Summary
Vi presenterar i denna artikel en roman stretching plattform som kan användas för att undersöka en enda cell svar på komplexa anisotrop tvåaxlig mekanisk deformation och kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos biologiska vävnader.
Abstract
Verktyg att tillåta tillämpning av mekaniska krafter på celler och vävnader, eller som kan kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos biologiska vävnader har bidragit avsevärt till förståelsen av grund mechanobiology. Dessa tekniker har i stor utsträckning använts för att visa hur uppkomsten och utvecklingen av olika sjukdomar är starkt påverkade av mekaniska signaler. I denna artikel presenteras en multifunktionell biaxiell sträckning (BAXS) plattform som kan antingen mekaniskt stimulera enskilda celler eller kvantifiera den mekaniska stelhet i vävnader. Den BAXS plattformen består av fyra talspole motorer som kan styras oberoende av varandra. Enstaka celler kan odlas på ett flexibelt substrat som kan fästas på motorerna som tillåter en att utsätta cellerna för komplexa, dynamiska, och rumsligt varierande fält stam. Omvänt, genom att införliva en kraftbelastningscell, en kan även kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos primära vävnader eftersom de är utsatta för deformation cykler.I båda fallen måste en ordentlig uppsättning klämmor konstrueras och monteras till BAXS plattformsmotorerna för att stadigt hålla det flexibla substrat eller vävnaden av intresse. Den BAXS plattform kan monteras på ett inverterat mikroskop för att utföra samtidig transmitterat ljus och / eller fluorescensavbildning för att undersöka den strukturella eller biokemiska svaret hos provet under stretching experiment. Den här artikeln innehåller experimentella uppgifter om utformning och användning av BAXS plattformen och presenterar resultat för enskild cell och hela vävnadsstudier. Den BAXS plattform användes för att mäta deformationen av kärnor i enstaka mus myoblastceller som svar till substrat-stam och för att mäta styvheten hos isolerade mus aortas. Den BAXS-plattformen är ett mångsidigt verktyg som kan kombineras med olika optiska microscopies för att tillhandahålla nya mechanobiological insikter på sub-cellulära, cellulär och hela vävnadsnivåer.
Introduction
Den mekaniska mikromiljön spelar en viktig roll i många cellfunktioner, t.ex. proliferation, migration och differentiering, som har en djupgående inverkan på utveckling och homeostas av vävnader och även i sjukdomar 1-6. Under årens lopp har en mängd experimentella verktyg använts för att mekaniskt stimulera celler eller vävnader och mäta mekaniska egenskaper hos biologiska vävnader med målet att öka vår förståelse av grundläggande mechanobiology och studera uppkomsten och utvecklingen av sjukdomar 6-17. Däremot måste man ofta bygga på flera olika experimentella enheter för att uppnå målen för en särskild undersökning. I denna artikel presenteras en enda multifunktionell, tvåaxlig stretching (BAXS) plattform som möjliggör studier som undersöker den roll som mekaniska egenskaper och mekaniska krafter spela i biologi på sub-cellulära till hela vävnad längdskalor. Den BAXS plattformen möjliggör inte bara för quantification av de mekaniska egenskaperna hos isolerade vävnader, men också underlättar möjligheten att tillämpa enkla, komplexa och dynamiska spänningsfält till levande celler för att förstå deras svar att stretching som sker in vivo. Den BAXS plattformen har även kapacitet att utföra live-cell mikroskopi under mekanisk provning och störningar på celler och vävnader.
Den BAXS-plattformen är en specialbyggd apparat som kan användas för att undersöka effekten av substrat deformation på cellnivå och utför dragprov på biologiska vävnader (Figur 1A). En aluminiumvärmare tillverkades för att rymma en standard 10-cm petriskål och behålla någon fysiologiska lösningar vid 37 ° C med hjälp av en temperaturregulator och Kapton värmare (Figur 1B). Denna BAXS plattformen kan integreras på en inverterad fas kontrast och / eller fluorescensmikroskop och möjliggör samtidig avbildning (Figur 1C).I korthet, det BAXS plattformen består av fyra linjära talspole motorer varav de rörliga delarna är monterade på miniatyr linjär rörelse kullagrade diabilder orienterade längs två vinkelräta axlar (Figur 1D). En linjär positionering skede är monterad på var och en av de fyra motorerna för att medge vertikal rörelse av fastspänningssystem som kommer att användas (figur 1E). Positionen för varje motor övervakas av en optisk kodare med en upplösning på 500 nm (figur 1F). Alla fyra motorerna oberoende kontrolleras med en spelkontroll med optisk pulsgivaråterkoppling för att utföra rörelsekommandon (figur 1G). En LabVIEW gränssnitt ger full kontroll över förskjutningen magnitud, hastighet och acceleration av varje motor för att generera helt anpassningsbara, statisk och dynamisk, deformation av celler eller vävnadsprover.
Tekniken som används för att inducera en deformation i celler uppnås genom att helt enkelt allowing celler att stadigt hålla sig till en flexibel och transparent substrat och sedan sträcka detta substrat med hjälp av de fyra motorerna i BAXS plattformen. Den BAXS plattformen möjliggör montering av alla skräddarsydda uppsättning klämmor för att fästa underlaget på röstspolen motorerna. För detta ändamål har vi utformat en uppsättning klämmor till vilka ett flexibelt och transparent substrat, tillverkade av polydimetylsiloxan (PDMS), kan fästas (Fig. 2A-C och fig. 3). Eftersom klämmorna kommer att utsättas för fysiologiska lösningar, alla delar bearbetad ur rostfritt stål för att medge sterilisering. Dessa klämmor är omsorgsfullt utformad för att ge underlaget så nära som möjligt till mikroskop målet att förbättra bildkvaliteten och samtidigt minimera belastningen på underlaget under sträckning (figur 2D).
Samma BAXS plattform kan också användas för att kvantifiera styvheten av små vävnadsprover, med användning av en lämplig uppsättning klämmor med adapted har stöd för vävnadsprover och en lastcell för att övervaka krafter. Flera metoder kan vidtas för att montera en vävnad till BAXS plattform motorer; i detta fall de rostfria insekts minutiens stift kan koppla genom öppningen av vaskulära vävnader i syfte att utföra dragprov (fig. 4A-B). Alternativt, för tjocka vävnader utan en naturlig öppning, vävnadskanter kan antingen hållas på plats med klämmorna knutna till talspole motorerna eller limmade till små glasskivor med biologisk lim och fästa vid motorer med klämmorna. För att utföra drag tester en miniatyr lastcell krävs och kan lätt införlivas på de BAXS plattforms motorer och används för att mäta den kraft som verkar på vävnaden under en sträckningscykel (Figur 4C). Såsom BAXS plattform består av fyra motorer medger införandet av en andra belastningscell en för att utföra dragprovning längs två ortogonala riktningar. Denna förmåga gör det möjligt för en att quantify den mekaniska styvheten hos ett enda vävnad längs två vinkelräta riktningar under samma försök.
Viktigt är i alla konfigurationer, cellerna eller vävnadsprov av intresse är alltid bibehållas i ett temperaturreglerat bad som är tillgängligt för användaren. Denna förmåga gör det möjligt för införandet av farmakologiska medel under prov sträckning för att undersöka det temporala svaret hos provet. Dessutom, eftersom den optiska axeln för inverterat mikroskop förblir intakt, alla former av mikroskopi är fortfarande tillgängliga för användaren. Slutligen, eftersom alla fyra motorer i BAXS plattformen är oberoende är det möjligt att tillämpa mycket konfigurerbara spänningsfält till provet av intresse. In vivo-celler och vävnader utsätts för komplexa och anisotropisk stretching som kan vara lämpligare härmade i denna plattform i motsats till traditionell enaxlig sträckning plattform 7,13,15,18,19. Dessutom är de fysikaliska egenskapernaav stammen fältet kan ändras i farten under ett experiment. Dessa förmågor tillåta användaren att undersöka den cellulära och vävnadsnivå som svar på ett stort antal mycket komplexa, anisotrop, tidsmässigt och rumsligt varierande spänningsfält. Denna artikel beskriver de fördelar och begränsningar av BAXS plattformen samt dess utformning, verksamhetsprinciper, och de experimentella detaljer för enskild cell och hela vävnadsexperiment.
Figur 1. Översikt av BAXS plattformen. A) Top bild av BAXS plattform som visar de fyra talspole motorer. B) Detaljerad bild av petriskålen värmare används för att upprätthålla celler och vävnader vid 37 ° C. C) Plattformen kan monteras på ett inverterat mikroskop för att spela live- cell imaging under stretching experiment.D) Detaljerad bild av talspolemotorn; den rörliga delen av plattformen. E) Detaljerad bild av den linjära positionerings scenen tillåter vertikal förskjutning av klämsystem. F) detaljerad bild av den optiska pulsgivare som ger realtidsläge för motorn till den rörelsekänsliga handkontrollen. G) Detaljerad bild av den rörelsekänsliga handkontrollen som visar de fyra optiska pulsgivaringångar och effekt till de fyra talspole motorer.
Figur 2. Kläm systemet för cell stretching experiment. AB) Bilder som visar detaljerna i klämmorna som används för att fästa PDMS substrat till talspole motorerna för stretching. C) Underlaget är virad runt den cylindriska delen av klämman med sin förankring features sitter i spåret på toppen. Då underlaget är säkrad med hjälp av ställskruvarna som driver substrat / förankring funktioner i det övre spåret. D) Illustration av BAXS plattform med klämmorna som håller underlaget på plats. Den infällda bilden visar en detaljerad vy av substratet med celler som är anslutna till den som sitter strax ovanför ett täckglas och mikroskopobjektivet.
Figur 3. Bill av material av membranet och dess fastspänningssystem. Ritningar som visar dimensionerna hos huvuddelarna integreras till den biaxiella plattform för att utföra cell stretching experiment.
Figur 4. Expel på ett fastspänningssystem för styvhet bedömning av finkalibriga fartyg. AB) Detaljerade bilder av fastspänningssystem används för att inducera deformation i en 1 mm mus diameter aorta. Stift av rostfritt stål var noggrant formas till öppna trianglar för att tillåta fartyget att glida på båda stiften. C) Illustration av den BAXS plattform med klämmorna håller kärlet och en lastcell fäst mellan den fasta motorn och den vänstra klämman. Den infällda bilden visar en detaljerad vy ovanifrån av kärlet monterad på tapparna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mekanisk Deformation av enskilda celler
- Tillverkning av en PDMS Substrat med Embedded fluorescerande pärlor
Före tillverkningen av substratet, är fluorescerande mikrosfärer i vatten-lösning återsuspenderades i isopropanol för att förbättra sträng blandning i PDMS på grund av dess hydrofoba natur.- Pipettera 500 ul av fluorescerande mikrosfärer i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 16200 xg under 10 min.
- Kasta bort supernatanten och tillsätt 500 | il isopropanol följt med 5 min av virvling. Sätt flaskan åt sidan över natten i mörker så att eventuella stora partiklar aggregat att sedimentera.
- Nästa morgon, försiktigt bort supernatanten till en ren mikroflaska. Denna vulst lösning kan användas för att tillverka mer än 5 substrat. OBS: Vulsten lösningen kommer att fortsätta att sedimentera för de nästa 3 dagarna. Var noga med att undvika resuspending pelleten.
- Häll 0,5 g av härdaren tillgängligmed PDMS kit i en 1,5 ml mikrocentrifug ampull med hjälp av en vetenskaplig balans. Genom successiva steg, lägger totalt 90 l av pärlor (i sex 15 il tillägg), vortexa under 1 minut mellan varje tillsats. Ställ åt sidan.
- Väg upp 10 g av PDMS och blanda i minst 12 min med 0,5 g av härdaren kompletteras med fluorescerande pärlor.
- Tillverka en SU-8 2050 korsformad gjutform med användning av standardfotolitografitekniker i enlighet med tillverkarens instruktioner. Den form som används har en höjd på 320 | im och en yta av 13,4 cm 2 (Figur 3). Formen kan innehålla 428 l eller 440 mg av PDMS.
- Häll 400 mg av PDMS med pärlor i den korsformad form med användning av en överföringspipett och härda i 2 timmar vid 80 ° C. Efter härdning skalas av substratet från formen (figur 5A). Substratet kan hållas i en petriskål vid rumstemperatur under två veckor utan att uppvisa signifikanta förändringar i sina mekaniska egenskaper. Häll droppar av PDMS (härdare: PDMS med ett förhållande på 1:20) i en petriskål med en slutlig storlek på ca 4 mm i diameter och bota dem upp och ner i 2 timmar vid 80 ° C (figur 5B). Dessa förankrings funktioner kan hållas i en petriskål i veckor. ANMÄRKNING: Underhåll skålen upp och ned för att förhindra att droppar från utplattning under härdningsprocessen.
- Luft-plasma treat (30 sek vid 30 W) underlaget och 8 förankringsfunktioner. Maska funktionerna på varje ände av substratet på ett avstånd av 4 mm från den fyrkantiga stycket är närvarande på substratet (figur 5C).
- Monterings membranet på Klämmor
- Wrap varje ände av substratet runt den räfflade cylindriska delen av klämmorna och fäst den på plats med de två ställskruvarna från toppen (Figur 2B och figur 5D-E).
- Skruva fast de 4 klämmorna på klämhållaren och häll PDMS (förhållandet 01:20) med hjälp av en engångs tverför pipett vid gränsytan mellan substratet och det spårförsedda cylindriska delen av klämmorna. Sprid ohärdade PDMS runt räfflade cylindriska delen med hjälp av en 1,5 mm insexnyckel.
- Häll PDMS (1:20) i spåren tills den är helt fylld av kapillärkraften och bota monteringen vid 80 ° C under 2 timmar (figur 5F).
- Sådd Celler på Membrane
- Luft plasma treat (30 sek vid 30 W) hela anordningen för att sterilisera och funktionalisera substratet för att tillåta kollagenbeläggning.
- Funktionalisera område av substratet där cellerna kommer att ympas med 1 ml av 0,02 M ättiksyra med tillsats av 16 pg / ml av råttsvanskollagen vid rumstemperatur under 1 timme. Den önskade slutliga kollagendensiteten är 5 ^ g / cm 2.
- Skölj substratet 3x med fosfatbuffert och låt den torka vid rumstemperatur under åtminstone 10 min.
- Tillsätt 40 | il av odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint Serum och 1% penicillin-streptomycin innehållande 2000 celler i det centrala partiet av substratet för att täcka ett område på 1 cm 2 (celldensitet: 20 celler / mm 2). Celldensiteten kan förändras enligt experimentella kraven.
- Sätt hela församlingen i en standard cellkultur inkubator med underlaget uppåt med droppe odlingsmedium innehållande celler på det. OBS: Enheten måste hållas med underlaget uppåt i minst 3 timmar för att låta cellerna att stadigt fästa det. För att förhindra avdunstning, är 30 ^ il varmt odlingsmedium sattes till droppen på substratet var 45 min under 3 timmar.
- Efter 3 tim, vända hela aggregatet i en petriskål fylld med färskt odlingsmedium för att dränka substratet och inkubera över natten för att tillåta cellerna att föröka sig.
- Nästa dag, förbereda HEPES-buffrad saltlösning (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSO 4, 1,8 mM CaCl2 och 11,1 mM av dextrose). Justera pH till 7,4. OBS: HBSS lösning måste beredas dagligen och hölls vid 37 ° C under experimenten. Denna fysiologisk lösning används för att bibehålla cellerna på mikroskopställningen genom att efterlikna den normala vävnaden / blod miljö.
- Montera set-up på inverterad fas kontrast eller fluorescerande mikroskop Montera kläm-substratenheten på BAXS plattform och motorer. Fyll petriskålens inuti petriskål värmaren med HEPES-buffert (figur 2D).
2. Stelhet Mätning av finkalibrig Fartyg
- Framställning
- Krebs fysiologisk lösning: Bered en lösning av 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-glukos, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, och 2,5 mM CaCl2. Justera pH till 7,4 och syresätta lösningen med karbogen medicinsk gas (95% O2 / 5% CO2) under 30 min. OBS: Krebs solutiden måste förberedas dagligen och hålls vid 37 ° C under experimenten. Denna fysiologisk lösning används för att upprätthålla de vävnader vid liv genom att efterlikna den normala vävnaden / blodmiljön.
- Samla instrumentering för dissekering och mekanisk bedömning av aorta fartyg: kirurgiska saxar, böjda pincett, mikro-sax, kirurgisk dissekera mikroskop, 50 ml polypropylen centrifugrör, och 10 ml serologiska pipetter. Det kirurgiska och experimentera förfarande kräver inga sterila förhållanden. Montera klämmor BAXS plattform tillsammans med lastcellen i förväg.
- Vävnads Isolering och Dissection
Alla experimentella procedurer som involverar försöksdjur måste godkännas av Animal Care och användning kommittén av användarnas institution, som överensstämmer med Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur i användarnas land.- Utför musen dödshjälp med inhalation av 99% CO2 (7 psi)i en plexiglaskammare (figur 6A).
- Öppna musen buken och skära bröstaortan att blöda musen.
- Ta bort membranet, bröstkorgen och lunglober (Figur 6B). OBS: För att minimera risken för skador på vävnaden, hålla hjärtat fäst aorta och undvik att röra fartyget direkt men manipulera den med hjärtat.
- Ta hjärtat, aortaroten och aorta genom att försiktigt skära mellan fartyget och ryggraden. OBS: Framkalla inte någon förlängning i kärlet under excision för att hålla den inre strukturen i vävnaden intakt (figur 6C).
- Omedelbart fördjupa och hålla hjärtat och stora kroppspulsådern i Krebs lösning.
- Klipp och noggrant tvätta kroppspulsådern i Krebs lösning för att ta bort eventuella blodproppar. Ta bort bindväv med hjälp av mikro-sax, pincett och kirurgisk dissekera mikroskop (Figur 6D-E). OBS: Håll alla fartygets längd och använda aortic roten för att bestämma kärlorientering.
- Vessel Dimension Fastställande och Montering
För att bestämma styvheten hos kärlet, är lossade fartygets dimensioner erfordras och kan bestämmas med ett kalibrerat mikroskop.- Skär en aortaring på ca 2 mm i längd och exakt mäta dess längd med hjälp av en kalibrerad mikroskop inställning (figur 6F-G). Sätt detta segment åt sidan i Krebs lösning.
- Skär annan aortaringen så litet som möjligt mellan vardera av två mm segment (Figur 6f). Sätt denna lilla segment på ett objektglas med lumen uppåt och mäta väggtjockleken med hjälp av en kalibrerad mikroskopinställning (figur 6H).
- Fyll petriskål på BAXS plattform med Krebs lösning och sätt i 2 mm aorta ringsegment på dragstift (infälld i Figur 4C).
GE = "alltid"> 
Figur 5. PDMS substrat tillverkning och montering. A) Efter härdning är underlaget försiktigt skalade av SU-8 2050 mögel och lägga undan i en petriskål. B) Förankring funktioner gjorda av PDMS och bidra till att säkra underlaget på klämmor. C) Substrat med förankring funktioner klara för montering. D) Underlaget är monterad på de 4 klämmor, som sedan monterade på klämhållaren (se infälld bild). E) Detaljerad bild av underlaget monteras på de 4 klämmorna. F ) Förfarande för att hälla PDMS i spåret under substratet. Pilen visar PDMS långsamt fyller spåret genom kapillaritet.
454fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 6. Framställning och isolering av aorta. A) framställning av kirurgiska instrument och euthanized mus. B) genom en längsgående buksnitt, är bröstkorgen och lung lobs bort. C) Aortan avlägsnas försiktigt med hjälp av hjärtat för att manipulera vävnaden. D) Hjärtat och aorta placeras i Krebs fysiologisk lösning. Aorta rengöres genom att ta bort all bindväv. E) detaljerad bild som visar hjärtat och aorta. F) Aorta-segmentet som används för styvhet bedömningen tillsammans med små segment som används för tjockleksmätning. GH) Den exakta längd (G) och tjocklek (H) av varje fartygssegment utvärderas med hjälp av ett omvänt mikroskop och ett analysprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cell Stretching
Den BAXS plattform användes för att undersöka mekanisk respons av nucleus i enstaka mus myoblastceller (C2C12) exponeras för ett substrat deformation av 25%. Myoblastceller finns i muskelvävnad och är ständigt utsatta för mekanisk sträckning och kompression in vivo. Formen och mekaniska egenskaperna hos cellkärnan har visat sig spela en viktig roll i regleringen av genuttryck och transkriptionsaktivitet 20,21 och även i en mängd olika utvecklingsmässiga defekter och sjukdomar som Hutchinson-Gilford progeria syndrom (HGPS), Emery -Dreifuss muskeldystrofi (EDMD), dilaterad kardiomyopati, för tidigt åldrande och cancer 22-25. Därför att förstå hur krafter från yttre mekanisk mikromiljö påverkar struktur och funktion av kärnan är av yttersta intresse. Den BAXS plattform användes för att undersöka överföringen av kraft från mil croenvironment till kärnan genom sträckning av substratet parallell med dess huvud-eller lillaxeln. Figurer 7A-F illustrerar förmågan hos den plattform för inducering av en deformation i substratet längs två ortogonala riktningar. Dessutom kan BAXS plattformen framkalla komplexa spänningsfält i underlaget i tillägg till standard enaxlad av equi-tvåaxlig spänningsfält. Siffror 7G-H illustrerar den flexibilitet som oberoende kontroll av stammen fältet längs två ortogonala riktningar, vilket tillåter oss att antingen producera en standard (tryck) eller ren (icke-komprimerande) enaxlig stam fält. Den BAXS plattform kan producera en ren enaxlig spänningsfält genom att lätt dra substratet i riktningen vinkelrätt mot huvudsträckningsriktning (fig. 7G) för att kompensera för kompression är närvarande i substratet längs denna riktning under en vanlig enaxlig sträckning (Figur 7H ).
ntent "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 7. Deplacement-deformation relationer från att utföra standard och ren uniaxiella stretching. AB) Fluorescerande pärlor manuellt valda på den första bildrutan i videon och spåras från en ram till den andra tills maximal stretch nås längs den horisontella (C) och vertikal (D)-riktningarna. Ett MATLAB-skript beräknar automatiskt komponenterna i den gröna stammen tensor för varje ram och ger en kalibreringskurva av stammen i förhållande till motorns deplacement 27. EF) De blå och röda linjerna motsvarar den del av den gröna stammen tensor längs den horisontella och vertikala riktningar respektive. G) Stretching samma substrat genom 4 mm längs x-axeln och något sträcker sig längsy-axel med 1,5 mm (markerade i rött) ger ett rent enaxlade fält utan tryck deformation i underlaget. H) Sträckning av substratet längs x-axeln av 3,5 mm ger en deformation av 25% och en kompressiv deformation av 7% vid ändarna på substratet längs den vertikala axeln är fixerade (markerade i rött).
Med möjligheten att spela live-cell mikroskopi avbildning under stretch, var kärnorna färgas med en live-cell fluorescerande färgämne, som binder till DNA (Hoescht 33342). Generellt C2C12 celler har elliptiska kärnor med större och mindre axel. Först var cellerna identifierades där de stora eller små nukleära axlar var orienterade parallellt med den horisontella stretching riktning. Vid denna punkt, var cellerna har sträckts med 25% längs varje ortogonal sträckning axel samtidigt förvärva bilder av den odeformerade och deformerade kärna mellan varje sträckningscykler (fig 8A-I). På detta sätt kunde vi bedöma deformerbarhet av kärnanlängs dess största och minsta axel i en exakt kontrollerad substrat deformation. Ovuscule, en ImageJ plugin, användes för att bestämma längden på de större och mindre kärnkrafts axlar. Dessa längder registrerades under odeformerade tillstånd och när kärnan var i tur och ordning sträckte sig längs dess större och mindre axlar (figur 8G-I). För att beräkna den deformation av kärnan utmed dess mindre och större axlar, var den relativa förändringen i längd längs varje axel i de sträckta och odeformerade states beräknas:
där ε är deformationen, L 1 är den deformerade längden och L 0 är den odeformerade längd.
Formförändringen av kärnan i C2C12 uppvisar en mekanisk anisotropi som den uppvisar en signifikant högre deformerbarhet längs dess lillaxel (6,3 ± 1,1%) i jämförelse med dess huvudaxel (3,077, 0,6%) (Figur 8J). Dessutom, även vi granskat roll aktin och mikrotubuli cytoskelettet i reglering av kärn deformerbarhet. Detta uppnåddes genom depolymerisering aktinfilament eller mikrotubuli selektivt använda cytochalasin-D och nokodazol, respektive. Depolymerisering aktinfilament eller mikrotubuli befanns inducera en förlust av den anisotropa deformerbarheten hos kärnan (Figur 8J). Dessa resultat stöder de fynd som cytoskelettala komponenter överför krafter till kärnan från underlaget och är också viktigt för att bevara den naturliga mekaniska beteende kärnan under deformation 25.
Figur 8. Stretching protokoll och kärn deformerbarhet. AC) Schematisk illustration av stre tching protokoll av en enda cell med dess kärna orienterade horisontellt. Faskontrast bilder (DF) och epi-fluorescensbilder (GI) i en cell färgades med DNA-specifik fluorescerande färgämne. Denna bildsekvens illustrerar en typisk cell stretching experiment där samma cell exponeras för ortogonala deformations fält. Skala barer är 25 nm. J) C2C12 visar anisotrop kärn deformerbarhet med lillaxeln deformeras betydligt mer än huvudaxeln. I aktin-eller mikrotubuli-berövade celler (cyt-d och nokodazol, respektive), försvinner denna anisotropi. Under alla förhållanden, nucleus deformationer är signifikant skilda från noll i ett substrat deformation av 25%. ** P-värde <0,01, parat t-test. † † p-värde <0,01, † † † p-värde <0,001, en-sampel t-test.
Bedömning Fartygs Styvhet
t "> Nyligen, vår grupp undersökte effekten av den kroniska överuttryck av Heat Shock Protein-27 (HSP27 o / e) om bildandet av aorta plack i en åderförkalkning benägna musmodell (apoE - / -). 26 Vi visade att HSP27 fungerar som en kärlskyddande protein som minskar plack lipid-och makrofager överflöd och ökar intimala glatta muskelceller och kollageninnehåll (figur 9A-B). För att bedöma effekten av denna histologiska ombyggnad på fartygs mekaniska egenskaper, var BAXS plattform som används att mäta aorta styvhet.Fig. 9C visar en typisk spännings-töjningskurva från drag sträckning av en aortaringen. För att kvantifiera stelhet, var den inkrementella modul beräknas från stress-töjningskurvor vid en deformation av 30%. Styvheten är lutningen av tangenten till kurvan. Genom att införa en belastningsmätare på en av de BAXS plattformsmotorerna, den samtidiga förvärv av displacement och kraftdata är möjlig. Förskjutningen-kraft kurvor omvandlades till spännings-töjnings-kurvor baserade på den odeformerade dimensioner av varje aortaring. Den spänning och töjning beräknas med hjälp av följande formler:
där ε är deformationen, L 1 är den deformerade längden, L 0 är den odeformerade längd, s är den stress, F är den kraft och A 0 är den odeformerade området av vävnaden under belastning. I det specifika fallet av en aortaringen, är den odeformerade området (A 0) två gånger tjockleken av ring gånger längden av segmentet.
Varje prov deformeras cykliskt med en maximal deformation av 40% vid en förflyttningshastighet av 50 ^ m / sek i 12 cykler med de första 11 cyklerna som möjliggör förkonditionering av vävnaden och last en för datainsamling. Vi fann att styvheten aorta segment av apoE - / - HSP27 o / e möss (62,8 ± 3,0 kPa) ökade signifikant med 41% jämfört med APOE - / - kontroll musmodell (44,4 ± 3,8 kPa) (figur 9D) .
Sammantaget, den mekaniska bedömningen i kombination med fartyget och plack histologi visade att överuttryck av HSP27 präglas av ökad kärl styvhet och kollagen / glatt innehåll muskelcell. Dessa resultat tyder på att HSP27 potentiellt kan öka stabiliteten av aterosklerotiska lesioner och därmed minska risken för plackbristning.
Figur 9. Effekt av HSP27 överuttryck på fartyg stelhet. Vi visade att HSP27 modifierat den histologiska komponenterförvärv av ateroskleros skador genom att öka intima glatta muskelceller (A: anti-α-SMA) och kollageninnehåll (B: picrosirius röd fläck) C) Typisk arbetskurva som erhålls från stretching en aortakärl där styvheten beräknas vid 30. % av stam. . Styvheten är lutningen på tangenten (röd linje) till kurvan D) Kronisk överuttryck av HSP27 ökar fartyg styvhet i jämförelse med kontroll apoE - / - möss modell (D). Skalstrecken i (A) och (B) är båda 40 um och 400 um i inläggningar. L = lumen, I = intima, prickade linjer delineates medierna. * P-värde <0,05, envägs ANOVA. *** P-värde <0,001, envägs ANOVA. Figur anpassad från arbetet av Cuerrier et al 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den BAXS plattform presenteras här underlättar många experiment i studien av mechanobiology, från undersökningar av enskilda celler för att hela vävnader. Dessutom är plattformen mycket flexibel och konfigurerbar, vilket möjliggör ett stort antal mekanisk stimulering experiment och multiaxiell dragprovning. Plattformen möjliggör också upprätthållandet av celler och vävnader under fysiologiska betingelser och ger möjlighet till samtidig mikroskopi under stretching experiment. De två experiment som beskrivs i de föregående avsnitten demonstrera mångsidigheten hos BAXS plattform vid användning av en lämplig uppsättning av fästklammer. En modulär och anpassningsbar prov monteringssystem, optisk access och möjlighet att lägga till ytterligare givare (t.ex. en lastcell), öppnar upp många möjligheter för andra typer av experiment som ska utföras.
Protokollet presenteras ovan innehåller många viktiga steg som måste utföras endequately för att producera de bästa resultaten. Inom cellen sträcker protokollet, montering av PDMS substrat till klämmorna kräver känslig och exakt manipulering. PDMS-substratet måste vara väl centrerad med avseende på de fyra klämmorna för att undvika oönskade sidorörelser hos substratet under sträckning. Sådana sidorörelser kan göra spårningen av cellerna svårt under stretching experiment. Dessutom, är det kritiskt att övervaka avdunstning av droppe av odlingsmediet under cellsådd när substratet är vänd uppåt i inkubatorn. Beroende på hur ofta inkubatorn dörren öppnas under processen, kan avdunstningshastigheten förändras. Inom kärlet stretching protokollet är det mest kritiska steget vid mätning av dimensionerna hos det prov som skall testas. Dessa mått skall vara så korrekta som möjligt eftersom de är involverade i beräkningen av vävnaden styvhet och därmed ha en direkt inverkan på resultatet. Efter att ha samma person utför kärl dimension mätningar kommer att bidra till att minska variationen mellan proverna.
Tillverkningen av klämmorna som används för att dra i PDMS substrat under cell stretching experiment involverade flera utvecklingscykler. Den första versionen av klämmorna hade inte en förankringsspår som ligger på botten av de cylindriska delar (Figur 2B). Utan detta spår, halkade underlaget längs den cylindriska delen, att framkalla en betydande variation i substrat deformation över tid. Med förekomsten av spåret och tillsatsen av härdade PDMS (Figur 5f), substratet inte längre glider. Denna experimentuppställning alstrar en konstant deformation i substratet med tiden. För vävnad stretching experiment, välja rätt lastcellen är också mycket viktigt. Lastcellen som används här har en låg belastningsområde (upp till 150 g), vilket är tillräckligt för de testade här proverna. Den mycket känslig belastningscell som krävs för measnder dragkrafter på små prover uppvisade en relativt låg signal-brus (S / N)-förhållandet. För att förbättra S / N-förhållandet och följaktligen förbättra upplösningen var lastcell är elektriskt isolerad från talspolen motor och några metalldelar med plast-skruvar och distansorgan. På detta sätt kan en hög S / N-förhållande med en upplösning på 0,03 g erhölls. För mjukare prov, är användningen av en lägre växel lastcell rekommenderas för att upprätthålla hög upplösning.
För närvarande är den huvudsakliga begränsningen av den BAXS plattform förmågan att utföra långsiktiga stretching experiment på grund av avdunstning av HBSS-buffert över tiden. Vatten avdunstning ökar koncentration av lösta ämnen som potentiellt kan ha en effekt på celler. Med den nuvarande konfigurationen av BAXS plattformen, är det svårt att ha ett experiment som mekaniskt skulle stimulera celler eller vävnader över dagar som buffert i vilken de celler och vävnader är nedsänkta måste vara supplem terade med vätska över tiden. I den aktuella inställningen, är avdunstningshastigheten cirka 0,9 ml / h från en initial volym av 25 ml av HBSS buffertlösning. Den aktuella inställningen är idealisk för korttidsexperiment. För att utföra tillförlitlig cell-och vävnads stretching experiment över längre tidsperioder, är två tillägg föreslås: 1) En fluidic system för att upprätthålla buffertvolym, och 2) tillägg av en kommersiell eller hembyggda inkubator kammare som innesluter hela systemet för att upprätthålla konstant fuktighet och temperatur och ger en 5% / 95% CO2 / luftatmosfär. Beträffande möjligheten att stretching kärlvävnader, installationen som beskrivs ovan tillät oss att mäta styvheten finkalibriga fartyg. Det är viktigt att använda stift med en lämplig diameter för att se till att de inte kommer att deformeras under sträckning, men är tillräckligt små för att passa in i kärllumen. Att inte ta denna detalj i beaktande skulle kunna införa felaktigheter i den uppmätta deformationen av vävnaden.
ve_content ">In vivo, är vävnads inbäddade celler som utsätts för mekaniska krafter och påfrestningar som varierar både i tid och rum, men ännu viktigare är de ofta multi axial. Ett bra exempel är det mekaniska beteendet hos kärlväggarna som svar på hemodynamiska krafter. Kombinationen av lokala hemodynamiska krafter 28-30 med de anisotropa egenskaperna hos kärlvävnader 13,14,16,27 att resultera i en komplicerad mekanisk mikromiljö, vilket exponerar endotelceller och vaskulära glatta muskelceller till komplexa multi-axiella och cyklisk spänningsfält. Även befintlig cell sträcker experiment har i hög grad bidragit till den grundläggande förståelsen för mechanotransduction och mechanobiology, de har traditionellt förlitat sig på idealiserade enaxlade eller equi-tvåaxlig spänningsfält som inte reproducerar komplexa vivo spänningsfält i 8-10,19,29,31-34 . Den BAXS plattformen möjliggör anisotrop tvåaxlig cell stretching med samtidig levande cell mikroskopi. Förmågan att kontrollera deformationen av substratet längs två ortogonala riktningar, tillåter oss att ha full kontroll över den spänningsfältet. Detta möjliggör produktion av komplexa spänningsfält utöver enkla enaxlig och equi-tvåaxlig spänningsfält. Dessutom tillåter plattformen oss att dynamiskt ändra riktningen av stammen fält i samma sträckning experiment.
Möjligheten att integrera en modulär och anpassad fastspänningssystem öppnar upp möjligheten för många tillämpningar inom cell mechanobiology och vävnadslära med hjälp av en enkel stretching plattform. Till exempel, med lämpliga spännsystem 13,27, kan denna plattform utföra plana enaxlig och tvåaxlig dragprovning av biologiska vävnader. På detta sätt kan de mekaniska egenskaperna för varje vävnad, skuren i en kvadratisk eller rektangulär form, kan kvantifieras utmed två ortogonala axlar i ett enda experiment. Dessutom utför histologiska ennalyses efter mekanisk stimulering kan avslöja stretch-induced strukturella ändringar i vävnader. Torsion är också en mycket viktig typ av mekanisk belastning för muskler och ligament 35. Denna plattform ger möjlighet att designa ett klämsystem som kan framkalla en rotation runt den sträckande axel för att alstra en kombinato mekanisk belastning involverar vridning och spänning. Det är också möjligt att bedöma större kaliber fartyg med lämpliga monteringsstift. Studera cellulära svar efter mekanisk deformation är också under intensiv utredning. Den BAXS plattformen erbjuder en unik funktion för att ändra riktning och komplexiteten i spänningsfältet inom samma experiment utöver möjliggör samtidig avbildning. Huvudsakligen multimodala former av mikroskopi är fortfarande möjligt, eftersom plattformen inte interfererar med den optiska axeln för mikroskopet. Detta är en viktig egenskap som de strukturella och biokemiska live-cell svar på mekanisk deformation kan mätas. Sammantaget, det BAXS plattformen designen äger flera viktiga funktioner som underlättar användningen för enskild cell och hela vävnadsexperiment. Genom att använda ett modulärt fastspänningssystem och tillsättning av upp till fyra möjliga lastceller kan BAXS plattform användas för en mängd olika experiment. Den här artikeln visar uppgifter om två exempel på experiment; men modularitet och flexibilitet i systemet kan utnyttjas ytterligare för att undersöka många olika aspekter av mechanobiology på sub-cellulära, cellulära och hela vävnad längdskalor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
DT fick stöd av ett postdoktorsanställning från le Fonds de Recherche du Quebec-Nature et Technologies (FQRNT) och en MITACS Elevate strategisk Fellowship. CMC fick stöd av ett postdoktorsanställning från le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) och Ernest och Margaret Ford kardiologi begåvat forskning stipendium från University of Ottawa Hjärtainstitutet. EOB stöddes av verksamhetsbidrag MOP80204 från den kanadensiska Institute for Health Research (CIHR) och T6335 från hjärtat och Stroke Foundation i Ontario. Den CIHR och Medtronic tillsammans ger EOB med en peer-reviewed forskning ordförande (URC # 57093). AEP finansieras av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council (NSERC) Discovery Grant, en NSERC Discovery Accelerator Supplement och tacksamt erkänner stöd från Kanada Research Chairs (CRC) program och en tidig forskare Award från provinsen Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
References
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
- Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
- Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
- Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
- Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
- Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
- Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
- Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
- Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
- Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
- Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
- Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
- Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
- Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
- Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
- Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
- Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
- Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
- Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
- Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
- Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
- Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
- Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
- Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
- Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
- Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
- Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
- Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
- Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).
