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Bioengineering

सेल और टिशू Mechanobiology में अनुप्रयोगों के लिए एक उपन्यास टूटती प्लेटफार्म

Published: June 3, 2014 doi: 10.3791/51454
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 1,4,5
1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa

Summary

हम इस लेख में जटिल anisotropic द्विअक्षीय यांत्रिक विरूपण करने के लिए एकल कक्ष प्रतिक्रियाओं की जांच और जैविक ऊतकों के यांत्रिक गुणों यों इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक उपन्यास खींच मंच प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

कोशिकाओं और ऊतकों को यांत्रिक बलों के आवेदन या कि अनुमति देने के उपकरण है कि जैविक ऊतकों के यांत्रिक गुणों बुनियादी mechanobiology को समझने के लिए नाटकीय रूप से योगदान दिया है यों कर सकते हैं. इन तकनीकों में बड़े पैमाने पर विभिन्न रोगों की शुरुआत प्रगति भारी यांत्रिक cues से प्रभावित हैं कैसे प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह लेख यंत्रवत् एकल कोशिकाओं को उत्तेजित या ऊतकों के यांत्रिक कठोरता यों सकता है कि या तो एक बहुआयामी द्विअक्षीय खींच (BAXS) मंच प्रस्तुत करता है. BAXS मंच स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जा सकता है कि चार आवाज का तार मोटर्स के होते हैं. एकल कक्षों एक जटिल गतिशील, और स्थानिक अलग तनाव क्षेत्रों के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए अनुमति मोटर्स से जुड़ा जा सकता है कि एक लचीला सब्सट्रेट पर संवर्धित किया जा सकता है. इसके विपरीत, एक बल लोड सेल को शामिल करके, एक भी वे विरूपण चक्र को उजागर कर रहे हैं के रूप में प्राथमिक ऊतकों के यांत्रिक गुणों यों कर सकते हैं.दोनों ही मामलों में, clamps के एक उचित सेट तैयार किया जाना चाहिए और मजबूती से लचीला सब्सट्रेट या हित के ऊतक पकड़ के क्रम में BAXS मंच मोटर्स के लिए मुहिम शुरू की. BAXS मंच खींच प्रयोगों के दौरान नमूने के संरचनात्मक या जैव रासायनिक प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक साथ प्रेषित प्रकाश और / या प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप पर रखा जा सकता है. यह लेख BAXS मंच के डिजाइन और उपयोग की प्रायोगिक जानकारी प्रदान करता है और एकल कक्ष और पूरे ऊतक के अध्ययन के लिए परिणाम प्रस्तुत करता है. BAXS मंच तनाव सब्सट्रेट करने के लिए और पृथक माउस aortas की कठोरता को मापने के जवाब में एक माउस myoblast कोशिकाओं में नाभिक के विरूपण को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. BAXS मंच उप सेलुलर, सेलुलर और पूरे ऊतक के स्तर पर उपन्यास mechanobiological अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विभिन्न ऑप्टिकल microscopies के साथ जोड़ा जा सकता है कि एक बहुमुखी उपकरण है.

Introduction

यांत्रिक microenvironment ऊतकों के विकास और homeostasis में और भी बीमारियों 1-6 में एक गहरा प्रभाव पड़ता है जो इस तरह के प्रसार, प्रवास, और भेदभाव के रूप में कई सेल काम करता है, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इन वर्षों में, प्रयोगात्मक उपकरणों की एक भीड़ यंत्रवत् कोशिकाओं या ऊतकों को प्रोत्साहित और बुनियादी mechanobiology के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने और रोगों 6-17 की शुरुआत प्रगति का अध्ययन करने के लक्ष्य के साथ जैविक ऊतकों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, एक बार एक विशेष अध्ययन के लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए कई अलग अलग प्रयोगात्मक उपकरणों पर भरोसा करना चाहिए. इस अनुच्छेद के यांत्रिक गुणों और यांत्रिक बलों पूरे ऊतक लंबाई तराजू को उप सेलुलर जीव विज्ञान में खेलने कि भूमिका की जांच कि पढ़ाई के लिए अनुमति देता है एक एकल, बहुआयामी, द्विअक्षीय खींच (BAXS) मंच प्रस्तुत करता है. BAXS मंच quantificatio के लिए अनुमति देता है न केवलयह भी यांत्रिक पृथक ऊतकों के गुण, लेकिन एन कि vivo में होता खींच लिए उनकी प्रतिक्रियाओं को समझने के क्रम में जीवित कोशिकाओं के लिए, सरल, जटिल और गतिशील तनाव के खेतों लागू करने की क्षमता की सुविधा. BAXS मंच भी कोशिकाओं और ऊतकों पर यांत्रिक परीक्षण और perturbations के दौरान रहते सेल माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने की क्षमता रखता है.

BAXS मंच सेलुलर स्तर पर सब्सट्रेट विरूपण के प्रभाव की जांच और जैविक ऊतकों (चित्रा 1 ए) पर तन्यता परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कस्टम निर्मित उपकरण है. एक एल्यूमीनियम हीटर एक मानक 10 सेमी पेट्री डिश को समायोजित और एक तापमान नियंत्रक और Kapton हीटर (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी शारीरिक समाधान बनाए रखने के लिए निर्मित किया गया था. इस BAXS मंच एक औंधा चरण विपरीत और / या प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर एकीकृत और एक साथ इमेजिंग (चित्रा 1C) के लिए अनुमति देता है किया जा सकता है.संक्षेप में, BAXS मंच चलती भागों सीधा दो कुल्हाड़ियों (चित्रा -1) के साथ उन्मुख लघु रेखीय गति गेंद असर स्लाइड पर बढ़ रहे हैं, जिनमें से चार रेखीय आवाज का तार मोटर्स के होते हैं. एक रेखीय पोजीशनिंग मंच (चित्रा 1E) का उपयोग किया जाएगा कि clamping प्रणाली के ऊर्ध्वाधर आंदोलन की अनुमति के लिए चार मोटरों में से प्रत्येक के लिए मुहिम शुरू की है. प्रत्येक मोटर की स्थिति 500 एनएम के एक संकल्प (चित्रा 1F) के साथ एक ऑप्टिकल एनकोडर द्वारा नजर रखी है. सभी चार मोटर्स स्वतंत्र रूप से गति आदेशों (चित्रा 1G) निष्पादित करने के लिए ऑप्टिकल एनकोडर प्रतिक्रिया को रोजगार एक गति नियंत्रक के साथ नियंत्रित कर रहे हैं. एक LabVIEW अंतरफलक कोशिकाओं या ऊतकों के नमूनों की, पूरी तरह से अनुकूलन स्थिर और गतिशील विकृति उत्पन्न करने के क्रम में विस्थापन परिमाण, गति, और प्रत्येक मोटर की गति पर पूरा नियंत्रण प्रदान करता है.

कोशिकाओं में एक विकृति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक बस allowin द्वारा हासिल की हैजी कोशिकाओं को मजबूती से एक लचीला और पारदर्शी सब्सट्रेट का पालन करना और फिर BAXS मंच की चार मोटरों का उपयोग इस सब्सट्रेट खींच लिए. BAXS मंच आवाज का तार मोटर्स पर सब्सट्रेट संलग्न करने के लिए clamps के किसी भी कस्टम डिजाइन सेट के बढ़ते अनुमति देता है. इस प्रयोजन के लिए, हम polydimethylsiloxane (PDMS) से बना एक लचीला और पारदर्शी सब्सट्रेट,, (आंकड़े 2A सी और चित्रा 3) के साथ संलग्न किया जा सकता है जिसके लिए clamps के एक सेट बनाया गया. Clamps शारीरिक समाधान को उजागर किया जाएगा, सभी भागों नसबंदी के लिए अनुमति देने के लिए स्टेनलेस स्टील से machined थे. इन clamps ध्यान से (चित्रा 2 डी) खींच दौरान सब्सट्रेट पर तनाव को कम करते हुए छवि गुणवत्ता बढ़ाने के लिए खुर्दबीन उद्देश्य के लिए संभव के रूप में बंद सब्सट्रेट लाने के लिए डिजाइन किया गया है.

एक ही BAXS मंच भी ADAP साथ clamps के एक उचित सेट का उपयोग, छोटे ऊतकों के नमूनों की कठोरता यों इस्तेमाल किया जा सकता हैटेड ऊतकों के नमूनों और बलों की निगरानी के लिए एक लोड सेल के लिए समर्थन करता है. कई तरीकों BAXS मंच मोटर्स के लिए एक ऊतक माउंट करने के लिए लिया जा सकता है; इस मामले में स्टेनलेस स्टील कीट minutiens पिंस तन्यता परीक्षण (आंकड़े -4 ए बी) प्रदर्शन करने के क्रम में संवहनी ऊतकों के उद्घाटन के माध्यम से हुक कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक प्राकृतिक खोलने के बिना मोटी ऊतकों के लिए, ऊतक किनारों या तो आवाज का तार मोटर्स से जुड़ी या जैविक गोंद के साथ छोटे गिलास स्लाइड से चिपके और clamps के साथ मोटर्स से जुड़ी clamps के साथ स्थिति में आयोजित किया जा सकता है. तन्यता प्रदर्शन करने के क्रम में एक लघु लोड सेल आवश्यक है जांचता है और आसानी से BAXS मंच मोटर्स पर शामिल है और एक खींच चक्र (चित्रा 4C) के दौरान ऊतकों पर अभिनय बल को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. BAXS मंच चार मोटर्स से बना है के रूप में, एक दूसरे लोड सेल की शुरूआत एक दो orthogonal दिशाओं साथ तनन परीक्षण प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. यह क्षमता एक quantif करने की अनुमति देता हैY ही प्रयोग के दौरान दो सीधा दिशाओं के साथ एक एकल ऊतक के यांत्रिक कठोरता.

महत्वपूर्ण बात है, सभी विन्यास में, कोशिकाओं या ब्याज के ऊतकों के नमूनों हमेशा उपयोगकर्ता के लिए सुलभ है कि एक तापमान नियंत्रित स्नान में रखा जाता है. इस क्षमता का नमूना के अस्थायी प्रतिक्रिया की जांच के क्रम में खींच नमूना दौरान औषधीय एजेंटों की शुरूआत के लिए अनुमति देता है. उलटा माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल अक्ष अबाधित रहता है के रूप में इसके साथ ही, माइक्रोस्कोपी के सभी रूपों अभी भी उपयोगकर्ता के लिए उपलब्ध हैं. BAXS मंच के सभी चार मोटर्स स्वतंत्र हैं के रूप में अंत में, यह ब्याज के नमूने के लिए उच्च विन्यास तनाव क्षेत्रों को लागू करने के लिए संभव है. में vivo कोशिकाओं और ऊतकों को उजागर कर रहे हैं जटिल और विरोध के रूप में है कि इस मंच में अधिक उचित रूप से मजाक उड़ाया जा सकता खींच anisotropic पारंपरिक अक्षीय खींच मंच 7,13,15,18,19 लिए. इसके अलावा, शारीरिक विशेषताओंतनाव क्षेत्र की एक प्रयोग के दौरान उड़ान पर बदला जा सकता है. इन क्षमताओं उपयोगकर्ता एक अस्थायी अत्यधिक जटिल, anisotropic की व्यापक संख्या, और स्थानिक अलग तनाव क्षेत्रों के लिए सेलुलर और ऊतक स्तर प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं. इस अनुच्छेद के फायदे और सीमाएं BAXS मंच के साथ ही इसकी डिजाइन, ऑपरेटिंग सिद्धांतों, और एकल कक्ष और पूरे ऊतक प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक विवरण का वर्णन करता है.

चित्रा 1
BAXS मंच की चित्रा 1. अवलोकन. चार आवाज का तार मोटर्स मंच प्रदर्शन करने के लिए जीना एक औंधा माइक्रोस्कोप पर रखा जा सकता है) में 37 डिग्री सेल्सियस सेल्सियस पर कोशिकाओं और ऊतकों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया पेट्री डिश हीटर की. बी) विस्तृत चित्र दिखा BAXS मंच की ए) शीर्ष देखें खींच प्रयोगों के दौरान सेल इमेजिंग.डी) आवाज का तार मोटर की विस्तृत तस्वीर; clamping सिस्टम गति नियंत्रक. जी) विस्तृत चित्र के लिए मोटर की वास्तविक समय स्थिति प्रदान करता है कि ऑप्टिकल एनकोडर की. एफ) विस्तृत चित्र के ऊर्ध्वाधर विस्थापन की अनुमति रेखीय पोजीशनिंग मंच के मंच से चलती हिस्सा. ई) विस्तृत चित्र चार आवाज का तार मोटर्स को चार ऑप्टिकल एनकोडर जानकारी और बिजली outputs दिखा गति नियंत्रक की.

चित्रा 2
चित्रा 2. सेल खींच प्रयोगों के लिए प्रणाली clamping. सब्सट्रेट इसके प्रस्तोता featur साथ दबाना का बेलनाकार हिस्से के चारों ओर लपेटा जाता है. सी) खींचने के लिए आवाज का तार मोटर्स को PDMS सब्सट्रेट देते थे clamps के विवरण दिखा एबी) चित्रतों शीर्ष पर नाली में बैठे. फिर सब्सट्रेट शीर्ष नाली में सुविधाओं प्रस्तोता / सब्सट्रेट धक्का कि setscrews का उपयोग कर सुरक्षित है. Clamps जगह में सब्सट्रेट जोत के साथ BAXS मंच की डी) चित्रण. इनसेट इसे से जुड़ी कोशिकाओं सिर्फ एक कवर पर्ची और खुर्दबीन उद्देश्य ऊपर बैठा के साथ सब्सट्रेट की एक विस्तृत विवरण से पता चलता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. झिल्ली और उसके clamping प्रणाली की सामग्री के बिल. प्रिंसिपल भागों के आयाम दिखा चित्र सेल खींच प्रयोगों प्रदर्शन करने द्विअक्षीय मंच को एकीकृत.

चित्रा 4
चित्रा 4. पूर्वछोटे कैलिबर जहाजों की कठोरता आकलन एक 1 मिमी व्यास माउस महाधमनी में विकृति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया clamping प्रणाली की. एबी) विस्तृत चित्र के लिए एक clamping प्रणाली की पर्याप्त. स्टेनलेस स्टील पिंस ध्यान से पोत दोनों पिंस पर clamps पोत और तय मोटर और बाईं दबाना बीच संलग्न एक लोड सेल में रखने के साथ BAXS मंच की. सी) चित्रण स्लाइड करने की अनुमति के लिए खुला त्रिकोण में आकार थे. इनसेट पिन पर घुड़सवार पोत की एक विस्तृत ऊपर से देखने से पता चलता है.

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Protocol

एकल कक्षों के 1. यांत्रिक विरूपण

  1. एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एक PDMS सब्सट्रेट का निर्माण
    पिछले सब्सट्रेट का निर्माण करने के लिए, पानी के घोल में फ्लोरोसेंट microspheres अपने हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण PDMS में मनका मिश्रण को बढ़ाने के लिए isopropanol में resuspended हैं.
    1. 10 मिनट के लिए 16,200 XG पर एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र में फ्लोरोसेंट microspheres की पिपेट 500 μl.
    2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और जोड़ isopropanol के 500 μl vortexing के 5 मिनट के साथ पीछा किया. किसी भी बड़े कणों तलछट समुच्चय की अनुमति देने के क्रम में अंधेरे में रात भर अलग शीशी रखो.
    3. अगली सुबह, ध्यान से एक स्वच्छ microcentrifuge शीशी को सतह पर तैरनेवाला हटायें. इस मनका समाधान अधिक से अधिक 5 substrates के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नोट: मनका समाधान अगले 3 दिनों के लिए तलछट के लिए जारी रहेगा. गोली resuspending से बचने के लिए सावधान रहें.
    4. प्रदान की इलाज एजेंट की 0.5 ग्राम डालोएक वैज्ञानिक संतुलन का उपयोग कर एक 1.5 एमएल microcentrifuge शीशी में PDMS किट के साथ. लगातार कदम के द्वारा, इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बीच 1 मिनट के लिए vortexing, (छह से 15 μl फाईल में) मोती के 90 μl की कुल जोड़. अलग निर्धारित करें.
    5. PDMS की 10 ग्राम वजन और फ्लोरोसेंट मोती के साथ पूरक इलाज एजेंट की 0.5 ग्राम से कम से कम 12 मिनट के लिए मिश्रण.
    6. निर्माता के निर्देशों का पालन मानक फोटोलिथोग्राफी तकनीक का उपयोग कर एक SU-8 2050 पार के आकार मोल्ड बनाना. इस्तेमाल किया ढालना 320 माइक्रोन की ऊंचाई और 13.4 सेमी 2 के एक क्षेत्र (चित्रा 3) है. ढालना 428 μl या PDMS की 440 मिलीग्राम शामिल कर सकते हैं.
    7. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग पार के आकार मोल्ड में मोतियों के साथ PDMS की 400 मिलीग्राम डालो और 80 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इलाज इलाज करने के बाद, मोल्ड (चित्रा 5A) से सब्सट्रेट छील. सब्सट्रेट अपने यांत्रिक गुणों में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाने के बिना 2 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर एक पेट्री डिश में रखा जा सकता है. व्यास में लगभग 4 मिमी की एक अंतिम आकार के साथ एक पेट्री डिश में: (1:20 के अनुपात के साथ PDMS इलाज के एजेंट) और 80 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 5 ब) में 2 घंटे के लिए उल्टा उन्हें इलाज PDMS की बूंदों डालो. ये प्रस्तोता सुविधाओं सप्ताह के लिए एक पेट्री डिश में रखा जा सकता है. नोट: इलाज की प्रक्रिया के दौरान सपाट से बूंदों को रोकने के लिए उल्टा पकवान बनाए रखें.
    8. एयर प्लाज्मा इलाज (30 डब्ल्यू में 30 सेकंड) सब्सट्रेट और 8 प्रस्तोता सुविधाओं. सब्सट्रेट (चित्रा 5C) पर मौजूद चौकोर आकार मांगपत्र से 4 मिमी की दूरी पर सब्सट्रेट के प्रत्येक के अंत पर सुविधाओं बाँध.
  2. क्लैंप पर झिल्ली बढ़ते
    1. Clamps के अंडाकार बेलनाकार हिस्से के चारों ओर सब्सट्रेट के प्रत्येक के अंत लपेटें और ऊपर से 2 setscrews (चित्रा 2B और आंकड़े 5D-ई) के साथ उसे सही जगह पर.
    2. दबाना धारक पर 4 clamps भाड़ और एक डिस्पोजेबल टी का उपयोग PDMS (अनुपात 1:20) डालनासब्सट्रेट और clamps के अंडाकार बेलनाकार भाग के बीच इंटरफेस में ransfer पिपेट. एक 1.5 मिमी हेक्स कुंजी का उपयोग अंडाकार बेलनाकार हिस्से के चारों ओर uncured PDMS बिखरा हुआ है.
    3. पूरी तरह से केशिका कार्रवाई से भरा है और 2 घंटा (चित्रा 5F) के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर विधानसभा का इलाज जब तक खांचे में PDMS (1:20) डालो.
  3. झिल्ली पर कोशिकाओं सीडिंग
    1. एयर प्लाज्मा इलाज (30 डब्ल्यू में 30 सेकंड) कोलेजन कोटिंग के लिए अनुमति देने के लिए सब्सट्रेट बाँझ और functionalize करने के लिए पूरे विधानसभा.
    2. कोशिकाओं 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर चूहे की पूंछ कोलेजन के 16 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक 0.02 एम एसिटिक एसिड के 1 मिलीलीटर के साथ वरीयता प्राप्त किया जाएगा जहां सब्सट्रेट के क्षेत्र functionalize. वांछित अंतिम कोलेजन घनत्व 5 ग्राम / 2 सेमी है.
    3. फॉस्फेट बफर के साथ सब्सट्रेट 3x कुल्ला और यह कमरे के तापमान पर शुष्क कम से कम 10 मिनट के लिए के लिए करते हैं.
    4. 10% भ्रूण गोजातीय SERU के साथ पूरक संस्कृति के माध्यम से 40 μl जोड़ेंमी और 1 सेमी 2 के एक क्षेत्र को कवर करने के लिए सब्सट्रेट के मध्य भाग में 2,000 कोशिकाओं से युक्त 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (सेल घनत्व: 20 कोशिकाओं / 2 मिमी). सेल घनत्व प्रयोगात्मक जरूरतों के हिसाब से बदला जा सकता है.
    5. सब्सट्रेट उस पर कोशिकाओं से युक्त मध्यम संस्कृति की गिरावट के साथ सामना करना पड़ के साथ एक मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में पूरे विधानसभा रखो. नोट: विधानसभा सब्सट्रेट कक्षों मजबूती से संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 3 घंटे के लिए ऊपर का सामना करना पड़ के साथ रखा जाना चाहिए. वाष्पीकरण को रोकने के लिए, गर्म संस्कृति के माध्यम से 30 μl सब्सट्रेट पर ड्रॉप 3 घंटे के लिए हर 45 मिनट में जोड़ दिया जाता है.
    6. 3 घंटा बाद, सब्सट्रेट डूब और कोशिकाओं को पैदा करने के लिए अनुमति देने के लिए रातोंरात सेते ताजा संस्कृति के माध्यम से भरा एक पेट्री डिश में पूरे विधानसभा फ्लिप.
    7. अगले दिन, HEPES बफर नमक समाधान (HBSS तैयार; HEPES, NaCl के 120 मिमी, KCl की 5.3 मिमी, 4 MgSO की 0.8 मिमी, 2 CaCl के 1.8 मिमी, और डी के 11.1 मिमी 20 मिमीxtrose). 7.4 पीएच को समायोजित करें. नोट: HBSS समाधान दैनिक तैयार है और प्रयोगों के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना है. यह शारीरिक समाधान सामान्य ऊतक / रक्त वातावरण नकल उतार द्वारा खुर्दबीन मंच पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    8. उल्टे चरण विपरीत या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप माउंट BAXS मंच और मोटरों पर दबाना सब्सट्रेट विधानसभा पर सेट अप माउंट. HEPES बफर (चित्रा 2 डी) के साथ पेट्री डिश हीटर के अंदर पेट्री डिश भरें.

छोटे कैलिबर जहाजों के 2. कठोरता मापन

  1. तैयारी
    1. क्रेब्स शारीरिक समाधान: 118.1 मिमी NaCl, 11.1 मिमी डी ग्लूकोज, 25 मिमी 3 NaHCO, 4.7 मिमी KCl, 1.2 मिमी MgSO 4, 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, और 2.5 मिमी 2 CaCl का एक समाधान तैयार करें. 7.4 पीएच को समायोजित करें और 30 मिनट के लिए carbogen मेडिकल गैस (95% 2 हे / 5% सीओ 2) के साथ समाधान आक्सीजन के साथ मिलना. नोट: क्रेब्स solutiपर दैनिक तैयार है और प्रयोगों के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना है. यह शारीरिक समाधान सामान्य ऊतक / रक्त वातावरण नकल उतार द्वारा जीवित ऊतकों को बनाए रखने के लिए किया जाता है.
    2. शल्य कैंची, मुड़ा हुआ चिमटी, सूक्ष्म कैंची, शल्य विदारक माइक्रोस्कोप, 50 एमएल polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूबों, और 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipettes: विच्छेदन और महाधमनी वाहिकाओं के यांत्रिक मूल्यांकन के लिए उपकरण को इकट्ठा करो. शल्य चिकित्सा और प्रयोग प्रक्रिया किसी भी बाँझ शर्तों की आवश्यकता नहीं है. पहले से लोड सेल के साथ BAXS मंच की clamps माउंट.
  2. ऊतक अलगाव और विच्छेदन
    प्रयोगशाला जानवरों को शामिल सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं देश के उपयोगकर्ताओं की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के साथ अनुपालन जो संस्था, 'उपयोगकर्ताओं के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना है.
    1. 99% सीओ 2 की साँस लेना के साथ माउस इच्छामृत्यु प्रदर्शन करना (7 साई)एक Plexiglas कक्ष (चित्रा 6A) में.
    2. ओपन माउस पेट और माउस खून बहाना वक्ष महाधमनी में कटौती.
    3. डायाफ्राम, वक्ष पिंजरे और फेफड़ों lobes (चित्रा 6B) निकालें. नोट: ऊतकों को नुकसान पहुँचाए के जोखिम को कम महाधमनी से जुड़ी दिल रखने के लिए और सीधे पोत को छूने से बचें, लेकिन दिल का उपयोग कर यह हेरफेर.
    4. धीरे पोत और रीढ़ की हड्डी के बीच में कटौती करके दिल, महाधमनी जड़ और वक्ष महाधमनी निकालें. नोट: ऊतक बरकरार (चित्रा 6C) की अंदरूनी संरचना रखने के लिए छांटना दौरान पोत में किसी भी बढ़ाव प्रेरित नहीं करते.
    5. तुरंत विसर्जित और क्रेब्स समाधान में दिल और महाधमनी रखना.
    6. कट और ध्यान से किसी भी रक्त के थक्के को हटाने के लिए क्रेब्स समाधान में महाधमनी धो लो. सूक्ष्म कैंची, चिमटी और शल्य विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 6D-ई) का उपयोग संयोजी ऊतक निकालें. नोट: सभी पोत की लंबाई रखें और AOR उपयोगपोत उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए टिक जड़.
  3. पोत परिमाण निर्धारण और बढ़ते
    पोत की कठोरता यह निर्धारित करने के लिए, उतार पोत आयाम आवश्यक हैं और एक calibrated माइक्रोस्कोप के साथ निर्धारित किया जा सकता है.
    1. लंबाई में लगभग 2 मिमी की एक महाधमनी अंगूठी कट और ठीक (आंकड़े 6F जी) की स्थापना एक calibrated माइक्रोस्कोप का उपयोग कर उसकी लम्बाई मापने. क्रेब्स समाधान में एक तरफ इस क्षेत्र रखो.
    2. 2 मिमी खंडों (चित्रा 6f) में से प्रत्येक के बीच यथासंभव कम एक और महाधमनी अंगूठी कट. लुमेन का सामना करना पड़ के साथ एक खुर्दबीन गिलास स्लाइड पर इस छोटे से क्षेत्र रखो और एक calibrated खुर्दबीन सेटिंग (चित्रा 6H) का उपयोग कर दीवार मोटाई मापने.
    3. क्रेब्स समाधान के साथ BAXS मंच पर पेट्री डिश भरें और (चित्रा 4C में इनसेट) खींच पिनों पर 2 मिमी महाधमनी अंगूठी खंड सम्मिलित करें.

जीई = "हमेशा"> चित्रा 5
इलाज करने के बाद चित्रा 5. PDMS सब्सट्रेट निर्माण और बढ़ते. ए), सब्सट्रेट ध्यान से SU-8 2050 आचारण से खुली और. बी) PDMS से बाहर कर दिया सुविधाओं एंकरिंग एक पेट्री डिश में एक तरफ रख दिया और पर सब्सट्रेट सुरक्षित करने के लिए मदद कर रहा है 4 clamps पर घुड़सवार सब्सट्रेट सब्सट्रेट तो दबाना धारक पर बढ़ रहे हैं जो 4 clamps, (इनसेट देखें) पर मुहिम शुरू की है. डी) बढ़ते के लिए तैयार सुविधाओं प्रस्तोता साथ clamps. सी) सब्सट्रेट. ई) विस्तृत चित्र. एफ सब्सट्रेट के नीचे नाली में PDMS डालने का कार्य की) प्रक्रिया. तीर धीरे धीरे कैशिकता द्वारा नाली भरने PDMS से पता चलता है.

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चित्रा 6. तैयारी और वक्ष महाधमनी के अलगाव. ए) एक अनुदैर्ध्य पेट चीरा के माध्यम से शल्य चिकित्सा उपकरण और euthanized माउस. बी) तैयार कर रहा है, वक्ष पिंजरे और फेफड़ों LOBs हटा रहे हैं. सी) महाधमनी ध्यान से हेरफेर करने के लिए दिल का उपयोग कर हटा दिया जाता है ऊतक. डी) दिल और महाधमनी क्रेब्स शारीरिक समाधान में डाल रहे हैं. महाधमनी सभी संयोजी ऊतक को हटाने से साफ किया जाता है. मोटाई माप के लिए इस्तेमाल किया छोटे खंडों के साथ कठोरता मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया दिल और महाधमनी. एफ) महाधमनी खंड. जीएच) सटीक लंबाई (जी) और मोटाई दिखा ई) विस्तृत चित्र (एच) के प्रत्येक पोत क्षेत्रों एक व्युत्क्रम माइक्रोस्कोप और एक विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है.

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Representative Results

टूटती सेल

BAXS मंच एकल माउस myoblast कोशिकाओं में नाभिक के यांत्रिक प्रतिक्रिया (C2C12) 25% की एक सब्सट्रेट विरूपण के संपर्क में जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Myoblast कोशिकाओं मांसपेशियों के ऊतकों में पाया जाता है और लगातार vivo में यांत्रिक खिंचाव और सम्पीडन के संपर्क में हैं. सेल नाभिक के आकार और यांत्रिक गुणों जीन अभिव्यक्ति और transcriptional गतिविधि 20,21 के नियमन में और भी विकास दोष और ऐसे हचिंसन-Gilford progeria सिंड्रोम (HGPS), एमरी जैसे रोगों की एक किस्म में एक प्रमुख भूमिका निभा दिखाया है -Dreifuss पेशी dystrophy (EDMD), फैली हुई cardiomyopathy, समय से पहले बूढ़ा और कैंसर 22-25. इसलिए, बाह्य यांत्रिक microenvironment से सेना के नाभिक की संरचना और कार्य प्रभावित समझ कैसे चरम ब्याज की है. BAXS मंच मील से बल के संचरण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अपने बड़े या छोटे अक्ष सब्सट्रेट समानांतर खींच द्वारा नाभिक को croenvironment. 7A एफ दो orthogonal दिशाओं साथ सब्सट्रेट में एक विरूपण उत्प्रेरण के लिए मंच की क्षमताओं दिखाता आंकड़े. इसके अलावा, BAXS मंच सम-द्विअक्षीय तनाव क्षेत्रों के मानक अक्षीय के अलावा सब्सट्रेट में जटिल तनाव क्षेत्र को उत्पन्न कर सकते हैं. 7G-एच हमें निर्माण करने के लिए या तो अनुमति देता है, दो orthogonal दिशाओं साथ तनाव क्षेत्र के स्वतंत्र नियंत्रण द्वारा प्रदान लचीलापन दिखाता आंकड़े एक मानक (compressive) या शुद्ध (गैर compressive) अक्षीय तनाव क्षेत्र. BAXS मंच थोड़ा एक मानक अक्षीय खिंचाव (चित्रा 7 के दौरान इस दिशा साथ सब्सट्रेट में सम्पीडन वर्तमान के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए दिशा (चित्रा 7G) खींच प्रिंसिपल को सीधा दिशा में सब्सट्रेट खींच कर एक शुद्ध अक्षीय तनाव क्षेत्र का उत्पादन करने में सक्षम है ).

ntent "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 7
चित्रा 7. प्रदर्शन से विस्थापन विरूपण रिश्तों मानक और शुद्ध अक्षीय अधिकतम खिंचाव क्षैतिज (सी के साथ पहुंच गया) और खड़ी है जब तक. एबी) फ्लोरोसेंट मोती मैन्युअल रूप से वीडियो का पहला फ्रेम पर चयनित और अन्य को एक सीमा से ट्रैक कर रहे हैं खींच (डी) दिशाओं. एक matlab स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से प्रत्येक फ्रेम के लिए ग्रीन तनाव tensor के घटकों की गणना करता है और नीले और लाल लाइनों क्षैतिज साथ ग्रीन तनाव tensor के घटक के अनुरूप और) मोटर के संबंध में तनाव का एक अंशांकन वक्र 27. एफई विस्थापन का उत्पादन एक्स अक्ष के साथ 4 मिमी से ही सब्सट्रेट टूटती और थोड़ा साथ खींच क्रमशः ऊर्ध्वाधर दिशाओं. जी)(लाल रंग में हाइलाइट) 1.5 मिमी से वाई अक्ष सब्सट्रेट में कोई compressive विरूपण के साथ एक शुद्ध अक्षीय क्षेत्र पैदा करता है. ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ सब्सट्रेट के सिरों () लाल रंग में हाइलाइट तय कर रहे हैं जब 3.5 मिमी से एक्स अक्ष के साथ सब्सट्रेट टूटती एच) 25% की एक विकृति और 7% की एक compressive विरूपण पैदा करता है.

खिंचाव के दौरान रहते सेल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता के साथ, नाभिक डीएनए (Hoescht 33342) को बांधता है जो एक जीवित कोशिका फ्लोरोसेंट डाई, साथ दाग रहे थे. सामान्य में, C2C12 कोशिकाओं को एक बड़ी और छोटी अक्ष के साथ अण्डाकार नाभिक के पास है. सबसे पहले, कोशिकाओं बड़े या छोटे परमाणु कुल्हाड़ियों क्षैतिज खींच दिशा के समानांतर उन्मुख थे जिसमें पहचान की गई. इस बिंदु पर, कोशिकाओं प्रत्येक खींच चक्र (आंकड़े 8A-मैं) के बीच undeformed और विकृत नाभिक की छवियों को प्राप्त करते हुए अक्ष खींच प्रत्येक orthogonal साथ 25% से बढ़ाकर थे. इस तरीके में हम नाभिक की विरूपता का आकलन कर सकता हैएक ठीक नियंत्रित सब्सट्रेट विरूपण के तहत अपने बड़े और छोटे अक्ष के साथ. Ovuscule, एक ImageJ प्लगइन, बड़ी और छोटी परमाणु कुल्हाड़ियों की लंबाई निर्धारित किया गया था. नाभिक क्रमिक रूप से अपनी बड़ी और छोटी कुल्हाड़ियों (आंकड़े 8G-I) के साथ बढ़ाया गया था जब इन लंबाई undeformed राज्य के दौरान दर्ज किए गए थे और. अपने छोटे और बड़े axes साथ नाभिक के विरूपण की गणना करने के लिए, और बढ़ाकर undeformed राज्यों में प्रत्येक अक्ष के साथ लंबाई में रिश्तेदार परिवर्तन अभिकलन किया गया था:

ε विकृति है जहां, एल 1 विकृत लंबाई और एल 0 undeformed लंबाई है.

यह 3.0 (इसकी प्रमुख धुरी की तुलना में (6.3 ± 1.1%) अपनी नाबालिग अक्ष के साथ एक महत्वपूर्ण उच्च विरूपता प्रदर्शित करता है के रूप में C2C12 में नाभिक की विरूपता एक यांत्रिक anisotropy दर्शाती77; 0.6%) (चित्रा 8J). इसके अलावा, हम भी परमाणु विरूपता को विनियमित करने में actin और microtubule cytoskeleton की भूमिका की जांच की. यह चुनिंदा क्रमशः, cytochalasin डी और nocodazole का उपयोग actin filaments या सूक्ष्मनलिकाएं depolymerizing द्वारा प्राप्त किया गया था. Actin filaments Depolymerizing या सूक्ष्मनलिकाएं नाभिक (चित्रा 8J) की anisotropic विरूपता का नुकसान प्रेरित पाया गया था. इन परिणामों cytoskeletal घटकों सब्सट्रेट से नाभिक बल के स्थानान्तरण और भी विरूपण 25 के दौरान नाभिक की प्राकृतिक यांत्रिक व्यवहार के संरक्षण के लिए आवश्यक हैं कि निष्कर्ष का समर्थन है.

8 चित्रा
Stre की संख्या 8. प्रोटोकॉल और परमाणु विरूपता टूटती. एसी) योजनाबद्ध चित्रण इसके नाभिक के साथ एक एकल कक्ष की tching प्रोटोकॉल क्षैतिज उन्मुख. एक सेल के चरण विपरीत छवियों (डीएफ) और महामारी फ्लोरोसेंट छवियों (सैनिक) डीएनए विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग. इस छवि अनुक्रम में एक ही सेल orthogonal विरूपण क्षेत्रों के संपर्क में है, जहां एक ठेठ सेल खींच प्रयोग दिखाता है. स्केल सलाखों 25 माइक्रोन हैं. जे) C2C12 नाबालिग अक्ष प्रमुख धुरी की तुलना में काफी अधिक विरूपण के साथ anisotropic परमाणु विरूपता से पता चलता है. में actin या (क्रमशः CYT डी और nocodazole,) microtubule से वंचित कोशिकाओं, इस anisotropy गायब हो जाता है. सभी परिस्थितियों में, नाभिक विकृतियों 25% की एक सब्सट्रेट विरूपण के तहत शून्य से काफी अलग हैं. ** पी मूल्य <0.01, बनती टी परीक्षण. † † पी मूल्य <0.01, † † पी मूल्य † <0.001, एक नमूना टी परीक्षण.

पोत कठोरता आकलन

टी "> हाल ही में, हमारे समूह पुरानी के प्रभाव की जांच की अभिव्यक्ति से अधिक हीट शॉक एक atherosclerosis की आशंका माउस मॉडल में महाधमनी सजीले टुकड़े के गठन पर प्रोटीन -27 (HSP27 ओ / ए) के (APOE - / -). 26 हम HSP27 पट्टिका लिपिड और बृहतभक्षककोशिका बहुतायत कम कर देता है और intimal चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और कोलेजन सामग्री (आंकड़े 9A-B) बढ़ जाती है कि एक atheroprotective प्रोटीन के रूप में कार्य करता है कि पता चला है. पोत यांत्रिक गुणों पर इस ऊतकीय remodeling के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, BAXS मंच का इस्तेमाल किया गया था महाधमनी कठोरता को मापने के लिए.

चित्रा 9C एक महाधमनी अंगूठी की खींच तन्यता से एक ठेठ तनाव तनाव की अवस्था से पता चलता है. कठोरता यों, वृद्धिशील मापांक 30% की एक विकृति में तनाव तनाव घटता से गणना की गई थी. कठोरता वक्र को स्पर्श करने की ढलान है. BAXS मंच मोटर्स में से एक, displaceme के एक साथ अधिग्रहण पर एक लोड सेल शुरू करकेNT और बल डेटा संभव है. विस्थापन बल घटता प्रत्येक महाधमनी अंगूठी की undeformed आयामों पर आधारित तनाव तनाव घटता में परिवर्तित किया गया. तनाव और तनाव निम्न सूत्रों का उपयोग गणना कर रहे हैं:

ε विकृति है जहां, एल 1 एफ बल है और एक 0 लदान के तहत ऊतक के undeformed क्षेत्र है, तनाव है, एल 0 undeformed लंबाई है, विकृत लंबाई है. एक महाधमनी अंगूठी के विशिष्ट मामले में, undeformed क्षेत्र (ए 0) अंगूठी बार खंड की लंबाई की दो बार मोटाई है.

प्रत्येक नमूने की अनुमति पहले 11 चक्र के साथ 12 चक्र के लिए 50 माइक्रोन / सेकंड की एक विस्थापन दर में 40% की एक अधिकतम विरूपण के साथ cyclically विकृत किया गया था ऊतक की शर्त और लाडाटा अधिग्रहण के लिए एक अनुसूचित जनजाति. - / - HSP27 ओ / ई चूहों (62.8 ± 3.0 kPa) काफी apoE की तुलना में 41% की वृद्धि हुई थे - हम ApoE के महाधमनी खंडों की कठोरता पाया गया कि / - नियंत्रण माउस मॉडल (44.4 ± 3.8 kPa) (चित्रा 9D) .

साथ में ले ली, पोत और पट्टिका ऊतक विज्ञान के साथ संयुक्त मैकेनिकल मूल्यांकन HSP27 की अभिव्यक्ति से अधिक की वृद्धि हुई पोत कठोरता और कोलेजन / चिकनी पेशी सेल सामग्री की विशेषता है कि प्रदर्शन किया. इन परिणामों HSP27 संभावित atherosclerotic घावों की स्थिरता बढ़ाने के लिए और इसलिए पट्टिका टूटना का खतरा कम हो सकता है सुझाव देते हैं.

9 चित्रा
चित्रा 9. HSP27 का प्रभाव अधिक अभिव्यक्ति पोत कठोरता पर. हम HSP27 ऊतकीय कम्पो संशोधित पता चला है किऔर कोलेजन सामग्री: intimal चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एंटी α-SMA ए) में वृद्धि से atherosclerosis के घावों की विपक्षी (बी: लाल दाग picrosirius) कठोरता 30 पर गणना की है, जहां एक महाधमनी पोत खींच से प्राप्त सी) विशिष्ट तनाव तनाव वक्र. तनाव का%. . - / - चूहों मॉडल (डी) कठोरता वक्र स्पर्श करने के लिए (लाल रेखा) की ढलान है डी) अधिक अभिव्यक्ति HSP27 की लगातार नियंत्रण ApoE के तुलना में जहाजों कठोरता बढ़ जाती है. स्केल (ए) में सलाखों और (बी) 40 माइक्रोन और insets में 400 माइक्रोन दोनों हैं. एल = लुमेन, मैं = intima, बिंदीदार लाइनों मीडिया रूपरेखा बनाती है. * पी मूल्य <0.05, एक तरह से एनोवा. *** पी मूल्य <0.001, एक तरह से एनोवा. Cuerrier एट अल 26 के काम से रूपांतरित चित्रा.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत BAXS मंच एकल कक्षों की जांच से पूरे ऊतकों को, mechanobiology के अध्ययन में कई प्रयोगों की सुविधा. इसके अलावा, मंच कई यांत्रिक उत्तेजना प्रयोगों और बहु ​​- अक्षीय तनन परीक्षण के लिए अनुमति देता है, अत्यंत लचीला और विन्यास है. मंच भी शारीरिक स्थितियों में कोशिकाओं और ऊतकों के रखरखाव के लिए सक्षम बनाता है और खींच प्रयोगों के दौरान एक साथ माइक्रोस्कोपी के लिए अनुमति देता है. बढ़ते clamps के एक उचित सेट का उपयोग करते समय पिछले अनुभागों में वर्णित दो प्रयोगों BAXS मंच की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन. एक मॉड्यूलर और अनुकूलन नमूना बढ़ते प्रणाली, ऑप्टिकल का उपयोग और अतिरिक्त सेंसर (उदाहरण के लिए एक लोड सेल) जोड़ने की संभावना, प्रदर्शन किया जा प्रयोगों के अतिरिक्त प्रकार के लिए कई संभावनाएं खोल.

ऊपर प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण चरण हैं एकdequately सबसे अच्छा परिणाम का उत्पादन करने के क्रम में. सेल खींच प्रोटोकॉल के भीतर, clamps करने पर PDMS सब्सट्रेट बढ़ते नाजुक और सटीक हेरफेर की मांग. PDMS सब्सट्रेट अच्छी तरह से खींच के दौरान सब्सट्रेट के अवांछित पार्श्व आंदोलनों से बचने के लिए चार clamps के संबंध में केंद्रित किया जाना चाहिए. इस तरह के पार्श्व आंदोलनों प्रयोगों खींच दौरान कोशिकाओं की ट्रैकिंग कठिन बना सकते हैं. इसके अलावा, यह सब्सट्रेट इनक्यूबेटर में सामना करना पड़ रहा है जब सेल बोने के दौरान संस्कृति के माध्यम से ड्रॉप का वाष्पीकरण की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. इनक्यूबेटर दरवाजा प्रक्रिया के दौरान खोला जाता है कि कितनी बार पर निर्भर करता है, वाष्पीकरण की दर को बदल सकते हैं. पोत खींच प्रोटोकॉल के भीतर, सबसे महत्वपूर्ण कदम परीक्षण किया जा नमूना के आयामों की माप है. वे ऊतक कठोरता की गणना में शामिल कर रहे हैं और इसलिए परिणाम पर सीधा प्रभाव पड़ता है के रूप में इन आयामों में संभव के रूप में सटीक होना चाहिए. एक ही व्यक्ति पोत डी प्रदर्शन करने के बादimension माप नमूनों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने में सहायता करेगा.

सेल खींच प्रयोगों के दौरान PDMS सब्सट्रेट पर खींचने के लिए इस्तेमाल किया clamps के निर्माण कई विकास चक्र शामिल किया गया. clamps के पहले संस्करण बेलनाकार भागों (चित्रा 2 बी) के तल पर स्थित एक प्रस्तोता नाली नहीं था. इस नाली के बिना, सब्सट्रेट समय के साथ सब्सट्रेट विरूपण में एक महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता उत्प्रेरण, बेलनाकार भाग के साथ फिसल गया. नाली और ठीक PDMS (चित्रा 5F) के अलावा की उपस्थिति के साथ, सब्सट्रेट अब नहीं निकल जाता है. इस प्रयोगात्मक सेटअप समय के साथ सब्सट्रेट में लगातार विकृति पैदा करता है. ऊतक उचित लोड सेल चुनने, प्रयोगों खींचने के लिए भी बहुत महत्वपूर्ण है. यहां इस्तेमाल लोड सेल यहां परीक्षण के नमूने के लिए पर्याप्त है, जो एक कम भार सीमा (150 ग्राम) है. Meas के लिए आवश्यक बहुत संवेदनशील लोड सेलuring छोटे नमूनों पर बल खींच शोर (एस / एन) के अनुपात में एक अपेक्षाकृत कम संकेत के पास थी. एस / एन अनुपात में सुधार लाने और इसलिए संकल्प में सुधार करने के लिए, लोड सेल विद्युत आवाज का तार मोटर और प्लास्टिक शिकंजा और spacers का उपयोग कर किसी भी धातु भागों से पृथक किया गया. इस तरीके में 0.03 जी का एक संकल्प के साथ एक उच्च एस / एन अनुपात प्राप्त हुई थी. नरम नमूने लिए, एक कम रेंज लोड सेल का उपयोग उच्च संकल्प बनाए रखने के लिए सिफारिश की है.

वर्तमान में, BAXS मंच की प्रमुख सीमा की वजह से समय के साथ HBSS बफर के वाष्पीकरण के प्रयोगों खींच लंबी अवधि के प्रदर्शन करने की क्षमता है. पानी के वाष्पीकरण संभावित कोशिकाओं पर एक प्रभाव हो सकता है कि घुला हुआ पदार्थ एकाग्रता बढ़ जाती है. BAXS मंच की मौजूदा विन्यास के साथ, यह यंत्रवत् कोशिकाओं और ऊतकों डूबे हुए हैं जिसमें बफर supplem हो गया है के रूप में दिनों से अधिक कोशिकाओं या ऊतकों को प्रोत्साहित करेंगे कि एक प्रयोग है के लिए मुश्किल है समय के साथ तरल साथ ented. वर्तमान स्थापित करने में, वाष्पीकरण दर HBSS बफर समाधान की 25 मिलीलीटर की एक शुरुआती मात्रा से लगभग 0.9 मिलीग्राम / घंटा है. वर्तमान सेटिंग अल्पकालिक प्रयोगों के लिए आदर्श है. विश्वसनीय सेल और समय की लंबी अवधि में प्रयोगों खींच ऊतक को करने के लिए दो अतिरिक्त सुझाव दिया जाता है: बफर मात्रा को बनाए रखने के लिए 1) एक fluidic प्रणाली, और बनाए रखने के लिए पूरी व्यवस्था enclosing एक वाणिज्यिक या घर बनाया इनक्यूबेटर चैंबर के 2) इसके अलावा लगातार नमी और तापमान और एक 5% / 95% सीओ 2 / हवा वातावरण प्रदान करते हैं. संवहनी ऊतकों खींच के विकल्प के बारे में, ऊपर वर्णित सेटअप हमें छोटे कैलिबर जहाजों की कठोरता को मापने के लिए अनुमति दी. यह वे खींच दौरान ख़राब नहीं करेंगे सुनिश्चित करने के लिए एक उचित व्यास के साथ पिन का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन पोत लुमेन में फिट करने के लिए काफी छोटे हैं. इस खाते में विस्तार से नहीं ले रही ऊतक की मापी विरूपण में अशुद्धि मिलवा सकता है.

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इन विवो, ऊतक एम्बेडेड कोशिकाओं दोनों spatially और अस्थायी भिन्नता है कि यांत्रिक बलों और दबाव से अवगत कराया है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि वे अक्सर बहु ​​- अक्षीय हैं. एक अच्छा उदाहरण hemodynamic बलों के जवाब में vasculature दीवारों के यांत्रिक व्यवहार है. जटिल बहु - अक्षीय और चक्रीय तनाव क्षेत्रों के लिए endothelial और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को उजागर करता है, जो एक जटिल यांत्रिक microenvironment में संवहनी ऊतकों 13,14,16,27 परिणाम की anisotropic गुणों के साथ स्थानीय hemodynamic बलों के संयोजन 28-30. मौजूदा सेल खींच प्रयोगों बहुत mechanotransduction और mechanobiology की बुनियादी समझ के लिए योगदान दिया है, वे पारंपरिक रूप से जटिल vivo में तनाव क्षेत्रों 8-10,19,29,31-34 पुन: पेश नहीं करते कि आर्दश अक्षीय या सम-द्विअक्षीय तनाव क्षेत्रों पर भरोसा किया है . BAXS मंच की अनुमति देता है एक साथ रहते सीईएल के साथ खींच anisotropic द्विअक्षीय सेलएल माइक्रोस्कोपी. दो orthogonal दिशाओं साथ सब्सट्रेट के विरूपण को नियंत्रित करने की क्षमता हमें तनाव क्षेत्र पर पूरा नियंत्रण देता है. यह सरल अक्षीय और सम-द्विअक्षीय तनाव क्षेत्रों के अलावा जटिल तनाव क्षेत्रों के उत्पादन में सक्षम बनाता है. इसके अलावा, मंच हमें गतिशील रूप से एक ही खींच प्रयोग के भीतर तनाव क्षेत्र की दिशा बदलने के लिए अनुमति देता है.

एक मॉड्यूलर और कस्टम clamping प्रणाली को एकीकृत करने का विकल्प एक भी खींच मंच का उपयोग कर कई सेल mechanobiology में अनुप्रयोगों और ऊतक यांत्रिकी के लिए संभावना को खोलता है. उदाहरण के लिए, उचित प्रणालियों clamping 13,27 के साथ, इस मंच जैविक ऊतकों की तलीय अक्षीय और द्विअक्षीय तनन परीक्षण प्रदर्शन कर सकते हैं. इस तरीके में, एक आयताकार या चौकोर आकार में कटौती किसी भी ऊतक, के यांत्रिक गुणों, एक ही प्रयोग में दो orthogonal axes साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इसके अलावा, ऊतकीय एक प्रदर्शनnalyses यांत्रिक उत्तेजना के बाद ऊतकों में खिंचाव प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों को प्रकट कर सकते हैं. मरोड़ भी मांसपेशियों के ऊतकों के लिए यांत्रिक लोड हो रहा है की एक बहुत ही महत्वपूर्ण प्रकार है और 35 स्नायुबंधन. इस मंच मरोड़ और तनाव से जुड़े एक combinatory यांत्रिक लोड हो रहा है निर्माण करने के लिए खींच धुरी के चारों ओर एक रोटेशन उत्पन्न कर सकता है कि एक clamping प्रणाली डिजाइन करने की क्षमता प्रदान करता है. यह उचित बढ़ते पिन के साथ बड़ा कैलिबर जहाजों का आकलन करने के लिए भी संभव है. यांत्रिक विरूपण निम्नलिखित सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन गहन जांच के तहत भी है. BAXS मंच एक साथ इमेजिंग के लिए अनुमति के अलावा एक ही प्रयोग में दिशा और तनाव क्षेत्र की जटिलता को बदलने की एक अनूठी विशेषता प्रदान करता है. मंच खुर्दबीन के ऑप्टिकल अक्ष के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है के रूप में महत्वपूर्ण, माइक्रोस्कोपी के मल्टी मॉडल रूपों, अभी भी संभव हैं. इस यांत्रिक विकास के लिए संरचनात्मक और जैव रासायनिक लाइव सेल प्रतिक्रिया के रूप में एक महत्वपूर्ण विशेषता हैeformation मापा जा सकता है. साथ में ले ली, BAXS मंच डिजाइन एकल कक्ष और पूरे ऊतक प्रयोगों के लिए इसके उपयोग की सुविधा है कि कई महत्वपूर्ण सुविधाओं के पास. एक मॉड्यूलर clamping प्रणाली और ऊपर से चार संभव लोड कोशिकाओं के अलावा रोजगार, BAXS मंच प्रयोगों की एक भीड़ के लिए नियोजित किया जा सकता. इस अनुच्छेद के प्रयोगों के दो उदाहरण के विवरण से पता चलता है; हालांकि प्रणाली के प्रतिरूपकता और लचीलापन आगे उप सेलुलर, सेलुलर और पूरे ऊतक लंबाई पैमाने पर mechanobiology के कई विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

डीटी ले Fonds डे Recherche डु क्यूबेक प्रकृति एट टेक्नोलॉजीज (FQRNT) और एक MITACS तरक्की सामरिक फैलोशिप से एक postdoctoral छात्रावस्था द्वारा समर्थित किया गया. सीएमसी ले Fonds डे Recherche एन SANTE डु क्यूबेक (FRSQ) और अर्नेस्ट और ओटावा हार्ट इंस्टीट्यूट के विश्वविद्यालय से मार्गरेट फोर्ड कार्डियोलॉजी संपन्न अनुसंधान फेलोशिप से एक postdoctoral छात्रावस्था द्वारा समर्थित किया गया. EOB संचालन अनुदान स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा संस्थान (CIHR) से MOP80204 और दिल से T6335 और ओंटारियो के स्ट्रोक फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया. CIHR और Medtronic सामूहिक रूप से एक सहकर्मी की समीक्षा रिसर्च चेयर (URC # 57093) के साथ EOB प्रदान करते हैं. एईपी प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) डिस्कवरी अनुदान, एक NSERC डिस्कवरी त्वरक अनुपूरक द्वारा वित्त पोषित है और कृतज्ञता कनाडा अनुसंधान अध्यक्षों (सीआरसी) कार्यक्रम और ओंटारियो प्रांत से एक प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार के समर्थन मानता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your 
FluoSpheres fluorescent microspheres Invitrogen F8810 Keep away from light.
Linear voice coil Moticont LVCM-051-051-01 The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide Edmund Optics NT37-360 Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage Edmund Optics 38-960 Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder GSI microE systems Mercury II 1600S - 0.5um resolution reflective incremental encoder.
Motion controller Galil DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell Honeywell 31 low miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm) Pin Service Austerlitz Insect pins Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050 Micro Chem SU-8 2050 Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system Glowresearch Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen Invitrogen A10483-01 Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342 Invitrogen R37605 DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters omega.ca KHLV-0504/(10)-P 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers omega.ca CN63200-R1-LV Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium Hyclone SH3024301 Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010 Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH3039603C Keep frozen.
Trypsin 0.05% Hyclone SH30236.02 Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes Wisent Inc 330-050-EL HEPES-buffered salt solution 
NaCl Fisher Scientific BP358-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl Fisher Scientific BP366-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4 Fisher Scientific M65-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2 Fisher Scientific C614-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose Fisher Scientific BP220-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1 Krebs physiological solution
KH2PO4 Fisher Scientific BP362-500 Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2 Lindle DIN:02154749 Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole Sigma M1404 Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D Sigma C8273 Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC Sigma F3777 Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain Fluka 43665 Used to stain and quantify collagen content

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References

  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  4. Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
  5. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
  6. Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
  7. Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
  8. Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
  9. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
  10. Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
  11. Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
  12. Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
  13. Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
  14. Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
  15. Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
  16. Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
  17. Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
  18. Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
  19. Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
  20. Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
  21. Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
  22. Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
  23. Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
  24. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  25. Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
  26. Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
  28. Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
  29. Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
  30. Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
  31. Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
  32. Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
  33. Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
  34. Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
  35. Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).

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Tremblay, D., Cuerrier, C. M.,… More

Tremblay, D., Cuerrier, C. M., Andrzejewski, L., O'Brien, E. R., Pelling, A. E. A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology. J. Vis. Exp. (88), e51454, doi:10.3791/51454 (2014).

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