Summary
Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.
Abstract
Las herramientas que permiten la aplicación de fuerzas mecánicas a las células y tejidos o que pueden cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos han contribuido de manera espectacular a la comprensión de mecanobiología básica. Estas técnicas se han utilizado ampliamente para demostrar cómo el inicio y la progresión de diversas enfermedades están muy influenciados por las señales mecánicas. Este artículo presenta un estiramiento biaxial (BAXS) plataforma multifuncional que puede estimular mecánicamente las células individuales o cuantificar la rigidez mecánica de los tejidos. La plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz que pueden ser controlados de forma independiente. Única células pueden ser cultivadas en un sustrato flexible que se puede acoplar a los motores que permiten una para exponer las células a campos de tensiones complejas, dinámicas y espacialmente variables. Por el contrario, mediante la incorporación de una célula de carga de fuerza, se puede cuantificar también las propiedades mecánicas de los tejidos primarios como los que están expuestos a los ciclos de deformación.En ambos casos, un conjunto adecuado de abrazaderas debe ser diseñado y montado en los motores de la plataforma BAXS con el fin de sostener firmemente el sustrato flexible o el tejido de interés. La plataforma BAXS se puede montar en un microscopio invertido para llevar a cabo simultánea luz transmitida y / o imágenes de fluorescencia para examinar la respuesta estructural o bioquímica de la muestra durante los experimentos de estiramiento. Este artículo proporciona detalles experimentales del diseño y el uso de la plataforma BAXS y presenta los resultados de una sola célula y estudios de todo el tejido. La plataforma BAXS se utilizó para medir la deformación de los núcleos en células individuales de mioblastos de ratón en respuesta al sustrato cepa y para medir la rigidez de las aortas aisladas de ratón. La plataforma BAXS es una herramienta versátil que se puede combinar con diversos microscopías óptica con el fin de proporcionar nuevos conocimientos mecanobiológicos en los niveles de tejido sub-celulares, celular y conjunto.
Introduction
El microambiente mecánica juega un papel importante en muchas funciones celulares tales como proliferación, migración, y diferenciación, que tienen un impacto profundo en el desarrollo y la homeostasis de los tejidos y también en enfermedades 1-6. A través de los años, una multitud de herramientas experimentales se han utilizado para estimular mecánicamente las células o tejidos y medir las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos con el objetivo de aumentar la comprensión de mecanobiología básica y el estudio de la aparición y progresión de enfermedades de 6-17. Sin embargo, hay que a menudo se basan en varios dispositivos experimentales diferentes con el fin de lograr los objetivos de un estudio en particular. En este artículo se presenta un solo biaxial plataforma, multi-funcional, que se extiende (BAXS) que permite que los estudios que investigan el papel que las propiedades mecánicas y las fuerzas mecánicas juegan en biología en la sub-celular a escalas de longitud tejido enteros. La plataforma BAXS no sólo permite la quantification de las propiedades mecánicas de los tejidos aislados, sino que también facilita la capacidad de aplicar campos de deformación simples, complejos, y dinámicas a las células vivas a fin de comprender sus respuestas al estiramiento que se produce in vivo. La plataforma BAXS también mantiene la capacidad de realizar la microscopía de células vivas durante las pruebas mecánicas y perturbaciones en las células y tejidos.
La plataforma BAXS es un aparato construido a la medida que se puede utilizar para investigar el efecto de la deformación del sustrato a nivel celular y realizar ensayos de tracción sobre los tejidos biológicos (Figura 1A). Un calentador de aluminio se fabricó para dar cabida a un plato estándar de 10 cm de Petri y mantener las soluciones fisiológicas a 37 ° C usando un controlador de temperatura y calentadores de Kapton (Figura 1B). Esta plataforma BAXS se puede integrar en un contraste de fase invertida y / o un microscopio de fluorescencia y permite la formación de imágenes simultánea (Figura 1C).En breve, la plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz lineales de los cuales las partes móviles están montados en miniatura de bolas de movimiento lineal diapositivas del rodamiento orientadas a lo largo de dos ejes perpendiculares (Figura 1D). Una etapa de posicionamiento lineal está montado en cada uno de los cuatro motores para permitir el movimiento vertical del sistema de sujeción que se utilizará (Figura 1E). La posición de cada motor se controla mediante un codificador óptico con una resolución de 500 nm (Figura 1F). Los cuatro motores son controlados de manera independiente con un controlador de movimiento que emplea realimentación del codificador óptico para comandos de movimiento (Figura 1G) de ejecutar. Una interfaz de LabVIEW proporciona un control total sobre la magnitud de desplazamiento, velocidad y aceleración de cada motor con el fin de generar la deformación completamente personalizable, estático y dinámico, de las células o muestras de tejido.
La técnica utilizada para inducir una deformación en las células se consigue simplemente allowing de células se adhieran firmemente a un sustrato flexible y transparente y luego se extiende este sustrato utilizando los cuatro motores de la plataforma BAXS. La plataforma BAXS permite el montaje de cualquier conjunto de diseño personalizado de pinzas para sujetar el sustrato en los motores de bobina de voz. Para este fin, se diseñó un conjunto de abrazaderas a la que un sustrato flexible y transparente, hecha de polidimetilsiloxano (PDMS), puede ser conectado al mismo (Figuras 2A-C y la Figura 3). Como las abrazaderas estarán expuestos a soluciones fisiológicas, todas las partes se mecanizan a partir de acero inoxidable para permitir la esterilización. Estas abrazaderas han sido cuidadosamente diseñados para llevar el sustrato lo más cerca posible al objetivo del microscopio para mejorar la calidad de imagen al tiempo que minimiza la presión sobre el sustrato durante el estiramiento (Figura 2D).
La misma plataforma BAXS también se puede utilizar para cuantificar la rigidez de pequeñas muestras de tejido, utilizando un conjunto adecuado de abrazaderas con ADAPTed soportes para las muestras de tejido y una célula de carga para monitorizar fuerzas. Varios enfoques pueden ser tomados para montar un tejido a los motores de la plataforma BAXS; en este caso los minutiens de insectos de acero inoxidable pines pueden conectar a través de la apertura de los tejidos vasculares con el fin de realizar ensayos de tracción (Figuras 4A-B). Alternativamente, para tejidos gruesos sin una abertura natural, bordes de tejido puede ser celebrada en su posición con las abrazaderas unidas a los motores de bobina de voz o pegados a las pequeñas placas de vidrio con pegamento biológico y unidos a los motores con las abrazaderas. Con el fin de realizar las pruebas de tracción se requiere una célula de carga en miniatura y se puede incorporar fácilmente en los motores de la plataforma BAXS y se utiliza para medir la fuerza que actúa sobre el tejido durante un ciclo de estiramiento (Figura 4C). Como la plataforma BAXS se compone de cuatro motores, la introducción de una segunda célula de carga permite a uno realizar ensayos de tracción a lo largo de dos direcciones ortogonales. Esta capacidad permite a uno quantify la rigidez mecánica de un solo tejido a lo largo de dos direcciones perpendiculares durante el mismo experimento.
Es importante destacar que, en todas las configuraciones, las células o muestras de tejido de interés se mantienen siempre en un baño de temperatura controlada que es accesible para el usuario. Esta capacidad permite la introducción de agentes farmacológicos durante el estiramiento de la muestra con el fin de examinar la respuesta temporal de la muestra. Además, como el eje óptico del microscopio invertido permanece sin obstrucciones, todas las formas de microscopía están todavía disponibles para el usuario. Por último, como todos los cuatro motores de la plataforma BAXS son independientes, es posible aplicar campos de deformación altamente configurables para la muestra de interés. In vivo células y tejidos están expuestos a complejo y anisotrópico de estiramiento que puede ser imitado más apropiadamente en esta plataforma en oposición al tradicional estirado uniaxial 7,13,15,18,19 plataforma. Además, las características físicasdel campo de deformación se puede cambiar sobre la marcha durante un experimento. Estas capacidades permiten al usuario examinar la respuesta celular y el nivel de tejido a una amplia serie de altamente complejo, anisotrópico, temporalmente, y campos de deformación espacialmente diferentes. En este artículo se describen las ventajas y limitaciones de la plataforma BAXS así como su diseño, principios de funcionamiento, y los detalles experimentales para una sola célula y los experimentos de todo el tejido.
Figura 1. Visión general de la plataforma BAXS. A) Vista superior de la plataforma BAXS mostrando los cuatro motores de bobina de voz. B) Cuadro detallado del calentador de placa de Petri se utiliza para mantener las células y los tejidos a 37 º C. C) La plataforma se puede montar en un microscopio invertido para tocar en vivo- imágenes de células durante los experimentos de estiramiento.D) Cuadro detallado del motor de bobina de voz; la parte móvil de la plataforma. E) Cuadro detallado de la etapa de posicionamiento lineal que permite el desplazamiento vertical de los sistemas de sujeción. F) Cuadro detallado del codificador óptico que proporciona la posición en tiempo real del motor para el controlador de movimiento. G) Cuadro detallado del controlador de movimiento que muestra las cuatro entradas de encoder ópticos y salidas de potencia a los cuatro motores de bobina de voz.
Figura 2. Sistema de sujeción para los experimentos de células de estiramiento. AB) imágenes que muestran los detalles de las abrazaderas utilizadas para unir el sustrato de PDMS a los motores de bobina de voz para el estiramiento. C) El sustrato se envuelve alrededor de la parte cilíndrica de la abrazadera con su Featur anclajees que se sienta en la ranura en la parte superior. A continuación, el sustrato se fija con los tornillos que empujan el sustrato / anclaje características en la ranura superior. D) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas que sostiene el sustrato en su lugar. El recuadro muestra una vista detallada del sustrato con las células unidas a él sentado justo por encima de una hoja de cubierta y el objetivo del microscopio.
Figura 3. Lista de materiales de la membrana y su sistema de sujeción. Dibujos que muestran las dimensiones de las partes principales integrados a la plataforma de dos ejes para llevar a cabo experimentos de células de estiramiento.
Figura 4. Explo de un sistema de sujeción para la evaluación de la rigidez de los vasos de pequeño calibre. AB) imágenes detalladas del sistema de sujeción se utiliza para inducir la deformación en un 1 mm de diámetro de la aorta del ratón. Pasadores de acero inoxidable fueron cuidadosamente en forma en triángulos abiertos para permitir que el buque se deslice en ambas clavijas. C) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas de la celebración de la embarcación y una célula de carga conectada entre el motor fijo y la pinza izquierda. El recuadro muestra una vista superior detallada del buque montado en las patillas.
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Protocol
1. Deformación mecánica de las células individuales
- La fabricación de un sustrato PDMS con bolas fluorescentes incrustados
Antes de la fabricación del sustrato, microesferas fluorescentes en solución de agua se vuelven a suspender en isopropanol para mejorar la mezcla del grano en el PDMS debido a su naturaleza hidrofóbica.- Pipetear 500 l de microesferas fluorescentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 16.200 xg durante 10 min.
- Desechar el sobrenadante y añadir 500 l de isopropanol siguieron con 5 min de vórtice. Ponga el vial a un lado toda la noche en la oscuridad con el fin de permitir que cualquier partícula grande de agregados al sedimento.
- A la mañana siguiente, retire con cuidado el sobrenadante a un vial de microcentrífuga limpio. Esta solución de bolas se puede utilizar para fabricar más de 5 sustratos. NOTA: La solución del grano seguirá sedimentar durante los próximos 3 días. Tenga cuidado de evitar resuspensión del sedimento.
- Vierta 0,5 g del agente de curado proporcionadocon el kit de PDMS en un vial de microcentrífuga de 1,5 ml usando un equilibrio científica. Por etapas sucesivas, añadir un total de 90 l de bolas (seis en 15 mu l adiciones), vortex durante 1 min entre cada adición. Ponga a un lado.
- Pesar 10 g de PDMS y se mezcla durante al menos 12 min con la 0,5 g del agente de curado suplementado con perlas fluorescentes.
- Fabrique un molde en forma de cruz SU-8 2050 usando técnicas de fotolitografía estándar siguiendo las instrucciones del fabricante. El molde utilizado tiene una altura de 320 micras y un área de 13,4 cm 2 (Figura 3). El molde puede contener 428 l ó 440 mg de PDMS.
- Vierta 400 mg de los PDMS con cuentas en el molde en forma de cruz con una pipeta de transferencia y curar durante 2 horas a 80 ° C. Después del curado, retire el sustrato del molde (Figura 5). El sustrato se puede mantener en una placa de Petri a temperatura ambiente durante 2 semanas sin mostrar cambios significativos en sus propiedades mecánicas. Vierta gotitas de PDMS (agente de curado: PDMS con una relación de 01:20) en una placa de Petri con un tamaño final de aproximadamente 4 mm de diámetro y curar boca abajo durante 2 horas a 80 ° C (Figura 5B). Estas características de anclaje se pueden mantener en una placa de Petri para la semana. NOTA: Mantener el plato boca abajo para evitar que las gotas de aplanamiento durante el proceso de curado.
- Tratamiento de aire de plasma (30 seg a 30 W) el sustrato y 8 funciones de anclaje. Enlazar las características en cada extremo del sustrato a una distancia de 4 mm del guión de forma cuadrada presentes en el sustrato (Figura 5C).
- Montaje de la membrana de las abrazaderas
- Envuelva cada extremo del sustrato alrededor de la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas y seguro en su lugar con los tornillos de fijación 2 de la parte superior (Figura 2B y las figuras 5D-E).
- Atornille las 4 abrazaderas en el soporte de sujeción y vierta PDMS (relación 01:20) usando un t desechableRANSFERENCIA pipeta en la interfase entre el sustrato y la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas. Corre el PDMS sin curar alrededor de la parte cilíndrica ranurada utilizando una llave hexagonal de 1,5 mm.
- Vierta PDMS (1:20) en las ranuras hasta que esté completamente llena por acción capilar y curar el conjunto a 80 ° C durante 2 horas (Figura 5F).
- La siembra de células en la membrana
- Tratamiento de aire-plasma (30 segundos a 30 W) todo el conjunto para esterilizar y funcionalizar el sustrato para permitir que para el revestimiento de colágeno.
- Funcionalizar el área del sustrato donde las células se sembraron con 1 ml de ácido acético 0,02 M suplementado con 16 g / ml de colágeno de cola de rata a temperatura ambiente durante 1 h. La densidad de colágeno final deseado es 5 g / cm 2.
- Enjuagar el sustrato 3x con tampón fosfato y dejar secar a temperatura ambiente por lo menos durante 10 minutos.
- Añadir 40 l de medio de cultivo suplementado con 10% Seru bovino fetalm y 1% de penicilina-estreptomicina que contenía 2000 células en la porción central del sustrato para cubrir un área de 1 cm 2 (densidad de células: 20 células / mm 2). La densidad celular puede ser alterado de acuerdo con los requisitos experimentales.
- Ponga todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular estándar con el sustrato hacia arriba con la gota de medio de cultivo que contiene las células en ella. NOTA: El montaje se debe mantener con el sustrato hacia arriba durante al menos 3 horas para permitir que las células se unan firmemente ella. Para evitar la evaporación, 30 l de medio de cultivo caliente se añade en la gota sobre el sustrato cada 45 min durante 3 horas.
- Después de 3 h, dar la vuelta todo el conjunto en una placa de Petri llena de medio de cultivo fresco para sumergir el sustrato y se incuba durante la noche para permitir que las células proliferen.
- El día siguiente, preparar la solución salina tamponada con HEPES (HBSS; 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO4, 1,8 mM de CaCl2, y 11,1 mM de dextrose). Ajustar el pH a 7,4. NOTA: La solución HBSS tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener las células en la platina del microscopio mediante la imitación de las condiciones del tejido / normal de la sangre.
- Monte la puesta a punto de contraste de fase invertida o un microscopio fluorescente Monte el conjunto de la abrazadera del sustrato en la plataforma y motores BAXS. Llene la caja de Petri en el interior del calentador de placa de Petri con tampón HEPES (Figura 2D).
2. Rigidez medición de los buques de pequeño calibre
- Preparación
- Krebs solución fisiológica: Prepare una solución de NaCl 118,1 mM, 11,1 mM D-glucosa, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4 y 2,5 mM CaCl 2. Ajustar el pH a 7,4 y oxigenar la solución con gas médico carbógeno (95% O 2/5% CO 2) durante 30 min. NOTA: El soluti Krebsel tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener los tejidos vivos al imitar las condiciones del tejido / sangre normal.
- Reúna la instrumentación para la disección y la evaluación mecánica de los vasos aórticos: tijeras quirúrgicas, pinzas dobladas, micro-tijeras, microscopio de disección quirúrgica, 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno y 10 ml pipetas serológicas. El procedimiento quirúrgico y el experimento no requiere condiciones estériles. Montar las abrazaderas de la plataforma BAXS junto con la célula de carga de antemano.
- Aislamiento de tejido y disección
Todos los procedimientos experimentales con animales de laboratorio tienen que ser aprobados por el Comité de los usuarios de Cuidado de Animales y Uso 'institución, que cumple con la Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los usuarios' país.- Lleve a cabo la eutanasia de ratón con la inhalación de 99% de CO 2 (7 psi)en una cámara de Plexiglas (Figura 6A).
- Abdomen abierto ratón y cortar la aorta torácica a sangrar el ratón.
- Retire el diafragma, la caja torácica y los lóbulos pulmonares (Figura 6B). NOTA: Para reducir al mínimo el riesgo de dañar el tejido, mantener el corazón conectado a la aorta y evitar tocar el recipiente directamente, sino manipularla usando el corazón.
- Quite el corazón, la raíz aórtica y de la aorta torácica cortando suavemente entre el buque y la columna vertebral. NOTA: No provocar ningún alargamiento en el recipiente durante la escisión de mantener la estructura interna del tejido intacto (Figura 6C).
- Inmediatamente sumerja y mantener el corazón y la aorta en solución de Krebs.
- Cortar y lavar cuidadosamente la aorta en solución de Krebs para eliminar cualquier coágulo de sangre. Quitar el tejido conectivo usando micro-tijeras, pinzas y microscopio de disección quirúrgica (Figura 6D-E). NOTA: Mantenga toda la eslora del buque y el uso de la aorraíz de tic para determinar la orientación del vaso.
- Vessel Determinación de dimensiones y montaje
Para determinar la rigidez del recipiente, se requiere que las dimensiones de la embarcación sin carga y se pueden determinar con un microscopio calibrado.- Cortar un anillo aórtico de aproximadamente 2 mm de longitud y medir con precisión su longitud utilizando un ajuste (Figuras 6F-G) microscopio calibrado. Ponga a un lado este segmento en solución de Krebs.
- Corte otro anillo aórtico tan pequeño como sea posible entre cada uno de los segmentos 2 mm (Figura 6F). Añadir este pequeño segmento en un portaobjetos de vidrio de microscopio con el lumen hacia arriba y medir el espesor de la pared usando un ajuste de microscopio calibrado (Figura 6H).
- Llene la caja de Petri en la plataforma BAXS con solución Krebs e inserte el segmento de anillo aorta 2 mm en los pernos de tracción (recuadro en la Figura 4C).
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Figura 5. Fabricación sustrato de PDMS y de montaje. A) Después del curado, el sustrato es cuidadosamente pelado fuera de la 2050 molde SU-8 y dejar de lado en una placa de Petri. B) Anclaje características hechas de PDMS y ayudan a asegurar el sustrato en la abrazaderas. C) sustrato con características de anclaje listo para el montaje. D) El sustrato se monta en las abrazaderas 4, que se montan entonces en el soporte de la abrazadera (véase el recuadro). E) Imagen detallada del sustrato montado en las abrazaderas 4. F ) Procedimiento de colada de PDMS en la ranura debajo de la del sustrato. La flecha muestra el PDMS de llenado lentamente la ranura por capilaridad.
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Figura 6. Preparación y aislamiento de la aorta torácica. A) preparar instrumentos quirúrgicos y el ratón sacrificado. B) A través de una incisión abdominal longitudinal, se retiran de la jaula torácica y globos de pulmón. C) La aorta se retira cuidadosamente usando el corazón para manipular el tejido. D) El corazón y la aorta se ponen en solución fisiológica de Krebs. La aorta se limpia mediante la eliminación de todos los tejidos conectivos. E) imagen detallada que muestra el. F) segmento de la aorta del corazón y la aorta utilizado para la evaluación de rigidez a lo largo con pequeños segmentos utilizados para la medición de espesor. GH) La longitud precisa (G) y el espesor (H) de cada uno de los segmentos de buques se evalúan usando un microscopio inverso y un programa de análisis.
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Representative Results
Celular Estiramiento
La plataforma BAXS se utilizó para investigar la respuesta mecánica del núcleo en las células individuales de mioblastos de ratón (C2C12) expuesta a una deformación del sustrato de 25%. Células mioblastos se encuentran en el tejido muscular y están constantemente expuestos a estiramiento mecánico y de compresión in vivo. Las propiedades de forma y mecánicas del núcleo de la célula han demostrado que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica y la actividad transcripcional 20,21 y también en una variedad de defectos y enfermedades tales como el síndrome de Hutchinson-Gilford progeria (HGPS), Emery desarrollo -Dreifuss distrofia muscular (EDMD), miocardiopatía dilatada, el envejecimiento prematuro y cáncer de 22-25. Por lo tanto, la comprensión de cómo las fuerzas de la microambiente mecánica externa afectan a la estructura y la función del núcleo es de sumo interés. La plataforma BAXS se utilizó para investigar la transmisión de la fuerza desde el millas croenvironment al núcleo por el estiramiento de la paralela sustrato a su eje mayor o menor. Figuras 7A-F ilustra las capacidades de la plataforma para inducir una deformación en el sustrato a lo largo de dos direcciones ortogonales. Por otra parte, la plataforma BAXS puede inducir campos de deformaciones complejas en el sustrato además de uniaxial estándar de campos de deformación-equi biaxial. Figuras 7G-H ilustra la flexibilidad proporcionada por el control independiente de la cepa de campo a lo largo de dos direcciones ortogonales, lo que nos permite ya sea producimos una norma (compresión) o puro (sin compresión) campo de deformación uniaxial. La plataforma BAXS es capaz de producir un campo de deformación uniaxial puro tirando ligeramente el sustrato en la dirección perpendicular a la dirección principal de estiramiento (Figura 7G) para compensar la compresión presente en el sustrato a lo largo de esta dirección durante un estiramiento uniaxial estándar (Figura 7H ).
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Figura 7. Relaciones Desplazamiento-deformación de la realización estándar y pura estirado uniaxial. AB) perlas fluorescentes se seleccionan manualmente en el primer cuadro del vídeo y realiza un seguimiento de un cuadro a otro hasta que se alcanza el máximo estiramiento a lo largo de la horizontal (C) y vertical (D) las direcciones. Un script de MATLAB calcula automáticamente los componentes del tensor de deformaciones verde para cada cuadro y produce una curva de calibración de la tensión con respecto al motor Desplazamientos 27. EF) Las líneas azules y rojas se corresponden con el componente del tensor de deformaciones verde a lo largo de la horizontal y direcciones vertical respectivamente. g) de estiramiento el mismo sustrato por 4 mm a lo largo del eje x y un poco de estiramiento a lo largo de laeje y en 1,5 mm (resaltados en rojo) produce un campo uniaxial puro sin deformación compresiva en el sustrato. H) Estirar el sustrato a lo largo del eje x por 3,5 mm produce una deformación del 25% y una deformación a la compresión de 7% cuando los extremos del sustrato a lo largo del eje vertical son fijos (resaltado en rojo).
Con la capacidad para realizar las imágenes de microscopía de células vivas durante el estiramiento, los núcleos fueron teñidos con un colorante fluorescente de células vivas, que se une al ADN (Hoechst 33342). En general, las células C2C12 poseen núcleos elíptica con un eje mayor y menor. En primer lugar, se identificaron células en las que los ejes nucleares mayores o menores estaban orientadas paralelamente a la dirección de alargamiento horizontal. En este punto, las células se estiraron en un 25% a lo largo de cada eje ortogonal de estiramiento, mientras que la adquisición de imágenes del núcleo no deformada y deformada entre cada uno de los ciclos de estiramiento (Figuras 8A-I). De esta manera podemos evaluar la deformabilidad del núcleoa lo largo de su eje mayor y menor de una deformación sustrato controlada con precisión. Ovuscule, un plugin ImageJ, se utilizó para determinar la longitud de los ejes mayores y menores nucleares. Estas longitudes se registraron durante el estado no deformado y cuando el núcleo se estira secuencialmente a lo largo de sus ejes mayor y menor (Figuras 8G-I). Para calcular la deformación del núcleo a lo largo de sus ejes menor y mayor, se calculó el cambio relativo en longitud a lo largo de cada eje en los estados estiradas y no deformadas:
donde ε es la deformación, L 1 es la longitud deformada y L 0 es la longitud no deformada.
La deformabilidad del núcleo en C2C12 exhibe una anisotropía mecánica, ya que muestra una deformabilidad significativamente mayor a lo largo de su eje menor (6,3 ± 1,1%) en comparación con su eje mayor (3,077; 0,6%) (Figura 8J). Además, también examinamos el papel de la actina y microtúbulos del citoesqueleto en la regulación de deformabilidad nuclear. Esto se logró mediante la despolimerización de los microtúbulos o filamentos de actina utilizando selectivamente citocalasina-D y nocodazol, respectivamente. Despolimerización de los filamentos de actina o los microtúbulos se encontró para inducir una pérdida de la deformabilidad anisotrópica del núcleo (Figura 8J). Estos resultados apoyan los hallazgos de que los componentes del citoesqueleto transmiten fuerzas al núcleo del sustrato y también son esenciales para preservar el comportamiento mecánico natural del núcleo durante la deformación 25.
Figura 8. Estiramiento protocolo y deformabilidad nuclear. CA) Ilustración esquemática de la stre tching protocolo de una sola célula con su núcleo orientado horizontalmente. Imágenes de contraste de fase (DF) y las imágenes epi-fluorescencia (GI) de una célula tiñeron con ADN específico tinte fluorescente. Esta secuencia de imágenes ilustra un experimento de estiramiento celular típico en el que la misma célula se expone a los campos de deformación ortogonales. Las barras de escala son 25 micras. J) C2C12 muestra deformabilidad anisotrópica nuclear con el eje menor de deformación significativamente más que el eje mayor. En las células de los microtúbulos-privada (CYT-d y nocodazole, respectivamente) actina-o, esta anisotropía desaparece. En todas las condiciones, deformaciones núcleo son significativamente diferentes de cero en virtud de una deformación del sustrato de 25%. ** Valor p <0,01, prueba t pareada. † † valor de p <0,01, † † † p-valor <0,001, una muestra de t-test.
Evaluación Rigidez Vessel
t "> Recientemente, nuestro grupo investigó el efecto de la crónica sobre-expresión de proteína de choque térmico-27 (HSP27 O / E) en la formación de placas de la aorta en un modelo de ratón-aterosclerosis propensos (apoE - / -). 26 Nos mostró que la HSP27 actúa como una proteína ateroprotector que reduce los lípidos de la placa y la abundancia de macrófagos y aumenta las células del músculo liso de la íntima y el contenido de colágeno (Figuras 9A-B). Para determinar el impacto de esta remodelación histológico sobre las propiedades mecánicas de los vasos, se utilizó la plataforma BAXS para medir la rigidez aórtica.La Figura 9C muestra una curva de tensión-deformación típica de la resistencia a la tracción de estiramiento de un anillo aórtico. Para cuantificar la rigidez, el módulo de incremento se calculó a partir de curvas de tensión-deformación a una deformación de 30%. La rigidez es la pendiente de la tangente a la curva. Mediante la introducción de una célula de carga en uno de los motores de la plataforma BAXS, la adquisición simultánea de DISLOCACIÓnt y datos de la fuerza es posible. Las curvas de desplazamiento de fuerza se convirtieron a curvas de tensión-deformación sobre la base de las dimensiones no deformadas de cada anillo aórtico. El estrés y la tensión se calculan utilizando las siguientes fórmulas:
donde ε es la deformación, L 1 es la longitud deformada, L 0 es la longitud no deformada, s es el estrés, F es la fuerza y A 0 es el área no deformada del tejido bajo carga. En el caso específico de un anillo aórtico, la zona no deformada (A 0) es el doble del espesor de los tiempos de timbrado de la longitud del segmento.
Cada muestra se deforma cíclicamente con una deformación máxima del 40% a una velocidad de desplazamiento de 50 m / s durante 12 ciclos con los primeros 11 ciclos que permiten preacondicionamiento del tejido y la LaSt uno para la adquisición de datos. Encontramos que la rigidez de los segmentos aórticos de apoE - / - ratones HSP27 o / e (62,8 ± 3,0 kPa) aumentaron significativamente en un 41% en comparación con el apoE - / - modelo de ratón de control (44,4 ± 3,8 kPa) (Figura 9D) .
Tomados en conjunto, la evaluación mecánica combinada con el recipiente y la histología placa demostró que la sobre-expresión de HSP27 se caracteriza por el aumento de la rigidez del vaso y colágeno / contenido de células de músculo liso. Estos resultados sugieren que la HSP27 podría aumentar potencialmente la estabilidad de las lesiones ateroscleróticas y por lo tanto disminuir el riesgo de ruptura de la placa.
Figura 9. Efecto de HSP27 sobre-expresión en la rigidez del vaso. Demostramos que HSP27 modificó la compo histológicosición de las lesiones de aterosclerosis mediante el aumento de las células musculares lisas de la íntima (A: anti-α-SMA) y el contenido de colágeno (B: picrosirio mancha roja) C) típica curva de tensión-deformación obtenido a partir de estiramiento un recipiente aórtica donde la rigidez se calcula en 30. % de deformación. . La rigidez es la pendiente de la tangente (línea roja) a la curva D) crónica sobre-expresión de HSP27 aumenta la rigidez en comparación vasos de control de apoE - / - ratones modelo (D). Las barras de escala en (A) y (B) son ambos de 40 micras y 400 micras de las inserciones. L = luz, I = íntima, líneas de puntos delinea los medios de comunicación. * Valor de p <0,05, ANOVA de una vía. *** P-valor <0,001, ANOVA de una vía. Figura adaptada de la obra de Cuerrier et al 26.
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Discussion
La plataforma BAXS presentado aquí facilita numerosos experimentos en el estudio de mecanobiología, de las investigaciones de las células individuales a los tejidos enteros. Además, la plataforma es altamente flexible y configurable, permitiendo numerosos experimentos de estimulación mecánicas y de ensayo de tracción multiaxial. La plataforma también permite el mantenimiento de células y tejidos en condiciones fisiológicas y permite para microscopía simultánea durante los experimentos de estiramiento. Los dos experimentos descritos en los apartados anteriores demuestran la versatilidad de la plataforma BAXS cuando se utiliza un conjunto adecuado de abrazaderas de montaje. Un sistema modular y personalizable montaje de la muestra, de acceso óptico y la posibilidad de añadir sensores adicionales (por ejemplo, una célula de carga), abre numerosas posibilidades para otros tipos de experimentos a realizar.
El protocolo presentado anterior contiene muchos pasos críticos que se deben realizar unadequately con el fin de producir los mejores resultados. Dentro del protocolo de células de estiramiento, de montaje en el sustrato de PDMS para las abrazaderas exige la manipulación delicada y precisa. El sustrato de PDMS debe estar bien centrada con respecto a las cuatro abrazaderas para evitar movimientos laterales no deseadas del sustrato durante el estiramiento. Tales movimientos laterales pueden hacer el seguimiento de las células difícil durante el estiramiento experimentos. Además, es crítico para controlar la evaporación de la gota de medio de cultivo durante la siembra de células cuando el sustrato esté hacia arriba en la incubadora. Dependiendo de la frecuencia con la que se abre la puerta de la incubadora durante el proceso, la tasa de evaporación puede cambiar. Dentro del protocolo de recipiente de estiramiento, el paso más crítico es la medición de las dimensiones de la muestra a ensayar. Estas dimensiones deben ser lo más preciso posible ya que están involucrados en el cálculo de la rigidez del tejido y por lo tanto tienen un impacto directo en los resultados. Tras la misma persona realice buque dmediciones IMENSIÓN ayudarán en la reducción de la variabilidad entre las muestras.
La fabricación de las abrazaderas utilizadas para tirar sobre el sustrato de PDMS durante los experimentos de estiramiento de células que participan varios ciclos de desarrollo. La primera versión de las abrazaderas no tenía una ranura de anclaje situado en la parte inferior de las partes cilíndricas (Figura 2B). Sin esta ranura, el sustrato se deslizó a lo largo de la parte cilíndrica, la inducción de una variabilidad significativa en la deformación del sustrato con el tiempo. Con la presencia de la ranura y la adición de PDMS curados (Figura 5F), el substrato ya no se desliza. Esta configuración experimental produce una deformación constante en el sustrato con el tiempo. Para el tejido de estiramiento experimentos, la elección de la célula de carga adecuada también es muy importante. La celda de carga utilizada aquí tiene un intervalo de carga baja (hasta 150 g), que es adecuada para las muestras analizadas aquí. La célula de carga muy sensible requerida para medicionesurante fuerzas de tracción en muestras pequeñas poseía una señal relativamente bajo ruido (s / n) relación. Para mejorar la s / n ratio y, por tanto, mejorar la resolución, la célula de carga se eléctricamente aislado del motor de bobina de voz y cualquier pieza de metal con tornillos de plástico y espaciadores. De esta manera se obtuvo una alta relación de s / n con una resolución de 0,03 g. Para muestras más suaves, se recomienda el uso de una celda de carga de rango inferior con el fin de mantener una alta resolución.
Actualmente, la principal limitación de la plataforma BAXS es la capacidad para llevar a cabo experimentos a largo plazo de estiramiento debido a la evaporación del tampón HBSS con el tiempo. La evaporación del agua aumenta la concentración de soluto que potencialmente pueden tener un efecto sobre las células. Con la configuración actual de la plataforma BAXS, es difícil tener un experimento que estimular mecánicamente las células o tejidos sobre días como el tampón en el que se sumergen las células y tejidos tiene que ser supplem ented con el líquido a través del tiempo. En la configuración actual, la velocidad de evaporación es de aproximadamente 0,9 ml / h a partir de un volumen inicial de 25 ml de solución tampón HBSS. El ajuste actual es ideal para experimentos a corto plazo. Para realizar celular fiable y estiramiento de los tejidos experimentos durante períodos más largos de tiempo, se sugieren dos adiciones: 1) Un sistema fluídico para el mantenimiento de volumen de tampón, y 2) la adición de una cámara de la incubadora construido comercial o en el hogar que encierra todo el sistema a fin de mantener humedad constante y temperatura y proporcionar una atmósfera de CO 2 / aire 5% / 95%. En cuanto a la opción de estirar los tejidos vasculares, la configuración descrita anteriormente nos permitió medir la rigidez de vasos de pequeño calibre. Es importante la utilización de los pins con un diámetro adecuado para asegurarse de que no se deforme durante el estiramiento, pero son lo suficientemente pequeños para caber en la luz del vaso. No tomar en cuenta este detalle podría introducir inexactitud en la deformación medida del tejido.
ve_content ">In vivo, las células de tejido incrustado-están expuestos a fuerzas mecánicas y cepas que varían tanto espacial como temporalmente, pero lo más importante que a menudo multiaxial son. Un buen ejemplo es el comportamiento mecánico de las paredes de la vasculatura en respuesta a las fuerzas hemodinámicas. La combinación de fuerzas hemodinámicas locales 28-30 con las propiedades anisotrópicas de los tejidos vasculares 13,14,16,27 resultado en un microambiente mecánica compleja, que expone a las células endoteliales y musculares lisas vasculares a los campos multiaxiales y la tensión cíclica complejas. Aunque los experimentos de estiramiento celulares existentes han contribuido en gran medida a la comprensión básica de mechanotransduction y mecanobiología, han confiado tradicionalmente en campos de deformación uniaxial o biaxial equi idealizadas que no se reproducen in vivo campos complejos de la cepa 8-10,19,29,31-34 . La plataforma permite BAXS celular biaxial anisotrópico estiramiento con live-cel simultáneal microscopía. La capacidad de controlar la deformación del sustrato a lo largo de dos direcciones ortogonales nos permite tener un control total sobre el campo de deformación. Esto permite la producción de campos de tensiones complejas, además de campos de deformación uniaxial y equi-biaxial simples. Por otra parte, la plataforma nos permite cambiar dinámicamente la dirección del campo de deformación en el mismo experimento de estiramiento.
La opción de integrar un sistema de fijación modular y personalizada abre la posibilidad para muchas aplicaciones en mecanobiología celular y la mecánica de tejido utilizando una sola plataforma de estiramiento. Por ejemplo, con sistemas de sujeción adecuados 13,27, esta plataforma puede llevar a cabo el ensayo de tracción uniaxial y biaxial plana de tejidos biológicos. De esta manera, las propiedades mecánicas de cualquier tejido, cortar en una forma rectangular o cuadrada, se pueden cuantificar a lo largo de dos ejes ortogonales en un solo experimento. Además, la realización de un histológiconalyses después de la estimulación mecánica puede revelar cambios estructurales inducidas por el estiramiento de los tejidos. La torsión es también un tipo muy importante de la carga mecánica para el músculo y ligamentos 35. Esta plataforma proporciona el potencial para diseñar un sistema de sujeción que podrían inducir una rotación alrededor del eje de estiramiento para producir una carga mecánica combinatoria implica la torsión y la tensión. También es posible evaluar vasos de mayor calibre con pasadores de montaje apropiados. El estudio de las respuestas celulares después de la deformación mecánica es también objeto de intensa investigación. La plataforma BAXS ofrece una característica única de cambiar la dirección y la complejidad del campo de deformación en el mismo experimento además de permitir para formación de imágenes simultánea. Es importante destacar que, formas multimodales de microscopía son todavía posibles, como la plataforma no interfiere con el eje óptico del microscopio. Esta es una característica importante como las respuestas de las células en vivo estructurales y bioquímicos a d mecánicoeformation se puede medir. Tomados en conjunto, el diseño de la plataforma BAXS posee varias características importantes que facilitan su uso para una sola célula y experimentos de todo el tejido. Mediante el empleo de un sistema de fijación modular y la adición de hasta cuatro posibles células de carga, la plataforma BAXS puede ser empleado para una multitud de experimentos. Este artículo muestra los detalles de dos ejemplos de experimentos; sin embargo, la modularidad y la flexibilidad del sistema pueden ser explotadas más allá para entender muchos aspectos diversos de mecanobiología en las escalas de longitud tejido subcelulares, celulares y enteros.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
DT fue apoyado por una beca postdoctoral del Le Fonds de recherche du Québec-Nature et Tecnologías (FQRNT) y un Elevate Estratégico Fellowship MITACS. CMC fue apoyado por una beca postdoctoral de Le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) y el Ernest y Margaret Ford cardiología dotado beca de investigación de la Universidad de Ottawa Heart Institute. EOB fue apoyada por subvenciones de funcionamiento MOP80204 del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) y T6335 de la Heart and Stroke Foundation de Ontario. El CIHR y Medtronic proporcionan colectivamente EOB con una Cátedra de investigación revisada por pares (URC # 57093). AEP es financiada por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC) Descubrimiento Grant, un Suplemento NSERC Discovery Accelerator y agradecidamente reconoce el apoyo de las Cátedras de Investigación de Canadá programa (CRC) y el Premio Investigador Temprana de la Provincia de Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
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