכית, גורם לו לשבור. חזור על צורך עד הקוטר החיצוני קצה פיפטה הוא בין 1-3 מיקרומטר (איור 5 ב, ג). ודא שיש לי micropipettes אלה עכבות בין כ 5-15 MΩ.
- הכן מלוח תאי (135 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, 5 מ"מ HEPES, pH 7.2 עם NaOH) 8 ולהוסיף 2% (w / v) שיקגו שמיים כחולים. באמצעות מזרק עם מחט 30 G או קטן יותר, למלא את הקצה האחורי של פיפטה עם הפתרון. לחלופין, לתיוג juxtacellular תא בודד להוסיף 2% (w / v) Neurobiotin או אמין dextran biotinylated (BDA-3000 או BDA-10000) לתמיסת מלח במקום של שיקגו שמיים כחולים.
- מניחים את החולדה בתוך גרב הבד בתוך הצינור הנוקשה על לנענע ניסוי מתאים (
- צרף את צלחת הראש-מרסן על החולדה לכתבה על לנענע המקבילה. כדי לעשות זאת, להצמיד ראשון צלחת הראש-איפוק במקום, ולאחר מכן לאבטח אותו באמצעות בורג 4-40. הקפד לחכות עד שהחיה היא רגועה על מנת להימנע מהחלת מומנט מוגזם לראש. בשלב הבא, מקום אגוז 8-32 בבורג ריסון-הראש שמושתל בחולדה. אז בורג במוט פלדת אל-חלד הברגה לראש הבורג. הצמד את המוט ללנענע הניסיוני באופן כזה שהוא יכול להדק במקום (איור 4).
הערה: אבטחת החיה עם הראש-בורג, כמו גם את דקות צלחת הראש-איפוקimizes כיפוף של המנגנון ומשפר את יציבות הקלטה. ברוב המקרים הקלטה יכולה להתחיל ביום הראשון של בעלי החיים הוא-מרוסן ראש. עם זאת, אם בעל החיים בעצבנות יתר על המידה או vocalizes, לספק יום אחד של אימוני התרגלות הראש-איפוק לפני תחילת כל הקלטות. במקרה זה, להשאיר את החיה על לנענע במשך 15 דקות ולאחר מכן למקם אותו בחזרה בכלוב שלה. חזור על שלב זה ביום שלמחרת ולהמשיך בפרוטוקול.- פתח את תא ההקלטה ולהסיר את ג'ל סיליקון. נקה את פתיחת הגולגולת באמצעות מלקחיים בסדר אם רקמות מחדש גדלו בפתיחת הגולגולת.
- צרף את פיפטה micromanipulator הממונע, וחבר בקדם-מגבר headstage.
הערה: בהפגנה הנוכחית, מעגל ממסר קטן על headstage משמש למעבר בין החוטים להוביל מגבר ומקור זרם חיצוני עם תאימות גבוהה (איור 6 א-ג). שימו לב שיש כמה מגברים מתאימים מובנים במקור גבוה תאימות(ראה סעיפי דיון וחומרים).- השתמש micromanipulator הממונע כדי להזיז את הקצה של פיפטה לסימן המזוהה stereotaxically בחדר ההקלטה. שים לב לקואורדינטות של מיקום זה. היזהר שלא לשבור את הקצה של פיפטה בגולגולת.
- הזז את פיפטה למיקום הרצוי בהקלטת הצירים הקדמי, האחוריים וMedio-צדדיים. לאחר מכן לקדם את פיפטה ventrally דרך הדורה עד שהוא כ 500 מיקרומטר גב למיקום ההקלטה המיועד.
- לאט לאט לקדם את פיפטה בעת ההאזנה ללהתחדד אירועים על צג שמע של המתח המוגבר נרשם בין קצה פיפטה וחוט ההתייחסות. ברגע שאירועים להתחדד מזוהים, תמשיך לנוע מיקרומטר פיפטה 0-100 עד deflections מתח הולך חיובית יותר מאשר כ -500 μV הם נצפו.
הערה: התנגדות האלקטרודה תגדל בפקטור של כ 1.5-10 ש"שen זה מתרחש.- להתחיל בהקלטה אחת ליחידה כבר מבודדת כפי צעד 3.11, יחד עם כל אמצעים התנהגותיים ופיסיולוגיים האחרים של עניין. בהפגנה הנוכחית, תנועות vibrissa עצמית שנוצר בפיקוח עם צילום וידאו במהירות גבוהה (ראה סעיף חומרים).
- לתייג את אתר ההקלטה, לעבור את האלקטרודה מובילה להתחבר למקור הזרם. יש כמה דרכים לעשות את זה, או באמצעות מעגל ממסר (איור 6 א - ג), (איור 6 ד, ראה שלב 3.8 ודיון) מובנה במקור זרם במגבר, או באופן ידני. לעבור -4 מייקרו-אמפר עם 2 פעימות לשנייה ב 50% מחזור למשך 4 דקות להזריק iontophoretically שיקגו שמיים כחולים באמצעות פיפטה.
- הרוג ואנקב את החיה לאחר מספר הליכי תיוג על פי מקובל. סעיף המוח וcounterstain כנדרש כדי לזהות את המיקום האנטומי של ההקלטה לשבתדואר. Counterstain הרקמה לתגובתיות מונואמין ציטוכרום לפי 14. לחלופין, לזהות את פיקדונות שיקגו שמיים כחולים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: כדי להבדיל באופן מדויק בין יחידות שונות שכותרתו חשובה שכל התוויות נעשות עם אותו פיפטה באותו היום, ללא unclamping פיפטה בין תוויות. במקרה זה יכול להיות מובחן אתרי הקלטה על ידי המיקומים היחסי שלהם בהיסטולוגיה פוסט-הוק יחד עם קואורדינטות מניפולטור ציינו של כל אתר (ראה שלב 3.9). לזיהוי חד משמעי, לסמן את התוויות בהפרש של לפחות 200 מיקרומטר זו מזו, ולא יותר מ3-5 תוויות לאזור במוח. - צרף את צלחת הראש-מרסן על החולדה לכתבה על לנענע המקבילה. כדי לעשות זאת, להצמיד ראשון צלחת הראש-איפוק במקום, ולאחר מכן לאבטח אותו באמצעות בורג 4-40. הקפד לחכות עד שהחיה היא רגועה על מנת להימנע מהחלת מומנט מוגזם לראש. בשלב הבא, מקום אגוז 8-32 בבורג ריסון-הראש שמושתל בחולדה. אז בורג במוט פלדת אל-חלד הברגה לראש הבורג. הצמד את המוט ללנענע הניסיוני באופן כזה שהוא יכול להדק במקום (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יחידות עצביות בהמדיאלי אחורי הגחון (VPM) התלמוס לקודד את השלב של תנועת vibrissa במהלך עצמי שנוצר ומעיף 15,16. איור 7 א מציג מדגם פעילות spiking של יחידת התלמוס VPM כחולדה הנעים במהירות באופן פעיל. איור 7 מציגה היסטוגרמה של ספייק פעמים מיושרות לשלב המיידי של תנועת vibrissa 17. יש יותר קוצים בשלב ההכחשה של הנעים במהירות. לאחר ההקלטה, המיקום של היחידה שכותרתו באמצעות iontophoresis של צבע כחול השמיים שיקגו, כפי שמוצג באיור 7 ג. רקמת counterstained לפעילות מונואמין ציטוכרום כדי לחשוף את גבולות neuroanatomical של התלמוס VPM. גרסה דומה של פרוטוקול זה יושמה לאחרונה כדי לפקח על פעילות עצבית הקשורים multiunit-טאטא (10-20 מיקרומטר טיפים פיפטה הקוטר) בגרעיני גזע המוח ספציפיים 18.
מחדש 1 "src =" / קבצים / ftp_upload / 51,453 / 51453fig1.jpg "/>
איור 1: גרב הרחקה בד צילום (א) לגרב עכברוש עם שרוכים ואבזמי שרוך.. הקצה הקטן ממוקם בנוחות סביב עצם החזה, ואת הקצה הגדול סביב הזנב. דפוס (B) עיצוב לגרב ב1A פנל. מידות הן בסנטימטרים.
איור 2: תכנון מכאני של מנגנון משענת הראש () עיצוב מכאני של צלחת משענת ראש דיוק לחולדות.. מידות הן בסנטימטרים. תכנון מכאני של בר משענת ראש לשימוש עם הצלחת ב2A לוח (B). הפרוטוקול מחייב שני החלקים האלה, רכובים באמצעות הודעה מלחציים זווית ישרה באותה זווית המגרש._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הליך כירורגי עכברוש (א ') במסגרת החזקת stereotaxic (צעד פרוטוקול 2.4).. אתר כירורגי עם ברגים מושתלים וסימוני גולגולת (צעד פרוטוקול 2.10) (B). אתר כירורגי עם פתיחת גולגולת (צעד פרוטוקול 2.12) (C). אתר כירורגי עם תא ההקלטה (צעד פרוטוקול 2.14) (D). אתר כירורגי עם חוט ההתייחסות וג'ל סיליקון (צעד פרוטוקול 2.17) (E). (F, G) אתר כירורגי עם צלחת משענת הראש ובר שנערך במקום (צעד פרוטוקול 2.20). אתר כירורגי בעם צלחת ובר (H) מקובע במקום (צעד פרוטוקול 2.21). ראש-איפוק סופי (I) וimpl תא הקלטה(צעד פרוטוקול 2.24) נמלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. לנענע ניסויי תרשים של עכברוש בלנענע המכנית לניסויי ניטור אלקטרו והתנהגות (פרוטוקול הצעדים 3.5-3.6). לנענע מנצל את בר וצלחת באיור 2.
איור 5: בניית האלקטרודה Micropipette מיקרוסקופ (א) לmicropipette רצוף (צעד פרוטוקול 3.1).. סרגל קנה מידה הוא כמו במיקרוסקופ פנל ג (ב) לmicropipette הרצוף וגוש זכוכית תחת מיקרוסקופ (צעד פרוטוקול 3.2).ההשתקפות של הקצה ניתן לראות בזכוכית. סרגל קנה מידה הוא כמו במיקרוסקופ פנל ג (C) של micropipette שבורה (צעד פרוטוקול 3.3). (ד) מיקרוסקופ של קצה micropipette הרצוף באזור התאגרף של בר סולם א פנל הוא כמו בפנל א (ה) מיקרוסקופ של קצה micropipette שבורה באזור התאגרף של ג פנל אנא לחץ כאן ל להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. ציוד למעבר בין המגבר ומקור זרם Setup () כדי לעבור מוביל מהמגבר למקור הזרם דרך ממסר מגנטי (אופציונאלי). מעגלים מודפסים המכילים את מתג ממסר שבשליטת המתח הוא ATTACהד לבמה ראש המגבר. פריסה (B) ללוח המעגל המודפס ב6A פנל. הלוח מחבר את מוביל המגבר ומקור זרם מוביל לפינים של הכניסה של הממסר, והאלקטרודה מובילה לסיכות הפלט. האלקטרודה מחוברת לאו מקור הזרם או המגבר על ידי יישום 0 או 5 V לסיכות שליטת ממסר. מבט מלמטה. מידות הן בסנטימטרים. מבט לראש פריסת הלוח ב6B לוח (C). התקנה (ד ') כדי לעבור מוביל מהמגבר למקור הזרם באופן ידני (לא חובה) דורשת בעל פתוח פיפטה וחוט להוביל גמיש כמו אלה שהוצגו (ראה גם: סעיף ציוד). גישה זו היא אלטרנטיבה למעגל הממסר בלוחות 6 א-C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: התקנה ניסיונית ותוצאות נציג Spikes () ותנועת vibrissa מיחידה אחת (צעד פרוטוקול 3.12).. (B1) מנורמל vibrissa עמדה מול שלב במחזור להקציף. כל להקציף מנורמל כך שעמדת הזנב ביותר במהלך להקציף מוגדרת כאפס והעמדה מקורי ביותר שהוגדרה כאחד. המסלול מייצג את העמדה המנורמלת לעומת שלב מיידי במחזור 17 להקציף. כל המקצפים המזוהים על גבי זו. סריקה של השלב במחזור להקציף שבקוצים להתרחש (B2). כל ניסוי על הציר האנכי מייצג להקציף יחיד. היסטוגרמה (B3) של שיעורי ספייק עם שלב המחזור להקציף כבוד לאותה יחידה. מיקום (C1) של צבע שיקגו סקיי הכחול עם counterstaining מונואמין ציטוכרום (פרוטוקול הצעדים 3.13-3.14). (C2 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בנייה לנענע הניסיוני
התיאור של החלקים מכאניים המשמשים לבנייה לנענע הניסוי (איור 4) מושמט מן הפרוטוקול, כפי שהוא יכול להיות בנוי במגוון דרכים. בהפגנה זו סטנדרטית אופטו-מכאני חלקים ומהדק תמיכה משמש להר בר משענת הראש וצינור איפוק גוף (ראה סעיף חומרים). חלקי אופטו-מכאני דומים יכולים לשמש לעלות בעל אלקטרודה לmicromanipulator הממונע. חשוב שבר משענת הראש בלנענע הוא רכוב באותה זווית המגרש כבר משמש להשתיל את צלחת הראש-האיפוק במהלך ניתוח. אם האלקטרודה הוא להתרגש לאורך צירי stereotaxic סטנדרטיים, אז ציר x של האלקטרודה צריך לעבור במקביל לבר הראש-האיפוק, וציר z בניצב למישור המכיל למבדה וגבחת ומקבילה לקרקע ( סוגים של מגברים מתאימים ומקורות הנוכחיים יש מגוון של מגברים מסחריים ומקורות הנוכחיים, שניתן להשתמש לצורך הניסוי הזה. רוב מגברי אלקטרופיזיולוגיה התאיים ו תאיים עם מצב נוכחי מהדק שישיגו רווח כולל של 1,000X מתאימים. לiontophoresis של שיקגו סקיי כחול עם 1-3 טפטפות מיקרומטר, מקור זרם שיכול לספק עד 10 מייקרו-אמפר עם רזולוציה של לפחות 1 מייקרו-אמפר ותאימות של 100 V לפחות מומלץ. שים לב שיש כמה מגברים מסחריים מתאימים מובנים במקורות הנוכחיים (ראה חלקים חלופיים בסעיף חומרים). עם זאת, כדי לעקוף את הדרישה של מגבר / מקור זרם בשילוב מתאים, מעגל ממסר מגנטי יכול להיות מחובר לקצה הקדמי של מגבר headstage (איור 6 א - ג). כזה הוא מעגל optional אבל זה מאפשר הנסיין כדי לעבור בין המגבר ומקור זרם נפרד כדי לספק פולסים iontophoresis ללא perturbing האלקטרודה פיזי. גישה חלופית היא להחליף באופן ידני את החוטים להוביל אלקטרודה עם אלה המתחברים למקור הזרם. במקרה זה, עדיף להשתמש במחזיק פיפטה שאינו מצרף העליון (הסוף רצוף) של פיפטה, ולהשתמש בחוט להוביל גמיש (איור 6 ד). צעדים שיחייבו חזרו להתאמן ישנם מספר צעדים שעשויים לדרוש בפועל לשלוט. הצעד שדורש רוב כישרון הוא לשבור את קצה פיפטה. זה מועיל לצייר הקצה של גוש הזכוכית כדי להמחיש את ההשתקפות של הקצה בזכוכית. ואז אחד יכול להתקדם לאט הבלוק ופיפטה עד הקצה בקושי פוגש את ההשתקפות שלה. קידום פיפטה או לחסום מהר מדי יכול לנפץ את micropipette ולהפוך את קוטר קצה larg מדידואר או לא אחיד. אנו ממליצים להשתמש micropipettes עשוי קוורץ, כפי שתואר בפרוטוקול. ליטרים micropipettes ביעילות לחדור דורה עכברוש שלמה בcraniotomies מוכן כרוני ללא כיפוף או שבירה. זה מבטל את הצורך בכריתת דורה, אשר יכול לגרום לסיבוכים נוספים. micropipettes בורוסיליקט עם נרות קצרים (<5 מ"מ) גם לחדור את הדורה, אך השימוש בם מוגבל להקלטה ממבנים שטחיים כמו הקליפה או סטריאטום המוחי. הקלטה ממבנים עמוקים יותר, במיוחד בתלמוס או גזע המוח, דורש micropipettes המחודד, רצוי קוורץ הארוך. צעד שני שדורש תרגול הוא מיצוב פיפטה בתצורת juxtacellular. העברת פיפטה מהר מדי כאשר קרוב לתא יכול להיקרע הקרום. לכן, כדאי לעקוב אחר ההתנגדות של פיפטה לדעת כאשר הקצה קרוב לתא משוער. שינויים בהתנגדות קרום של לפחות פי 2 עולים כי האלקטרודה עשויה להיות near או נגיעה קרום תא. מלכודות נפוצות יש כמה מכשולים נפוצים לזכור. ראשית, משום שקצה פיפטה הוא בהכרח קרוב מאוד לתא, אפשר "לאבד" את התא אם פיפטה מתרחקת מן הקרום. אפשר גם לתא להיות נסער או קרע באמצע ההקלטה. אם כן, רוחב ספייק וקצב ירי עלול להגביר ומשרעת ספייק עלול להפחית. אלה הם סימנים לכך שהתא יכול להיות לא בריא. תנועת בעלי החיים באופן בלתי נמנע תגרום האירועים הללו לקרות בכמה פרופורציה של ההקלטות, אבל ניתן למזער בכך שבעלי החיים גם מורגלים ועל ידי הימנעות עושה רעשים מיותרים, פתאומיים בקול רם או גרימת רעידות שלהבהיל את החיה. שינויים אפשריים בפרוטוקול ניתן להשתמש בטכניקת הקלטה ותיוג זה בהקשרים שבהם בעלי החיים הואביצוע מגוון רחב של משימות התנהגותיות. הדרכה למשימה התנהגותיות מסוימת יכולה להתבצע לאחר ניתוח אבל לפני שתתחילו להקליט. פעילות עצבית ניתן להקליט לפחות 1-2 שבועות לאחר הכנת craniotomy, וכתמי iontophoretic יכולים להימשך לפחות 2-3 ימים. מסגרת זמן זו מאפשרת מגוון רחב של מניפולציות ניסיוניות, הכוללים הקלטה מאזורי המוח מרובים במהלך הקלטות נפרדות. הטכניקה יכולה גם להיות שונה כדי למלא את נוירונים הבודדים ממנו ההקלטות שנעשו. אסטרטגיה חלופית זו של תיוג juxtacellular של נוירונים בודדים דורשת יציבות מכאנית שמושגת רק כאשר בעלי החיים הוא עדיין או בהרדמה. לאסטרטגית תיוג זה, השימוש בBDA מומלץ על Neurobiotin. BDA לא מושפל על ידי פרוטאזות, דבר המגדיל את שיעור הצלחה על Neurobiotin של באופן משמעותי. תיוג צריך להיות ניסה בעת ההקלטה האחרונה לפני מרוססבעלי חיים. יש לציין כי תיאורים מפורטים של פרוטוקול juxtacellular תוארו בעבר 6,19 .While הטכניקה נוצלה בהצלחה בעכברי התראת 8, בהזרקת iontophoretic הניסיון שלנו של שיקגו שמיים כחולים תשואה גבוהה באופן משמעותי. שים לב ששני שיקגו שמיים כחולים וסימון Neurobiotin או BDA ניתן לעשות באותו בעלי החיים. טכניקה זו עשויה להיות מתאים למגוון רחב של מינים. שים לב שהקלטות juxtacellular נעשו באזורים בקליפת המוח של עכברי התראת 9, למשל. בזמן אימונים, טיפול, וראש-איפוק הם מינים ספציפיים, טכניקות מסוימות לניטור ותיוג שתוארו בפרוטוקול זה צריכה להישאר אותו הדבר. לבסוף, פשוט על ידי שינוי הגודל של קצה פיפטה ופרמטרים של הקטניות הנוכחיות טכניקה זו יכולה לשמש להזרקת iontophoretic של מגוון רחב של מולקולות, כולל סוכנים תרופתיים 20,21. כך,גם טכניקה יכולה להיות שימושית ללימודי neuropharmacological אשר כרוכים בעלי חיים מתנהגים. מסקנות זה קורה לעתים קרובות כי אזורים במוח שהם קרובים מאוד יחד יכולים להיות נכסים ו / או פונקציות שונים במידה ניכרת 22. במקרים כאלה, הנוגעים לפעילות של תאי עצב בודדים מאזורים מוגדרים מבחינת אנטומית להתנהגות האורגניזם הוא קריטי להבנת מעגלים וחישוביות עצביים. המאמר הנוכחי מדגים פרוטוקול כדי להשיג את זה באמצעות שילוב של טכניקות סטנדרטיים ומתאר קידוד חושי בתאי עצב התלמוס VPM כדוגמא. הטכניקה עשויה להיות רלוונטי וישים במגוון רחב של אזורים במוח ופרדיגמות התנהגות במודלים של בעלי חיים שונים. יש לה שיעור הצלחה גבוה באופן משמעותי מאשר תיוג juxtacellular תא בודד בבעלי חיים ערניים 6,8, ויש את היתרון של רזולוציה אנטומיים טובה יותר על טכניקות המנצלות רב-eleמערכי ctrode או microdrives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , Springer. 197-236 (2006).
- Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fsubstances.html Forthcoming.
- Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fdyes.html Forthcoming.
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
