Summary
نقدم في هذه المقالة منصة تمتد الرواية التي يمكن استخدامها لتحقيق استجابات خلية واحدة إلى مجمع متباين الخواص الميكانيكية تشوه ذو محورين وتحديد الخواص الميكانيكية للالأنسجة البيولوجية.
Abstract
يمكن أن الأدوات التي تسمح تطبيق القوى الميكانيكية للخلايا والأنسجة أو أن قياس ساهمت الخواص الميكانيكية للالأنسجة البيولوجية بشكل كبير في فهم mechanobiology الأساسية. تم هذه التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لشرح كيفية تتأثر ظهور وتطور الأمراض المختلفة بشكل كبير من قبل العظة الميكانيكية. يقدم هذا المقال ذو محورين تمتد (BAXS) منصة متعددة الوظائف التي يمكن إما ميكانيكيا تحفيز خلايا واحد أو قياس صلابة الميكانيكية للأنسجة. تتكون منصة BAXS من أربعة محركات لفائف الصوت التي يمكن التحكم بشكل مستقل. الخلايا وحيدة يمكن تربيتها على ركيزة المرنة التي يمكن تركيبها على المحركات يسمح احد لفضح الخلايا إلى حقول سلالة معقدة، ودينامية، ومكانيا متفاوتة. على العكس، من خلال دمج خلية الحمل القوة، يمكن للمرء أيضا قياس الخواص الميكانيكية للأنسجة ابتدائية وهم يتعرضون لدورات تشوه.في كلتا الحالتين، ومجموعة مناسبة من المشابك يجب أن تصمم وشنت على منصة BAXS المحركات من أجل اعتقادا راسخا الركيزة مرنة أو الأنسجة من الاهتمام. منصة BAXS يمكن تركيبه على مجهر مقلوب لأداء الضوء المرسل في وقت واحد و / أو التصوير مضان لدراسة الاستجابة الهيكلية أو البيوكيميائية من العينة خلال التجارب التمدد. توفر هذه المقالة تفاصيل التجريبية من تصميم واستخدام منصة BAXS ويعرض النتائج لخلية واحدة ودراسات النسيج كله. تم استخدام منصة BAXS لقياس تشوه في نوى خلايا فأر myoblast واحد ردا على الركيزة سلالة وقياس صلابة من aortas الماوس معزولة. منصة BAXS هو أداة متعددة الاستعمالات التي يمكن دمجها مع مختلف microscopies الضوئية من أجل تقديم رؤى mechanobiological الرواية على الصعيدين الأنسجة شبه الخلوية، الخلوية وكامل.
Introduction
المكروية الميكانيكية تلعب دورا هاما في العديد من وظائف الخلية مثل انتشار، والهجرة، والتمايز، والتي يكون لها أثر عميق في التنمية والتوازن من الأنسجة، وكذلك في الأمراض 1-6. على مر السنين، وقد استخدمت العديد من الأدوات التجريبية لتحفيز ميكانيكيا الخلايا أو الأنسجة وقياس الخواص الميكانيكية للالأنسجة البيولوجية بهدف زيادة فهمنا للmechanobiology الأساسية ودراسة ظهور وتطور الأمراض 6-17. ومع ذلك، يجب على المرء غالبا ما تعتمد على العديد من الأجهزة التجريبية المختلفة من أجل تحقيق أهداف دراسة خاصة. تقدم هذه المقالة واحدة، متعددة الوظائف، ذو محورين تمتد (BAXS) منصة تسمح للدراسات أن التحقيق في الدور الذي تلعبه الخواص الميكانيكية والقوات الميكانيكية في علم الأحياء في شبه الخلوية لمقاييس الطول النسيج كله. منصة BAXS لا يسمح للquantificatioن من الخواص الميكانيكية للأنسجة معزولة، ولكن أيضا يسهل القدرة على تطبيق حقول السلالة بسيطة ومعقدة، ودينامية إلى الخلايا الحية من أجل فهم ردودها تمتد التي تحدث في الجسم الحي. منصة BAXS تحتفظ أيضا القدرة على أداء المجهري الخلية الحية أثناء اختبار الميكانيكية والاضطرابات على الخلايا والأنسجة.
منصة BAXS هو جهاز مبنية خصيصا والتي يمكن استخدامها لدراسة تأثير الركيزة تشوه على المستوى الخلوي وإجراء اختبارات الشد على الأنسجة البيولوجية (الشكل 1A). كانت ملفقة سخان الألومنيوم لاستيعاب القياسية صحن 10 سم بيتري والحفاظ على أي حلول الفسيولوجية عند 37 درجة مئوية باستخدام وحدة تحكم في درجة الحرارة وسخانات KAPTON (الشكل 1B). هذه المنصة BAXS يمكن أن تكون متكاملة على تباين المرحلة مقلوب و / أو المجهر مضان ويسمح للتصوير في وقت واحد (الشكل 1C).وباختصار، تتكون منصة BAXS أربعة الخطية المحركات لفائف صوت الأجزاء المتحركة التي هي التي شنت على مصغرة الكرة الحركة الخطية الموجهة الشرائح تحمل على طول محورين عمودي (الشكل 1D). هي التي شنت مرحلة تحديد المواقع خطية إلى كل من المحركات الأربعة للسماح الحركة العمودية للنظام لقط التي سيتم استخدامها (الشكل 1E). ويتم رصد موقف كل السيارات من قبل ترميز البصرية مع قرار من 500 نانومتر (الشكل 1F). يتم التحكم في كل أربعة المحركات بشكل مستقل مع وحدة تحكم حركة توظيف ردود الفعل ترميز البصرية لتنفيذ أوامر الحركة (الشكل 1G). يوفر واجهة ابفيف السيطرة الكاملة على حجم الإزاحة، والسرعة، والتسارع من كل محرك من أجل توليد تشوه تخصيص بالكامل، والدينامية، من الخلايا أو عينات الأنسجة.
ويتم تحقيق هذه التقنية تستخدم للحث على تشوه في الخلايا ببساطة عن طريق allowinالخلايا ز الالتزام التام ركيزة مرنة وشفافة ومن ثم تمتد هذه الركيزة باستخدام المحركات الأربعة للمنصة BAXS. منصة BAXS يسمح تركيب أي مجموعة مصمم خصيصا من المشابك إرفاق الركيزة على المحركات لفائف صوت. لهذا الغرض، قمنا بتصميم مجموعة من المشابك التي ركيزة مرنة وشفافة، مصنوعة من (PDMS) polydimethylsiloxane، يمكن أن تعلق (أرقام 2A-C والشكل 3). كما سوف يتعرض المشابك لحلول الفسيولوجية، تم تشكيله جميع أجزاء من الفولاذ المقاوم للصدأ للسماح للتعقيم. وقد تم تصميم هذه المشابك بعناية لتحقيق الركيزة أقرب وقت ممكن إلى الهدف المجهر لتعزيز جودة الصورة وتقليل الإجهاد على الركيزة خلال تمتد (الشكل 2D).
ويمكن أيضا منصة BAXS نفس أن تستخدم لقياس صلابة من عينات الأنسجة الصغيرة، وذلك باستخدام مجموعة مناسبة من المشابك مع ادابتيد لتدعم عينات الأنسجة والخلايا الحمل لمراقبة القوات. ويمكن اتخاذ عدة نهج لتركيب الأنسجة إلى منصة BAXS المحركات؛ في هذه الحالة الفولاذ المقاوم للصدأ المسامير minutiens الحشرات يمكن ربط من خلال افتتاح الأنسجة الوعائية من أجل إجراء اختبارات الشد (أرقام 4A-B). بدلا من ذلك، لأنسجة سميكة بدون فتحة طبيعية، يمكن أن تكون إما عقد حواف الأنسجة في موقف مع المشابك التي تعلق على المحركات لفائف الصوت أو لصقها على الشرائح الزجاجية الصغيرة مع الغراء البيولوجية وتعلق على المحركات مع المشابك. من أجل أداء اختبارات الشد مطلوب خلية الحمل مصغرة ويمكن إدراجها بسهولة على منصة BAXS المحركات وتستخدم لقياس القوة المؤثرة على النسيج خلال دورة تمتد (الشكل 4C). كما يتكون النظام الأساسي BAXS من أربعة محركات، وإدخال خلية الحمل الثاني يسمح احد لأداء اختبار الشد على طول اتجاهين متعامدين. هذه القدرة يسمح احد لquantifذ صلابة الميكانيكية للنسيج واحد على طول اتجاهين متعامدين خلال نفس التجربة.
الأهم من ذلك، في كافة تكوينات، والخلايا أو عينات الأنسجة من الاهتمام ويحتفظ دائما في حمام تسيطر عليها درجة الحرارة التي هي في متناول المستخدم. هذه القدرة تسمح لإدخال وكلاء الدوائية خلال عينة تمتد من أجل دراسة استجابة الزمني للعينة. بالإضافة إلى ذلك، والمحور البصري للمجهر مقلوب لا تزال دون عائق، وجميع أشكال المجهري لا تزال متاحة للمستخدم. أخيرا، وكما جميع المحركات الأربعة للمنصة BAXS مستقلة فمن الممكن تطبيق حقول سلالة شكلي للغاية لعينة من الفائدة. يتعرضون في الجسم الحي الخلايا والأنسجة لمعقدة ومتباين الخواص تمتد التي يمكن أن تكون تحاكي الأنسب في هذا المنبر في مقابل لالتقليدي ذو محورين تمتد منصة 7،13،15،18،19. وعلاوة على ذلك، فإن الخصائص الفيزيائيةالحقل سلالة يمكن تغيير على الطاير خلال التجربة. هذه القدرات تسمح للمستخدم لدراسة الاستجابة الخلوية ومستوى الأنسجة لعدد كبير من معقدة للغاية، متباين الخواص، زمانيا، ومكانيا متفاوتة المجالات السلالة. توضح هذه المقالة مزايا والقيود المفروضة على منصة BAXS فضلا عن تصميمها، مبادئ التشغيل، والتفاصيل التجريبية لخلية واحدة والتجارب النسيج كله.
الشكل 1. نظرة عامة على منصة BAXS. أ) أعلى نظرا منصة BAXS تظهر أربعة محركات لفائف صوت. B) صور مفصلة للسخان طبق بتري تستخدم للحفاظ على الخلايا والأنسجة عند 37 درجة مئوية C) ومنصة يمكن تركيبه على مجهر مقلوب لأداء الحية التصوير الخلية خلال التجارب التمدد.D) صورة تفصيلية للمحرك لفائف صوت؛ الجزء المتحرك من المنصة. E) صورة تفصيلية للمرحلة تحديد المواقع خطي يسمح النزوح العمودي للأنظمة لقط. F) صورة تفصيلية للترميز البصرية التي توفر موقف في الوقت الحقيقي من المحرك إلى وحدة تحكم الحركة. G) صورة تفصيلية من وحدة تحكم الحركة تظهر المدخلات البصرية التشفير أربعة ومخرجات الطاقة إلى أربعة محركات لفائف صوت.
الشكل 2. نظام تحامل الخلية تمتد التجارب. AB) صور تظهر تفاصيل المشابك تستخدم لإرفاق الركيزة PDMS إلى المحركات لفائف صوت ليمتد. C) يتم تغليف الركيزة حول الجزء الأسطواني من المشبك مع الملامح ترسيخ لوفاق يجلس في أخدود في الأعلى. ثم يتم تأمين الركيزة باستخدام الصواميل التي تدفع الركيزة / ترسيخ الميزات في أخدود العلوي. D) توضيحات من منصة BAXS مع المشابك عقد الركيزة في المكان. يبين أقحم على عرض تفصيلي لالركيزة مع الخلايا المرتبطة به يجلس فوق زلة الغطاء والهدف المجهر.
الرقم 3. بيل من المواد الغشاء ونظام لقط لها. رسومات تبين أبعاد الأجزاء الرئيسية المتكاملة إلى منصة ذو محورين لأداء الخلية تمتد التجارب.
الشكل 4. السابقينوافرة من نظام لقط لتقييم تصلب الأوعية العيار الصغير. AB) صور مفصلة للنظام لقط تستخدم للحث على تشوه في 1 مم الماوس الشريان الأورطي. وقد شكل دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ بعناية إلى مثلثات مفتوحة للسماح للسفينة أن تنزلق على كل الدبابيس. C) توضيحات من منصة BAXS مع المشابك عقد السفينة وخلية الحمل تعلق بين المحركات الثابتة والمشبك اليسرى. يظهر أقحم أعلى عرض مفصل للسفينة التي شنت على المسامير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التشوه الميكانيكية للخلايا واحدة
- اختلاق الركيزة PDMS مع الخرز نيون جزءا لا يتجزأ من
قبل تلفيق الركيزة، ومعلق المجهرية الفلورية في المحلول المائي في الأيزوبروبانول لتعزيز حبة خلط في PDMS نظرا لطبيعتها مسعور.- ماصة 500 ميكرولتر من الفلورسنت المجهرية إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 16،200 x ج لمدة 10 دقيقة.
- تجاهل طاف وإضافة 500 ميكرولتر من اتباعها مع الأيزوبروبانول 5 دقائق من vortexing ل. وضعت القارورة جانبا بين عشية وضحاها في الظلام من أجل السماح للأي الجزيئات الكبيرة المجاميع إلى الرواسب.
- في صباح اليوم التالي، وإزالة بعناية طاف لميكروسنتريفوج قارورة نظيفة. هذا الحل حبة يمكن استخدامها لصنع أكثر من 5 ركائز. ملاحظة: سوف تستمر الحل حبة لالرواسب لمدة 3 أيام القادمة. كن حذرا لتجنب إعادة التعليق على بيليه.
- صب 0.5 غرام من وكيل علاج المقدمةمع عدة PDMS في microcentrifuge قارورة 1.5 مل باستخدام ميزان علمي. خطوات متتالية، إضافة ما مجموعه 90 ميكرولتر من الخرز (15 في ستة الإضافات ميكرولتر)، vortexing لمدة 1 دقيقة بين كل إضافة. توضع جانبا.
- تزن 10 غرام من PDMS وتخلط لمدة 12 دقيقة على الأقل مع 0.5 غرام من وكيل علاج تستكمل مع الخرز الفلورسنت.
- افتعال SU-8 2050 قالب على شكل عبر استخدام تقنيات ضوئيه القياسية التالية تعليمات الشركة الصانعة. القالب تستخدم يبلغ ارتفاعه 320 ميكرومتر ومساحتها 13.4 سم 2 (الشكل 3). يمكن أن يحتوي القالب 428 ميكرولتر أو 440 ملغ من PDMS.
- صب 400 ملغ من PDMS مع حبات في قالب على شكل عبر باستخدام ماصة نقل وعلاج لمدة 2 ساعة على 80 درجة مئوية. بعد المعالجة، تقشر الركيزة من القالب (الشكل 5A). يمكن أن تظل الركيزة في طبق بيتري في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 أسابيع دون أن تظهر تغييرات كبيرة في خصائصه الميكانيكية. صب قطرات من PDMS (وكيل علاج: PDMS مع نسبة 1:20) في طبق بتري مع الحجم النهائي من حوالي 4 مم وقطرها علاجها رأسا على عقب لمدة 2 ساعة على 80 درجة مئوية (الشكل 5B). هذه الميزات ترسيخ يمكن أن يوضع في طبق بتري لعدة أسابيع. ملاحظة: الحفاظ على الطبق رأسا على عقب لمنع قطرات من تسطيح أثناء عملية المعالجة.
- علاج الهواء البلازما (30 ثانية في 30 W) الركيزة و8 الميزات رسو. ربط الميزات على كل نهاية من الركيزة على مسافة 4 مم من شكل مربع المسافة البادئة موجودة على الركيزة (الشكل 5C).
- تصاعد غشاء على المشابك
- التفاف كل نهاية الركيزة حول الجزء أسطواني مخدد من المشابك وضمان الحصول عليها في مكان مع 2 الصواميل من أعلى (الشكل 2B وأرقام 5D-E).
- المسمار 4 المشابك على حامل المشبك وتصب PDMS (نسبة 1:20) باستخدام ر القابل للتصرفاملحول ماصة في واجهة بين الركيزة والجزء المجوف أسطواني من المشابك. نشر PDMS غير مخمر حول الجزء أسطواني مخدد باستخدام مفتاح عرافة 1.5 مم.
- صب PDMS (1:20) في الأخاديد حتى تملأ تماما من عمل شعري وعلاج التجمع في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (الشكل 5F).
- بذر خلايا في غشاء
- علاج الهواء البلازما (30 ثانية في 30 W) على الجمعية العامة بكامل هيئتها لتعقيم وfunctionalize الركيزة للسماح للالكولاجين الطلاء.
- Functionalize مجال الركيزة حيث سيتم المصنفة الخلايا مع 1 مل من 0.02 M حمض الخليك تستكمل مع 16 ميكروغرام / مل من الفئران الذيل الكولاجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. كثافة الكولاجين النهائي المطلوب هو 5 ميكروغرام / سم 2.
- شطف 3X الركيزة مع العازلة الفوسفات واتركها لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
- إضافة 40 ميكرولتر من مستنبت تستكمل مع 10٪ سيرو بقري جنينيم و 1٪ البنسلين الستربتوميسين تحتوي على 2،000 الخلايا في جزء من مركز الركيزة لتغطية مساحة 1 سم 2 (كثافة الخلايا: 20 خلية / ملم 2). ويمكن تغيير كثافة الخلية وفقا لمتطلبات التجريبية.
- وضع التجميع كله في مستوى حاضنة الثقافة الخلية مع الركيزة مواجهة مع قطرة من مستنبت الخلايا التي تحتوي على ذلك. ملاحظة: يجب أن تبقى الجمعية مع الركيزة مواجهة لا يقل عن 3 ساعة للسماح للخلايا لنعلق بحزم ذلك. لمنع التبخر، يضاف 30 ميكرولتر من مستنبت دافئ في انخفاض على الركيزة كل 45 دقيقة لمدة 3 ساعة.
- بعد 3 ساعة، والوجه الجمعية العامة بكامل هيئتها في طبق بتري مليئة مستنبت جديدة ليغرق الركيزة واحتضان بين عشية وضحاها للسماح الخلايا على التكاثر.
- في اليوم التالي، وإعداد محلول ملحي HEPES مخزنة (HBSS؛ 20 ملم من HEPES، 120 ملي كلوريد الصوديوم، 5.3 ملي من بوكل، 0.8 ملي من MgSO 4، 1.8 ملم من و CaCl 2، و 11.1 ملي ديxtrose). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. ملاحظة: الحل HBSS أن تكون مستعدة يوميا وأبقت على 37 درجة مئوية خلال التجارب. يستخدم هذا الحل الفسيولوجية للحفاظ على الخلايا على المسرح المجهر عن طريق محاكاة البيئة الأنسجة / الدم الطبيعي.
- تركيب مجموعة المتابعة على النقيض من المرحلة مقلوب أو المجهر الفلورسنت جبل المشبك الجمعية الركيزة على منصة BAXS والمحركات. ملء طبق بتري داخل سخان طبق بتري مع HEPES العازلة (الشكل 2D).
2. تصلب قياس السفن الصغيرة العيار
- إعداد
- كريبس حل الفسيولوجية: يعد حل من 118.1 ملي مول كلوريد الصوديوم، 11.1 ملي مد الجلوكوز، 25 مم 3 NaHCO، 4.7 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO 4، 1.2 ملي KH 2 PO 4، و 2.5 مم CaCl 2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 والأوكسجين الحل مع كربوجين الغاز الطبي (95٪ O 2/5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: soluti كريبسعلى أن تكون مستعدة يوميا وأبقت على 37 درجة مئوية خلال التجارب. يستخدم هذا الحل الفسيولوجية للحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة عن طريق محاكاة البيئة الأنسجة / الدم الطبيعي.
- جمع الأدوات اللازمة للتشريح وتقييم الميكانيكية للسفن الأبهر: مقص جراحي، ملاقط محني، المقص الصغير، مجهر تشريح الجراحي، و 50 مل أنابيب البولي بروبلين الطرد المركزي، و 10 مل الماصات المصلية. إجراء العمليات الجراحية والتجربة لا تتطلب أي ظروف معقمة. جبل المشابك من منصة BAXS جنبا إلى جنب مع تحميل خلية مسبقا.
- عزل الأنسجة وتشريح
جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات المختبرية أن تتم الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المستخدمين مؤسسة، والذي يتوافق مع دليل الصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المستخدمين البلاد.- أداء الماوس الموت الرحيم مع استنشاق 99٪ CO 2 (7 رطل)في (الشكل 6A) غرفة زجاجي.
- البطن مفتوحة الماوس وقطع الشريان الأورطي الصدري ينزف الماوس.
- إزالة الحجاب الحاجز، والقفص الصدري وفصوص الرئة (الشكل 6B). ملاحظة: لتقليل خطر إتلاف الأنسجة، والحفاظ على قلب تعلق على الشريان الأورطي وتجنب لمس السفينة مباشرة ولكن التلاعب به باستخدام القلب.
- إزالة القلب وجذر الشريان الأبهر والشريان الأورطي الصدري عن طريق خفض بلطف بين السفينة والعمود الفقري. ملاحظة: لا تحمل أي استطالة في السفينة أثناء الختان للحفاظ على البنية الداخلية للأنسجة سليمة (الشكل 6C).
- تزج فورا والحفاظ على القلب والشريان الأورطي في حل كريبس.
- قص وغسل بعناية الشريان الأورطي في حل كريبس لإزالة أي جلطات الدم. إزالة النسيج الضام باستخدام مقص الصغرى، ملاقط والجراحية تشريح المجهر (الشكل 6D-E). ملاحظة: حافظ على كل طول السفينة واستخدام منطقة المسؤولية الجذر عرة لتحديد اتجاه السفينة.
- سفينة تحديد البعد وتصاعد
لتحديد صلابة من السفينة، ويطلب من أبعاد السفينة تفريغ ويمكن تحديد مع المجهر معايرة.- قطع حلقة الأبهر من حوالي 2 ملم في الطول وبدقة قياس طوله باستخدام مجهر معايرة وضع (أرقام 6F-G). وضع هذا الجزء جانبا في حل كريبس.
- خفض آخر حلقة الأبهر صغيرة قدر الإمكان بين كل من قطاعات مم 2 (الشكل 6F). وضع هذه الشريحة صغيرة على شريحة زجاجية المجهر مع لمعة مواجهة وقياس سمك الجدار باستخدام إعداد المجهر معايرة (الشكل 6H).
- ملء طبق بيتري على منصة BAXS مع الحل كريبس وإدراج شريحة حلقة الأبهر 2 ملم على دبابيس سحب (أقحم في الشكل 4C).
جنرال الكتريك = "دائما"> 
الرقم 5. الركيزة PDMS تصنيع وتركيب. A) وبعد المعالجة، ومقشر الركيزة بعناية قبالة SU-8 2050 العفن وضعت جانبا في طبق بتري. B) رسو ميزات مصنوعة من PDMS وتساعد على تأمين الركيزة على المشابك. C) الركيزة مع ترسيخ ملامح جاهزة للتركيب. D) هي التي شنت على الركيزة المشابك 4، والتي يتم تركيبها على حامل المشبك (انظر الشكل). E) صور مفصلة للالركيزة التي شنت على 4 المشابك. F ) الإجراء من صب PDMS في الأخدود تحت الركيزة. السهم يظهر PDMS ملء ببطء الأخدود التي كتبها الشعرية.
454fig6highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 6. إعداد وعزل الشريان الأورطي الصدري. أ) إعداد الأدوات الجراحية والماوس الموت الرحيم. B) من خلال شق في البطن الطولية، وتتم إزالة القفص الصدري والرئة lobs. C) يتم إزالة الشريان الأورطي بعناية باستخدام قلب للتلاعب الأنسجة. D) والقلب والشريان الأورطي وضعت في كريبس حل الفسيولوجية. يتم تنظيف الشريان الأورطي عن طريق إزالة جميع الأنسجة الضامة. E) صورة مفصلة تبين. F) الجزء الأبهر القلب والشريان الأورطي المستخدمة لتقييم صلابة جنبا إلى جنب مع شرائح صغيرة تستخدم لقياس سمك. GH) طول دقيقة (G) وسمك (H) يتم تقييم كل من قطاعات السفينة باستخدام مجهر العكسية وبرنامج التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلية تمتد
تم استخدام منصة BAXS للتحقيق في استجابة الميكانيكية للنواة في خلايا فأر myoblast واحد (C2C12) تعرضت لتشوه الركيزة من 25٪. تم العثور على خلايا Myoblast في الأنسجة العضلية ويتعرضون باستمرار لتمتد الميكانيكية والضغط في الجسم الحي. وقد أظهرت الشكل والخصائص الميكانيكية للنواة الخلية لتلعب دورا رئيسيا في تنظيم التعبير الجيني والنشاط النسخي 20،21 وأيضا في مجموعة متنوعة من العيوب التنموية والأمراض مثل متلازمة هتشنسون جيلفورد الشياخ (HGPS)، إيمري -دريفوس الحثل العضلي (EDMD)، تمدد عضلة القلب، والشيخوخة المبكرة والسرطان 22-25. وبالتالي، فهم كيفية قوات من المكروية الميكانيكية الخارجية تؤثر على بنية ووظيفة النواة هو من مصلحة المدقع. تم استخدام منصة BAXS للتحقيق في انتقال القوة من ميل croenvironment إلى النواة التي تمتد موازية لمحور الركيزة رئيسية أو ثانوية لها. أرقام 7A-F يوضح قدرات منصة لإحداث تشوه في الركيزة طول اتجاهين متعامدين. وعلاوة على ذلك، يمكن للمنصة BAXS حدوث مجالات سلالة معقدة في الركيزة بالإضافة إلى معيار أحادي المحور من المجالات سلالة ذو محورين الخيلية. أرقام 7G-H يوضح المرونة التي تقدمها مراقبة مستقلة من مجال السلالة على طول اتجاهين متعامدين، مما يسمح لنا إما تنتج معيار (الضغط) أو نقي (غير ضاغطة) حقل سلالة ذو محورين. منصة BAXS هي قادرة على انتاج سلالة نقية مجال ذو محورين عن طريق سحب قليلا الركيزة في اتجاه عمودي على اتجاه تمتد الرئيسية (الشكل 7G) للتعويض عن ضغط موجودة في الركيزة على طول هذا الاتجاه خلال تمتد ذو محورين القياسية (الشكل 7H ).
ntent "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الرقم 7. العلاقات التشرد تشويه من أداء معيار ونقية ذو محورين تمتد. AB) ويتم اختيار حبات نيون يدويا على الإطار الأول من الفيديو وتتبع من إطار واحد إلى أخرى حتى يتم التوصل إلى الحد الأقصى تمتد على طول الأفقي (C) والعمودي (D) الاتجاهات. وهناك سيناريو MATLAB تلقائيا يحسب مكونات موتر سلالة الخضراء لكل إطار وينتج منحنى المعايرة من سلالة فيما يتعلق المحرك تشريد 27. EF) خطوط زرقاء وحمراء تتوافق مع المكون من سلالة موتر الخضراء على طول الأفقي و الاتجاهات العمودية على التوالي. G) تمتد نفس الركيزة بنسبة 4 ملم على طول المحور س وتمتد قليلا على طولذ محور بنسبة 1.5 مم (المميزة باللون الأحمر) تنتج حقل ذو محورين النقي مع عدم وجود تشوه في الضغط الركيزة. H) تمتد على طول الركيزة المحور س بنسبة 3.5 مم ينتج تشوه 25٪ وتشوه الضغط من 7٪ عندما يتم إصلاح نهايات الركيزة على طول المحور العمودي (المميزة باللون الأحمر).
مع القدرة على أداء الخلية الحية التصوير المجهري خلال تمتد، كانت ملطخة النوى مع صبغة الفلورسنت الخلية الحية، الذي يربط الحمض النووي (Hoescht 33342). بصفة عامة، وخلايا C2C12 تمتلك نواة بيضاوي الشكل مع محور الرئيسية والثانوية. أولا، تم تحديد الخلايا التي كانت موجهة نحو محاور النووية رئيسية أو ثانوية موازية لاتجاه أفقي تمتد. عند هذه النقطة، وامتدت الخلايا بنسبة 25٪ على طول كل محور متعامد تمتد حين الحصول على الصور من نواة undeformed والمشوهة بين كل دورات تمتد (الأرقام 8A-I). بهذه الطريقة يمكننا أن تقييم التشوه للنواةعلى طول محور الرئيسية والثانوية في إطار تشويه الركيزة تسيطر على وجه التحديد. Ovuscule، المساعد يماغيج، تم استخدامها لتحديد طول محاور النووية الرئيسية والثانوية. وسجلت هذه أطوال أثناء حالة undeformed وعندما امتدت نواة بالتتابع على طول المحاور الرئيسية والثانوية لها (أرقام 8G-I). لحساب تشوه النواة على طول محاور لها صغرى وكبرى، تم حساب التغير النسبي في طول على طول كل محور في دول امتدت وundeformed:
حيث ε هو التشوه، L 1 هو طول المشوهة وL 0 هو طول undeformed.
عن التشوه للنواة في C2C12 يسلك تباين الميكانيكية كما يعرض التشوه أعلى بكثير على طول محورها طفيفة (6.3 ± 1.1٪) بالمقارنة مع المحور الرئيسي لها (3.077؛ 0.6٪) (الشكل 8J). بالإضافة إلى ذلك، درسنا أيضا دور الأكتين وأنيبيب الهيكل الخلوي في تنظيم التشوه النووية. وقد تحقق ذلك من خلال depolymerizing خيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة بشكل انتقائي باستخدام مثبط حركة الخلايا-D ونوكودازول، على التوالي. Depolymerizing خيوط الأكتين أو تم العثور على الأنابيب الدقيقة للحث على فقدان التشوه متباين للنواة (الشكل 8J). هذه النتائج تدعم النتائج أن مكونات هيكل الخلية نقل القوات إلى النواة من الركيزة وضرورية أيضا للحفاظ على السلوك الميكانيكي الطبيعية من خلال تشوه النواة 25.
الرقم 8. تمتد البروتوكول والتشوه النووية. AC) توضيح تخطيطي لتعزيز بنية الشع بروتوكول tching من خلية واحدة مع نواتها المنحى أفقيا. الصور الطوري (DF) والصور، برنامج التحصين الموسع الفلورسنت (GI) من خلية ملطخة الحمض النووي محددة صبغة الفلورسنت. يوضح هذا التسلسل صورة نموذجية التجربة الخلية تمتد حيث تتعرض الخلية نفسها إلى حقول تشوه المتعامدة. أشرطة النطاق هي 25 ميكرومتر. يظهر J) C2C12 التشوه النووية متباين مع محور طفيفة تشويه أكثر بكثير من محور رئيسي. في الأكتين أو خلايا المحرومين أنيبيب (د CYT ونوكودازول، على التوالي)، يختفي هذا تباين. في جميع الأحوال، التشوهات نواة تختلف اختلافا كبيرا من الصفر تحت تشوه الركيزة من 25٪. ** ف قيمة <0.01، إقران اختبار t. † † ف قيمة <0.01، † † † ف قيمة <0.001، عينة واحدة اختبار t.
تقييم سفينة تصلب
ر "> في الآونة الأخيرة، حققت مجموعتنا تأثير مزمن الإفراط في التعبير عن حرارة صدمة بروتين-27 (HSP27 س / ه) بشأن تشكيل لويحات الشريان الأبهر في نموذج الفأر المعرضة للتصلب الشرايين (APOE - / -) 26 ونحن أظهرت أن HSP27 بمثابة البروتين الذي يقلل من الدهون atheroprotective البلاك وفرة بلعم ويزيد من البطانية وخلايا العضلات الملساء محتوى الكولاجين (أرقام 9A-B). لتحديد أثر هذا يعيد البناء النسيجي على سفينة الخواص الميكانيكية، تم استخدام منصة BAXS لقياس صلابة الأبهر.ويبين الشكل 9C منحنى الإجهاد والانفعال نموذجية من الشد تمتد من حلقة الأبهر. لقياس صلابة، تم حساب معامل الإضافية من منحنيات الإجهاد والانفعال في تشوه 30٪. صلابة هو المنحدر من الظل الى منحنى. عن طريق إدخال خلية الحمل على واحدة من منصة BAXS المحركات، واقتناء وقت واحد من displacemeالإقليم الشمالي وبيانات القوى غير ممكن. تم تحويل المنحنيات النزوح القوة في منحنيات الإجهاد والانفعال على أساس أبعاد undeformed من كل حلقة الأبهر. يتم حساب الضغط العصبي والتوتر باستخدام الصيغ التالية:
حيث ε هو التشوه، L 1 هو طول مشوه، L 0 هو طول undeformed، و هو الإجهاد، F هي القوة وA 0 هو المجال undeformed من الأنسجة تحت التحميل. في حالة معينة من حلقة الأبهر، ومنطقة undeformed (A 0) هو ضعف سمك مرات حلقة طول هذا الجزء.
كان مشوه كل عينة دوريا مع تشوه أقصى 40٪ بمعدل تشريد 50 ميكرون / ثانية لمدة 12 دورات مع 11 دورات الأولى السماح شروط مسبقة من الأنسجة ولوس انجليسواحد شارع للحصول على البيانات. وجدنا أن تصلب الأبهر شرائح من APOE - / - الفئران HSP27 س / ه (62.8 ± 3.0 كيلو باسكال) وزيادة كبيرة بنسبة 41٪ مقارنة مع APOE - / - سيطرة نموذج الماوس (44.4 ± 3.8 كيلو باسكال) (الشكل 9D) .
أخذت معا، أظهر تقييم الميكانيكية جنبا إلى جنب مع السفينة والأنسجة اللوحة التي تتميز الإفراط في التعبير عن HSP27 عن طريق زيادة تصلب الأوعية والكولاجين / السلس محتوى الخلايا العضلية. وتشير هذه النتائج إلى أن HSP27 يحتمل أن تزيد من استقرار آفات تصلب الشرايين، وبالتالي تقلل من خطر حدوث تمزق اللوحة.
الرقم 9. تأثير HSP27 الإفراط في التعبير عن السفينة صلابة. أظهرنا أن HSP27 تعديل كومبو النسيجيةsition من آفات تصلب الشرايين عن طريق زيادة خلايا العضلات الملساء باطنة (A: مكافحة α-SMA) ومحتوى الكولاجين (B: picrosirius بقعة حمراء) C) نموذجي منحنى الإجهاد والانفعال تم الحصول عليها من تمتد سفينة الأبهر حيث يتم احتساب صلابة في 30. ٪ من السلالة. . صلابة هو المنحدر من الظل (خط أحمر) إلى منحنى D) المزمن الإفراط في التعبير عن HSP27 يزيد السفن صلابة مقارنة السيطرة APOE - / - الفئران نموذج (D). أشرطة النطاق في (أ) و (ب) وكلاهما 40 ميكرون و 400 ميكرون في إدراجات. L = التجويف، I = البطانية، الخطوط المنقطة يحدد وسائل الإعلام. * ف قيمة <0.05، في اتجاه واحد أنوفا. *** ف قيمة <0.001، في اتجاه واحد أنوفا. الرقم مقتبس من عمل Cuerrier وآخرون 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منصة BAXS المقدمة هنا يسهل تجارب عديدة في دراسة mechanobiology، من تحقيقات واحد من الخلايا إلى الأنسجة كله. بالإضافة إلى ذلك، منصة مرنة للغاية وشكلي، مما يسمح للعديد من التجارب التحفيز الميكانيكي ومتعددة المحوري اختبار الشد. منصة تمكن أيضا الحفاظ على الخلايا والأنسجة في الظروف الفسيولوجية ويسمح للفحص المجهري في وقت واحد خلال تجارب تمتد. التجربتين هو موضح في الأقسام السابقة تدل على براعة منصة BAXS عند استخدام مجموعة مناسبة من المشابك في تصاعد مستمر. نظام وحدات وتخصيص عينة تصاعد مستمر، والوصول البصرية وإمكانية لإضافة أجهزة استشعار إضافية (على سبيل المثال خلية الحمل)، وفتح العديد من الاحتمالات لأنواع إضافية من التجارب التي يتعين القيام بها.
بروتوكول المعروضة أعلاه يحتوي على العديد من الخطوات الحاسمة التي يجب تنفيذها لdequately من أجل تحقيق أفضل النتائج. ضمن بروتوكول الخلية تمتد، وتصاعد الركيزة PDMS إلى المشابك يطالب التلاعب حساسة ودقيقة. الركيزة PDMS يجب أن تركز جيدا فيما يتعلق المشابك أربعة لتجنب الحركات الجانبية غير المرغوب فيها من خلال الركيزة تمتد. يمكن لمثل هذه الحركات الجانبية تجعل عملية تعقب للخلايا صعبة خلال تمتد التجارب. أيضا، من المهم جدا لرصد تبخر قطرة من مستنبت خلال بذر الخلية عندما يواجه الركيزة يصل في الحاضنة. اعتمادا على كيفية غالبا ما يتم فتح باب الحاضنة خلال هذه العملية، يمكن أن معدل التبخر تغيير. ضمن بروتوكول سفينة تمتد، فإن الخطوة الأكثر أهمية هو قياس أبعاد العينة لفحصها. يجب أن تكون هذه الأبعاد دقيقة قدر الإمكان لأنها تشارك في حساب صلابة الأنسجة، وبالتالي يكون لها تأثير مباشر على النتائج. بعد أن نفس الشخص أداء السفينة دسوف قياسات imension مساعدة في الحد من التباين بين العينات.
تلفيق من المشابك تستخدم لسحب على الركيزة PDMS خلال التجارب الخلية تمتد تشارك عدة دورات التنمية. لم يكن لديك النسخة الأولى من المشابك رسو خيوط الموجود في الجزء السفلي من الأجزاء الاسطوانية (الشكل 2B). دون هذا الأخدود، وتراجع الركيزة طول الجزء أسطواني، الأمر الذي أدى إلى تقلب كبير في الركيزة تشوه على مر الزمن. مع وجود أخدود وإضافة PDMS الشفاء (الشكل 5F)، الركيزة لم يعد زلات. هذا الإعداد التجريبية ينتج تشوه دائم في الركيزة مع مرور الوقت. لتمتد الأنسجة التجارب، واختيار خلية الحمل السليم هو أيضا مهم جدا. الخلية الحمل المستخدمة هنا لديها مجموعة وتحميل منخفضة (تصل إلى 150 غ)، والتي هي كافية لعينات اختبار هنا. الخلية حمولة حساسة للغاية المطلوبة للالاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافخلال شهر سحب القوات على عينات صغيرة تمتلك إشارة منخفضة نسبيا إلى الضوضاء (ق / ن) النسبة. لتحسين ق / ن نسبة وبالتالي تحسين القرار، وتحميل خلية معزولة كهربائيا من المحرك لفائف الصوت وأي الأجزاء المعدنية باستخدام مسامير بلاستيكية والفواصل. بهذه الطريقة تم الحصول على نسبة عالية ق / ن مع قرار من 0.03 غرام. للحصول على عينات ليونة، فمن المستحسن استخدام خلية أقل حمولة مجموعة من أجل الحفاظ على دقة عالية.
حاليا، فإن القيود الرئيسية من منصة BAXS هو القدرة على أداء على المدى الطويل تمتد التجارب بسبب تبخر المخزن المؤقت HBSS مع مرور الوقت. تبخر الماء يزيد من تركيز المادة المذابة التي يمكن أن يحتمل أن يكون لها تأثير على الخلايا. مع التكوين الحالي للمنصة BAXS، فمن الصعب أن يكون هناك تجربة من شأنها أن تحفز الخلايا أو الأنسجة ميكانيكيا خلال الأيام كما المخزن المؤقت الذي يتم مغمورة الخلايا والأنسجة يجب أن يكون supplem ented مع السائل مع مرور الوقت. في الإعداد الحالي، فإن معدل تبخر حوالي 0.9 مل / ساعة من وحدة تخزين الأولية من 25 مل من محلول العازلة HBSS. الإعداد الحالي يعتبر مثاليا للتجارب قصيرة الأجل. لأداء الخلية موثوقة والأنسجة تمتد التجارب على مدى فترات أطول من الوقت، واقترح اثنين من الإضافات: 1) نظام فلويديك للحفاظ على حجم العازلة، و2) إضافة تجاري أو منزل بنيت غرفة الحاضنة أرفق النظام برمته من أجل الحفاظ على الرطوبة ودرجة الحرارة المستمر وتوفير 5٪ / 95٪ CO جو 2 / بضغط الهواء. فيما يتعلق بخيار تمتد أنسجة الأوعية الدموية، والإعداد المذكورة أعلاه سمح لنا لقياس صلابة من سفن صغيرة العيار. من المهم استخدام دبابيس مع قطر السليم للتأكد من أنها لن تشوه خلال تمتد، ولكن هي صغيرة بما يكفي لتناسب في التجويف السفينة. لا يمكن أخذ هذه التفاصيل في الاعتبار عدم دقة في إدخال تشوه قياس من الأنسجة.
ve_content ">، يتم كشفها في الجسم الحي الخلايا جزءا لا يتجزأ من النسيج إلى القوات الميكانيكية والسلالات التي تختلف مكانيا وزمانيا، ولكن الأهم من ذلك أنها غالبا ما تكون متعددة المحوري. ومن الأمثلة الجيدة على السلوك الميكانيكي للجدران الأوعية الدموية في استجابة لقوى الدورة الدموية. مزيج من القوات الدورة الدموية المحلية 28-30 مع خصائص متباين الخواص من الأنسجة الوعائية 13،14،16،27 النتيجة في المكروية الميكانيكية المعقدة، الذي يعرض البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأوعية الدموية لعدة المحوري وسلالة دوري الحقول المعقدة. على الرغم من أن الخلايا الموجودة تجارب تمتد ساهمت إلى حد كبير في فهم أساسي للmechanotransduction وmechanobiology، فقد اعتمدت تقليديا على المثالية الحقول سلالة ذو محورين أو ذو محورين الخيلية التي لا تتكاثر المعقدة في الجسم الحي الحقول سلالة 8-10،19،29،31-34 . يسمح للمنصة BAXS خلية ذو محورين متباين الخواص تمتد في وقت واحد يعيش مع سلل المجهري. القدرة على السيطرة على تشوه الركيزة طول اتجاهين متعامدين يتيح لنا السيطرة الكاملة على الميدان السلالة. وهذا يتيح إنتاج الحقول سلالة معقدة بالإضافة إلى حقول سلالة ذو محورين والجل ذو محورين بسيطة. وعلاوة على ذلك، ومنصة تتيح لنا تغيير حيوي اتجاه المجال سلالة داخل نفس التجربة تمتد.
خيار دمج نظام لقط وحدات والعرف يفتح إمكانية للعديد من التطبيقات في mechanobiology الخلية وميكانيكا النسيج باستخدام منصة واحدة تمتد. على سبيل المثال، مع أنظمة لقط السليم 13،27، وهذا يمكن أداء منصة مستو ذو محورين ذو محورين واختبار الشد من الأنسجة البيولوجية. بهذه الطريقة، فإن الخواص الميكانيكية للأي نوع من الأنسجة، وقطع في شكل مستطيل أو مربع، ويمكن أن يكون كميا على محورين متعامدين في تجربة واحدة. بالإضافة إلى ذلك، أداء النسيجي لnalyses بعد التحفيز الميكانيكي يمكن أن تكشف عن التغييرات الهيكلية التي يسببها تمتد في الأنسجة. الالتواء هو أيضا نوع مهم جدا من التحميل الميكانيكية للأنسجة العضلات والأربطة 35. توفر هذه المنصة القدرة على تصميم نظام لقط التي يمكن أن تحفز على الدوران حول محور يمتد لإنتاج التحميل الميكانيكية التوفيقية التي تنطوي على الالتواء والتوتر. ومن الممكن أيضا لتقييم السفن عيار أكبر مع دبابيس المناسبة في تصاعد مستمر. دراسة الاستجابات الخلوية التالية تشوه الميكانيكية هو أيضا قيد التحقيق المكثف. منصة BAXS يوفر ميزة فريدة من نوعها لتغيير الاتجاه وتعقد مجال سلالة داخل نفس التجربة بالإضافة إلى السماح للتصوير في وقت واحد. الأهم من ذلك، أشكال متعددة الوسائط المجهر لا تزال ممكنة، كمنصة لا تتداخل مع المحور البصري للالمجهر. هذه هي ميزة هامة مثل استجابات الخلايا الحية الهيكلية والبيوكيميائية لد الميكانيكيةeformation يمكن قياسها. أخذت معا، وتصميم منصة BAXS تمتلك العديد من الميزات الهامة التي تسهل استخدامه لخلية واحدة والتجارب النسيج كله. من خلال استخدام نظام لقط وحدات وإضافة ما يصل إلى أربعة خلايا الحمل ممكن، ومنصة BAXS يمكن استخدامها للعديد من التجارب. يوضح هذا المقال تفاصيل عن مثالين من التجارب؛ ولكن نمطية ومرونة النظام يمكن استغلالها مزيد من التحقيق في العديد من جوانب متنوعة من mechanobiology في شبه الخلوية، والمقاييس طول الأنسجة الخلوية وكامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد DT قبل studentship ما بعد الدكتوراه من Le فون للبحوث كيبيك الطبيعة وآخرون تكنولوجيز (FQRNT) وارفع زمالة الاستراتيجية MITACS. وأيد CMC من قبل studentship ما بعد الدكتوراه من Le فون للبحوث في مجال سانتي كيبيك (FRSQ) وإرنست ومارغريت فورد أمراض القلب هبت زمالة بحثية من جامعة أوتاوا معهد القلب. وأيد EOB من خلال تشغيل المنح MOP80204 من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) وT6335 من القلب والسكتة الدماغية مؤسسة أونتاريو. وCIHR ومدترونيك تقديم جماعي EOB مع كرسي أبحاث لاستعراض الأقران (URC # 57093). ويتم تمويل AEP من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC) اكتشاف غرانت، وهو الملحق NSERC اكتشاف مسرع وبامتنان دعم كراسي البحث كندا برنامج (CRC)، وجائزة الباحث في وقت مبكر من مقاطعة أونتاريو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
References
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
- Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
- Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
- Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
- Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
- Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
- Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
- Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
- Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
- Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
- Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
- Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
- Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
- Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
- Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
- Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
- Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
- Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
- Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
- Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
- Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
- Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
- Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
- Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
- Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
- Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
- Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
- Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
- Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).
