Summary
우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.
Abstract
세포와 조직에 기계적인 힘의 응용 프로그램이나 그 수있는 도구는 생물학적 조직의 기계적 특성이 기본 mechanobiology의 이해에 크게 기여 정량화 할 수 있습니다. 이 기술은 광범위하게 각종 질병의 발병과 진행이 크게 기계적 신호에 의해 영향을하는 방법을 설명하는 데 사용되었다. 이 문서는 기계적으로 하나의 세포를 자극하거나 조직의 기계적 강도를 정량화 할 수 있습니다 다기능 축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 독립적으로 제어 할 수있는 네 개의 보이스 코일 모터로 구성되어 있습니다. 단일 세포는 하나, 복잡한 동적 및 공간적 변화 스트레인 필드에 세포를 노출 할 수 있도록 모터에 부착 될 수있는 유연한 기판상에서 배양 될 수있다. 반대로, 로드셀을 통합하여, 하나는 이들이 변형 사이클에 노출 될 때 기본 조직의 기계적 특성을 정량화 할 수있다.두 경우 모두, 클램프의 적절한 세트를 설계해야하고 단단히 유연성 기판 또는 그 조직을 유지하기 위하여 BAXS 플랫폼 모터에 장착. BAXS 플랫폼은 연신 실험 동안 샘플의 구조적 또는 생화학 적 반응을 조사하기 위해 동시 투과광 및 / 또는 형광 이미징을 수행하는 도립 현미경에 장착 될 수있다. 이 문서에서는 BAXS 플랫폼의 디자인과 사용의 실험 세부 사항을 제공하고 단일 셀 및 전체 조직 연구에 대한 결과를 제시한다. BAXS 플랫폼은 기판 변형시키고 절연 쥐 대동맥의 강성을 측정하는 것에 응답하여 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 변형을 측정 하였다. BAXS 플랫폼은 하위 세포, 세포 및 전체 조직 수준에서 신규 mechanobiological 통찰력을 제공하기 위해 다양한 광학 microscopies과 결합 될 수있는 다양한 도구이다.
Introduction
기계적인 미세 환경은 조직의 발달 및 항상성에 또한 질병 1-6에 지대한 영향을 미칠 예컨대 증식, 이동 및 분화와 같은 다양한 세포 기능에 중요한 역할을한다. 수년에 걸쳐, 실험의 여러 도구는 기계적으로 세포 나 조직을 자극하고 기본 mechanobiology에 대한 우리의 이해를 증가시키고 질병 6-17의 발병과 진행을 공부하는 것을 목표로 생물 조직의 기계적 특성을 측정하는 데 사용되었다. 그러나, 하나는 종종 특정 연구의 목적을 달성하기 위하여 여러 가지 실험 장치에 의존한다. 이 문서에서는 기계적 특성 및 기계적 힘이 전체 조직 저울의 길이에 하위 세포 생물학에서 재생하는 역할을 조사 연구를 허용하는 단일, 멀티 기능, 이축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 quantificatio 수 있습니다뿐만 아니라,또한 기계적 격리 조직의 특성 만의 N은 생체 내에서 발생하는 연신 그들의 응답을 이해하기 위해 살아있는 세포로, 간단한 복소 및 동적 스트레인 필드를 적용하는 능력을 용이하게한다. BAXS 플랫폼은 세포와 조직에 기계적인 테스트와 동요 동안 라이브 세포 현미경을 수행 할 수있는 능력을 유지합니다.
BAXS 플랫폼은 세포 수준에서, 기판 변형의 효과를 조사하여 생체 조직 (도 1a)에서 인장 시험을 수행하는 데 사용할 수있는 맞춤식 장치이다. 알루미늄 히터는 표준 10 cm 페트리 접시를 수용 및 온도 제어기와 캡톤 히터 (도 1b)를 사용하여 37 ° C에서 어떠한 생리적 용액을 유지하기 위해 제조 하였다. 이 BAXS 플랫폼은 반전 위상 콘트라스트 및 / 또는 형광 현미경에 통합 및 동시 영상 (그림 1C)을 허용 할 수 있습니다.요컨데, BAXS 플랫폼은 이동 부분이이 수직축 (도 1D)을 따라 배향 소형 선형 모션 볼 베어링 슬라이드 상에 장착되어있는 4 개의 선형 보이스 코일 모터로 구성된다. 선형 위치 결정 스테이지 (도 1E)를 사용한다 클램핑 시스템의 수직 운동을 허용하기 위해 4 개의 모터의 각각에 장착된다. 각 모터의 위치는 500 nm의 해상도 (그림 1 층)와 광 인코더에 의해 모니터링된다. 네 개의 모터가 독립적으로 동작 명령 (그림 1G)를 실행하기 위해 옵티컬 엔코더 피드백을 이용한 모션 컨트롤러로 제어된다. LabVIEW는 인터페이스는 세포 또는 조직 샘플의, 완전히, 사용자 정의 정적 및 동적 변형을 생성하기 위해 변위의 크기, 속도 및 각 모터의 가속을 완전히 제어 할 수 있습니다.
세포에서 변형을 유도하는 데 사용되는 기술은 단순히 allowin함으로써 달성된다g 세포 단단히 플렉시블 투명 기판에 부착하고 BAXS 플랫폼의 네 개의 모터를 사용하여이 기판을 연신한다. BAXS 플랫폼은 음성 코일 모터에 기판을 연결하는 클램프의 맞춤 설계 세트로 장착 할 수 있습니다. 이 목적을 위해, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 유연하며 투명 기판이, (도 2A-C 및도 3)에 접속 될 수있는 클램프 세트를 설계했다. 클램프 생리적 용액에 노출 될 수있는 바와 같이, 모든 부품은 멸균 수 있도록 스테인레스 스틸로 기계 가공 하였다. 이러한 클램프 정중 (도 2d)를 연신하는 동안 기판 상에 스트레스를 최소화하면서 이미지 품질을 향상시키기 위해 현미경 대물 최대한 가까운 기판을 가지고 고안되었다.
동일한 BAXS 플랫폼은 ADAP와 클램프 적절한 세트를 사용하여, 작은 조직 샘플의 강성을 정량화하는데 사용될 수있다테드 조직 샘플 및 힘을 감시하는 로드셀 지원한다. 여러 가지 방법이 BAXS 플랫폼 모터에 조직을 마운트 가지고 갈 수있다; 이 경우에는 스텐레스 곤충 minutiens 핀은 인장 시험 (도 4A-B)를 수행하기 위해 혈관 조직의 개구부를 통해 연결 할 수있다. 대안 적으로, 천연 열지 않고 두꺼운 조직에 대한 조직 가장자리 역시 보이스 코일 모터에 부착 또는 생물학적 접착제와 작은 유리 슬라이드에 접착 및 클램프 모터에 연결된 클램프 위치에 유지 될 수있다. 인장을 수행하기 위해 소형 로드셀이 요구되는 테스트 용이 BAXS 플랫폼 모터에 혼입 및 연신 사이클 (도 4C) 동안 조직에 작용하는 힘을 측정 할 수있다. BAXS 플랫폼은 네 개의 모터로 구성 될 때, 제 2로드 셀을 도입 한 두 개의 직교하는 방향을 따라 인장 시험을 수행 할 수있다. 이 기능은 하나의 quantif 할 수 있습니다Y 동일한 실험을하는 동안 두 개의 수직 방향에 따라 단일 조직의 기계적 강성.
중요한 사실은, 모든 구성에서, 셀 또는 또한 조직 샘플은 항상 사용자에게 액세스 온도 조절 욕에서 유지된다. 이 능력은 샘플의 시간 응답을 조사하기 위해서 샘플 연신 동안 약리 제제의 도입을 허용한다. 도립 현미경의 광축이 막히지 남아 또한, 현미경의 모든 형태는 여전히 사용자가 이용할 수있다. BAXS 플랫폼의 네 개의 모터가 독립적으로 작동 마지막으로, 그 샘플에 높은 구성 변형 필드를 적용하는 것이 가능하다. 생체 세포와 조직이 노출되는 복잡하고 반대하는이 플랫폼에보다 적절하게 모방 할 수있는 스트레칭 이방성 전통적인 축 연신 플랫폼 7,13,15,18,19합니다. 또한, 물리적 특성변형 필드의 실험 기간 동안 즉석에서 변경 될 수 있습니다. 이러한 능력은 사용자가 시간적으로 매우 복잡한 이방성의 다양한 수, 및 공간적으로 다양한 변형 필드 세포 및 조직 수준의 응답을 검사 할 수있다. 이 문서는 장점과 한계에 BAXS 플랫폼뿐만 아니라 디자인, 작동 원리, 그리고 단일 세포 및 전체 조직 실험에 대한 실험 내용을 설명합니다.
BAXS 플랫폼의 그림 1. 개요. 네 보이스 코일 모터 플랫폼 수행 라이브 거꾸로 현미경에 장착 할 수 있습니다) 37 ° C. C에서 세포와 조직을 유지하기 위해 사용되는 배양 접시 히터. B) 상세한 그림을 보여주는 BAXS 플랫폼의 윗면) 스트레칭 실험 도중 세포 이미징.D) 보이스 코일 모터의 상세한 그림; 클램핑 시스템 모션 컨트롤러. G) 상세 사진에 모터의 실시간 위치를 제공하는 광학 인코더의. F) 상세 사진의 수직 변위를 허용하는 선형 위치 결정 스테이지의 플랫폼의 이동 부분. E) 상세한 그림 네 개의 보이스 코일 모터로 네 광학 엔코더 입력과 전원 출력을 나타낸 모션 컨트롤러.
그림 2. 세포 스트레칭 실험 시스템을 클램핑. 기판은 그것의 앵커 featur와 클램프의 원통형 부분의 주위에 싸여있다. C)를 연신위한 보이스 코일 모터에 PDMS 기판을 연결하는 데 사용되는 클램프의 상세를 도시 AB) 이미지에스 상단에있는 홈에 앉아. 그런 다음, 기판 상단 홈에 기능을 고정 / 기판을 밀어 고정 나사를 사용하여 고정한다. 클램프 자리에 기판을 들고 BAXS 플랫폼의 D) 그림. 삽입물은 부착 세포는 단지 커버 슬립과 현미경 대물 위에 앉아있는 기판의 세부를 도시한다.
도 3. 막과 클램핑 시스템의 재료의 명세서. 주요부의 치수를 나타낸 도면 셀 연신 실험을 수행하기 위해 이축 플랫폼에 통합.
그림 4. 예소 구경 혈관의 강성 평가 1mm 직경 쥐 대동맥에서 변형을 유도하기 위해 사용되는 클램핑 시스템. AB) 상세한 그림 클램핑 시스템의 충분한. 스테인레스 스틸 핀은주의 깊게 선박이 두 핀에 클램프 선박 및 고정 모터와 왼쪽 클램프 사이에 부착 된 로드셀을 들고 BAXS 플랫폼. C) 그림을 슬라이드 할 수 있도록 열려있는 삼각형으로 형성되었다. 삽입 된 핀에 장착 된 용기에 대한 자세한 높은 전망을 보여줍니다.
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Protocol
단일 세포의 1. 기계 변형
- 임베디드 형광 구슬을 가진 PDMS 기판의 제조
이전에 기판의 제조에, 물 해결책에있는 형광 마이크로 스피어의 소수성으로 인해 PDMS에 구슬 혼합을 향상시키기 위해 이소프로판올에 재현 탁하고 있습니다.- 10 분 동안 16,200 XG에 1.5 ML의 microcentrifuge 관과 원심 분리기에 형광 마이크로 피펫 500 μL.
- 뜨는을 취소하고 추가 이소프로판올 500 μL은 소용돌이로 교반의 5 분으로 하였다. 어떤 큰 입자가 침강 집계 있도록하기 위해 어둠 속에서 밤새 옆 유리 병을 넣어.
- 다음 날 아침, 조심스럽게 깨끗한 마이크로 원심 유리 병에 뜨는을 제거합니다. 이 비드 용액을 5 개 이상의 기판을 제조하는데 사용될 수있다. 주 : 구슬 솔루션은 다음 3 일 동안 침전 할 것입니다. 펠렛을 재현 탁 않도록주의하십시오.
- 제공된 경화제 0.5 g을 붓고과학적인 균형을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 원심 유리 병에 PDMS 키트. 연속적인 단계로, 각 추가 사이에 1 분 동안 소용돌이로 교반, (6 개 15 μL의 추가에) 비즈 90 μL의 총을 추가합니다. 옆으로 설정합니다.
- PDMS의 10g을 달아 형광 비드로 보충 경화제 0.5 g과 적어도 12 분 동안 혼합한다.
- 제조업체의 지시에 따라 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여 SU-8 2050 십자가 모양의 몰드를 제작. 사용되는 금형은 320 ㎛의 높이 13.4 cm 2의 면적 (그림 3). 형은 428 μL 또는 PDMS의 440 밀리그램을 포함 할 수 있습니다.
- 전송 피펫을 사용하여 십자가 모양의 금형에 구슬과 PDMS의 400 밀리그램을 넣어 80 ℃에서 2 시간 동안 치료 경화 후, 주형 (도 5a)로부터 기판을 벗긴다. 기판은 그것의 기계적 특성에 상당한 변화를 나타내지 않고, 실온에서 2 주간 배양 접시에서 유지 될 수있다. 직경 약 4mm의 최종 크기와 페트리 접시에 (1:20 비율로 PDMS 경화제)와 80 ° C (그림 5B)에서 2 시간 동안 거꾸로 그들을 치료 PDMS의 방울을 붓는다. 이러한 고정 기능은 주 페트리 접시에 보관하실 수 있습니다. NOTE : 경화 공정 중에 평탄화로부터 방울을 방지하기 위해 거꾸로 접시를 유지한다.
- 에어 플라즈마 치료 (30 W에서 30 초) 기판과 8 고정 기능을 제공합니다. 기판 (그림 5C)에 존재하는 사각형 모양의 들여 쓰기의 4 mm의 거리에서 기판의 양쪽에있는 기능을 결합한다.
- 클램프에 막 설치
- 클램프의 홈이있는 부분의 주위에 원통형 기판의 각 끝을 감싸고 위로부터 2 개의 고정 나사 (그림 2B 및 그림 5D-E)와 함께 제자리에 고정.
- 클램프 홀더 4 클램프 나사와 일회용 T를 사용하여 PDMS (비율 1:20) 부어기판 클램프 그루브 원통형 부분 사이에서 인터페이스를 ransfer 피펫. 1.5 mm 육각 키를 사용하여 홈이 원통 부분의 주위에 경화 PDMS를 확산.
- 완전히 모세관 작용에 의해 채워지고 2 시간 (그림 5 층) 80 ° C에서 어셈블리를 치료할 때까지 홈에 PDMS (1:20) 붓는다.
- 막에서 셀 시드
- 에어 플라즈마 치료 (30 W에서 30 초) 콜라겐 코팅이 가능하도록 기판을 소독 및 기능화하는 전체 집합.
- 세포를 실온에서 1 시간 동안 쥐 꼬리 콜라겐을 16 ㎍ / ㎖로 보충 된 0.02 M 아세트산 1 ㎖ 시드 될 기판의 영역을 기능화. 원하는 최종 콜라겐 농도가 5 ㎍ / cm 2입니다.
- 인산염 완충액으로 기판의 3 배를 세척하고 실온에서 건조 적어도 10 분 동안 식히십시오.
- 10 % 소 태아 오는 보충 문화 매체의 40 μl를 추가합니다m 및 1cm 2의 면적 덮도록 상기 기판의 중앙부에서 2000 세포를 포함하는 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (셀 밀도 : 20 세포 / mm 2). 세포 밀도는 실험 요구 사항에 따라 변경 될 수 있습니다.
- 기판은 그 위에 세포를 포함하는 배양 배지의 드롭 위로 향하게 표준 세포 배양 인큐베이터에서 전체 어셈블리를. 참고 : 어셈블리 기판이 세포가 단단하게 부착 할 수 있도록 적어도 3 시간 동안 향하도록 유지해야합니다. 증발을 방지하기 위해, 따뜻한 문화 매체의 30 μL은 기판의 드롭 3 시간 동안 매 45 분에 추가됩니다.
- 3 시간 후, 기판을 담그고 세포가 증식 할 수 있도록 밤새 품어 신선한 배지로 가득 페트리 접시에 전체 어셈블리를 플립.
- 다음 날, HEPES 버퍼 소금 솔루션 (HBSS를 준비, 헤 페스, 염화나트륨 120 밀리미터,의 KCl 5.3 밀리미터, 망초 0.8 밀리미터, 염화칼슘 1.8 ㎜, 드의 11.1 mm의 20 mM의xtrose). 7.4으로 산도를 조정합니다. 참고 : HBSS 용액을 매일 준비하고 실험하는 동안 37 ° C로 유지되어야한다. 이 생리 용액 정상 조직 / 혈액 환경을 흉내 현미경 스테이지에서 세포를 유지하기 위해 사용된다.
- 반전 위상차 또는 형광 현미경 마운트 BAXS 플랫폼과 모터의 클램프 기판 조립품의 세트 업을 탑재합니다. HEPES 버퍼 (그림 2D)와 페트리 접시 히터 내부의 페트리 접시를 채우십시오.
작은 구경의 선박 2. 강성 측정
- 준비하기
- 크렙스 생리 솔루션 : 118.1 mM의 NaCl을, 11.1 mM의 D-글루코스, 25 mM의 탄산 수소 나트륨, 4.7 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 망초, 1.2 ㎜ KH 2 PO 4, 2.5 mM의 염화칼슘 용액을 준비합니다. 7.4로 pH를 조정하고, 30 분간 carbogen 의료 가스 (95 % O2 / 5 % CO 2)와 용액에 산소. 참고 : 크렙스 soluti입니다에 매일 준비하고 실험하는 동안 37 ° C로 유지되어야한다. 이 생리적 솔루션은 정상 조직 / 혈액 환경을 흉내 살아있는 조직을 유지하는 데 사용됩니다.
- 외과 용 가위, 굽은 핀셋, 마이크로 가위, 외과 해부 현미경, 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브, 10 ㎖의 혈청 피펫 : 절개 대동맥 혈관의 기계적 평가를위한 장비를 수집합니다. 수술 및 실험 절차는 무균 조건을 필요로하지 않습니다. 미리로드 셀과 함께 BAXS 플랫폼의 클램프를 장착합니다.
- 조직 분리 및 해부
실험 동물을 포함한 모든 실험 절차는 국가의 사용자의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드를 준수 기관, '사용자의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아야합니다.- 99 % CO 2의 흡입으로 마우스 안락사를 수행합니다 (7 PSI)플렉시 유리 챔버 (그림 6A)에.
- 오픈 마우스의 복부와 마우스를 피 흉부 대동맥을 잘라.
- 다이어프램, 흉곽과 폐 엽 (叶) (그림 6B)를 제거합니다. 참고 : 조직 손상의 위험을 최소화 대동맥에 부착 된 마음을 유지하고 직접 용기에 닿지 않도록하지만, 마음을 사용하여 조작 할 수 있습니다.
- 부드럽게 용기와 척추 사이에 절단하여 심장, 대동맥 근부 및 흉부 대동맥을 제거합니다. 참고 : 조직 손상 (그림 6C)의 내부 구조를 유지하기 위해 절단하는 동안 용기의 모든 신도를 유도하지 마십시오.
- 즉시 담그고 크렙스 용액에 심장과 대동맥을 유지합니다.
- 잘라 내기 및주의 깊게 혈전을 제거하는 크렙스 용액에 대동맥을 씻는다. 마이크로 가위, 핀셋, 외과 해부 현미경 (그림 6D-E)를 사용하여 결합 조직을 제거합니다. 참고 : 모든 선박의 길이를 유지하고 AOR을 사용선박의 방향을 결정하는 TIC 루트.
- 선박 치수 측정 및 설치
용기의 강성을 확인하려면 언로드 용기 치수가 필요하고 보정 현미경으로 확인할 수 있습니다.- 길이가 약 2 ㎜의 대동맥 고리를 잘라 정밀 (그림 6 층-G)를 설정 보정 현미경을 사용하여 길이를 측정합니다. 크렙스 용액에 옆이 세그먼트를 넣습니다.
- 2mm 세그먼트 (그림 6 층)의 각각의 사이에 가능한 한 작은 다른 대동맥 고리를 잘라. 루멘이 위로 향 현미경 유리 슬라이드에이 작은 세그먼트를 넣고 교정 현미경 설정 (그림 6H)를 사용하여 벽 두께를 측정합니다.
- 크렙스 용액으로 BAXS 플랫폼에서 페트리 접시를 입력하고 (그림 4C의 확대 그림) 당기 핀에 2mm의 대동맥 링 세그먼트를 삽입합니다.
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치료 후 그림 5. PDMS 기판의 제조 및 설치.는), 기판은 조심스럽게 SU-8 2050 형을 벗겨. B) PDMS 만든 기능을 앵커 페트리 접시에 따로 넣고에 기판을 보호하는 데 도움이됩니다 4 클램프에 장착 된 기판의 기판이어서 클램프 홀더에 장착되는 4 클램프 (인셋 참조) 상에 장착된다. D)를 장착하기위한 준비 기능 정박와 페이. C) 기판. E) 상세한 그림. F 기판 아래 홈에 PDMS를 붓는) 절차. 화살표는 천천히 모세관 현상에 의해 홈을 채우는 PDMS를 보여줍니다.
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그림 6. 준비 및 흉부 대동맥의 분리.) 길이 복부 절개를 통해 수술기구와 안락사 마우스. B)를 준비, 흉곽과 폐의 LOB가 제거됩니다. C) 대동맥은 신중하게 조작 할 마음을 사용하여 제거 조직. D) 심장과 대동맥은 크렙스 생리 솔루션에 배치됩니다. 대동맥은 모든 결합 조직을 제거하여 청소한다. 두께 측정에 사용되는 작은 세그먼트와 함께 강성 평가에 사용되는 심장과 대동맥. F) 대동맥 세그먼트. GH)의 정확한 길이 (G) 및 두께를 나타내는 E) 상세한 그림 (H)에게 각 용기의 세그먼트들은 역 현미경 및 분석 프로그램을 이용하여 평가된다.
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Representative Results
스트레칭 셀
BAXS 플랫폼은 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 기계적 응답 (C2C12) 25 %의 기판의 변형에 노출을 조사하기 위해 사용 하였다. 근원 세포 세포는 근육 조직에서 발견하고 지속적으로 생체 내에서 기계적 스트레칭 및 압축에 노출되어 있습니다. 세포핵의 형상이나 기계적 성질은 유전자 발현 및 전사 활성 (20, 21)의 조절에 또한 발달 결함과 같은 허친슨 - 길 포드의 조로증 증후군 (HGPS), 에머리 같은 다양한 질병에 중요한 역할을하는 것으로 보여 - Dreifuss 근육 퇴행 위축 (EDMD), 확장 성 심근증, 조기 노화 및 암 22 ~ 25. 따라서, 외부로부터의 기계적 미세 힘이 핵의 구조와 기능에 영향을 미치는지 이해하는 것은 극도의 관심이다. BAXS 플랫폼 마일 힘의 전송을 조사하는 데 사용되었다 주요 또는 보조 축에 평행 한 기판을 스트레칭하여 핵 croenvironment하면. 7A-F 두 직교하는 방향을 따라 기판에 변형을 유도하는 플랫폼의 기능을 도시 한 도면. 더욱이 BAXS 플랫폼 동등 이축 스트레인 필드 표준 축성 이외에 기판에 복잡한 변형 필드를 유도 할 수있다. 7G-H 우리가 생성하는 어느 허용 개의 직교 방향을 따라 변형 필드의 독립 제어가 제공하는 유연성을 도시 피규어 표준 (압축) 또는 순수 (비 압축) 단축 변형 필드. BAXS 플랫폼 약간 표준 축성 스트레치 (도 7H 동안이 방향을 따라 기판에 압축 존재를 보상하기 위해 방향 (도 7G)를 연신 주체에 수직 인 방향으로 기판을 잡아 당겨 순수 축성 스트레인 필드를 생성 할 수있다 ).
ntent "FO : 유지 - together.within 페이지를 ="항상 ">
그림 7. 수행에서 변위 - 변형 관계 표준 및 순수 일축 최대 스트레치가 수평 (C를 따라 도달) 및 수직 될 때까지. AB) 형광 구슬을 수동으로 비디오의 첫 번째 프레임을 선택하고 다른 하나의 프레임에서 추적 스트레칭 (D) 방향. MATLAB 스크립트가 자동으로 각 프레임의 녹색 변형 텐서의 구성 요소를 계산하고 파란색과 빨간색 선이 수평을 따라 녹색 변형 텐서의 구성 요소에 해당하고) 모터에 관하여 변형의 교정 곡선 27. EF를 변위 발생 x 축 방향의 4mm로 동일 기판 스트레칭 약간 함께 스트레칭 각각 수직 방향. G)(빨간색으로 강조 표시) 1.5 mm로 y 축이 기판 없음 압축 변형으로 순수한 축 필드를 생성합니다. 종축을 따라, 기판의 단부 ()가 적색으로 강조 고정 될 때 3.5 mm에서 x-축선을 따라 기판을 스트레칭 H)의 25 %의 변형 및 7 %의 압축 변형을 생성한다.
스트레칭 동안 라이브 세포 현미경 이미징을 수행 할 수있는 능력과 함께, 핵은 DNA (Hoescht 33342)에 결합 라이브 세포 형광 염료로 염색 하였다. 일반적으로, C2C12 세포는 메이저와 마이너 축과 타원형의 핵을 보유하고 있습니다. 첫째, 세포의 주요 마이너 핵 축이 수평 연신 방향에 평행하게 지향 된에서 확인되었다. 이 시점에서, 세포는 각 연신 사이클 (도 8A-I) 사이의 미 변형 및 변형 된 핵의 영상을 획득하는 동안 축 연신 각 직교 따라 25 %로 연신 하였다. 이러한 방법으로 우리는 핵의 변형능을 평가할 수있다정밀하게 제어 기판의 변형에서의 전공 및 부전공 축을 따라. Ovuscule, ImageJ에 플러그인은 메이저와 마이너 핵 축의 길이를 결정하는 데 사용되었다. 핵 순차적는 메이저와 마이너 축 (그림 8G-I)을 따라 뻗어 때이 길이는 변형되지 않은 상태에서 기록되었다. 그 크고 작은 축을 따라 핵의 변형을 계산하기 위해 뻗어 및 변형되지 않은 상태에서 각 축을 따라 길이의 상대적 변화를 계산했다 :
ε가 변형이고, L 1은 변형 길이와 L 0은 변형되지 않은 길이입니다.
그것이 3.0 (장축에 비해 (6.3 ± 1.1 %)의 부축을 따라 상당히 높은 변형성을 디스플레이 등 C2C12에서 핵의 변형능은 기계적 이방성을 나타낸다77, 0.6 %) (그림 8J). 또한, 우리는 또한 핵 변형성 조절에 액틴 세포 골격 및 미세 소관의 역할을 조사 하였다. 이 선택적으로 각각 사이토-D와 노 코다 졸을 사용하여 액틴 필라멘트 또는 미세 소관을 해중합에 의해 달성되었다. 액틴 필라멘트를 해중합 또는 미세 소관은 핵 (그림 8J)의 이방성 변형성의 손실을 유발하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 세포 골격 구성 요소가 기판에서 핵에 힘을 전달하고 또한 변형 25시 핵의 자연적인 기계적인 동작을 유지에 필수적이라는 연구 결과를 지원합니다.
Stre에 그림 8. 프로토콜 및 핵 변형성을 스트레칭. AC) 개략도 그 핵을 가진 단일 셀의 tching 프로토콜은 가로 방향으로. 셀의 위상 콘트라스트 이미지 (DF)와 에피 형광 이미지 (GI)는 DNA 특정 형광 염료로 염색. 이 이미지 시퀀스는 동일한 셀이 직교 변형 필드에 노출되는 일반적인 셀 연신 실험을 도시한다. 스케일 바는 25 μm의 수 있습니다. J) C2C12가 작은 축이 주축보다 훨씬 더 많은 변형과 이방성 핵 변형성을 보여줍니다. 에서 굴지 또는 (각각 CYT-D와 노 코다 졸) 미세 소관 박탈 세포,이 이방성이 사라집니다. 모든 조건에서 핵 변형은 25 %의 기판의 변형에 따라 0에서 크게 다르다. * P-값 <0.01, 쌍 t-검정. † † P-값 <0.01, † † † p 값 <0.001, 1 표본 t 검정.
선박 강성 평가
t "> 최근에, 우리의 그룹은 만성의 영향을 조사를 통해 표현 열 충격 동맥 경화가 발생하기 쉬운 마우스 모델에서 대동맥 플라크의 형성에 단백질 27 (HSP27의 O / E)의 (의 apoE - / -). 26 우리 HSP27은 플라크의 지질 및 대 식세포의 풍요를 줄이고 내막 평활근 세포와 콜라겐 함량 (도 9a-B)을 증가시키는 동맥 경화를 예방하는 단백질의 역할을 보여 주었다. 용기의 기계적 성질에이 조직 학적 리모델링의 영향을 확인하려면 BAXS 플랫폼을 사용 하였다 대동맥 강성을 측정합니다.도 9c는 대동맥 링 스트레칭 인장에서 전형적인 응력 - 변형 곡선을 보여줍니다. 강성을 정량화하기 위해, 증분 탄성률은 30 %의 변형시 응력 - 변형 곡선으로부터 계산 하였다. 강성은 곡선의 접선의 기울기이다. BAXS 플랫폼 모터 중 하나 displaceme의 동시 수집에 로드셀을 도입함으로써NT와 포스 데이터가 가능합니다. 변위 힘 곡선은 각각의 대동맥 고리의 변형되지 않은 크기에 따라 응력 - 변형 곡선으로 변환되었다. 스트레스와 긴장은 다음과 같은 수식을 사용하여 계산된다 :
ε가 변형이고, L 1 F는 힘이고, 0은 하중 하에서 조직의 변형되지 않은 영역이며, s는 스트레스, L 0은 변형되지 않은 길이, 변형 된 길이입니다. 대동맥 고리의 구체적인 경우, 변형되지 않은 영역 (A 0) 링 시간 세그먼트의 길이의 두 배의 두께이다.
각 샘플은 허용 제 11 사이클과 12 사이클 동안 50 ㎛ / sec의 변위 속도의 40 %의 최대 변형을 주기적으로 변형 된 티슈의 전처리 및 라데이터 수집을위한 성 하나. / - - HSP27의 O / E 마우스 (62.8 ± 3.0 kPa의) 크게의 apoE에 비해 41 % 증가했다 - 우리의 apoE의 대동맥 부분의 강성이 발견 / - 제어 마우스 모델 (44.4 ± 3.8 kPa의) (그림 9D) .
함께 촬영, 혈관 플라크의 조직학과 함께 기계적 평가는 HSP27의 이상 발현이 증가 된 혈관 강성과 콜라겐 / 평활근 세포의 내용이 특징입니다 것을 보여 주었다. 이러한 결과는 HSP27이 잠재적으로 동맥 경화 병변의 안정성을 증가하기 때문에 플라크 파열의 위험을 줄일 수있는 것이 좋습니다.
그림 9. HSP27의 효과를 통해 표현 용기의 강성. 우리는 HSP27은 조직 학적 COMPO을 수정 한 것으로 나타났다콜라겐 내용 : 내막 평활근 세포 (항-α-SMA) 증가시켜 동맥 경화 병변의 구성비 (B를 : 붉은 얼룩 picrosirius) 강성 (30)에서 계산 된 대동맥 혈관을 스트레칭에서 얻은 C) 전형적인 응력 - 변형 곡선. 긴장의 %. . / - - 마우스 모델 (D) 강성은 곡선의 접선 (빨간색 선)의 기울기 D)을 통해 표현 HSP27의 만성 통제의 apoE의 비교에서 혈관의 강성을 증가시킨다. 스케일 (A)의 바, (B)는 40 μm의 인 세트에 400 μm의 양입니다. L는 = 루멘, I = 내막, 점선은 미디어를 묘사한다. * P-값 <0.05, 일방향 ANOVA. *** p 값 <0.001, 일방향 ANOVA. Cuerrier 등 (26)의 직장에서 적응 그림.
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Discussion
여기에 제시된 BAXS 플랫폼은 단일 세포의 조사에서 전체 조직에, mechanobiology의 연구에서 많은 실험을 용이하게한다. 또한, 플랫폼은 다수의 기계적인 자극 실험 및 다축 인장 시험을 허용하고 매우 유연한 구성이다. 이 플랫폼은 또한 생리 학적 조건에서 세포와 조직의 유지를 가능하게하고 스트레칭 실험시 현미경을 동시에 할 수 있습니다. 설치 클램프의 적절한 세트를 사용할 때 이전 섹션에서 설명 된 두 개의 실험 BAXS 플랫폼의 다양성을 설명한다. 모듈 제작 샘플 장착 시스템, 광 액세스 및 추가 센서 (예를 들어로드 셀)를 추가 할 가능성이 수행 될 실험 밖의 유형의 다양한 가능성을 열어.
위에서 밝힌 프로토콜을 수행해야합니다 많은 중요한 단계를 포함하는dequately 최상의 결과를 생산하기 위해. 세포 스트레칭 프로토콜 내에서 클램프에 PDMS 기판을 장착하여 섬세하고 정확한 조작을 요구한다. PDMS 기판 확실히 연신 중에 기판의 원치 않는 측 방향 움직임을 방지하기 위해 클램프 4에 대하여 중심되어야한다. 이러한 측면 이동은 실험을 연신하는 동안 세포의 추적을 어렵게 만들 수있다. 또한, 기판이 배양기에서 향 세포 시딩 동안 배지 방울의 증착을 모니터하는 것이 중요하다. 인큐베이터의 문이 과정에서 열립니다 빈도에 따라, 증발 속도가 변경 될 수 있습니다. 용기 연신 프로토콜 내에서, 가장 중요한 단계는 테스트 할 시료의 치수의 측정이다. 그들은 조직 강성의 계산에 관여하고, 따라서 결과에 직접적인 영향을 가지고 이러한 치수는 가능한 한 정확해야한다. 같은 사람은 혈관 D를 수행하는 데imension 측정은 샘플 사이의 변동성을 줄이는 데 도움이됩니다.
세포 스트레칭 실험을하는 동안 PDMS 기판에 당겨하는 데 사용되는 클램프의 제조는 여러 개발주기를하고있었습니다. 클램프의 첫 번째 버전은 원통형 부품 (그림 2B)의 하단에 고정 홈을하지 않았다. 이 그루브없이 기판은 시간에 기판의 변형에 큰 변동을 유도, 원통형 부분을 따라 미끄러. 그루브 및 경화 PDMS (도 5F)의 첨가의 유무와, 기판은 더 이상 어긋나 없다. 이 실험 장치는 시간이 지남에 따라 기판에 일정한 변형을 생성합니다. 조직이 적절한로드 셀을 선택, 실험을 스트레칭의 경우도 매우 중요합니다. 여기에 사용되는로드 셀은 여기에 테스트 샘플에 대한 적절한입니다, 저 부하 범위 (최대 150 g)을 가지고 있습니다. MEAS 필요한 매우 민감 로드셀uring 작은 샘플에 힘을 당기는 잡음 (S / N) 비율을 상대적으로 낮은 신호를 소유. S / N 비를 개선하고, 따라서 해상도를 개선하기 위해,로드 셀은 전기적으로 보이스 코일 모터 및 성형 나사와 스페이서를 이용하여 금속 부분으로부터 단리 하였다. 이러한 방법으로 0.03 g의 분해능이 높은 S / N 비를 얻었다. 부드러운 샘플은 하한 범위 로드셀의 사용은 높은 해상도를 유지하기 위해 추천된다.
현재 BAXS 플랫폼의 주요 제한은 경시 HBSS 버퍼의 증발 실험 스트레칭 장기를 수행 할 수있는 능력이다. 수분 증발은 잠재적으로 세포에 영향을 미칠 수있는 용질의 농도를 증가시킨다. BAXS 플랫폼의 현재 구성으로, 기계적 세포 및 조직이 침수되는 버퍼 supplem이어야 같은 일을 통해 세포 또는 조직을 자극하는 것이 실험을하기 어렵다 시간이 지남에 따라 액체로 ented. 현재 설정에서는 증발 속도 HBSS 완충액 25 ㎖의 초기 부피는 약 0.9 ㎖ / 시간이다. 현재 설정은 단기 실험에 이상적입니다. 신뢰할 수있는 세포와 오랜 기간 동안 실험을 스트레칭 조직을 수행하려면 두 가지 추가 사항이 제시되어 버퍼의 양을 유지하기위한 1) 유체 시스템 및 유지 관리하기 위해 시스템 전체를 둘러싸는 상업 또는 가정 내장 인큐베이터 실, 2) 또한 일정한 습도와 온도 및 5 % / 95 % CO 2 / 공기 분위기를 제공합니다. 혈관 조직을 스트레칭하는 옵션에 대해서는, 상기의 설정은 우리가 작은 구경 혈관의 강도를 측정 할 수 있었다. 그것은 그들이 연신 중에 변형되지 않도록하기 위해 적절한 직경의 핀을 사용하는 것이 중요하지만, 혈관 내강에 들어갈 정도로 작다. 계정에이 내용을 복용하지 않으면 조직의 측정 변형 부정확성을 소개 할 수 있습니다.
"ve_content>생체, 조직 포함 된 세포는 공간적으로 시간적으로 변화 기계적 힘과 긴장에 노출,하지만 더 중요한 것은 그들은 종종 다축 있습니다됩니다. 좋은 예는 혈역학 적 힘에 반응하여 혈관 벽의 기계적 동작입니다. 복잡한 다중 축 방향 및 순환 변형 필드 내피 세포와 혈관 평활근 세포를 노출하는 복잡한 기계 미시, 혈관 조직 13,14,16,27 결과의 이방성 특성을 가진 지역의 혈역학 적 힘의 조합 28-30. 기존의 세포 스트레칭 실험은 크게 mechanotransduction의 및 mechanobiology의 기본적인 이해에 기여했지만, 그들은 전통적으로 복잡한 생체 변형 필드 8-10,19,29,31-34를 재현하지 않는 이상적인 단축 또는 동등 축 변형 필드에 의존 . BAXS 플랫폼은 수의 동시 라이브 CEL과 스트레칭 이방성 축 세포L 현미경. 두 개의 직교 방향을 따라 기판의 변형을 제어 할 수있는 능력은 우리가 변형 필드를 완벽하게 제어 할 수 있습니다. 이것은 간단한 일 축성과 동등 이축 스트레인 필드 이외에 복잡한 변형 분야의 생산을 가능하게한다. 또한,이 플랫폼은 우리가 동적으로 같은 스트레칭 실험에서 변형 필드의 방향을 변경할 수 있습니다.
모듈 형 및 사용자 지정 클램핑 시스템을 통합하는 옵션은 하나의 스트레칭 플랫폼을 사용하여 많은 세포 mechanobiology 응용 프로그램과 조직 역학에 대한 가능성을 열어. 예를 들어, 적절한 클램핑 시스템 13,27로,이 플랫폼은 생체 조직의 평면 축과 축 인장 시험을 수행 할 수 있습니다. 이와 같이, 직사각형 또는 정사각형 모양으로 잘라 어떤 조직의 기계적 특성은, 단일 실험 개의 직교 축을 따라 정량화 될 수있다. 또, 조직학을 수행nalyses 기계적 자극 후 조직에 스트레치에 의한 구조 변화를 공개 할 수 있습니다. 비틀림은 근육 조직에 대한 기계적 부하의 매우 중요한 유형이고 35 인대. 이 플랫폼은 비틀림 및 인장 관련된 조합 적 기계적 하중을 생산하는 연신 축 주위의 회전을 유도 할 수있는 클램핑 시스템을 설계 할 수있는 가능성을 제공한다. 그것은 적절한 마운팅 핀 큰 구경의 용기를 평가하는 것도 가능하다. 기계적 변형에 다음과 같은 세포 반응을 연구하는 것은 강렬한 조사도있다. BAXS 플랫폼 동시 이미징을 허용 이외에 동일한 실험 내 방향 및 변형 필드의 복잡도를 변화의 고유 한 기능을 제공한다. 플랫폼은 현미경의 광축과 간섭하지 않는 중요한 현미경의 멀티 모달 폼은 여전히 가능하다. 이것은 기계적 D에 구조적 및 생화학 살아있는 세포 반응과 같은 중요한 기능이다eformation을 측정 할 수있다. 이와 함께, BAXS 플랫폼 디자인은 하나의 세포와 조직 전체 실험에 대한 사용을 용이하게 몇 가지 중요한 기능을 가지고 있습니다. 모듈 형 클램핑 시스템과 최대 네 개의 가능한 로드셀의 첨가를 채용함으로써, BAXS 플랫폼은 다수의 실험에 이용 될 수있다. 이 문서는 실험의 두 가지 예에 대한 자세한 내용을 보여줍니다; 그러나 시스템의 모듈 성과 유연성은 더 하위 세포, 세포 및 조직 전체 길이 규모에서 mechanobiology의 여러 다양한 측면을 조사하기 위해 이용 될 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
DT는 르 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡 - 자연 등 기술 (FQRNT)와 MITACS 높이기 전략 원정대에서 박사 재학에 의해 지원되었다. CMC는 르 퐁 드 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 (FRSQ)와 어니스트 오타와 심장 연구소의 대학에서 마가렛 포드 심장 부여 연구 활동에서 박사 재학에 의해 지원되었다. EOB는 운영 보조금 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에서 MOP80204과 마음에서 T6335과 온타리오의 뇌졸중 재단에 의해 지원되었다. CIHR과 메드 트로닉은 집단적으로 피어 리뷰 연구 의자 (URC # 57093)와 EOB를 제공합니다. AEP는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 NSERC 발견 가속기 보충에 의해 투자하고 감사 한 캐나다 연구 의자 (CRC) 프로그램 및 온타리오 주에서 조기 연구원 상의 지원을 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
References
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