Summary
Nous présentons dans cet article une nouvelle plate-forme d'étirage qui peut être utilisé pour étudier les réponses des cellules individuelles à une déformation mécanique biaxial anisotrope complexe et quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques.
Abstract
Des outils qui permettent l'application de forces mécaniques de cellules et de tissus ou qui peuvent quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques ont contribué considérablement à la compréhension de mécanobiologie de base. Ces techniques ont été largement utilisés pour démontrer comment l'apparition et la progression de diverses maladies sont fortement influencés par des signaux mécaniques. Cet article présente une plate-forme multi-fonctionnelle étirage biaxial (Baxs) qui peuvent soit stimuler mécaniquement des cellules individuelles ou de quantifier la rigidité mécanique des tissus. La plate-forme est constituée de quatre Baxs moteurs à bobine mobile qui peuvent être contrôlés de manière indépendante. Les cellules individuelles peuvent être cultivés sur un substrat flexible qui peut être attaché aux moteurs permettant une pour exposer les cellules à des champs de contraintes complexes, dynamiques, et variant spatialement. A l'inverse, par incorporation d'une cellule force de charge, on peut aussi quantifier les propriétés mécaniques des tissus primaires tels qu'ils sont exposés à des cycles de déformation.Dans les deux cas, un ensemble propre de pinces doit être conçu et monté sur les moteurs de plate-forme Baxs afin de maintenir fermement le substrat flexible ou le tissu d'intérêt. La plate-forme Baxs peut être monté sur un microscope inversé pour effectuer simultanément la lumière transmise et / ou de l'imagerie de fluorescence d'examiner la réponse structurelle ou biochimique de l'échantillon au cours d'expériences d'étirement. Cet article fournit des détails expérimentaux de la conception et de l'utilisation de la plate-forme Baxs et présente les résultats pour une seule cellule et études de tissus entiers. La plate-forme Baxs été utilisé pour mesurer la déformation des noyaux dans des cellules de myoblastes de souris individuelles en réponse au substrat souche et de mesurer la rigidité d'aortes de souris isolées. La plate-forme Baxs est un outil polyvalent qui peut être combiné avec différentes microscopies optiques afin de fournir de nouveaux aperçus mécanobiologique au niveau des tissus sous-cellulaire, cellulaire et tout.
Introduction
Le micro-mécanique joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que la prolifération, la migration, la différenciation et qui ont un impact considérable dans le développement et l'homéostase des tissus et également dans des maladies 6.1. Au fil des ans, une multitude d'outils expérimentaux ont été utilisés pour stimuler mécaniquement les cellules ou les tissus et mesurer les propriétés mécaniques des tissus biologiques avec l'objectif d'accroître notre compréhension de mécanobiologie de base et l'étude de l'apparition et la progression des maladies 6-17. Cependant, il faut souvent compter plusieurs différents dispositifs expérimentaux en vue d'atteindre les objectifs d'une étude particulière. Cet article présente une plate-forme unique, multi-fonctionnel, étirage biaxial (Baxs) qui permet à des études qui se penchent sur le rôle que les propriétés mécaniques et les forces mécaniques jouent en biologie à la sous-cellulaire à des échelles de longueur de tissu ensemble. La plate-forme Baxs permet non seulement de la quantification des propriétés mécaniques des tissus isolés, mais aussi facilite l'aptitude à appliquer des champs de contrainte simples, complexes et dynamiques pour les cellules vivantes, pour comprendre leur réponse à l'étirement qui se produit in vivo. La plate-forme Baxs maintient également la capacité d'effectuer la microscopie de cellules vivantes au cours des essais et les perturbations mécaniques sur des cellules et des tissus.
La plate-forme Baxs est un appareil sur-mesure qui peut être utilisé pour étudier l'effet de la déformation du substrat au niveau cellulaire, et effectuer des essais de traction sur des tissus biologiques (Figure 1A). Un dispositif de chauffage de l'aluminium a été fabriquée pour recevoir une boîte de Petri de 10 cm standard et maintenir des solutions physiologiques à 37 ° C en utilisant un régulateur de température et chauffe kapton (Figure 1B). Cette plate-forme de Baxs peut être intégré sur un contraste de phase inversée et / ou le microscope de fluorescence et permet une imagerie simultanée (Figure 1C).En bref, la plate-forme Baxs se compose de quatre moteurs à bobine mobile linéaire dont les parties mobiles sont montées sur des mini-billes à mouvement linéaire portant des glissières orientées le long de deux axes perpendiculaires (figure 1D). Un étage de positionnement linéaire est monté à chacun des quatre moteurs pour permettre le mouvement vertical de l'ensemble de serrage qui sera utilisée (Figure 1E). La position de chaque moteur est contrôlée par un codeur optique avec une résolution de 500 nm (Figure 1F). Les quatre moteurs sont commandés indépendamment avec un contrôleur de mouvement employant retour codeur optique pour exécuter des commandes de mouvement (figure 1G). Une interface de LabVIEW fournit un contrôle total sur la grandeur de déplacement, la vitesse, et l'accélération de chaque moteur afin de générer une déformation complètement personnalisable, statique et dynamique, des cellules ou des échantillons de tissus.
La technique utilisée pour induire une déformation dans les cellules est obtenue par simple allowing de cellules à adhérer fermement à un substrat flexible et transparent, et puis en étirant ce substrat en utilisant les quatre moteurs de la plate-forme Baxs. La plate-forme Baxs permet le montage de n'importe quel ensemble de pinces pour fixer le substrat sur les moteurs à bobine mobile conçu sur mesure. A cet effet, nous avons conçu un ensemble de pinces à laquelle un substrat flexible et transparente, faite de polydiméthylsiloxane (PDMS), peut être fixé (figures 2A-C et Figure 3). Comme les pinces seront exposés à des solutions physiologiques, toutes les pièces ont été usinés à partir d'acier inoxydable pour permettre la stérilisation. Ces colliers de serrage ont été soigneusement conçus pour amener le substrat le plus près possible de l'objectif du microscope pour améliorer la qualité de l'image tout en réduisant au minimum la contrainte sur le substrat lors de l'étirage (Figure 2D).
La même plate-forme de Baxs peut également être utilisée pour quantifier la rigidité de petits échantillons de tissu, en utilisant un ensemble approprié de pinces avec des adapted supports pour les échantillons de tissu et une cellule de charge pour surveiller les forces. Plusieurs approches peuvent être utilisées pour monter un tissu pour les moteurs de plate-forme Baxs; dans ce cas, les inox minutiens insectes broches peuvent accrocher à travers l'ouverture des tissus vasculaires afin d'effectuer des essais de traction (figures 4A-B). En variante, pour les tissus épais sans une ouverture naturelle, des bords de tissus peuvent être soit maintenues en position avec les pinces fixées aux moteurs à bobine mobile ou collés sur les petites lames de verre avec de la colle biologique et attachés aux moteurs avec les pinces. Afin d'effectuer la traction teste une cellule de charge miniature est nécessaire et peut être facilement incorporée sur les moteurs de plate-forme Baxs et sert à mesurer la force agissant sur le tissu pendant un cycle d'étirage (Figure 4C). Comme la plate-forme Baxs est composé de quatre moteurs, l'introduction d'une seconde cellule de charge permet d'effectuer les essais de traction le long de deux directions orthogonales. Cette capacité permet de QUANTIFy la rigidité mécanique d'un tissu unique le long de deux directions perpendiculaires au cours de la même expérience.
Fait important, dans toutes les configurations, les cellules ou des échantillons de tissus d'intérêt sont toujours maintenues dans un bain à température contrôlée qui est accessible à l'utilisateur. Cette capacité permet l'introduction d'agents pharmacologiques échantillon pendant l'étirage, afin d'examiner la réponse temporelle de l'échantillon. De plus, comme l'axe optique du microscope inversé reste dégagée, toutes les formes de microscopie sont encore à la disposition de l'utilisateur. Enfin, comme toutes les quatre moteurs de la plate-forme Baxs sont indépendantes, il est possible d'appliquer des champs de déformation hautement configurables à l'échantillon d'intérêt. Dans des cellules et des tissus in vivo sont exposés au complexe et anisotrope étirement qui peut être plus appropriée imité dans cette plate-forme, par opposition à uniaxiale plate-forme d'étirement 7,13,15,18,19 traditionnelle. En outre, les caractéristiques physiquesdu champ de déformation peut être modifié à la volée lors d'une expérience. Ces capacités permettent à l'utilisateur d'examiner la réponse cellulaire et tissulaire à niveau d'un grand nombre de très complexe, anisotrope, temporellement et spatialement divers champs de déformation. Cet article décrit les avantages et les limites de la plate-forme Baxs ainsi que sa conception, les principes de fonctionnement et les détails expérimentaux pour une seule cellule et expériences de tissus entiers.
Figure 1. Vue d'ensemble de la plate-forme Baxs. A) Vue du haut de la plate-forme Baxs montrant les quatre moteurs à bobine mobile. B) de l'image détaillée de la boîte de chauffage Petri utilisé pour maintenir les cellules et les tissus à 37 ° C. C) La plate-forme peut être monté sur un microscope inversé à effectuer en direct imagerie cellulaire lors des expériences étirement.D) image détaillée du moteur à bobine mobile; la partie mobile de la plate-forme. E) image détaillée de la phase de positionnement linéaire permettant le déplacement vertical des systèmes de serrage. F) d'image détaillée de l'encodeur optique qui fournit la position en temps réel du moteur au contrôleur de mouvement G) de l'image détaillée. de la commande de mouvement montrant les quatre entrées du codeur optique et des sorties de puissance pour les quatre moteurs à bobine mobile.
Figure 2. Système de serrage pour les expériences étirement des cellules. AB) Les photos montrant les détails des pinces servant à fixer le substrat de PDMS pour des moteurs à bobine mobile pour l'étirage. C) Le substrat est enroulé autour de la partie cylindrique de la bride d'ancrage avec son features assis dans la rainure en haut. Ensuite, le substrat est fixé à l'aide des vis de fixation qui poussent le substrat / ancrage fonctionnalités dans la rainure supérieure. D) Illustration de la plate-forme Baxs avec les pinces maintenir le substrat en place. L'encart montre une vue de détail du substrat de cellules attachées à elle repose juste au-dessus d'une lamelle couvre-objet et l'objectif de microscope.
Figure 3. Projet de loi de matériaux de la membrane et son système de serrage. Dessins indiquant les dimensions des pièces principales intégrées à la plate-forme bi-axial pour effectuer des expériences étirement des cellules.
Figure 4. Exsuffisamment d'un système de serrage pour l'évaluation de la rigidité des petits vaisseaux de gros calibre. AB) des images détaillées de l'ensemble de serrage utilisé pour induire une déformation dans une aorte mm diamètre de la souris. Goupilles en acier inoxydable ont été soigneusement façonnés en triangles ouverts pour permettre au navire de coulisser sur les deux broches. C) Illustration de la plate-forme Baxs avec les pinces de fixation du récipient et une cellule de charge fixée entre le moteur et la bride fixe gauche. L'encart montre une vue de dessus détaillée du navire monté sur les broches.
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Protocol
1. Déformation mécanique des cellules individuelles
- Fabrication d'un substrat de PDMS avec des perles fluorescentes incorporées
Avant la fabrication du substrat, les microsphères fluorescentes dans une solution d'eau sont remis en suspension dans de l'isopropanol pour améliorer bourrelet mélange dans les PDMS à cause de son caractère hydrophobe.- Introduire à la pipette 500 ul de microsphères fluorescentes dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et centrifuger à 16 200 xg pendant 10 min.
- Jeter le surnageant et ajouter 500 ul d'isopropanol suivi à 5 min de vortex. Mettez le flacon de côté toute la nuit dans l'obscurité afin de permettre les grosses particules de granulats dans les sédiments.
- Le lendemain matin, retirez délicatement le surnageant dans un flacon à centrifuger propre. Cette solution de talon peut être utilisé pour fabriquer plus de 5 substrats. NOTE: La solution de perle va continuer à sédimenter pour les 3 prochains jours. Soyez prudent pour éviter la remise en suspension du culot.
- Verser 0,5 g de l'agent de durcissement prévueavec le kit PDMS dans un flacon à centrifuger de 1,5 ml en utilisant une balance scientifique. Par étapes successives, ajouter un total de 90 ul de billes (15 en six ajouts ul), vortex pendant 1 minute entre chaque addition. Mettre de côté.
- Peser 10 g de PDMS et mélanger pendant au moins 12 min avec 0,5 g de l'agent de durcissement supplémenté avec des billes fluorescentes.
- Fabriquer un SU-8 2050 moule en forme de croix en utilisant des techniques classiques de photolithographie en suivant les instructions du fabricant. Le moule utilisé a une hauteur de 320 pm et une surface de 13,4 cm 2 (figure 3). Le moule peut contenir 428 pi ou 440 mg de PDMS.
- Verser 400 mg de perles avec le PDMS dans le moule en forme de croix à l'aide d'une pipette de transfert et de durcir pendant 2 heures à 80 ° C. Après durcissement, se décoller du substrat à partir du moule (figure 5A). Le substrat peut être conservé dans une boîte de Pétri à température ambiante pendant 2 semaines, sans présenter de changements importants dans les propriétés mécaniques. Verser gouttelettes de PDMS (durcisseur: PDMS avec un ratio de 1:20) dans une boîte de Pétri avec une taille finale d'environ 4 mm de diamètre et de guérir les à l'envers pendant 2 heures à 80 ° C (figure 5B). Ces caractéristiques d'ancrage peuvent être conservés dans une boîte de Pétri pendant des semaines. NOTE: maintenir la coupelle à l'envers pour empêcher les gouttes de s'aplatir au cours du processus de durcissement.
- Traitement de l'air-plasma (30 sec à 30 W), le substrat et 8 caractéristiques d'ancrage. Lier les caractéristiques de chaque extrémité du substrat à une distance de 4 mm à partir de la forme carrée tiret présents sur le substrat (figure 5C).
- Membrane de montage sur les pinces
- Envelopper chaque extrémité du substrat autour de la partie cylindrique cannelée des pinces et le fixer en place avec les vis de fixation 2 à partir du haut (figure 2B et les figures 5D-E).
- Visser les 4 pinces sur le support de serrage et versez PDMS (rapport 1:20) en utilisant un t jetableransfert pipette à l'interface entre le substrat et la partie cylindrique rainurée des pinces. Répartir les PDMS non durcis autour de la partie cylindrique cannelée en utilisant une clé Allen de 1,5 mm.
- Verser PDMS (01h20) dans les rainures jusqu'à ce que complètement rempli par capillarité et de guérir l'ensemble à 80 ° C pendant 2 heures (figure 5F).
- Ensemencement des cellules sur la membrane
- Traitement de l'air-plasma (30 sec à 30 W) toute l'assemblée à stériliser et fonctionnaliser le substrat pour permettre revêtement de collagène.
- Fonctionnaliser la surface du substrat où les cellules sont ensemencées avec 1 ml de 0,02 M d'acide acétique additionné de 16 pg / ml de collagène de queue de rat à la température ambiante pendant 1 heure. La densité souhaitée finale en collagène est de 5 ug / cm 2.
- Rincer le 3x de substrat avec un tampon phosphate et le laisser sécher à la température ambiante pendant au moins 10 min.
- Ajouter 40 ul de milieu de culture supplémenté avec 10% de fœtus bovin serum et 1% de pénicilline-streptomycine contenant 2000 cellules dans la partie centrale du substrat pour couvrir une surface de 1 cm 2 (densité de cellules: 20 cellules / mm 2). La densité cellulaire peut être modifiée selon les exigences expérimentales.
- Mettre l'ensemble de l'assemblage dans un incubateur de culture cellulaire standard avec le substrat vers le haut avec la goutte de milieu de culture contenant les cellules sur elle. NOTE: Le montage doit être conservé avec le substrat vers le haut pendant au moins 3 heures pour permettre aux cellules de se fixer fermement. Pour empêcher l'évaporation, 30 ul de milieu de culture chaud est ajouté dans la goutte sur le substrat tout 45 min à 3 h.
- Après 3 heures, retourner l'ensemble de l'assemblage d'une boîte de Pétri remplie de milieu de culture frais pour immerger le substrat et incuber pendant une nuit pour permettre aux cellules de proliférer.
- Le lendemain, préparer une solution de sel tamponnée par HEPES (HBSS, 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO 4, 1,8 mM de CaCl2, et 11,1 mM de dextrose). Ajuster le pH à 7,4. REMARQUE: La solution HBSS doit être préparée chaque jour et maintenu à 37 ° C au cours des expériences. Cette solution physiologique est utilisé pour maintenir les cellules sur la platine du microscope en imitant l'environnement tissu / sang normal.
- Monter le set-up sur le contraste de phase inversée ou microscope à fluorescence Monter le montage pince-substrat sur la plate-forme et les moteurs Baxs. Remplissez la boîte de Petri dans le plat chauffe Petri avec du tampon HEPES (figure 2D).
2. Rigidité jaugeage des bateaux de petit calibre
- Préparation
- Solution physiologique de Krebs: Préparer une solution de 118,1 mM de NaCl, 11,1 mM de D-glucose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, et 2,5 mM de CaCl2. Ajuster le pH à 7,4 et oxygéner la solution avec du gaz médical de carbogène (95% O 2/5% CO 2) pendant 30 min. NOTE: La soluti Krebssur doit être préparé chaque jour et maintenu à 37 ° C au cours des expériences. Cette solution physiologique est utilisé pour maintenir les tissus vivants en imitant l'environnement tissu / sang normal.
- Recueillir l'instrumentation pour la dissection et l'évaluation mécanique des navires de l'aorte: ciseaux chirurgicaux, pinces courbées, micro-ciseaux, chirurgical dissection microscope, tubes de 50 ml à centrifuger en polypropylène, et 10 ml de pipettes sérologiques. La procédure chirurgicale et expérience ne nécessite pas de conditions stériles. Monter les mâchoires de la plate-forme Baxs avec la cellule de pesée à l'avance.
- Isolation des tissus et Dissection
Toutes les procédures expérimentales sur des animaux de laboratoire doivent être approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux des utilisateurs de l'institution, qui est conforme à la Guide de santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire des utilisateurs de pays.- Pratiquer l'euthanasie de la souris à l'inhalation de 99% de CO 2 (7 psi)dans une chambre en plexiglas (Figure 6A).
- Abdomen ouvert de la souris et couper l'aorte thoracique à saigner de la souris.
- Retirer le diaphragme, la cage thoracique et les lobes pulmonaires (figure 6B). REMARQUE: Pour réduire le risque d'endommager le tissu, garder le cœur attaché à l'aorte et éviter de toucher directement le navire, mais manipuler en utilisant le coeur.
- Retirez le cœur, la racine de l'aorte et l'aorte thoracique en coupant délicatement entre le navire et la colonne vertébrale. NOTE: Ne pas faire tout allongement dans le navire pendant l'excision de conserver la structure interne du tissu intact (figure 6C).
- Immerger immédiatement et garder le coeur et l'aorte dans une solution de Krebs.
- Couper et laver l'aorte dans une solution de Krebs pour enlever les caillots de sang attentivement. Retirer le tissu conjonctif à l'aide des micro-ciseaux, pince à épiler et chirurgicale dissection microscope (Figure 6D-E). REMARQUE: Conservez toute la longueur du navire et utilisez le pétrolier ravitailleurtic racine pour déterminer l'orientation de la cuve.
- Navire Dimension Détermination et montage
Pour déterminer la rigidité de l'enceinte, les dimensions du réservoir déchargées sont nécessaires et peuvent être déterminées avec un microscope étalonné.- Couper un anneau aortique d'environ 2 mm de longueur et de mesurer précisément la longueur avec un réglage (figures 6F-G) microscope calibré. Mettez de côté ce segment dans une solution de Krebs.
- Couper un autre anneau aortique aussi faible que possible entre chacun des segments de 2 mm (figure 6F). Mettez ce petit segment sur une lame de verre de microscope avec la lumière vers le haut et de mesurer l'épaisseur de la paroi à l'aide d'un réglage du microscope calibré (figure 6H).
- Remplir la boîte de Pétri sur la plate-forme Baxs avec une solution de Krebs et insérer le segment de bague d'aorte de 2 mm sur les broches de traction (encart sur la figure 4C).
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Figure 5. PDMS substrat fabrication et de montage A). Après durcissement, le substrat est soigneusement pelées 2050 moule SU-8 et mis de côté dans une boîte de Pétri. B) caractéristiques fabriqués à partir de PDMS ancrage et aident à garantir le substrat sur la pinces. C) Substrat avec ancrage caractéristiques prêts pour le montage. D) Le substrat est monté sur les 4 pinces, qui sont ensuite montés sur le support de serrage (voir encadré). E) image détaillée du substrat monté sur les 4 pinces. F ) Procédure de verser PDMS dans la rainure sous le substrat. La flèche indique le PDMS remplissage lentement la gorge par capillarité.
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Figure 6. Préparation et isolement de l'aorte thoracique. A) Préparation des instruments chirurgicaux et la souris euthanasiées. B) Grâce à une incision abdominale longitudinal, la cage thoracique et lobs pulmonaires sont retirés C). L'aorte est soigneusement éliminé en utilisant le cœur à manipuler le tissu. D) Le coeur et l'aorte sont mis dans une solution physiologique de Krebs. L'aorte est nettoyé en retirant tous les tissus conjonctifs. E) image détaillée montrant le cœur et l'aorte. F) secteur aorte utilisée pour l'évaluation de la rigidité avec de petits segments utilisés pour la mesure d'épaisseur. GH) La longueur exacte (G) et l'épaisseur (H) chacun des segments de vaisseau sont évaluées en utilisant un microscope inversé et un programme d'analyse.
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Representative Results
Cellule Stretching
La plate-forme Baxs a été utilisé pour étudier la réponse mécanique du noyau dans des cellules de myoblastes de souris simples (C2C12) est exposé à une déformation de substrat de 25%. Cellules myoblastes sont trouvées dans les tissus musculaires et sont constamment exposés à un étirement et une compression mécanique in vivo. Les propriétés de la forme et mécaniques du noyau cellulaire ont montré à jouer un rôle majeur dans la régulation de l'expression des gènes et de l'activité transcriptionnelle 20,21 et également dans une variété de défauts et de maladies telles que le syndrome de Hutchinson-Gilford progeria (HGPS), Emery développement -Dreifuss dystrophie musculaire (EDMD), cardiomyopathie dilatée, le vieillissement prématuré et cancer 22-25. Par conséquent, comprendre comment les forces de la micro-mécanique externe affectent la structure et la fonction du noyau est d'un intérêt extrême. La plate-forme Baxs a été utilisé pour étudier la transmission de la force de la mi croenvironment au noyau par l'étirement du substrat parallèlement à son axe majeur ou mineur. Figures 7A-F illustre les capacités de la plate-forme pour induire une déformation dans le substrat le long de deux directions orthogonales. En outre, la plate-forme Baxs peut induire des champs de contraintes complexes dans le substrat, en plus de uniaxiale niveau de champs de contrainte équi-biaxiale. Figures 7G-H illustre la flexibilité offerte par un contrôle indépendant du champ de déformation le long de deux directions orthogonales, ce qui nous permet soit de produire un standard (compression) ou pur (sans compression) champ de déformation uniaxiale. La plate-forme Baxs est capable de produire un champ de déformation uniaxiale pur en tirant légèrement le substrat dans la direction perpendiculaire à la direction principale (figure 7G) d'étirage afin de compenser la compression présent dans le substrat le long de cette direction lors d'un étirement uniaxial standard (Figure 7H ).
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Figure 7. Relations déplacement-déformation à partir de l'exécution standard et pur étirement uniaxial. AB) des billes fluorescentes sont sélectionnées manuellement sur la première image de la vidéo et le suivi d'une trame à l'autre jusqu'à ce que étirement maximal est atteint le long de l'horizontale (C) et vertical (D) les directions. Un script MATLAB calcule automatiquement les composantes du tenseur de déformation verte pour chaque trame, et donne une courbe d'étalonnage de la contrainte en ce qui concerne le moteur débattements 27. EF) Les lignes bleues et rouges correspondent à la composante de la souche verte tenseur le long de l'horizontale, et les directions verticale, respectivement. G) étirer le même substrat par 4 mm le long de l'axe x et un peu d'étirement le long duaxe des y de 1,5 mm (en surbrillance en rouge) produit un champ uniaxial pur sans déformation de compression dans le substrat. H) L'étirement du substrat le long de l'axe x de 3,5 mm produit une déformation de 25%, et une déformation à la compression de 7% lorsque les extrémités du substrat le long de l'axe vertical sont fixés (en rouge).
Avec l'aptitude à effectuer l'imagerie microscopique en temps réel des cellules au cours de tronçon, les noyaux ont été colorés avec un colorant fluorescent des cellules vivantes, qui se lie à l'ADN (Hoechst 33 342). En général, les cellules C2C12 possèdent des noyaux elliptiques ayant un axe majeur et mineur. Tout d'abord, les cellules ont été identifiées dans laquelle les axes majeurs ou mineurs nucléaires ont été orientées parallèlement à la direction d'étirement horizontal. À ce stade, les cellules ont été étirés de 25% le long de chaque axe orthogonal étirements tout en acquérant des images du noyau non déformée et déformée entre chaque cycle d'étirement (figures 8A-I). De cette manière, nous avons pu évaluer l'aptitude à la déformation du noyaule long de son axe majeur et mineur sous une déformation du substrat contrôlée avec précision. Ovuscule, un plugin ImageJ, a été utilisé pour déterminer la longueur des axes majeur et mineur nucléaires. Ces longueurs ont été enregistrées au cours de l'état non déformé, et quand le noyau a été étirée de manière séquentielle le long de ses axes majeur et mineur (Figures I-8G). Pour le calcul de la déformation du noyau le long de ses axes majeurs et mineurs, la variation relative de longueur le long de chaque axe dans les états non déformés et étirés a été calculée:
où ε est la déformation, L 1 est la longueur déformée et L 0 est la longueur non déformée.
L'aptitude à la déformation du noyau en C2C12 présente une anisotropie mécanique car il affiche une déformabilité plus élevée de façon significative le long de son axe mineur (6,3 ± 1,1%) par rapport à son axe principal (3.077; 0,6%) (figure 8J). En outre, nous avons également examiné le rôle de l'actine et microtubules du cytosquelette dans la régulation de la déformabilité nucléaire. Ceci a été obtenu par dépolymérisation des filaments d'actine ou de microtubules en utilisant sélectivement la cytochalasine D-et le nocodazole, respectivement. Dépolymérisation des filaments d'actine ou les microtubules a été trouvé pour induire une perte de la capacité de déformation anisotrope du noyau (Figure 8J). Ces résultats supportent les conclusions que les composants du cytosquelette transmettent les forces vers le noyau à partir du substrat et qui sont également essentiels pour conserver le comportement mécanique naturelle du noyau lors de la déformation 25.
Figure 8. Stretching protocole et déformabilité nucléaire. AC) Illustration schématique du stre protocole de tchhing d'une seule cellule avec son noyau orienté horizontalement. contraste de phase images (DF) et images épi-fluorescence (GI) d'une cellule colorées avec un colorant fluorescent spécifique de l'ADN. Cette séquence d'images illustre une expérience typique cellule d'étirage lorsque la même cellule est exposée à des champs de déformation orthogonales. Barres d'échelle sont de 25 um. J) C2C12 montre déformabilité nucléaire anisotrope avec l'axe de déformation beaucoup plus que le grand axe. Dans l'actine ou les microtubules des cellules privées (cyt-d et nocodazole, respectivement), cette anisotropie disparaît. Dans toutes les conditions, les déformations du noyau sont significativement différents de zéro dans le cadre d'une déformation du substrat de 25%. ** P <0,01, test t apparié. † † p <0,01, † † † p <0,001, t sur un échantillon-test.
Évaluation de la rigidité des vaisseaux
t "> Récemment, notre groupe a étudié l'effet de la chronique sur-expression de Heat Shock Protein 27 (HSP27 o / e) sur la formation de plaques aortiques dans un modèle de souris athérosclérose sujettes (apoE - / -). 26 Nous a montré que HSP27 agit comme une protéine athéroprotectrice qui réduit lipidique de la plaque et des macrophages abondance et augmente les intima des cellules musculaires lisses et la teneur en collagène (figures 9A-B). Afin de déterminer l'impact de ce remodelage histologique sur navire propriétés mécaniques, la plate-forme Baxs a été utilisé pour mesurer la rigidité aortique.La figure 9C montre une caractéristique courbe contrainte-déformation à partir de la tension d'étirage d'un anneau aortique. Pour quantifier la rigidité, le module supplémentaire a été calculée à partir des courbes de contrainte-déformation à une déformation de 30%. La rigidité est la pente de la tangente à la courbe. En introduisant une cellule de charge sur l'un des moteurs de plate-forme Baxs, l'acquisition simultanée de déplacemennt et des données de force est possible. Les courbes de déplacement de force ont été converties en courbes contrainte-déformation en fonction des dimensions non déformées de chaque anneau aortique. La contrainte et la déformation sont calculées en utilisant les formules suivantes:
où ε est la déformation, L 1 est la longueur déformée, L 0 est la longueur non déformée, s est la contrainte, la force F est 0 et A est la zone non déformée du tissu sous une charge. Dans le cas particulier d'un anneau aortique, la zone déformée (A 0) est deux fois l'épaisseur du temps de cycle, la longueur du segment.
Chaque échantillon a été déformé de manière cyclique avec une déformation maximale de 40% à une vitesse de déplacement de 50 um / s pendant 12 cycles avec les 11 premiers cycles permettant le préconditionnement du tissu et la last un pour l'acquisition de données. Nous avons constaté que la rigidité des segments aortiques de apoE - / - souris HSP27 o / e (62,8 ± 3,0 kPa) ont été significativement augmenté de 41% par rapport à l'apoE - / - modèle de souris de contrôle (44,4 ± 3,8 kPa) (figure 9D) .
Pris ensemble, l'évaluation mécanique combinée avec le récipient et la plaque d'histologie a montré que la sur-expression de HSP27 est caractérisée par une augmentation de la rigidité des vaisseaux et le collagène / lisse contenu de la cellule musculaire. Ces résultats suggèrent que HSP27 peut potentiellement augmenter la stabilité des lésions athéroscléreuses et donc de diminuer le risque de rupture de plaque.
Figure 9. Effet de HSP27 sur-expression de la rigidité des vaisseaux. Nous avons montré que la protéine HSP27 modifié la compo histologiquetion des lésions d'athérosclérose en augmentant les cellules musculaires lisse de l'intima (A: anti-α-SMA) et la teneur en collagène (B: picrosirius tache rouge) C) Typique courbe contrainte-déformation obtenue à partir de l'étirage d'un navire de l'aorte, où la raideur est calculée en 30. % de déformation. . La rigidité est la pente de la tangente (ligne rouge) à la courbe D) chronique sur-expression de HSP27 augmente navires rigidité en comparaison du contrôle apoE - / - un modèle de souris (D). Barres d'échelle dans (A) et (B) sont à la fois 40 um et 400 um dans les encarts. L = lumière, I = intima, pointillés délimite les médias. * P <0,05, ANOVA. *** P <0,001, ANOVA. Figure adaptée de l'œuvre de l'arrêt Cuerrier et al 26.
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Discussion
La plate-forme Baxs présenté ici facilite de nombreuses expériences dans l'étude de mécanobiologie, des enquêtes de cellules individuelles dans les tissus entiers. En outre, la plate-forme est très flexible et configurable, permettant ainsi à de nombreuses expériences de stimulation mécanique et les essais de traction multi-axiale. La plate-forme permet en outre le maintien des cellules et des tissus dans des conditions physiologiques et permet une microscopie simultanée au cours d'expériences d'étirement. Les deux expériences décrites dans les paragraphes précédents démontrent la polyvalence de la plate-forme lors de l'utilisation Baxs un ensemble approprié de crochets de fixation. Un système de montage modulaire et personnalisable échantillon, l'accès optique et la possibilité d'ajouter des capteurs supplémentaires (par exemple une cellule de charge), ouvrent des possibilités multiples pour d'autres types d'expériences à réaliser.
Le protocole présenté ci-dessus contient de nombreuses étapes cruciales qui doivent être effectuées undequately afin de produire les meilleurs résultats. Au sein du protocole d'étirage de la cellule, le montage du substrat de PDMS sur les pinces pour la manipulation exige délicat et précis. Le substrat PDMS doit être bien centré par rapport aux quatre pinces à éviter les mouvements latéraux indésirables du substrat lors de l'étirage. Ces mouvements latéraux peuvent faire le suivi des cellules difficile lors de l'étirage expériences. En outre, il est essentiel de contrôler l'évaporation de la goutte de milieu de culture au cours de l'ensemencement des cellules lorsque le substrat est tourné vers le haut dans l'incubateur. En fonction de la fréquence à la porte de l'étuve est ouverte pendant le procédé, le taux d'évaporation peut changer. Au sein du protocole de la cuve d'étirage, l'étape la plus critique est la mesure des dimensions de l'échantillon à tester. Ces dimensions doivent être aussi précis que possible, car ils sont impliqués dans le calcul de la rigidité des tissus et ont donc une incidence directe sur les résultats. Ayant la même personne à accomplir navire dLes mesures de DIMENSION participe à la réduction de la variabilité entre les échantillons.
La fabrication des pinces utilisées pour tirer sur le substrat de PDMS lors des expériences étirement de cellules impliqué plusieurs cycles de développement. La première version de pinces ne dispose pas d'une rainure d'ancrage situé à la partie inférieure des parties cylindriques (Figure 2B). Sans cette rainure, le substrat a glissé le long de la partie cylindrique, induisant une variabilité importante dans la déformation du substrat au cours du temps. Avec la présence de la rainure et l'addition de PDMS durcis (Figure 5F), le substrat ne glisse pas. Ce dispositif expérimental produit une déformation constante dans le substrat au cours du temps. Pour les expériences d'étirement des tissus, le choix de la cellule de charge appropriée est également très important. La cellule de charge utilisée ici a une plage de charge faible (jusqu'à 150 g), ce qui est suffisant pour les échantillons testés ici. La cellule très sensible à la charge requise pour les AMEors des forces de traction sur de petits échantillons possédait un signal relativement faible bruit (s / n) rapport. Pour améliorer le rapport signal / bruit et donc d'améliorer la résolution, la cellule de charge a été isolé électriquement du moteur à bobine mobile et les pièces métalliques à l'aide de vis et entretoises en plastique. De cette manière, un rapport élevé s / n avec une résolution de 0,03 g a été obtenu. Pour les échantillons plus tendres, l'utilisation d'une cellule de charge inférieure de la plage est recommandée afin de maintenir une grande résolution.
Actuellement, la principale limitation de la plate-forme Baxs est la possibilité d'effectuer des expériences de longue durée en raison de l'étirement de l'évaporation du tampon HBSS dans le temps. l'évaporation de l'eau augmente la concentration de soluté qui peut potentiellement avoir un effet sur les cellules. Avec la configuration actuelle de la plate-forme Baxs, il est difficile d'avoir une expérience qui stimuler mécaniquement les cellules ou les tissus au cours de jours en tant que tampon dans laquelle les cellules et les tissus sont immergés doit être supplém donné de liquide au cours du temps. Dans le contexte actuel, la vitesse d'évaporation est d'environ 0,9 ml / heure à partir d'un volume initial de 25 ml de solution tampon HBSS. Le réglage actuel est idéal pour les expériences à court terme. Pour effectuer cellule fiable et le tissu qui s'étend expériences sur des périodes de temps plus longues, deux ajouts sont proposés: 1) Un système fluidique pour le maintien du volume de la mémoire tampon, et 2) l'ajout d'une chambre de l'incubateur intégré commercial ou domestique enfermant l'ensemble du système afin de conserver humidité et température constantes et fournir un CO atmosphère à 5% / 95% 2 / air. En ce qui concerne l'option d'étirement des tissus vasculaires, la configuration décrite ci-dessus a permis de mesurer la rigidité des petits vaisseaux de gros calibre. Il est important d'utiliser des épingles avec un diamètre approprié pour faire en sorte qu'ils ne se déforme pas lors de l'étirage, mais sont suffisamment petits pour tenir dans la lumière du vaisseau. Ne pas prendre ce détail en compte pourrait introduire inexactitude dans la déformation mesurée du tissu.
ve_content ">In vivo, les cellules du tissu enrobé sont exposés à des forces mécaniques et les souches qui varient à la fois spatialement et temporellement, mais plus important encore, ils sont souvent multi-axiale. Un bon exemple est le comportement mécanique des parois du système vasculaire en réponse aux forces hémodynamiques. La combinaison des forces hémodynamiques locaux 28 à 30 avec des propriétés anisotropes de tissus vasculaires 13,14,16,27 de résultats dans un micro-mécanique complexe, ce qui expose les cellules endotheliales et du muscle lisse vasculaire de champs multi-axiales et des déformations cycliques complexes. Bien que les expériences étirement des cellules existantes ont grandement contribué à la compréhension de base de la mécanotransduction et mécanobiologie, ils ont toujours compté sur les champs de contrainte uniaxiale ou équi-biaxiale idéalisées qui ne reproduisent pas in vivo domaines complexes de contrainte 8-10,19,29,31-34 . La plate-forme permet Baxs anisotrope cellule étirage biaxial avec traduction simultanée en direct-cell microscopie. La capacité de contrôler la déformation du substrat selon deux directions orthogonales nous permet d'avoir un contrôle total sur le champ de déformation. Cela permet la production de champs de contraintes complexes, en plus de champs de contraintes uniaxiales et équi-biaxial simples. En outre, la plate-forme permet de gérer dynamiquement la direction du champ de contrainte au sein de la même expérience d'étirage.
La possibilité d'intégrer un système de serrage modulaire et personnalisé ouvre la possibilité pour de nombreuses applications dans mécanobiologie cellulaire et la mécanique des tissus en utilisant une seule plate-forme d'étirement. Par exemple, avec les systèmes de serrage appropriés 13,27, cette plate-forme peut effectuer des essais de traction uniaxiale et biaxiale plane des tissus biologiques. De cette manière, les propriétés mécaniques de tout tissu, coupé en une forme carrée ou rectangulaire, peuvent être quantifiés suivant deux axes orthogonaux dans une seule expérience. En outre, la réalisation d'une histologiquenalyses après stimulation mécanique peut révéler des changements structurels induits par l'étirement des tissus. Torsion est aussi un type très important de la charge mécanique pour les tissus musculaires et des ligaments 35. Cette plate-forme offre la possibilité de concevoir un système de serrage qui pourraient induire une rotation autour de l'axe d'étirage pour produire un chargement mécanique combinatoire impliquant torsion et de tension. Il est également possible d'évaluer plus gros vaisseaux de gros calibre avec des broches de montage appropriés. L'étude des réponses cellulaires suite à la déformation mécanique est également à l'étude intense. La plate-forme Baxs offre une caractéristique unique de changement de la direction et de la complexité des champs de contraintes au sein de la même expérience en plus de permettre à l'imagerie simultanée. Fait important, les formes multi-modales de microscopie sont encore possibles, comme la plate-forme n'interfère pas avec l'axe optique du microscope. C'est une caractéristique importante que les réponses des cellules vivantes structurales et biochimiques à d mécaniqueeformation peut être mesurée. Dans l'ensemble, la conception de la plate-forme Baxs possède plusieurs caractéristiques importantes qui facilitent son utilisation pour une seule cellule et expériences de tissus entiers. En utilisant un système modulaire de serrage et l'addition d'un maximum de quatre cellules de charge possibles, la plate-forme Baxs peut être utilisé pour une multitude d'expériences. Cet article présente les détails de deux exemples d'expériences; cependant la modularité et la flexibilité du système peuvent encore être exploitées pour étudier des aspects très divers de mécanobiologie à l'échelle sub-cellulaire, cellulaires et toute la longueur du tissu.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
DT a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de Le Fonds de recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) et un MITACS Elevate bourse stratégique. CMC a été soutenue par une bourse postdoctorale du Fonds le de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) et Ernest et Margaret Ford cardiologie doté bourse de recherche de l'Université de l'Institut de cardiologie d'Ottawa. EOB a été soutenu par des subventions d'exploitation MOP80204 de l'Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) et T6335 de la Fondation des maladies de l'Ontario. Les IRSC et Medtronic fournissent collectivement EOB avec une chaire de recherche évaluées par les pairs (URC # 57093). AEP est financé par les sciences naturelles et en génie (CRSNG) subvention à la découverte, un supplément CRSNG Discovery Accelerator et reconnaît avec gratitude le soutien des chaires de recherche du Canada (CRC) et une bourse de nouveau chercheur de la province de l'Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
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