Summary
Apresentamos neste artigo uma novela que se estende plataforma que pode ser usada para investigar as respostas das células individuais a complexa deformação mecânica biaxial anisotrópica e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos.
Abstract
As ferramentas que permitem a aplicação de forças mecânicas de células e tecidos, ou que podem quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos têm contribuído significativamente para o entendimento de mechanobiology básico. Estas técnicas têm sido amplamente utilizados para demonstrar como o aparecimento e progressão de várias doenças são fortemente influenciados por estímulos mecânicos. Este artigo apresenta uma plataforma multi-funcional biaxial alongamento (BAXS) que pode estimular mecanicamente células individuais ou quantificar a rigidez mecânica dos tecidos. A plataforma BAXS consiste de quatro motores de bobina de voz, que pode ser controlada de forma independente. As células individuais podem ser cultivadas num substrato flexível que pode ser ligada aos motores que permitem uma para expor as células a campos de deformação complexos, dinâmicos, e variando espacialmente. Por outro lado, através da incorporação de uma célula de carga de força, pode-se também quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos primários, eles são expostos a ciclos de deformação.Em ambos os casos, um conjunto apropriado de braçadeiras devem ser concebidas e montadas para os motores de plataforma BAXS de modo a segurar firmemente o substrato flexível ou o tecido de interesse. A plataforma BAXS pode ser montado em um microscópio invertido para realizar luz transmitida em simultâneo e / ou imagem de fluorescência para verificar a resposta estrutural ou bioquímica da amostra durante as experiências de alongamento. Este artigo fornece detalhes experimentais do projeto e utilização da plataforma BAXS e apresenta os resultados de estudos de tecidos inteiros única célula e. A plataforma BAXS foi usado para medir a deformação de núcleos nas células do rato mioblastos individuais em resposta ao substrato tensão e para medir a rigidez de isolados de rato aortas. A plataforma BAXS é uma ferramenta versátil, que pode ser combinado com vários microscopia óptica, a fim de proporcionar novos conhecimentos mechanobiological nos níveis de tecidos sub-celular, celular e inteiro.
Introduction
O microambiente mecânica desempenha um importante papel em muitas funções celulares tais como a proliferação, migração e diferenciação, que têm um impacto profundo no desenvolvimento e homeostasia dos tecidos e também em doenças 1-6. Ao longo dos anos, uma série de ferramentas experimentais têm sido utilizados para estimular mecanicamente as células ou tecidos e medir as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos com o objetivo de aumentar a compreensão das mechanobiology básico e estudando o início e progressão de doenças 6-17. No entanto, deve-se muitas vezes dependem de vários dispositivos experimentais diferentes, a fim de alcançar os objetivos de um estudo particular. Este artigo apresenta uma plataforma única, multi-funcional, biaxial alongamento (BAXS) que permite para os estudos que investigam o papel que as propriedades mecânicas e forças mecânicas jogar em biologia na sub-celular para escalas de comprimento tecido inteiras. A plataforma BAXS não só permite a quantification das propriedades mecânicas dos tecidos isolados, mas também facilita a capacidade de aplicar campos de tensão simples, complexos, e dinâmicas de células vivas, de modo a compreender as suas respostas ao alongamento que ocorre in vivo. A plataforma BAXS também mantém a capacidade de realizar microscopia de células ao vivo durante os testes mecânicos e perturbações em células e tecidos.
A plataforma BAXS é um aparelho integrado personalizado que pode ser utilizado para investigar o efeito de deformação do substrato, ao nível celular e realizar ensaios de tracção em tecidos biológicos (Figura 1A). Um aquecedor de alumínio foi fabricado para acomodar um padrão prato de Petri de 10 cm e manter as soluções fisiológicas, a 37 ° C, utilizando um controlador de temperatura e aquecedores de Kapton (Figura 1B). Esta plataforma BAXS podem ser integrados em um contraste de fase invertida e / ou microscópio de fluorescência e permite a gravação simultânea (Figura 1C).Em breve, a plataforma BAXS consiste de quatro motores lineares de bobina de voz, dos quais as partes móveis são montadas em lâminas de rolamento de esferas de movimento linear em miniatura orientados ao longo de dois eixos perpendiculares (Figura 1D). Uma fase de posicionamento linear é montado em cada um dos quatro motores para permitir o movimento vertical do sistema de aperto que vai ser usado (Figura 1E). A posição de cada um dos motores é controlada por um codificador óptico com uma resolução de 500 nm (Figura 1F). Todos os quatro motores são controlados de forma independente com um controlador de movimento empregando retorno do codificador óptico para executar comandos de movimento (Figura 1G). Uma interface LabVIEW fornece controle total sobre a magnitude do deslocamento, velocidade e aceleração de cada motor, a fim de gerar deformação completamente customizável, estática e dinâmica, das células ou amostras de tecido.
A técnica utilizada para induzir uma deformação em células é conseguido por simplesmente allowing de células para aderir firmemente a um substrato flexível e transparente e, em seguida, este alongamento do substrato utilizando quatro motores da plataforma BAXS. A plataforma BAXS permite a montagem de qualquer conjunto de design personalizado de grampos para prender o substrato sobre os motores de bobina de voz. Para esta finalidade, desenvolvemos uma série de grampos para que um substrato transparente e flexível, feita de polidimetilsiloxano (PDMS), podem ser ligados (Figuras 2A-C e Figura 3). Como os grampos vai ser exposto a soluções fisiológicas, todas as partes foram maquinados a partir de aço inoxidável para permitir a esterilização. Estes grampos foram cuidadosamente concebidos para levar o substrato tão perto quanto possível em relação ao objectivo do microscópio para melhorar a qualidade de imagem ao mesmo tempo minimizando a tensão sobre o substrato durante o alongamento (Figura 2D).
A mesma plataforma BAXS também pode ser utilizado para quantificar a rigidez de pequenas amostras de tecido, utilizando um conjunto apropriado de braçadeiras com adaptaçãoted suporte para as amostras de tecido e de uma célula de carga para monitorar forças. Várias abordagens podem ser tomadas para a montagem de um tecido para os motores de plataforma BAXS; neste caso, os aços inoxidáveis micro alfinetes minucias insectos pinos pode ligar através da abertura de tecidos vasculares, a fim de realizar ensaios de tracção (Figuras 4A-B). Em alternativa, no caso dos tecidos de espessura sem uma abertura natural, as bordas do tecido pode ser mantido em posição com grampos ligados aos motores de bobina de voz, ou colados às pequenas lâminas de vidro com cola biológica e ligados aos motores com os grampos. A fim de realizar os testes de tracção é necessária uma célula de carga e em miniatura podem ser facilmente incorporados em motores de plataforma BAXS e usadas para medir a força que actua sobre o tecido durante um ciclo de alongamento (Figura 4C). À medida que a plataforma BAXS é composta de quatro motores, a introdução de uma segunda célula de carga permite a realização de testes de tracção ao longo de duas direcções ortogonais. Esta capacidade permite quantify a rigidez mecânica de um único tecido ao longo de duas direcções perpendiculares, durante o mesmo experimento.
Importante, em todas as configurações, as células ou amostras de tecido de interesse são sempre mantidas em um banho de temperatura controlada, que é acessível ao utilizador. Esta capacidade permite a introdução de agentes farmacológicos, durante o alongamento da amostra, a fim de analisar a resposta temporal da amostra. Além disso, como o eixo óptico do microscópio invertido permanece sem obstruções, todas as formas de microscopia ainda estão disponíveis para o utilizador. Finalmente, como todos os quatro motores da plataforma BAXS são independentes, é possível aplicar campos estirpe altamente configuráveis para a amostra de interesse. Em células in vivo e os tecidos são expostos a complexo e anisotrópica de alongamento que pode ser mais apropriadamente imitou nesta plataforma, em oposição a tradicional uniaxial 7,13,15,18,19 plataforma alongamento. Além disso, as características físicasdo campo de tensão pode ser alterado em tempo real durante um experimento. Essas habilidades permitem que o usuário examinar a resposta ao nível do tecido celular e um grande número de alta complexidade, anisotrópica, temporalmente, e os campos de deformação variando espacialmente. Este artigo descreve as vantagens e limitações da plataforma BAXS, bem como a sua concepção, princípios de funcionamento e os detalhes experimentais para uma única célula e tecido experiências integrais.
Figura 1. Visão geral da plataforma BAXS. A) Vista de cima da plataforma BAXS mostrando os quatro motores de bobina de voz. B) imagem detalhada do aquecedor de placa de Petri usada para manter as células e os tecidos a 37 ° C. C) A plataforma pode ser montada sobre um microscópio invertido para apresentar ao vivo- imagens de células durante as experiências de alongamento.D) imagem detalhada do motor de bobina de voz; E) foto da parte móvel da plataforma. detalhada da fase de posicionamento linear permitindo o deslocamento vertical dos sistemas de fixação. F) imagem detalhada do codificador óptico que fornece posição em tempo real do motor para o controlador de movimento G) Retrato detalhado. do controlador de movimento que mostra as quatro entradas e saídas do codificador óptico de energia para os quatro motores de bobina de voz.
Figura 2. Sistema de fixação para experimentos com células de alongamento. AB) de imagens que mostram os detalhes dos grampos utilizados para fixar o substrato de PDMS para os motores de bobina de voz para o alongamento. C) O substrato é enrolado em volta da parte cilíndrica do grampo com a sua ancoragem features sentado na ranhura na parte superior. Em seguida, o substrato é D) Ilustração da plataforma BAXS com os grampos segurando o substrato em lugar protegido usando os parafusos que empurram o substrato / ancoragem recursos para o topo groove.. A inserção mostra uma visão detalhada do substrato com células ligadas a ele sentado logo acima uma lamínula ea objetiva do microscópio.
Figura 3. Lista de materiais da membrana e o seu sistema de aperto. Desenhos mostram as dimensões das partes principais integrado para a plataforma biaxial para efectuar experiências com células de alongamento.
Figura 4. Examplo de um sistema de fixação para a avaliação da rigidez dos vasos de pequeno calibre. AB) Imagens detalhadas do sistema de fixação usado para induzir deformação de 1 mm de diâmetro rato aorta. Pinos de aço inoxidável, foram cuidadosamente moldadas em triângulos abertos para permitir que o navio para deslizar em ambos os pinos C) Ilustração da plataforma BAXS com os grampos de segurar o recipiente e uma célula de carga ligado entre o motor e fixo o grampo esquerdo.. A inserção mostra uma vista de cima e pormenorizada do recipiente montado sobre os pinos.
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Protocol
1. Deformação mecânica de células individuais
- Fabricação de um substrato de PDMS com partículas fluorescentes incorporadas
Antes do fabrico do substrato, as microesferas fluorescentes em solução aquosa, são suspensas de novo em isopropanol para melhorar a mistura do grânulo em PDMS, devido à sua natureza hidrofóbica.- Pipetar 500 l de microesferas fluorescentes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuga-se a 16.200 xg durante 10 min.
- Descartar o sobrenadante e adicionar 500 mL de isopropanol seguido de 5 min de agitação em vórtice. Coloque o frasco de lado durante a noite, no escuro, a fim de permitir que as partículas grandes agregados para sedimentar.
- Na manhã seguinte, retire cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. Esta solução de esferas pode ser utilizado para fabricar mais do que 5 substratos. Nota: A solução talão continuará a sedimentar para os próximos 3 dias. Tenha cuidado para evitar ressuspensão do pellet.
- Despeje 0,5 g do agente de cura desdecom o kit de PDMS em um frasco de 1,5 ml de microcentrífuga com uma balança científica. Por etapas sucessivas, adicionar um total de 90 ul de contas (em seis adições de 15 ul), vortex durante 1 minuto entre cada adição. Ponha de lado.
- Pesar 10 g de PDMS e mistura-se durante pelo menos 12 minutos, com a 0,5 g do agente de cura suplementado com esferas fluorescentes.
- Fabricar um SU-8 2050 molde em forma de cruz, utilizando técnicas de fotolitografia padrão seguindo as instruções do fabricante. O molde utilizado tem uma altura de 320 microns e uma área de 13,4 cm 2 (Figura 3). O molde pode conter 428 mL ou 440 mg de PDMS.
- Despeje a 400 mg de PDMS com grânulos no molde em forma de cruz com uma pipeta de transferência e de cura durante 2 horas a 80 ° C. Após a cura, descolar o substrato a partir do molde (Figura 5A). O substrato pode ser mantido numa caixa de Petri à temperatura ambiente durante 2 semanas sem exibir alterações significativas nas suas propriedades mecânicas. Despeje gotículas de PDMS (agente de cura: PDMS com uma proporção de 1:20) em uma placa de Petri com um tamanho final de aproximadamente 4 mm de diâmetro e curá-las de cabeça para baixo durante 2 horas a 80 ° C (Figura 5B). Estas características de ancoragem podem ser mantidos numa placa de Petri por semana. NOTA: Mantenha o prato de cabeça para baixo para evitar que as gotas de achatamento durante o processo de cura.
- Deleite Ar plasma (30 segundos a 30 W) o substrato e oito recursos de ancoragem. Ligar os recursos em cada extremidade do substrato a uma distância de 4 mm a partir do travessão em forma quadrada presentes sobre o substrato (Figura 5C).
- Montagem da membrana sobre os grampos
- Enrole cada extremidade do substrato ao redor da parte cilíndrica com ranhuras dos grampos e fixá-lo no lugar com os dois parafusos da parte superior (Figura 2B e Figuras 5D-E).
- Aperte os quatro grampos no suporte do grampo e despeje PDMS (razão de 1:20) usando um descartável transferência pipeta na interface entre o substrato e a parte cilíndrica com ranhuras das braçadeiras. Espalhe as PDMS não curado ao redor da parte cilíndrica com ranhuras utilizando uma chave sextavada de 1,5 mm.
- Despeje PDMS (01:20) nas ranhuras até estar completamente preenchido por acção capilar e curar o conjunto a 80 ° C durante 2 horas (Figura 5F).
- Semeando células na membrana
- Deleite Ar plasma (30 segundos a 30 W) toda a assembléia para esterilizar e funcionalizar o substrato para permitir revestimento de colágeno.
- Funcionalizar a superfície do substrato em que as células irão ser semeado com 1 ml de 0,02 M de ácido acético suplementado com 16 ug / ml de colagénio de rato-cauda, à temperatura ambiente durante 1 hora. A densidade de colagénio final desejado é de 5 mg / cm 2.
- Lavar 3x com tampão de fosfato de substrato e deixar secar à temperatura ambiente durante, pelo menos, durante 10 min.
- Adicionar 40 ul de meio de cultura suplementado com 10% seru fetal bovinom e 1% de penicilina-estreptomicina, contendo 2000 células na porção central do substrato para cobrir uma área de 1 cm 2 (densidade celular: 20 células / mm 2). A densidade celular pode ser alterado de acordo com requisitos experimentais.
- Colocar todo o conjunto numa incubadora de cultura de células padrão com o substrato virado para cima com a gota de meio de cultura contendo as células nele. NOTA: O conjunto deve ser mantido com o substrato virado para cima por pelo menos 3 horas para permitir que as células para anexá-lo com firmeza. Para evitar a evaporação, a 30 mL de meio de cultura quente é adicionada à gota sobre o substrato a cada 45 min durante 3 horas.
- Depois de 3 horas, virar todo o conjunto em uma placa de Petri cheia de meio de cultura fresco para submergir o substrato e incubar durante a noite para permitir que as células a proliferar.
- No dia seguinte, preparar uma solução salina tamponada com HEPES (HBSS, 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO4, 1,8 mM de CaCl2, e 11,1 mM de dextrose). Ajustar o pH para 7,4. NOTA: A solução de HBSS tem que ser preparada diariamente e mantida a 37 ° C durante as experiências. Esta solução fisiológica é usada para manter as células na fase de microscópio imitando o ambiente de tecido / sangue normal.
- Monte o set-up em invertido de contraste de fase ou microscópio fluorescente Monte o conjunto da braçadeira-substrato na plataforma BAXS e motores. Encher o prato de Petri no interior do aquecedor de placa de Petri com um tampão de HEPES (Figura 2D).
2. Rigidez Arqueação das Embarcações de pequeno calibre
- Preparação
- Solução fisiológica de Krebs: Prepara-se uma solução de 118,1 mM de NaCl, 11,1 mM de D-glucose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, e 2,5 mM de CaCl 2. Ajustar o pH para 7,4 e oxigenar a solução com carbogénio gás médico (95% de O2 / 5% CO 2) durante 30 min. NOTA: A solução que Krebsno tem que ser preparada diariamente e mantida a 37 ° C durante as experiências. Esta solução fisiológica é usada para manter os tecidos vivos ao imitar o ambiente de tecido / sangue normal.
- Reúna a instrumentação para a dissecção e avaliação mecânica dos vasos de aorta: tesouras cirúrgicas, pinças dobrados, micro-tesouras, cirúrgica microscópio de dissecação, 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno e 10 ml pipetas sorológicas. O procedimento cirúrgico e experiência não necessita de quaisquer condições estéreis. Montar as pinças da plataforma BAXS juntamente com a célula de carga de antemão.
- Isolamento de Tecidos e Dissection
Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais de laboratório tem que ser aprovado pelo Comitê Animal Care e Use dos usuários "instituição, que está em conformidade com o Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos usuários 'país.- Realizar rato eutanásia com a inalação de 99% de CO 2 (7 psi)numa câmara de plexiglass (Figura 6A).
- Abdômen aberto rato e cortar a aorta torácica para sangrar o mouse.
- Remover o diafragma, a caixa torácica e os lobos pulmonares (Figura 6B). NOTA: Para minimizar o risco de danificar o tecido, manter o coração ligado à aorta e evite tocar o navio diretamente, mas manipulá-lo usando o coração.
- Remover o coração, a raiz da aorta e da aorta torácica, cortando suavemente entre o navio e da coluna vertebral. NOTA: Não induzir qualquer alongamento no navio durante a excisão para manter a estrutura interna do tecido intacto (Figura 6C).
- Mergulhar imediatamente e manter o coração ea aorta em solução de Krebs.
- Cortar e lavar cuidadosamente a aorta em solução de Krebs para remover quaisquer coágulos sanguíneos. Remover o tecido conjuntivo usando micro-tesouras, pinças e cirúrgico microscópio de dissecação (Figura 6D-E). NOTA: Mantenha todo o comprimento do vaso e usar o aorraiz tique para determinar a orientação da embarcação.
- Vessel Dimension Determinação e montagem
Para determinar a rigidez do recipiente, as dimensões do reservatório descarregadas são necessários e podem ser determinadas com um microscópio calibrado.- Cortar um anel aórtico de cerca de 2 mm de comprimento e medir com precisão o seu comprimento, utilizando um microscópio calibrado configuração (Figuras 6F-L). Coloque este segmento de lado em solução de Krebs.
- Corte outro anel aórtico tão pequeno quanto possível entre cada um dos segmentos de 2 milímetros (Figura 6F). Coloque este pequeno segmento sobre uma lâmina de vidro de microscópio com a luz para cima e medir a espessura da parede usando uma configuração de microscópio calibrado (Figura 6H).
- Encher a placa de Petri sobre a plataforma BAXS com solução de Krebs e inserir o segmento de aorta anel 2 mm nas pinos de tracção (inset na Figura 4C).
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Fabricação de substrato Figura 5. PDMS e montagem. A) Após a cura, o substrato é cuidadosamente tirou o SU-8 2050 molde e posta de lado em uma placa de Petri. B) Ancoragem recursos feitos de PDMS e ajudar a proteger o substrato sobre o E) imagem grampos C Substrato.) com características de fixação prontos para a montagem. D) O substrato é montado nos quatro grampos, que são depois montadas sobre o suporte do grampo (ver inserção). detalhada do substrato montadas nos quatro grampos. F ) Processo de verter PDMS na ranhura por baixo do substrato. A seta indica o PDMS enchendo lentamente o sulco por capilaridade.
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Figura 6. Preparação e isolamento da aorta torácica. A) Preparação de instrumentos cirúrgicos e o ratinho sacrificado. B) Através de uma incisão abdominal longitudinal, a caixa torácica e lobs pulmonares são removidos. C) A aorta é cuidadosamente removido utilizando o coração para manipular o tecido. D) O coração e aorta são colocados em solução fisiológica de Krebs. A aorta é limpa por remoção de todos os tecidos conjuntivos. E) imagem detalhada, mostrando o coração e aorta. F) do segmento da aorta utilizado para a avaliação da rigidez juntamente com pequenos segmentos utilizados para a medição da espessura. GH) O comprimento exacto (L) e a espessura (H) de cada um dos segmentos de navios são avaliados utilizando um microscópio invertido e um programa de análise.
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Representative Results
Alongamento celular
A plataforma BAXS foi utilizado para investigar a resposta mecânica do núcleo do rato em células individuais de mioblastos (C2C12) exposto a uma deformação do substrato de 25%. Células de mioblastos são encontrados no tecido muscular e estão constantemente expostos a estiramento mecânico e compressão in vivo. As propriedades de forma e mecânicas do núcleo celular têm demonstrado desempenhar um papel importante na regulação da expressão de genes e a actividade de transcrição 20,21 e também de uma variedade de defeitos do desenvolvimento e doenças tais como a síndrome de Hutchinson-Gilford progeria (HGPS), Emery -Dreifuss Distrofia muscular (EDMD), miocardiopatia dilatada, envelhecimento precoce e câncer de 22-25. Portanto, compreender como as forças do microambiente mecânica externa afecta a estrutura e a função do núcleo é de extremo interesse. A plataforma BAXS foi utilizado para investigar a transmissão de força a partir da mi croenvironment ao núcleo por estiramento do substrato paralela ao seu eixo maior ou menor. Figuras 7A-F ilustra as capacidades da plataforma para induzir uma deformação no substrato ao longo de duas direcções ortogonais. Além disso, a plataforma BAXS pode induzir campos de deformação complexas no substrato, além de uniaxial padrão de campos de deformação equi-biaxial. Figuras 7G-H ilustra a flexibilidade proporcionada pelo controle independente do campo de tensão ao longo de duas direções ortogonais, permitindo-nos, quer produzir um padrão (compressão) ou puro (sem compressão) campo de tensão uniaxial. A plataforma BAXS é capaz de produzir um campo de tensão uniaxial puro puxando ligeiramente para o substrato na direcção perpendicular à direcção principal de alongamento (Figura 7G) para compensar a compressão presente no substrato, ao longo deste sentido durante um estiramento uniaxial padrão (Figura 7H ).
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Figura 7. Relações deslocamento-deformação de realização de padrão e puro estiramento uniaxial. AB) miçangas fluorescentes são selecionadas manualmente no primeiro frame do vídeo e acompanhados de um quadro para o outro até que seja atingido o máximo trecho ao longo da horizontal (C) e vertical (D) as direções. Um script MATLAB calcula automaticamente os componentes do tensor de tensão verde para cada quadro e produz uma curva de calibração da tensão em relação ao motor deslocamentos 27. EF) As linhas azul e vermelha corresponde à componente do tensor de tensão verde ao longo da horizontal e direções vertical, respectivamente. G) Esticando o mesmo substrato por quatro milímetros ao longo do eixo x e um pouco de alongamento ao longo doeixo y por 1,5 mm (destacados em vermelho) produz um campo uniaxial puro sem deformação de compressão no substrato. H) O alongamento do substrato ao longo do eixo-x por 3,5 milímetros produz uma deformação de 25% e uma deformação de compressão de 7%, quando as extremidades do substrato, ao longo do eixo vertical são fixos (destacado em vermelho).
Com a capacidade de realizar microscopia de imagem de células vivas durante o alongamento, os núcleos foram marcadas com um corante fluorescente de células vivas, que se liga ao DNA (Hoescht 33342). Em geral, as células C2C12 possuem núcleos elípticos com um eixo maior e menor. Em primeiro lugar, identificaram-se as células em que os eixos maiores e menores nucleares foram orientadas paralelamente à direcção de alongamento horizontal. Neste ponto, as células foram esticadas em 25% ao longo de cada eixo ortogonal de alongamento enquanto a obtenção de imagens do núcleo não deformada e deformada entre cada alongamento ciclos (Figuras 8A-I). Desta forma pode-se avaliar a capacidade de deformação do núcleoao longo de seu eixo maior e menor de uma deformação substrato precisamente controlado. Ovuscule, um plug-in ImageJ, foi utilizada para determinar o comprimento dos eixos maior e menor nucleares. Estes comprimentos foram registrados durante o estado não deformado e quando o núcleo foi esticado sequencialmente ao longo de seus eixos maior e menor (Figuras 8G-I). Para calcular a deformação do núcleo ao longo dos seus eixos maiores e menores, a variação relativa de comprimento ao longo de cada eixo nos estados estiradas e não deformados foi calculado:
onde ε é a deformação, G 1 é o comprimento deformado e L 0 é o comprimento não deformada.
A deformabilidade de o núcleo em C2C12 apresenta uma anisotropia mecânica, uma vez que apresenta uma deformabilidade significativamente mais elevado ao longo do seu eixo menor (6,3 ± 1,1%) em comparação com o seu eixo maior (3,077; 0,6%) (Figura 8J). Além disso, também examinámos o papel da actina e de microtúbulos do citoesqueleto na regulação deformabilidade nuclear. Isto foi conseguido por despolimerização dos filamentos de actina ou microtúbulos selectivamente utilizando citocalasina-D e nocodazol, respectivamente. Despolimerizando os filamentos de actina ou os microtúbulos foi encontrada para induzir uma perda de deformabilidade anisotrópica do núcleo (Figura 8J). Estes resultados apoiam a conclusão de que os componentes do citoesqueleto transmitem forças para o núcleo a partir do substrato e também são essenciais para preservar o comportamento mecânico natural do núcleo durante a deformação 25.
Figura 8. Protocolo e deformabilidade nuclear Alongamento. AC) Ilustração esquemática do stre protocolo tching de uma única célula com seu núcleo orientado horizontalmente. Imagens de contraste de fase (DF) e imagens epi-fluorescente (GI) de uma célula corada com corante fluorescente específico do DNA. Esta sequência de imagens ilustra uma experiência típica de células de alongamento, onde a mesma célula está exposta a campos de deformação ortogonais. As barras de escala são de 25 mM. J) C2C12 mostra deformabilidade nuclear anisotrópica com o eixo menor de deformação significativamente mais do que o eixo principal. Em células privadas de microtúbulos (cyt-d e nocodazol, respectivamente)-actina ou, este anisotropia desaparece. Em todas as condições, as deformações do núcleo são significativamente diferentes de zero sob uma deformação do substrato de 25%. ** P <0,01, teste t pareado. † † p <0,01, † † † p <0,001, teste t de uma amostra.
Avaliação Rigidez navio
t "> Recentemente, nosso grupo investigou o efeito da crônica sobre-expressão de Choque Térmico Protein-27 (HSP27 o / e) sobre a formação de placas da aorta em um modelo de camundongo propenso a aterosclerose (apoE - / -). Nós 26 mostraram que a HSP27 actua como uma proteína ateroprotetora que reduz lípidos placa e abundância de macrófagos e aumenta as células de músculo liso da íntima e teor de colagénio (Figuras 9A-B). Para determinar o impacto desta remodelação histológica em propriedades mecânicas do vaso, a plataforma BAXS foi usado para medir a rigidez aórtica.A Figura 9C mostra uma curva de tensão-deformação típica do alongamento à ruptura de um anel aórtico. Para quantificar a rigidez, o módulo incremental foi calculado a partir das curvas de tensão-deformação a uma deformação de 30%. A rigidez é o declive da tangente à curva. Através da introdução de uma célula de carga para um dos motores da plataforma BAXS, a aquisição simultânea de displacement e dados de força é possível. As curvas de deslocamento de força foram convertidos em curvas de tensão-deformação com base nas dimensões não deformadas de cada anel aórtico. O stress ea tensão são calculados utilizando as seguintes fórmulas:
onde ε é a deformação, G 1 é o comprimento deformado, L 0 é o comprimento não deformada, s é a tensão, F é a força e A 0 representa a área não deformada do tecido sob o carregamento. No caso específico de um anel da aorta, a área não deformada (A 0) é o dobro da espessura das vezes o comprimento do anel de segmento.
Cada amostra foi deformada ciclicamente com uma deformação máxima de 40% a taxa de deslocamento de 50 mm / seg durante 12 ciclos, com os primeiros 11 ciclos de pré-condicionamento de permitindo que o tecido e o lauma rua para aquisição de dados. Descobrimos que a rigidez dos segmentos de aorta de apoE - / - HSP27 o / e ratos (62,8 ± 3,0 kPa) foram significativamente aumentada em 41% em comparação com o apoE - / - modelo do rato controle (44,4 ± 3,8 kPa) (Figura 9D) .
Tomados em conjunto, a avaliação mecânica combinada com o navio e histologia placa demonstrou que a sobre-expressão de HSP27 é caracterizada por um aumento da rigidez do recipiente e colagénio / conteúdo da célula de músculo liso. Estes resultados sugerem que a HSP27 pode potencialmente aumentar a estabilidade das lesões ateroscleróticas e, por conseguinte, diminuir o risco de ruptura da placa.
Figura 9. Efeito de HSP27 a sobre-expressão em rigidez navio. Mostrámos que HSP27 modificado o componente histológicação de lesões ateroscleróticas, aumentando as células musculares lisas da íntima (a: anti-α-SMA) e conteúdo de colágeno (B: picrossírius mancha vermelha) C) curva tensão-deformação típica obtida a partir de um navio que se estende da aorta, onde a rigidez é calculado em 30. % da tensão. . A rigidez é o declive da tangente (linha vermelha) para a curva D) Chronic sobre-expressão de HSP27 aumenta a rigidez vasos em comparação de controlo apoE - / - murganhos modelo (D). As barras de escala em (A) e (B) estão ambos 40 mM e 400 mM em inserções. L = luz, I = íntima, linhas pontilhadas delineia a mídia. * P <0,05, ANOVA one-way. *** P <0,001, ANOVA one-way. Figura adaptada da obra de Cuerrier et al 26.
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Discussion
A plataforma BAXS aqui apresentado facilita numerosas experiências no estudo de mechanobiology, a partir de investigações de células individuais de tecidos completos. Além disso, a plataforma é altamente flexível e configurável, permitindo a numerosas experiências de estimulação mecânica e os ensaios de tracção de multi-axial. A plataforma também permite a manutenção de células e tecidos em condições fisiológicas e permite a microscopia simultânea durante as experiências de alongamento. Os dois experimentos descritos nas seções anteriores demonstram a versatilidade da plataforma BAXS ao utilizar um conjunto apropriado de grampos de montagem. Um sistema modular e personalizável amostra de montagem, acesso óptico ea possibilidade de adicionar sensores adicionais (por exemplo, uma célula de carga), abre inúmeras possibilidades para outros tipos de experimentos a serem realizados.
O protocolo apresentado acima contém muitos passos críticos que devem ser executadas umadequately, a fim de produzir os melhores resultados. Dentro do protocolo de célula que se estende, a montagem do substrato PDMS em que os grampos exige manipulação delicada e precisa. O substrato PDMS devem ser bem centrada em relação aos quatro grampos para evitar movimentos laterais indesejadas do substrato durante o estiramento. Tais movimentos laterais pode fazer o rastreamento das células difícil durante o alongamento experimentos. Além disso, é essencial para controlar a evaporação da gota de meio de cultura durante a sementeira das células, quando o substrato está virada para cima na incubadora. Dependendo da forma como a porta da incubadora é aberta durante o processo, a taxa de evaporação pode mudar. Dentro do vaso de protocolo de alongamento, o passo mais importante é a medição das dimensões da amostra a ser testada. Essas dimensões devem ser tão preciso quanto possível, eles estão envolvidos no cálculo da rigidez dos tecidos e, portanto, têm um impacto direto sobre os resultados. Tendo a mesma pessoa realizar navio dmedições imension ajudará a reduzir a variabilidade entre as amostras.
A fabricação dos grampos utilizados para puxar o substrato PDMS durante as experiências de alongamento celulares envolvidos vários ciclos de desenvolvimento. A primeira versão das pinças não tem uma ranhura de fixação localizado na parte inferior das partes cilíndricas (Figura 2B). Sem esse ritmo, o substrato escorregou ao longo da parte cilíndrica, induzindo uma variabilidade significativa na deformação do substrato ao longo do tempo. Com a presença do sulco e a adição de PDMS curados (Figura 5F), o substrato não desliza. Esta configuração experimental produz uma deformação constante no substrato ao longo do tempo. Para o tecido estica experiências, a escolha da célula de carga adequada também é muito importante. A célula de carga usado aqui tem uma gama baixa de carga (até 150 g), o qual é adequado para as amostras testadas aqui. A célula de carga muito sensível necessário para mediçãourante puxando forças em pequenas amostras possuía um sinal relativamente baixo ao ruído (s / n) ratio. Para melhorar a relação s / n e, portanto, melhorar a resolução, a célula de carga foi eletricamente isolados do motor de bobina de voz e todas as peças de metal com parafusos de plástico e espaçadores. Neste modo um elevado rácio de s / n com uma resolução de 0,03 g foi obtida. Para amostras mais suaves, a utilização de uma célula de carga inferior da gama é recomendado, a fim de manter uma elevada resolução.
Actualmente, a principal limitação da plataforma BAXS é a capacidade de realizar a longo prazo que se estende experiências, devido à evaporação do tampão HBSS ao longo do tempo. A evaporação da água aumenta a concentração de soluto que pode potencialmente ter um efeito sobre as células. Com a configuração actual da plataforma BAXS, é difícil ter uma experiência que estimulam mecanicamente as células ou tecidos ao longo do dia como o tampão no qual as células e tecidos são submersas tem de ser Contrib tura orientada com o líquido ao longo do tempo. Na configuração de corrente, a taxa de evaporação é de cerca de 0,9 ml / hr a partir de um volume inicial de 25 ml de solução tampão de HBSS. A configuração atual é ideal para experimentos de curta duração. Para realizar as células e tecidos que se estende experiências durante longos períodos de tempo confiáveis, duas adições são sugeridos: 1) Um sistema de fluidos para manter um volume de tampão, e 2) a adição de uma câmara incubadora construído comercial ou doméstico encerrando todo o sistema, a fim de manter humidade constante e temperatura e proporcionar uma atmosfera de CO 2 / ar de 5% / 95%. Em relação à opção de esticar os tecidos vasculares, a configuração descrita acima nos permitiu medir a rigidez de vasos de pequeno calibre. É importante o uso de pinos com um diâmetro adequado para se certificar de que eles não vão deformar durante o alongamento, mas são pequenos o suficiente para caber no lúmen do vaso. Não tomar este detalhe em consideração poderia introduzir imprecisão na deformação medida do tecido.
ve_content ">In vivo, as células embebidas em tecido são expostos a forças mecânicas e tensões que variam tanto espacial e temporalmente, mas mais importante é que eles são muitas vezes multi-axial. Um bom exemplo é o comportamento mecânico das paredes da vasculatura em resposta a forças hemodinâmicas. A combinação de forças hemodinâmicas locais 28-30 com as propriedades anisotrópicas de tecidos vasculares 13,14,16,27 resultado num microambiente mecânica complexa, o que expõe as células endoteliais e do músculo liso vascular para campos de multi-axiais e deformação cíclica complexa. Embora experimentos de alongamento de célula existente têm contribuído grandemente para o entendimento básico de mechanotransduction e mechanobiology, eles têm se apoiado tradicionalmente em campos de deformação idealizados uniaxiais ou equi-biaxial que não se reproduzem complexos in vivo campos de deformação 8-10,19,29,31-34 . A plataforma permite BAXS célula biaxial anisotrópica alongamento com simultânea live-celmicroscopia l. A capacidade de controlar a deformação do substrato ao longo de duas direções ortogonais nos permite ter controle total sobre o campo de tensão. Isto permite a produção de campos de deformação complexos, além de simples áreas de tensão uniaxial e equi-biaxial. Além disso, a plataforma permite alterar dinamicamente o sentido do campo estirpe dentro da mesma experiência que se estende.
A opção de integrar um sistema de fixação modular e personalizado abre a possibilidade para muitas aplicações em mechanobiology celular e mecânica de tecido usando uma única plataforma de alongamento. Por exemplo, com sistemas de fixação adequados 13,27, esta plataforma pode realizar o teste de tracção uniaxial e biaxial planar de tecidos biológicos. Deste modo, as propriedades mecânicas de qualquer tecido, o corte de uma forma quadrada ou rectangular, pode ser quantificada ao longo de dois eixos ortogonais de uma única experiência. Além disso, realizando uma histológicanalyses após estimulação mecânica pode revelar mudanças estruturais induzida por estiramento nos tecidos. Torção é também um tipo muito importante de carga mecânica nos tecidos muscular e ligamentos 35. Esta plataforma oferece o potencial para projetar um sistema de fixação que poderia induzir uma rotação em torno do eixo de alongamento para produzir uma carga mecânica combinatória envolvendo torção e tensão. Também é possível avaliar os vasos de maior calibre, com pinos de fixação adequados. Estudar respostas celulares após deformação mecânica também está sob intensa investigação. A plataforma BAXS oferece uma característica única de mudar a direção ea complexidade do campo de tensão dentro da mesma experiência, além de permitir a gravação simultânea. Mais importante, as formas de multi-modal de microscopia são ainda possíveis, como a plataforma não interfere com o eixo óptico do microscópio. Esta é uma característica importante quanto as respostas das células ao vivo estruturais e bioquímicas d mecânicaeformation pode ser medido. Tomados em conjunto, o projeto de plataforma BAXS possui várias características importantes que facilitam o seu uso para uma única célula e tecido experiências integrais. Empregando um sistema modular de fixação e a adição de até quatro células de carga eventuais, a plataforma BAXS pode ser empregue para uma grande variedade de experiências. Este artigo mostra os detalhes de dois exemplos de experiências; no entanto, a modularidade e flexibilidade do sistema pode ser ainda mais explorado para investigar vários aspectos diversos mechanobiology em escalas de comprimento, os tecidos celulares e subcelulares inteiras.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
DT foi apoiado por uma bolsa de estudo de pós-doutorado de Le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) e um MITACS Elevate Estratégico Fellowship. CMC foi apoiado por uma bolsa de estudo de pós-doutorado de le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e Ernest e Margaret Ford cardiologia dotado bolsa de pesquisa da Universidade de Ottawa Heart Institute. EOB foi apoiado por subvenções de funcionamento MOP80204 do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) e T6335 da Heart and Stroke Foundation of Ontario. O CIHR e Medtronic fornecer coletivamente EOB com uma cadeira da pesquisa peer-reviewed (URC # 57093). AEP é financiado pelas Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia (NSERC) Descoberta Grant, um suplemento NSERC Discovery Accelerator e agradece o apoio dos presidentes de Pesquisa do Canadá programa (CRC) e um pesquisador Prêmio início da Província de Ontário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
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