Summary
Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.
Abstract
Werkzeuge, die die Anwendung von mechanischen Kräften, um Zellen und Gewebe oder die Quantifizierung zu ermöglichen kann die mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe haben sich zum Verständnis der Grund Mechanobiologie beigetragen. Diese Techniken wurden intensiv genutzt, um zu zeigen, wie die Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten sind stark von mechanischen Signale beeinflusst. Dieser Artikel stellt eine multifunktionale biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die entweder mechanisch stimulieren können einzelne Zellen oder zu quantifizieren, die mechanische Steifigkeit des Gewebes. Die BAXS Plattform besteht aus vier Schwingspulenmotoren, die unabhängig voneinander gesteuert werden können. Einzelne Zellen können auf einem flexiblen Substrat, das an die Motoren so dass man die Zellen, um komplexe, dynamische und räumlich variierenden Dehnungsfeldern aus befestigt werden kann, kultiviert werden. Umgekehrt wird durch den Einbau eines Kraftlastzelle, kann man auch eine Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Primärgeweben, wie sie Deformationszyklen ausgesetzt sind.In beiden Fällen muss eine richtige Satz von Klemmen entwickelt und montiert, um den Motoren BAXS Plattform, um fest zu halten das flexible Substrat oder das Gewebe von Interesse sein. Die BAXS Plattform auf einem inversen Mikroskop, um die gleichzeitige Durchlicht und / oder Fluoreszenzabbildung durchzuführen, um die strukturelle oder biochemische Reaktion der Probe während des Streckens Experimente untersuchen montiert werden. Dieser Artikel enthält experimentelle Details der Gestaltung und Nutzung des BAXS Plattform und präsentiert die Ergebnisse für einzelne Zelle und ganze Gewebestudien. Die BAXS Plattform wurde verwendet, um die Verformung der Kerne in Einzel Maus Myoblasten Zellen in Reaktion zu messen, um Stamm-Substrat und die Steifigkeit der isolierten Maus-Aorten messen. Die BAXS Plattform ist ein vielseitiges Werkzeug, mit verschiedenen optischen Mikroskopie, um neue Erkenntnisse zu den mechanobiological subzellulärer, Zell-und Gewebespiegel bieten ganze kombiniert werden können.
Introduction
Die mechanische Mikro spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellfunktionen wie Proliferation, Migration und Differenzierung, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Entwicklung und die Homöostase von Geweben und auch Krankheiten 1-6 haben. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von experimentellen Werkzeuge werden verwendet, um mechanisch zu stimulieren Zellen oder Geweben zu messen und mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe mit dem Ziel der Erhöhung der unser Verständnis der Grund Mechanobiologie und Untersuchung der Entstehung und Progression von Krankheiten 6-17. Allerdings muss man oft auf verschiedenen experimentellen Vorrichtungen, um die Ziele einer bestimmten Untersuchung zu erreichen. Dieser Artikel stellt eine Einzel-, Multi-Funktions-, biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die für die Studien, die die Rolle zu untersuchen, dass die mechanischen Eigenschaften und mechanische Kräfte spielen in der Biologie an der sub-zellulären, ganze Gewebelängenskalen erlaubt. Die BAXS Plattform ermöglicht nicht nur für die quantification der mechanischen Eigenschaften von Geweben isoliert, sondern erleichtert auch die Fähigkeit, einfache, komplexe und dynamische Spannungsfeldern auf lebende Zellen, um ihre Reaktion auf Strecken, die in vivo auftritt verstehen anzuwenden. Die Plattform BAXS behält auch die Fähigkeit lebender Zellen Mikroskopie bei der mechanischen Prüfung und Störungen auf Zellen und Gewebe durchzuführen.
Die BAXS Plattform ist ein custom-built Vorrichtung, die verwendet werden können, um die Wirkung der Substratdeformation auf zellulärer Ebene zu untersuchen und durchzuführen, Zugversuche an biologischen Geweben (Abb. 1A). Eine Aluminium Heizvorrichtung wurde hergestellt, um eine Standard-10-cm-Petrischale aufzunehmen und irgendwelche physiologischen Lösungen aufrechterhalten bei 37 ° C mit einem Temperaturregler und Kapton Heizer (Fig. 1B). Diese BAXS Plattform auf einem invertierten Phasenkontrast und / oder Fluoreszenzmikroskop integriert werden und ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung (Fig. 1C).Kurz gesagt, die BAXS Plattform besteht aus vier linearen Schwingspulenmotoren, von denen die beweglichen Teile auf Miniatur-Linearbewegung-Kugellager gleitet entlang von zwei senkrechten Achsen (Fig. 1D) ausgerichtet montiert ist. Ein Linearstellstufe zu jeder der vier Motoren angebracht, um die vertikale Bewegung des Spannsystems, mit (1E) werden können. Die Position jedes Motors wird durch einen optischen Codierer mit einer Auflösung von 500 nm (Fig. 1F) überwacht. Alle vier Motoren sind unabhängig voneinander mit einer Bewegungssteuerung, die optische Encoder-Feedback, Bewegungsbefehle (1G) ausführen gesteuert. Ein LabVIEW-Schnittstelle bietet die volle Kontrolle über die Verschiebungsgröße, Geschwindigkeit und Beschleunigung jedes Motors, um vollständig anpassbar, statische und dynamische Verformung der Zellen oder Gewebeproben zu generieren.
Die Einrichtung zur Verformung in Zellen zu induzieren Technik wird erreicht, indem einfach allowing Zellen fest an einem flexiblen und transparenten Substrat zu haften und dann Strecken dieses Substrat mit den vier Motoren der BAXS Plattform. Die Plattform ermöglicht die Montage BAXS jeder maßgeschneiderten Satz von Klammern, um das Substrat auf den Schwingspulenmotoren befestigen. Zu diesem Zweck haben wir eine Reihe von Klemmen, um die ein flexibles und transparentes Substrat, Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt ist, kann angebracht werden (Fig. 2A-C und Fig. 3). Da die Klemmen werden physiologischen Lösungen ausgesetzt werden, wurden alle Teile aus rostfreiem Stahl gefertigt, um für die Sterilisation zu ermöglichen. Diese Klemmen sind sorgfältig entworfen, um das Substrat so nahe wie möglich an dem Mikroskopobjektiv zu bringen, um die Bildqualität zu verbessern und gleichzeitig eine Minimierung der Belastung des Substrats während des Streckens (Fig. 2D).
Das gleiche BAXS Plattform kann auch verwendet werden, um die Steifheit der kleinen Gewebeproben zu quantifizieren, unter Verwendung eines geeigneten Satzes von Klemmen mit ADAPted Träger für die Gewebeproben und einer Lastzelle, um Kräfte zu überwachen. Verschiedene Ansätze werden können, um ein Gewebe zu den BAXS Plattform Motoren montieren; in diesem Fall werden die Edelstahl-Insekten minutiens Stifte durch die Öffnung des Gefäßgewebe um Zugversuche (Fig. 4A-B) führen zu haken. Alternativ für dicke Gewebe ohne eine natürliche Öffnung, Gewebekanten können entweder in der Position mit den Klemmen an den Schwingspulenmotoren angebracht oder mit kleinen Glasobjektträger mit biologischen Kleber verklebt und an die Motoren mit den Klemmen befestigt gehalten werden. Um Zug-Tests durchführen, ein Miniatur-Wägezelle ist erforderlich und kann leicht auf die Plattform BAXS Motoren eingebaut und verwendet, um die während einer Streckzyklus (4C) auf das Gewebe wirkenden Kraft zu messen. Da die BAXS Plattform von vier Motoren besteht, die Einführung einer zweiten Lastzelle erlaubt es, Zugprüfmaschine entlang zweier orthogonaler Richtungen durchzuführen. Diese Fähigkeit ermöglicht es, quantify die mechanische Steifigkeit eines einzelnen Gewebe entlang zwei senkrechten Richtungen im gleichen Experiment.
Wichtig ist, dass in allen Konfigurationen, die Zellen oder Gewebeproben von Interesse sind immer in einem temperaturkontrollierten Bad, das für den Benutzer zugänglich ist, gehalten. Diese Fähigkeit ermöglicht die Einführung von pharmakologischen Mitteln während der Proben Strecken, um die zeitliche Antwort der Probe zu untersuchen. Zusätzlich, da die optische Achse des umgekehrten Mikroskop unbehindert bleibt, sind immer noch alle Formen der Mikroskopie für den Benutzer verfügbar. Schließlich wird, wie alle vier Motoren der BAXS Plattform unabhängig ist es möglich, in hohem Maße konfigurierbar Spannungsfeldern auf die Probe von Interesse anzuwenden. In vivo Zellen und Gewebe ausgesetzt sind komplex und anisotrope Streckung, angemessener nachgeahmt in dieser Plattform gegen sein kann zu herkömmlichen einachsigen Dehnung Plattform 7,13,15,18,19. Darüber hinaus sind die physikalischen Eigenschaftender Dehnungsfeld kann dynamisch während eines Experiments geändert werden. Diese Fähigkeiten ermöglichen es dem Benutzer, den Zell-und Gewebeebene als Reaktion auf eine große Anzahl von komplexen, anisotropen, zeitlich und räumlich variierenden Spannungsfelder zu prüfen. Dieser Artikel beschreibt die Vorteile und Grenzen der BAXS Plattform sowie sein Design, Funktionsprinzipien und die experimentellen Details für einzelne Zelle und ganze Gewebe Experimenten.
Abbildung 1. Übersicht der BAXS-Plattform. A) Top Blick auf die BAXS Plattform, welche die vier Schwingspulenmotoren. B) Detailaufnahme der Petrischale Heizung Die Plattform kann auf einem inversen Mikroskop live-montiert werden verwendet, um Zellen und Gewebe bei 37 ° C C zu halten) Cell Imaging Experimente während der Dehnung.D) Detailaufnahme des Schwingspulenmotor; der bewegliche Teil der Plattform. E) Detaillierte Abbildung des linearen Positionierungsstufe ermöglicht vertikale Verschiebung der Spannsystemen. F) Detailaufnahme des optischen Encoder, der Echtzeit-Position des Motors bietet der Bewegungssteuerung. G) Detailaufnahme der Motion-Controller, der die vier optischen Encoder-Eingänge und Stromausgänge zu den vier Schwingspulenmotoren.
2. Spannsystem für Zellstreckexperimente. AB) Bilder, welche die Details der zur Herstellung der PDMS-Substrat zu den Schwingspulenmotoren für die Dehnung. C) Das Substrat wird um den zylindrischen Teil der Klemme mit seiner Verankerung featur gewickelt befestigen Schellenes sitzt in der Nut an der Spitze. Dann wird das Substrat mit den Stellschrauben, die das Substrat schieben / Verankerung Features in die obere Nut D) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Substrat an Ort und Stelle gesichert.. Der Einschub zeigt eine Detailansicht des Substrats mit Zellen daran befestigt sitzt direkt über einem Deckglas und dem Mikroskopobjektiv.
3. Stückmaterialien der Membran und ihre Spannsystem. Zeichnungen, die die Abmessungen der Hauptteile integriert werden, um die biaxiale Streckung Plattform Zellexperimente durchzuführen.
4. Exreichlich von einem Spannsystem für Steifigkeit Beurteilung der Kleinkalibergefäße. AB) Detailbilder des Spannsystems verwendet, um eine Verformung in einem 1 mm Durchmesser Maus Aorta zu induzieren. Edelstahl-Pins wurden sorgfältig in offene Dreiecke geformt, dass das Schiff auf beide Pins gleiten. C) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Schiff und eine Lastzelle zwischen der feststehenden Motor und der linken Klammer befestigt. Der Einschub zeigt eine detaillierte Draufsicht des auf den Stiften montiert Gefäß.
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Protocol
1. Mechanische Verformung von Einzelzellen
- Die Herstellung einer PDMS Substrat mit Embedded Leuchtstoffperlen
Vor der Herstellung des Substrats werden fluoreszierenden Mikrosphären in einer Wasserlösung in Isopropanol suspendiert zu Wulst Mischen in PDMS aufgrund der hydrophoben Natur zu verbessern.- Pipette 500 ul von fluoreszierenden Mikrokugeln in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 16.200 × g für 10 min.
- Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul Isopropanol folgte mit 5 min von Vortex. Setzen Sie die Fläschchen beiseite über Nacht im Dunkeln, damit keine großen Partikel-Aggregate zu sedimentieren.
- Am nächsten Morgen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand in ein sauberes Mikro Fläschchen. Dieser Bead-Lösung kann verwendet werden, um mehr als 5 Substrate herzustellen. HINWEIS: Die Bead-Lösung wird sich weiterhin für die nächsten 3 Tage zu sedimentieren. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Resuspendieren des Pellets.
- Pour 0,5 g des Härters bereitgestelltmit dem PDMS-Kit in einem 1,5-ml-Mikro Fläschchen mit einem wissenschaftlichen Gleichgewicht. Durch die aufeinanderfolgenden Schritten, fügen Sie insgesamt 90 ul-Perlen (in sechs 15 ul Ergänzungen), Vortexen für 1 Minute zwischen jeder Zugabe. Beiseite stellen.
- Gewicht von 10 g PDMS und Mischen für mindestens 12 min mit 0,5 g des Härters mit fluoreszierenden Kügelchen ergänzt.
- Fabrizieren eine SU-8 2050 Kreuzform mit Standard-Photolithographietechniken folgenden Anweisungen des Herstellers. Die verwendete Form weist eine Höhe von 320 um und einer Fläche von 13,4 cm 2 (Fig. 3). Die Form kann 428 ul oder 440 mg PDMS enthalten.
- Pour 400 mg des PDMS mit Perlen in der kreuzförmigen Form mit Hilfe einer Transferpipette und Heilung für 2 Stunden bei 80 ° C. Nach dem Aushärten Abziehen des Substrats von der Form (Fig. 5A). Das Substrat kann in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 2 Wochen ohne eine signifikante Änderung in seiner mechanischen Eigenschaften gehalten werden. Gießen Tröpfchen PDMS (Härter: PDMS mit einem Verhältnis von 1,20) in einer Petrischale mit einer endgültigen Größe von etwa 4 mm im Durchmesser und härten sie auf den Kopf für 2 h bei 80 ° C (Fig. 5B). Diese Verankerungs Merkmale können in einer Petrischale für Wochen aufbewahrt. HINWEIS: Halten Sie die Schüssel auf den Kopf, um die Tropfen aus Abflachung während der Aushärtung zu verhindern.
- Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) das Substrat und 8 Verankerung Funktionen. Binden die Eigenschaften an jedem Ende des Substrats in einem Abstand von 4 mm von der quadratischen Gedankenstrich auf dem Substrat (Fig. 5C) vorhanden.
- Montage Membrane auf den Schellen
- Wickeln Sie jedes Ende des Substrats um die gerillten zylindrischen Teil der Klemmen und befestigen Sie sie mit den zwei Befestigungsschrauben von oben (2B und 5D-E).
- Schrauben Sie die 4 Klammern auf dem Klemmhalter und gießen PDMS (Verhältnis 1:20) mit einem Einweg-transfer Pipette an der Schnittstelle zwischen dem Substrat und der genuteten zylindrischen Teil der Klammern. Verbreiten Sie die nicht ausgehärteten PDMS rund um den genuteten zylindrischen Teil mit einem 1,5 mm-Sechskantschlüssel.
- Gießen PDMS (1:20) in die Nuten, bis sie vollständig durch Kapillarwirkung gefüllt und die Anordnung zu härten bei 80 ° C für 2 h (Fig. 5F).
- Impfen Zellen auf der Membran
- Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) die ganze Versammlung zu sterilisieren und zu funktionalisieren, die das Substrat für die Kollagenbeschichtung ermöglichen.
- Funktionalisieren den Bereich des Substrats, wo Zellen mit 1 ml 0,02 M Essigsäure mit 16 ug / ml Rattenschwanzkollagen bei Raumtemperatur 1 h ergänzt ausgesät werden. Die gewünschte endgültige Kollagendichte ist 5 ug / cm 2.
- Mit Phosphatpuffer spülen Substrat 3x und lassen Sie es trocken bei Raumtemperatur für mindestens 10 min.
- 40 &mgr; l Kulturmedium mit 10% fötalem Rinder seru ergänztm und 1% Penicillin-Streptomycin enthält 2.000 Zellen in dem zentralen Abschnitt des Substrats, um eine Fläche von 1 cm 2 bedecken (Zelldichte: 20 Zellen / mm 2). Zelldichte nach Versuchsanforderungen verändert werden.
- Setzen Sie die gesamte Anordnung in einem Standardzellkulturbrutschrank bei dem das Substrat nach oben mit dem Tropfen Kulturmedium, Zellen darauf. HINWEIS: Die Montage muss das Substrat nach oben für mindestens 3 Stunden, damit Zellen zu fest an sie gehalten werden. Um die Verdampfung zu verhindern, wird 30 ul warmes Kulturmedium in den Tropfen auf dem Substrat alle 45 min während 3 h zugegeben.
- Nach 3 Stunden, drehen die ganze Versammlung in eine Petrischale mit frischem Kulturmedium gefüllt, um das Substrat untertauchen und Inkubation über Nacht, sodass die Zellen zu vermehren.
- Am nächsten Tag vorzubereiten HEPES-gepufferter Salzlösung (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSO 4, 1,8 mM CaCl 2, 11,1 mM dextrose). Den pH-Wert auf 7,4. HINWEIS: Die HBSS-Lösung muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die Zellen auf dem Objekttisch durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten.
- Montieren Sie das Set-up auf invertierten Phasenkontrast-oder Fluoreszenzmikroskop Montieren Sie die Klemme-Substrat-Baugruppe auf der BAXS Plattform und Motoren. Füllen Sie die Petrischale in der Petrischale Heizung mit HEPES-Puffer (2D).
2. Steifigkeit Messung der Kleinkaliber Schiffe
- Vorbereitung
- Krebs physiologischer Lösung: Eine Lösung von 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4 und 2,5 mM CaCl 2. Den pH-Wert auf 7,4 und mit Sauerstoff der Lösung mit Carbogen medizinisches Gas (95% O 2/5% CO 2) für 30 min. HINWEIS: Der Krebs-Löauf muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die lebendig Gewebe durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten.
- Sammeln Instrumentierung für die Zerlegung und mechanische Beurteilung der Aorten-Behälter: chirurgische Schere, Pinzette gebogen, Mikro-Scheren, chirurgische Binokular, 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen, 10 ml und serologischen Pipetten. Das chirurgische Verfahren und Experiment keine sterilen Bedingungen. Montieren Sie die Klemmen des BAXS Plattform zusammen mit der Wägezelle vorher.
- Tissue Isolierung und Dissection
Alle Experimente mit Labortieren haben, die von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Nutzer Institution, die mit der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren der der Nutzer entspricht "Land genehmigt werden.- Führen Maus Euthanasie mit der Inhalation von 99% CO 2 (7 psi)in einer Plexiglaskammer (6A).
- Offene Maus Bauch und schneiden Sie die Brustaorta, die Maus zu bluten.
- Entfernen Sie die Blende, den Brustkorb und die Lungenlappen (6B). HINWEIS: Um die Gefahr einer Beschädigung des Gewebes zu minimieren, halten das Herz, die Aorta befestigt und vermeiden direktes Berühren des Schiffes, aber mit dem Herzen manipulieren.
- Entfernen des Herzens, der Aortenwurzel und der Aorta durch leichtes Schneiden zwischen dem Behälter und der Wirbelsäule. HINWEIS: Führen Sie keine Dehnung im Behälter während der Exzision herbeiführen, um die innere Struktur des Gewebes intakt (6C) zu halten.
- Sofort tauchen und halten das Herz und die Aorta in Krebs-Lösung.
- Schneiden und sorgfältig waschen die Aorta in Krebs-Lösung, um alle Blutgerinnsel zu entfernen. Entfernen Bindegewebe mit Mikro-Schere, Pinzette und chirurgische Binokular (6D-E). HINWEIS: Bewahren Sie alle Schiffslänge und verwenden Sie die aortic Wurzel, das Schiff Ausrichtung zu bestimmen.
- Schiff Dimension Ermittlung und Montage
Um die Steifigkeit des Behälters zu bestimmen, werden die entladenen Behälterabmessungen erforderlich und kann mit einem kalibrierten Mikroskop bestimmt werden.- Schneiden Sie ein Aorten-Ring von etwa 2 mm in der Länge und präzise die Länge messen mit einem kalibrierten Mikroskop-Einstellung (6F-G). Setzen Sie dieses Segment beiseite in Krebs-Lösung.
- Geschnitten andere Aortaring so klein wie möglich zwischen den einzelnen Segmenten 2 mm (6F). Diesen kleinen Segment auf einem Mikroskopglasobjektträger mit dem Lumen nach oben und messen die Wandstärke mit einem kalibrierten Mikroskopeinstellung (6H).
- Füllen Sie die Petrischale auf der BAXS Plattform mit Krebs-Lösung und der Aorta 2 mm Ringsegment auf der Ziehstifte (in 4C eingelassen) einfügen.
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Abbildung 5. PDMS-Substrat Fertigung und Montage. A) Nach dem Aushärten wird das Substrat vorsichtig von den SU-8 2050 Form geschält und beiseite stellen in einer Petrischale. B) Verankerung Funktionen von PDMS und helfen, das Substrat, auf die Sicherung Schellen. C) Substrat mit Verankerungs Funktionen bereit für die Montage. D) Das Substrat wird auf den 4 Klemmen, die dann auf dem Klemmhalter montiert sind (siehe Kasten) montiert. E) Detailaufnahme der auf den 4 Klemmen montiert Substrat. F ) Verfahren des Gießens PDMS in der Nut unterhalb des Substrats. Der Pfeil zeigt die PDMS langsam füllt die Nut durch Kapillarwirkung.
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Abbildung 6. Vorbereitung und Isolierung der thorakalen Aorta. A) Vorbereitung chirurgischer Instrumente und die eingeschläfert Maus. B) Durch eine Längsbauchschnitt, der Brustkorb-und Lungen Lobs entfernt werden. C) Die Aorta ist sorgfältig mit dem Herzen zu manipulieren entfernt das Gewebe. D) Das Herz und die Aorta in Krebs physiologischen Lösung setzen. Die Aorta wird durch Entfernen aller Bindegewebe gereinigt. E) Detaillierte Abbildung zeigt das Herz und die Aorta. F) Aorta-Segment für Steifigkeit Beurteilung zusammen mit kleinen Segmenten zur Dickenmessung verwendet. GH) Die genaue Länge (G) und Dicke (H) von jeweils Gefäßsegmente werden mit einem inversen Mikroskop und ein Analyseprogramm ausgewertet.
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Representative Results
Handy Stretching
Die BAXS Plattform verwendet, um die mechanische Antwort des Kerns in einzelne Maus-Myoblasten-Zellen (C2C12) auf ein Substrat eine Verformung von 25% exponiert wurden. Myoblasten-Zellen werden in Muskelgewebe gefunden und werden ständig mechanischen Dehnung und Kompression in vivo ausgesetzt wird. Die Form und die mechanischen Eigenschaften des Zellkerns haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression und Transkriptionsaktivität 20,21 und auch in einer Vielzahl von Entwicklungsstörungen und Krankheiten wie Hutchinson-Gilford Progerie-Syndrom (HGPS) Emery spielen -Dreifuss Muskeldystrophie (EDMD), dilatative Kardiomyopathie, vorzeitige Hautalterung und Krebs 22-25. Daher verstehen, wie Kräfte von der externen mechanischen Mikroumgebung auf die Struktur und Funktion des Kerns von großem Interesse. Die BAXS Plattform wurde verwendet, um die Übertragung der Kraft von der mi untersuchen croenvironment an den Kern durch die Dehnung des Substrats parallel zu seiner Haupt-oder Nebenachse. 7A-F veranschaulicht die Funktionalität der Plattform zur Induktion einer Verformung in dem Substrat entlang zwei orthogonalen Richtungen. Darüber hinaus kann die Plattform BAXS komplexen Spannungsfelder im Substrat zusätzlich zu den Standard einachsigen von equi-zweiachsigen Spannungsfelder induzieren. Fakten 7G-H zeigt die Flexibilität, die unabhängige Steuerung der Dehnungsfeld entlang zweier orthogonaler Richtungen vorgesehen sind, so dass wir entweder zu produzieren ein Standard-(Druck) oder reinen (nicht Druck) einachsigen Spannungsfeld. Die BAXS Plattform ist in der Lage, eine reine einachsige Dehnungsfeld durch leichtes Ziehen des Substrats in der Richtung senkrecht zur Hauptdehnungsrichtung (7G), die für die in dem Substrat entlang dieser Richtung vorliegenden Kompression während eines Standard-einachsige Dehnung (7H kompensieren produzieren ).
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Figur 7. Displacement-Verformungsbeziehungen aus Führen Standard und reinen uniaxiales Strecken. AB) Leuchtstoffperlen werden von Hand auf den ersten Frame des Videos ausgewählt und von einem Rahmen zum anderen verfolgt, bis die maximale Ausdehnung entlang der horizontalen (C erreicht) und vertikalen (D) Richtungen. Ein MATLAB-Skript berechnet automatisch die Komponenten des Grün Dehnungstensor für jeden Rahmen und erzeugt eine Eichkurve des Stammes in Bezug auf Motor Verschiebungen 27. EF) Die blauen und roten Linien entsprechen dem Anteil der Grünen Dehnungstensor entlang der horizontalen und vertikaler Richtung auf. G) Dehnen des gleichen Substrats 4 mm entlang der x-Achse und entlang der leicht gedehnty-Achse um 1,5 mm (rot markiert) eine reine einachsige Feld ohne Druckverformung im Substrat. H) Dehnen des Substrats entlang der x-Achse von 3,5 mm erzeugt eine Verformung von 25% und eine Druckverformung von 7%, wenn die Enden des Substrats entlang der vertikalen Achse befestigt sind (rot markiert).
Mit der Fähigkeit lebender Zellen Mikroskopie bei Dehnung durchzuführen, wurden Kerne mit einem Lebendzellen-Fluoreszenzfarbstoff, der DNA (Hoechst 33342) bindet gefärbt. Im Allgemeinen C2C12 Zellen besitzen elliptischen Kerne mit einem Haupt-und Nebenachse. Zunächst wurden die Zellen identifiziert, in denen die Haupt-oder Nebenachsen Kern wurden parallel zu der horizontalen Streckrichtung orientiert sind. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen durch 25% entlang jeder orthogonalen Streckachse, während die Erfassung von Bildern des unverformten und verformten Kern zwischen jeweils Streckzyklen (Fig. 8A-I) gestreckt. Auf diese Weise konnten wir die Verformbarkeit des Kerns beurteilenentlang der Haupt-und Nebenachse unter genau kontrollierten Substratdeformation. Ovuscule ein ImageJ-Plugin, wurde verwendet, um die Länge der Haupt-und Nebenkern Achsen zu bestimmen. Diese Längen wurden im unverformten Zustand aufgezeichnet, und wenn der Kern nacheinander entlang seiner Haupt-und Nebenachsen (Fig. 8 G-I) gestreckt. Um die Verformung des Kerns entlang seiner Neben-und Hauptachsen zu berechnen, wurde die relative Längenänderung entlang jeder Achse in der gestreckten und verformten Zustände berechnet:
wobei ε ist die Verformung, L 1 die Länge verformt und L 0 ist die unverformte Länge.
Die Verformbarkeit des Kerns in C2C12 weist eine mechanische Anisotropie zeigt es eine wesentlich höhere Verformbarkeit entlang ihrer Nebenachse (6,3 ± 1,1%) im Vergleich zu seiner Hauptachse (3.077, 0,6%) (Abbildung 8J). Zusätzlich untersuchten wir auch die Rolle der Mikrotubuli und Aktin-Zytoskelett regulieren Kern Verformbarkeit. Dies wurde durch Depolymerisieren der Aktinfilamente oder Mikrotubuli selektiv mit Cytochalasin-D und Nocodazol, gelöst. Depolymerisieren der Aktinfilamente oder Mikrotubuli zeigte einen Verlust der anisotrope Verformbarkeit des Kerns (Fig. 8J) induzieren. Diese Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse, dass Zytoskelett-Komponenten übertragen Kräfte auf den Kern von dem Substrat und sind auch wichtig für die Erhaltung der natürlichen mechanischen Eigenschaften des Kerns 25 während der Verformung.
Abbildung 8. Stretching-Protokoll und Kern Verformbarkeit. AC) Schematische Darstellung des stre Tching Protokoll einer einzelnen Zelle mit ihrem Kern horizontal ausgerichtet. Phasenkontrastbilder (DF) und Epi-Fluoreszenzbilder (GI) einer Zelle mit DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff angefärbt. Diese Bildfolge zeigt eine typische Zelle Zugexperimentes wo die gleiche Zelle mit orthogonalen Verformung Feldern ausgesetzt. Maßstabsbalken 25 &mgr; m sind. J) C2C12 zeigt anisotrope Kern Verformbarkeit mit der Nebenachse verformt deutlich mehr als die Hauptachse. In Aktin-Mikrotubuli-oder beraubt Zellen (cyt-d und Nocodazol, respectively), verschwindet diese Anisotropie. Bei allen Bedingungen sind Verformungen Kern signifikant von Null unter einem Substratdeformation von 25%. ** P-Wert <0,01, gepaarter t-Test. † † p-Wert <0,01, † † † p-Wert <0,001, einer Stichproben-t-Test.
Schiff Steifigkeit Bewertung
t "> Vor kurzem untersucht unsere Gruppe die Wirkung der chronischen Überexpression von Heat Shock Protein-27 (HSP27 o / e) auf die Bildung von Plaques in der Aorta eine Atherosklerose anfällig Mausmodell (ApoE - / -). 26. Wir zeigte, dass HSP27 fungiert als atheroprotective Protein, Lipid-und Plaque-Makrophagen-Überfluss reduziert und erhöht die Intima glatten Muskelzellen und Kollagengehalt (9A-B). Um die Auswirkungen dieser histologischen Umbau am Schiff mechanischen Eigenschaften zu bestimmen, die BAXS Plattform verwendet wurde Aorten-Steifigkeit zu messen.Fig. 9C zeigt eine typische Spannungs-Dehnungs-Kurve von der Zugfestigkeit Dehnung eines aortischen Rings. Um die Steifigkeit zu quantifizieren, wurde das Elastizitätsmodul der Zwischen von Spannungs-Dehnungskurven bei einer Verformung von 30% berechnet. Die Steifigkeit ist die Steigung der Tangente an die Kurve. Durch Einführen einer Lastzelle auf einen der BAXS Plattform Motoren, die gleichzeitige Erfassung displacement-und Kraftdaten ist möglich. Die Weg-Kraft-Kurven wurden in Spannungs-Dehnungskurven auf der Grundlage der unverformten Abmessungen jedes Aortenring umgewandelt. Der Stress und Belastung werden mit folgenden Formeln berechnet:
wobei ε ist die Verformung, L 1 die Länge verformt, L 0 ist die unverformte Länge S die Spannung, F die Kraft ist und A 0 die unverformten Bereich des Gewebes unter Belastung. In dem speziellen Fall eines aortischen Ring, der nicht verformten Bereich (A 0) der doppelten Dicke der Ring fache der Länge des Segments.
Jede Probe wurde zyklisch mit einer maximalen Verformung von 40% bei einer Verschiebungsgeschwindigkeit von 50 um / s für 12 Zyklen mit den ersten 11 Zyklen so verformt Vorbehandlung des Gewebes und der last eine für die Datenerfassung. Wir fanden, dass die Steifigkeit der Aorta Segmente ApoE - / - HSP27 o / e-Mäusen (62,8 ± 3,0 kPa) signifikant um 41% im Vergleich zu der ApoE - / - Kontroll-Maus-Modell (44,4 ± 3,8 kPa) (9D) .
Zusammengenommen zeigen die mechanische Prüfung in Verbindung mit dem Schiff und Plaque Histologie zeigte, dass die Überexpression von HSP27 wird durch erhöhte Steifigkeit und Gefäß Kollagen / Glattmuskelzellgehalt aus. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HSP27 können möglicherweise die Stabilität der atherosklerotischen Läsionen und damit das Risiko von Plaque-Bruch zu verringern.
Abbildung 9. Wirkung von HSP27-Überexpression auf Gefäßsteifigkeit. Wir zeigten, dass HSP27 modifizierte die histologischen Komponentensition von Arteriosklerose Läsionen durch die Erhöhung der Intima glatten Muskelzellen (A: anti-α-SMA) und Kollagen-Gehalt (B: Picrosirius rote Färbung) C) Typische Spannungs-Dehnungs-Kurve von Strecken eines Aorten-Behälter, wo die Steifigkeit bei 30 berechnet erhalten. % der Belastung. . Die Steifigkeit ist die Steigung der Tangente (rote Linie) an die Kurve D) Chronische Überexpression von HSP27 erhöht Gefäße Steifigkeit im Vergleich von Kontroll ApoE - / - Mäusen Modell (D). Maßstabsbalken in (A) und (B) beide 40 &mgr; m und 400 &mgr; m in den Einschüben. L = Lumen, I = Intima, gestrichelten Linien skizziert das Medium. * P-Wert <0,05, one-way ANOVA. *** P-Wert <0,001, one-way ANOVA. Abbildung aus der Arbeit von Cuerrier et al 26 angepasst.
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Discussion
Die hier vorgestellten BAXS Plattform ermöglicht zahlreiche Experimente in der Studie von Mechanobiologie aus Untersuchungen von Einzelzellen zu ganzen Geweben. Außerdem ist die Plattform hoch flexibel und konfigurierbar, so dass für zahlreiche mechanische Stimulationsexperimente und multiaxiale Zugversuch. Die Plattform ermöglicht auch die Aufrechterhaltung von Zellen und Geweben unter physiologischen Bedingungen und ermöglicht die gleichzeitige Mikroskopie während des Streckens Experimenten. Die beiden in den vorherigen Abschnitten beschriebenen Experimente demonstrieren die Vielseitigkeit des BAXS Plattform bei Verwendung eines richtigen Satz Befestigungsschellen. Eine modulare und anpassbare Probe-Montagesystem, optischen Zugang und die Möglichkeit, zusätzliche Sensoren (zum Beispiel eine Wägezelle) hinzuzufügen, öffnen sich zahlreiche Möglichkeiten für zusätzliche Arten von Experimenten durchgeführt werden.
Die oben vorgestellte Protokoll enthält viele wichtige Schritte, die durchgeführt werden, muss eindequately, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Innerhalb der Zelle Stretching-Protokoll, die Montage der PDMS-Substrat an die Klemmen verlangt feine und präzise Manipulation. Die PDMS-Substrat muß auch in bezug auf die vier Klemmen zentriert sein, um unerwünschte Seitenbewegungen des Substrats während des Streckens zu verhindern. Solche seitlichen Bewegungen kann während Stretching Experimente der Tracking der Zellen erschweren. Auch ist es wichtig, die Verdunstung der Tropfen des Kulturmediums während der Zellaussaat, wenn das Substrat nach oben in den Inkubator zu überwachen. Je nachdem, wie oft der Inkubator Tür während des Prozesses geöffnet wird, kann die Verdunstungsrate zu ändern. Innerhalb des Behälters Streck Protokoll ist der wichtigste Schritt die Messung der Abmessungen der Probe, die getestet werden. Diese Dimensionen müssen so genau wie möglich sein, da sie in die Berechnung der Gewebesteifigkeit beteiligt und haben daher einen direkten Einfluss auf die Ergebnisse. Nachdem dieselbe Person durchführen Gefäß dIMENSION Messungen werden bei der Verringerung der Variabilität zwischen den Proben unterstützen.
Die Herstellung der verwendeten, auf der PDMS-Substrat während der Zell Stretching Experimente ziehen Schellen beteiligt mehrere Entwicklungszyklen. Die erste Version der Klammern nicht über eine Verankerungsnut an der Unterseite der zylindrischen Teile (2B) befindet. Ohne diese Nut rutschte das Substrat entlang dem zylindrischen Teil und induziert eine signifikante Variabilität in der Substratverformung über die Zeit. Mit dem Vorhandensein der Nut und der Zugabe von PDMS ausgehärtet (Fig. 5F), wobei das Substrat nicht mehr schlüpft. Diese Versuchsanordnung eine konstante Verformung in dem Substrat über der Zeit. Für Gewebe Stretching Experimente, die Wahl der richtigen Wägezelle ist auch sehr wichtig. Die Wägezelle welche hier hat einen niedrigen Lastbereich (bis 150 g), die ausreichend für die hier untersuchten Proben ist. Die sehr empfindliche Wägezelle für Mess erforderlichährend Zugkräfte an kleinen Proben besaß einen relativ niedrigen Signal-Rausch (S / N)-Verhältnis. Zur Verbesserung der s / n-Verhältnis und damit die Auflösung zu verbessern, wurde die Wägezelle elektrisch von der Schwingspulenmotor und Metallteile mit Kunststoffschrauben und Abstandshalter getrennt. Auf diese Weise wird eine hohe S / N-Verhältnis mit einer Auflösung von 0,03 g erhalten. Für weichere Proben wird die Verwendung eines niedrigeren Bereich Lastzelle, um eine hohe Auflösung zu erhalten, empfehlen.
Derzeit ist die größte Einschränkung des BAXS Plattform die Fähigkeit zur Langzeitversuche durch Dehnung aufgrund der Verdampfung des HBSS-Puffer über die Zeit. Wasserverdampfung erhöht Konzentration an gelösten Stoffen, die möglicherweise haben einen Effekt auf Zellen. Mit der aktuellen Konfiguration des BAXS Plattform, ist es schwierig, ein Experiment, das mechanisch stimulieren Zellen oder Gewebe über Tage als der Puffer, in dem die Zellen und Geweben untergetaucht zu sein haben Nachtr. mit Flüssigkeit über die Zeit richtet. In der aktuellen Einstellung ist die Verdampfungsrate 0,9 ml / h von einem Anfangsvolumen von 25 ml HBSS Pufferlösung. Die aktuelle Einstellung ist ideal für Kurzzeit-Experimenten. Um eine sichere Zelle und Stretching Experimente über längere Zeiträume Gewebe durchzuführen, werden zwei Ergänzungen vorgeschlagen: 1) Ein Fluidsystem für die Aufrechterhaltung der Puffervolumen, und 2) die Zugabe einer gewerblichen oder Haus gebaut Inkubator Kammer, die das gesamte System zur Aufrechterhaltung konstante Luftfeuchtigkeit und Temperatur und eine 5% / 95% CO 2 / Luft-Atmosphäre. Über die Möglichkeit der Dehnung vaskulären Geweben, erlaubt die oben beschriebene Einrichtung uns um die Steifigkeit des kleinkalibrigen Gefäße zu messen. Es ist wichtig, Stifte mit einer richtigen Durchmesser verwenden, um sicherzustellen, dass sie nicht während der Dehnung verformen, sind aber klein genug, um in das Gefäßlumen passen. Nicht unter dieses Detail berücksichtigt könnte Ungenauigkeit der gemessenen Verformung des Gewebes vor.
ve_content ">In-vivo werden gewebe eingebetteten Zellen mechanische Kräfte und Belastungen, die sowohl räumlich als auch zeitlich variieren ausgesetzt, aber noch wichtiger ist sie oft mit mehreren axialen sind. Ein gutes Beispiel ist das mechanische Verhalten der Gefäßwand in Reaktion auf die hämodynamischen Kräften. Die Kombination von lokalen hämodynamischen Kräften 28-30 mit den anisotropen Eigenschaften von vaskulären Geweben 13,14,16,27 ergibt sich eine komplexe mechanische Mikroumgebung, die Endothel-und glatten Gefäßmuskelzellen, komplexe mehrachsige und zyklische Spannungsfeldern aussetzt. Obwohl die bestehenden Zell Stretching Experimente haben wesentlich zum Verständnis der Grund mechanotransduction und Mechanobiologie beigetragen, sie traditionell auf idealisierten einachsige oder zweiachsige equi-Spannungsfelder, die komplexe in vivo Spannungsfelder 8-10,19,29,31-34 sich nicht fortpflanzen verlassen haben . Die Plattform ermöglicht BAXS anisotropen biaxial Zelle Dehnung mit gleichzeitiger Live-cell Mikroskopie. Die Möglichkeit, die Verformung des Substrats entlang von zwei orthogonalen Richtungen steuern, ermöglicht es uns, die volle Kontrolle über das Dehnungsfeld zu haben. Dies ermöglicht die Herstellung von komplexen Spannungsfeldern neben einfachen einachsigen und zweiachsigen Dehnungs equi-Felder. Darüber hinaus ermöglicht die Plattform wir die Richtung des Spannungsfeldes in der gleichen Zugexperimentes dynamisch ändern.
Die Möglichkeit der Integration eine modulare und individuelle Spannsystem eröffnet die Möglichkeit für viele Anwendungen in der Zell Mechanobiologie und Gewebemechanik mit einem einzigen Stretching-Plattform. Zum Beispiel mit der richtigen Spannsysteme 13,27, diese Plattform kann eben einachsige und zweiachsige Zugversuche von biologischen Geweben durchzuführen. Auf diese Weise können die mechanischen Eigenschaften eines Gewebes, in einer rechteckigen oder quadratischen Form geschnitten, entlang zweier orthogonaler Achsen in einem einzigen Experiment zu quantifizieren. Darüber hinaus Durchführung einer histologischennalyses nach der mechanischen Stimulation Stretch-induzierte strukturelle Veränderungen im Gewebe zeigen. Torsion ist auch eine sehr wichtige Art der mechanischen Belastung für die Muskeln und Bänder 35. Diese Plattform bietet das Potential, ein Klemmsystem, das eine Drehung um die Streckachse induzieren könnte, um eine kombinatorische mechanische Belastung torsionsbelastete und Spannung erzeugen zu entwerfen. Es ist auch möglich, größere Kaliber Gefäße mit entsprechenden Befestigungsstiften zu beurteilen. Studieren zellulären Reaktionen nach mechanischer Verformung ist ebenfalls intensiv untersucht. Die BAXS Plattform bietet eine einzigartige Funktion zum Ändern der Richtung und der Komplexität der Dehnungsfeld im selben Experiment Darüber hinaus ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung. Wichtig ist, dass multimodale Formen der Mikroskopie noch möglich, wenn die Plattform nicht mit der optischen Achse des Mikroskops stören. Dies ist ein wichtiges Feature, da die strukturellen und biochemischen Live-Zell-Antworten auf mechanische deformation gemessen werden. Zusammengenommen, die BAXS Plattform-Design besitzt mehrere wichtige Funktionen, die die Verwendung für einzelne Zelle und ganze Gewebe Experimente erleichtern. Durch Verwendung eines modularen Spannsystem und die Zugabe von bis zu vier möglichen Lastzellen kann die BAXS Plattform für eine Vielzahl von Experimenten verwendet werden. Dieser Artikel zeigt Details der zwei Beispiele von Experimenten; aber die Modularität und Flexibilität des Systems kann weiter genutzt werden, um viele verschiedene Aspekte der Mechanobiologie an den subzellulären, zellulärer und Gewebe gesamte Längenskalen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
DT wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) und eine MITACS Elevate Strategische Fellowship unterstützt. CMC wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und Ernest und Margaret Ford Kardiologie dotierten Forschungsstipendium an der University of Ottawa Heart Institute unterstützt. EOB wurde durch Betriebskostenzuschüsse MOP80204 von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) und T6335 aus der Herz-und Schlaganfall-Stiftung von Ontario unterstützt. Die CIHR und Medtronic kollektiv EOB mit einem Peer-Review-Research Chair (URC # 57093). AEP wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Entdeckung Grant, NSERC Discovery Accelerator Supplement finanziert und dankt der Unterstützung des Canada Research Chairs (CRC)-Programm und einer früh Researcher Award aus der Provinz Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
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