Summary
Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.
Abstract
traduction de l'ARNm joue un rôle central dans la régulation de l'expression génique et représente le processus de consommer de l'énergie dans les cellules de mammifères plus. En conséquence, la dérégulation de la traduction des ARNm est considéré à jouer un rôle majeur dans une variété d'états pathologiques dont le cancer. Ribosomes accueillent également les accompagnateurs, qui facilitent le pliage des polypeptides naissants, modulant ainsi la fonction et la stabilité des polypeptides nouvellement synthétisés. En outre, les données indiquent que les ribosomes émergents servent de plate-forme pour un répertoire de molécules de signalisation, qui sont impliqués dans une variété de modifications post-traductionnelles des polypeptides nouvellement synthétisés tels qu'ils ressortent de la ribosome, et / ou des composants de la machinerie de translation. Ici, un procédé bien établi de fractionnement ribosome utilisant la centrifugation en gradient de densité de sucrose est décrite. En collaboration avec les pays développés "Anota" algorithme interne cette méthode permet la détermination directe de différentiel de traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. De plus, ce protocole polyvalent peut être utilisé pour une variété d'études biochimiques visant à disséquer la fonction des complexes protéiques associés au ribosome, y compris celles qui jouent un rôle central dans le repliement et la dégradation des polypeptides nouvellement synthétisés.
Introduction
Les réseaux de régulation qui contrôlent l'expression des gènes ont été étudiés dans les deux dernières décennies. La grande majorité de ces efforts de recherche axés sur la régulation transcriptionnelle, de sorte que des changements dans les niveaux d'ARNm à l'état stable à l'échelle du génome entier ont été utilisés pour déterminer les profils dits «expression génique». Des études récentes révèlent que les niveaux d'ARNm de l'état d'équilibre correspondent que faiblement à la composition du protéome 1,2, ce qui indique que les mécanismes post-transcriptionnels, y compris la traduction de l'ARNm, jouent un rôle majeur dans la régulation de l'expression génique 3,4. En effet, il a été estimé que ~ 50% des taux de protéines sont déterminés au niveau de la traduction de l'ARNm dans des fibroblastes de souris immortalisées 5.
traduction de l'ARNm est un processus hautement régulé au cours de laquelle les ARNm sont traduits en protéines par une action orchestrée des ribosomes, les ARN de transfert (ARNt) et les facteurs accessoires commonly dénommé facteurs de traduction (TFS) 6. La synthèse des protéines est un processus qui consomme le plus d'énergie dans les cellules de mammifères 7 et donc des taux de traduction de l'ARNm globales sont ajustés pour tenir compte de la disponibilité des nutriments et des taux de prolifération des cellules 8. En plus de modifications dans les taux globaux de la traduction de l'ARNm, divers stimuli extracellulaires (par exemple, les hormones et facteurs de croissance), des indices intracellulaires (par exemple les niveaux d'acides aminés) et différents types de stress (par exemple ER-stress) induire des changements sélectifs dans les piscines d'ARNm qui sont cours de traduction (translatome) 6. Selon le type de stimulus, l'activité de traduction de certains, mais pas tous les ARNm sont considérablement affectées, ce qui conduit à des changements dans le protéome qui sont nécessaires pour monter une réponse cellulaire rapide 6. Ces changements qualitatifs et quantitatifs dans le translatome sont pensés pour être médiée par l'interaction entre les facteurs agissant en trans (par exemple, 6,9. Par exemple, des changements dans les niveaux et / ou l'activité de limitation de vitesse initiation de la traduction eIF4E et facteurs eIF2 modulent sélectivement traduction des transcriptions sur la base des caractéristiques spécifiques 5'UTR 6. eIF4E et eIF2 sont nécessaires pour le recrutement de l'ARNm et l'ARNt initiateur au ribosome, respectivement 6. Une augmentation de l'activité de eIF4E renforce sélectivement la traduction des ARNm hébergeant 5'UTR longues et très structurées, y compris ceux codant pour la prolifération et la survie stimule les protéines, y compris les cyclines, c-myc et Bcl-XL 10. À son tour, l'inactivation de eIF2 conduit à la synthèse d'une protéine arrêt global, tout en régulant de manière sélective jusqu'à la traduction des ARNm contenant des inhibiteurs de courtes amont des cadres de lecture ouverts (uORFs) dans leurs 5'UTR, tels que ceux codant maître trégulateurs ranscriptional de la réponse de la protéine dépliée (par exemple ATF4). En réponse à divers stimuli, y compris les nutriments, les facteurs de croissance et les hormones, la cible mécaniste / mammalienne de la rapamycine (mTOR) voie stimule l'activité de eIF4E en inactivant la protéine 4E-liaison (4E-BP) de la famille des suppresseurs de la traduction, alors que la voie MAPK phosphorylé directement EIF4E 6,11. À leur tour, les kinases eIF2α (c.-à-PERK, PKR, HRI et GCN2) inhibent la phosphorylation de eIF2 par sa sous-unité régulatrice eIF2α en réponse à une carence en nutriments, ER-stress et infection par le virus 6,12. Les modifications de l'activité et / ou l'expression de facteurs de transcription, d'autres composants de la machinerie de translation et de facteurs de régulation, y compris miARN ont été observées dans divers états pathologiques y compris le cancer, les syndromes métaboliques, les troubles neurologiques et psychiatriques, et les maladies cardio-vasculaires et rénales 13-19. Collectivement, ces données indiquent que translationnelle moicanismes jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la cellule et que leur abrogation joue un rôle central dans l'étiologie de diverses maladies humaines.
Ici, un protocole pour le fractionnement des polysomes par centrifugation sur gradient de saccharose de densité dans des cellules de mammifère, qui est utilisé pour séparer les polysomes monosomes, à partir de sous-unités ribosomiques et messagers particules de ribonucléoprotéines (les mRNP) est décrite. Cela permet une discrimination entre traduit efficacement (associé à polysomes lourds) de mal traduits (associé à polysomes légers) ARNm. Dans ce dosage, les ribosomes sont immobilisés sur la traduction de l'ARNm en utilisant des inhibiteurs d'allongement tels que la cycloheximide 20 et des extraits cytosoliques sont séparés sur 5-50% de saccharose linéaire des gradients de densité par ultracentrifugation. Fractionnement ultérieur des gradients de saccharose permet l'isolement d'ARNm en fonction du nombre de ribosomes se lient à elles. ARN extrait à partir de chaque fraction peut être ensuite utilisée pour déterminerdes changements dans la distribution des ARNm à travers le gradient entre des conditions différentes, de sorte que l'efficacité de translation augmente à partir du haut vers le bas de la pente. Northern blot ou transcription inverse polymérase quantitative de la chaîne (qRT-PCR) sont utilisées pour déterminer les niveaux d'ARNm dans chaque fraction.
Alternativement, les fractions contenant polysomes lourds (généralement plus de 3 ribosomes) sont regroupées et les taux d'ARNm de polysomes associés génome entier sont déterminées à l'aide microarray ou séquençage profond. Il est de la plus haute importance de souligner que les niveaux d'ARNm de polysomes associés sont, en plus de la traduction, affecté par des mécanismes de transcription et de post-transcriptionnel qui influent sur les niveaux de ARNm cytosolique 21. Par conséquent, afin de déterminer les différences de translation à l'aide des données de l'ensemble du génome à partir d'ARNm de polysomes associée, il est nécessaire de corriger les effets des étapes de la voie de l'expression des gènes qui sont en amont de traduction 21. Pour permettre une telle correction, ARN cytosolique est préparé en parallèle avec l'ARN de polysome-associé de chaque échantillon et les taux d'ARNm de l'état d'équilibre du génome sont déterminés 21. Actuellement, soi-disant «traduction-efficacité" (TE) marque (c'est à dire le journal de rapport entre les données d'ARNm polysomes associés et les données d'ARNm cytosolique) sont souvent employés pour corriger les effets des changements dans les niveaux d'ARNm cytosolique sur la traduction efficacité d'un compte tenu de l'ARNm 22. Cependant, en utilisant les scores TE pour identifier traduction différentiel est associée à un nombre important de faux résultats positifs et faux négatifs en raison d'une propriété mathématique des scores TE communément appelés corrélation comme faux 27. En effet, une enquête sur les ensembles de données provenant de plusieurs laboratoires indiqué que ces fausses corrélations semblent inévitables lors de l'analyse des changements dans les translatomes 23. Cela a incité le développement de l '«analyse de tr différentiel anslation "(Anota) algorithme, ce qui ne présente pas les inconvénients précités 23. Pendant Anota-analyse d'un modèle de régression est utilisée pour dériver des mesures de l'activité de translation indépendants des niveaux d'ARN cytosoliques. Ces mesures sont ensuite comparées entre les conditions et une statistique est calculée. L'utilisateur a la possibilité d'application d'un procédé de retrait de la variance, ce qui permet d'améliorer la puissance statistique et réduit l'apparition de résultats faussement positifs dans les études avec quelques répétitions 24. De manière significative, il a été récemment démontré que des perturbations dans la translatome capturés par Anota, mais pas les partitions TE, en corrélation avec les changements dans le protéome 25. Par conséquent, il est fortement recommandé d'appliquer l'analyse de Anota pour l'identification des changements de traduction à l'échelle du génome entier. Alors que les fondements théoriques de l'algorithme de Anota ont été discutés en détail précédemment 21,23,26, ici l'accent est mis sur la façon de l'appliquer dans la pratique.
ve_content "> En plus de l'étude des changements dans l'activité de traduction de l'ARNm dans la cellule, ce protocole de fractionnement ribosome peut être utilisé pour isoler et biochimiquement et fonctionnellement caractériser-et ribosome complexes protéiques polysomes associés. Cette approche a bien été déployée dans le passé pour identifier complexes qui régissent la stabilité des polypeptides nouvellement synthétisés 27 et / ou sont impliquées dans la phosphorylation des composants de la machinerie traductionnelle. Cette application de la méthode de fractionnement polysome seront également brièvement discutées.Protocol
1. Gradient de saccharose Préparation
- Préparer 100 ml de 60% (p / v) de solution de saccharose dans le trou DDH 2 O. La solution doit être filtrée à travers un filtre de 0,22 um pour éviter le colmatage de la tuyauterie au cours de l'étape de fractionnement (étape 3.5).
- Préparer 5 ml de tampon 10x à gradient de saccharose: mM HEPES 200 (pH 7,6), 1 M de KCl, 50 mM de MgCl2, 100 ug / ml de cycloheximide, 1x inhibiteur de protéase cocktail (sans EDTA), 100 unités / inhibiteur de la RNase ml.
- Utilisation de la solution à 60% préparée comme décrit dans l'étape 1.1, faire 40 ml de 5% et des solutions de saccharose de 50% dans un tampon de gradient de saccharose 1x.
- Utilisez le bloc de marqueur fourni avec le fabricant de gradient pour marquer le point à moitié plein sur chaque tube d'ultracentrifugation polyallomer pour la superposition (6 tubes d'ultracentrifugation au total). Utilisation de l'appareil couches fourni avec le fabricant de gradient, ajouter la solution de saccharose à 5% jusqu'à ce qu'il atteigne le point à moitié plein. Ensuite, ajouter la solution de saccharose à 50% à partir du bas jusqu'à ce que l'interface entre les deux solutions atteint le point à moitié plein. Une attention particulière doit être prise lors de cette étape afin que les gradients sont aussi semblables que possible, car cela est essentiel pour obtenir une bonne reproductibilité (voir ci-dessous).
- Souder des tubes de taux plafonds de zone fournies avec le fabricant de gradient et transférer les tubes scellés au support de tube sur le fabricant de gradient.
- Exécutez le fabricant de gradient pour obtenir un 5% à 50% de pente linéaire. 6 dégradés linéaires seront formés en quelques minutes par rotation à l'angle d'inclinaison élevé.
Remarque: Les gradients de saccharose peuvent être utilisés immédiatement ou sont conservés à -80 ° C pendant 6 mois.
2. L'isolement et la sédimentation des polysomes
- Selon le type de cellule, semences cellules dans 1-5 15 cm des boîtes de Pétri (~ 15 x 10 6 cellules) au moins un jour avant la lyse. Le jour des expériences cellules doivent être ~ 80% de confluence. Remarque: confluence optimale est essentielle, car la traduction et de prolifération taux sont directementproportionnels 8, et donc polysomes doivent être analysés dans les cellules en prolifération active (à savoir des taux de conversion vont baisser de manière significative dans plus de cellules confluentes alors faible confluence des cellules peut ne pas fournir suffisamment de matériel pour une analyse plus approfondie). Exceptions à cette règle peuvent être faites si par exemple l'expérimentateur est intéressé à étudier l'effet de l'inhibition de contact sur la traduction. Cependant, les cellules ne doivent pas être gardés sous conditions sur confluentes pendant trop longtemps, car cela peut avoir des effets involontaires sur le translatome.
Si transfection est nécessaire, la plupart des kits disponibles dans le commerce n'ont pas d'incidence niveaux polysome. Parce que le jour de la transfection, les cellules doivent être de 80 à 90% de confluence, il est recommandé de se propager les cellules 24 heures après la transfection et isoler les polysomes 48 h post-transfection de cellules de ~ 80% de confluence. - Incuber les cellules avec du cycloheximide à une concentration finale de 100 pg / ml dans un milieu de croissance pendant 5 min à 37 ° C et 5% De CO 2; et laver les cellules deux fois avec 10 ml de glace-froid 1x PBS contenant 100 pg / ml de cycloheximide. Cycloheximide est un inhibiteur traduction d'élongation qui «gèle» ribosomes sur l'ARNm, empêchant ainsi ribosome ruissellement 20.
- Grattez délicatement les cellules, dans 5 ml de glace-froid 1x PBS contenant 100 ug / ml de cycloheximide et les recueillir dans un tube de 50 ml. Il est important que cette étape est réalisée raisonnablement vite en laissant les cellules sur la glace pour une période de temps prolongée va considérablement diminuer la qualité de la préparation de polysome.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 425 ul de tampon hypotonique [(5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM de MgCl2, KCl 1,5 mM et 1 x inhibiteur de protéase cocktail (sans EDTA)], ajouter 5 ul de 10 mg / CHX ml, 1 ul de DTT 1 M, 100 unités d'inhibiteur de RNAse et vortex pendant 5 secondes, suivi par l'addition de 25 ul de 10% Triton X-100 (concentration finale 0,5%) et 25 ul de 10% de désoxycholate de sodium (concentration finale 0,5%) et vortex pendant 5 secondes. Due à un gonflement de la cellule, la mémoire tampon hypotonique va perturber la membrane plasmique, alors que les conditions de détergent doux sont utilisés pour solubiliser et cytosolique ribosomes du réticulum endoplasmique associée sans perturber l'enveloppe nucléaire.
- Des lysats de centrifuger à 16 000 x g pendant 7 minutes à 4 ° C et le transfert surnageant (~ 500 ul) dans un nouveau tube de pré-réfrigéré 1,5 ml. Mesurer la DO à 260 nm pour chaque échantillon à l'aide d'un spectrophotomètre et conserver 10% du lysat en entrée qui sera utilisé pour déterminer les niveaux d'ARNm à l'état stationnaire cytosoliques. Diluer l'entrée à 750 pi dans RNAse H 2 O, ajouter 750 ul de Trizol et gel rapide dans l'azote liquide.
- Transfert tubes d'ultracentrifugation contenant des gradients de saccharose dans des seaux de rotor pré-réfrigérés. Retirer 500 pi de haut de gradients de saccharose. Ajuster lysats de manière qu'elles contiennent le même diamètre extérieur (10-20 DO à 260 nm) dans 500 ul de tampon de lyse (décrit à l'étape 2.5) et les charger sur chaque gradient de saccharose.
Remarque: Il est important de charger immédiatement lysats sur les gradients, comme ce sera critique d'améliorer la qualité de la préparation de polysomes. - Soupeser chaque gradient avant l'ultra-centrifugation.
- Centrifugeuse à 222 228 xg (36 000 rpm), pendant 2 heures à 4 ° C en utilisant SW41Ti rotor.
Remarque: Afin de ne pas perturber les gradients de saccharose, l'option de freinage "faible" doit être sélectionné.
3. Polysomes fractionnement et d'extraction d'ARN
- Préparer le collecteur de fraction en le nettoyant avec de l'eau sans RNAse chaude contenant RNase ZAP (quelques sprays). Répétez cette étape avec RNAse eau chaude seulement. Mettez la lampe UV et d'attendre le feu vert apparaisse.
- Retirez délicatement les tubes du rotor et placer sur la glace. Allumez l'ordinateur, pompe, détecteur UV et collecteur de fraction. Régler la pompe à 3 ml / min et de fill le tube avec la solution de chasse [60% (p / v) de saccharose contenant 0,02% (p / v) de bleu de bromophénol] jusqu'à ce qu'il atteigne l'aiguille. Assurez-vous de voir au moins une goutte sortant de l'aiguille, et s'assurer qu'aucune bulle sont introduits dans la pompe seringue ou un tube.
- Placez tubes de 2 ml dans un collecteur de fraction. Lancez le programme d'analyse et de régler la sensibilité de + / - 10 MeV. Réglez "base de temps" à 100 sec.
- Positionner chaque tube d'ultracentrifugation dans le détecteur UV tout en veillant à ce que le tube est en position orthogonale. Percer le tube avec l'aiguille en tournant le bouton au-dessous du support de tube.
- Régler la pompe à 1,5 ml / min et de recueillir les fractions de réglage du temps de 30 s sur le collecteur de fractions (il en résultera ~ 750 pl dans chaque fraction). Mettez la pompe en position "à distance", démarrer la pompe et collecteur de fraction, et en même temps commencer à enregistrer à l'aide du traceur DAQ. Cela va démarrer un déplacement vers le haut de la gra de saccharosedient et une détection simultanée de l'absorbance UV à 254 nm. Arrêter la collecte dès la première goutte de solution de chasse tombe dans un 2 ml tube collecteur.
- Enregistrez le traçage au format csv et (une fois l'étape 3.7 est terminé), dans un tableur, procédez comme suit pour identifier le positionnement de chaque fraction dans le profil d'absorbance UV.:
- Sélectionnez la colonne contenant les valeurs correspondant à l'absorbance à 254 nm (canal 0).
- Créer un complot ligne de dispersion lisse des absorbances.
- Régler l'unité principale de l'axe X de 300 (valeur obtenue en divisant le volume de la 5% à 50% de gradient de saccharose (~ 12 ml) par le temps de collecte de chaque fraction (30 sec).
- Ajouter 750 pi de Trizol dans chaque fraction et flash geler les fractions dans l'azote liquide.
- Isoler l'ARN de polysome associée et cytosolique (de 2,6) en utilisant le protocole Trizol selon les instructions du fabricant. Pour augmenter le rendement de l'ARN, procéder à précision d'ARNpitation à -80 ° C pendant 30 min ou à -20 ° C pendant une nuit.
Remarque: En raison de la quantité d'ARN précipité à partir de fractions polysomique peut pas être clairement visible, il est recommandé d'ajouter transporteur. Ajouter 1 pl de support au tube avant l'étape de précipitation de l'ARN au cours du protocole Trizol. - Déterminer les fractions correspondent aux ARNm associé à> 3 ribosome (en utilisant l'approche décrite 3.6) et mettent ces fractions. Utilisez le kit ARN de nettoyage pour effectuer le nettoyage de l'ARN commun de polysome-associé et cytosolique (de 2,6). Soumettre des échantillons à une installation pour déterminer les niveaux d'ARNm du génome utilisant des puces ou profonde séquençage.
Si la traduction des ARNm spécifiques doivent être surveillés par RT-qPCR, il est recommandé d'utiliser 500 ng d'ARN (à partir de fractions regroupées contenant> 3 ribosomes ou ARN total) pour synthétiser l'ADNc.
Note: ARNm associés à> 3 ribosomes est fixé arbitrairement à représenter ARNm efficacement traduits et contenir plus de 80% des nouveaux synthétiserpolypeptides de taille 28,29. Y compris les fractions correspondant à la lumière (1-2), moyen (2-3) et polysomes lourds (> 3) serait avantageux, mais ceux-ci augmenter le nombre des échantillons par 2 fois (4 vs 2 par état) et donc la coût de l'expérience. Malgré le fait que il est prévu que la diminution du coût des profondes séquençage et analyse microarray à l'avenir, devrait favoriser cette dernière approche, il est conseillé lors de la validation, de la distribution des ARNm individuels est assuré dans chaque fraction.
4. Analyse des ARNm traduction échelle du génome
- Installez R, bioconductor et le paquet de Anota:
- Installez R (téléchargement de r-project.org) et commencer un R-session.
Note: R est disponible pour tous les systèmes d'exploitation et Anota sera exécuté sur chacun d'eux. - Installez bioconductor (bioconductor.org). Code R est interprété par l'(par exemple, la console de R R-terminal dans Windows - qui est lancé par double cliquant sur le raccourci R). Bioconductor est installé en tapant (dans le système R-terminale):
source ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite () - Installez le paquet bioconductor de Anota (et le paquet qvalue que Anota nécessite) en tapant (dans la borne R):
source ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite (c ("Anota", "qvalue")) - Vérifiez que le paquet a été installé et ouvrir le manuel de Anota en tapant (dans la borne R) avec succès:
bibliothèque ("Anota")
vignette ("Anota") - Remarque: L'aide supplémentaire pour toutes les fonctions qui sont utilisés dans l'emballage de Anota se trouve soit à la page web de Anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) ou en utilisant la fonction d'aide dans R. Par exemple, pour obtenir de l'aide sur la fonction anotaPerformQc aller à la R-terminal et le type (à noter que cela ne fonctionne que lorsque le paquet de Anota a été chargé):
bibliothèque ("Anota") # charge le package de Anota
? AnotaPerformQc # s'ouvre aide pour cette fonction
- Installez R (téléchargement de r-project.org) et commencer un R-session.
- Importer des données à R:
- Préparer des données d'expression pour l'analyse. Les données doivent être pré-traitées (par exemple normalisée et un contrôle de qualité) par rapport à la technique qui a été utilisée pour mesurer les niveaux d'ARNm. Les valeurs d'entrée doivent être transformées en log, le plus commun est log2. Compiler un tableau de données pour tous les échantillons d'ARN polysomes associés et un pour tous les échantillons d'ARN cytosoliques. La première colonne doit contenir le gène identifiants suivis par une colonne de données par échantillon; la première ligne doit inclure les noms des échantillons. Il est essentiel que les tables ont l'ordre d'échantillon identique et l'ordre des gènes identiques. Enregistrer les fichiers comme des fichiers texte délimité par des tabulations appelés "myPolysomeData.txt" et "myCytosolicData.txt".
- Dans cet exemple, deux classes d'échantillons sont utilisés (commande ou malade) avec 3 répétitions par classe, ce qui génère 6 échantillons avec cet ordre: C1, C2, C3, D1, D2, D3 dans les deux fichiers myCytosolicData.txt et myPolysomeData.txt. Anota nécessite au moins 3 répétitions par condition quand il ya deux classes d'échantillons. Ceux-ci devraient être répétitions biologiques indépendantes.
- Créez un répertoire qui contient les fichiers d'entrée de données (myPolysomeData.txt et myCytosolicData.txt). Ouvrir R partir de ce répertoire. Dans Windows / Mac cela peut être fait en copiant un R-raccourci dans ce répertoire et lancer R en utilisant ce raccourci (la travailler directement peut également être modifié à l'aide des menus déroulants ci-).
- Créez un fichier appelé myCode.R dans le répertoire nouvellement créé et l'ouvrir à l'aide d'un logiciel d'édition de texte. Ecrire le code dans ce fichier.
- Pour charger les données dans R écrire le code suivant au fichier myCode.R (n'oubliez pas de ré-enregistrer ce fichier après chaque ajout de code). Voici une s étape-par-explication de tep du code, mais tout le code pourrait aussi être écrit d'abord et la fonction de la source (qui exécute le code, voir ci-dessous) utilisé qu'une seule fois:
# # Cette charge la bibliothèque de Anota
bibliothèque (Anota)
# # Ceci charge les données d'entrée dans R
dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", header = TRUE, row.names = 1, sep = " t"))
dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", header = TRUE, row.names = 1, sep = " t")) - Exécutez le code dans R en tapant directement dans la borne R:
source ("myCode.R") - Vérifiez que les données ont été chargées avec succès en tapant (dans la borne R):
tête (dataCyto) # affiche haut du tableau dataCyto
tête (dataPoly)
- Identification des gènes différemment traduits:
- Générer un vecteur qui décritles catégories de l'échantillon (un vecteur est un type d'objet dans R). Ce vecteur doit refléter l'ordre de l'échantillon dans le myPolysomeData.txt et myCytosolicData.txt sorte que les trois objets ont un ordre identique des échantillons. Le vecteur sera utilisé lorsque l'instruction Anota autour duquel les échantillons à comparer. Ajoutez les lignes suivantes dans le fichier de myCode.R:
# # Notez que les échantillons répétés ont identiques classe de l'échantillon
# # Descriptions (ie "C" ou "D") dans ce vecteur.
myPhenotypes <- c ("C", "C", "C", "D", "D", "D") - Effectuer un contrôle de qualité de l'ensemble de données. Il ya un certain nombre de mesures de qualité qui doivent être évalués avant Anota peut être utilisé pour l'analyse. Ceux-ci sont exposés en détail dans le manuel de Anota. Ajoutez ce code à myCode.R fichier et l'enregistrer:
anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, DATAP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)
anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) - Exécutez le code en tapant dans R-terminal:
source ("myCode.R")
Cela va générer un certain nombre de fichiers de sortie, qui peut être examiné comme indiqué dans le manuel d'Anota. - Identifier les gènes différemment traduits. Les échantillons seront comparés en fonction de l'ordre alphabétique des noms fournis au paramètre "phenoVec" (c'est à dire le "myPhenotypes" vecteur), sauf s'ils sont spécifiés par l'utilisateur (en utilisant le paramètre "contrastes"). Ajoutez le code suivant à myCode.R fichier et la finition en utilisant la commande "source" à l'intérieur du R-terminal tel que décrit ci-dessus:
anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, DATAP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) - Utilisez l'aide pour anotaGetSigGenes pour comprendre comment le output est formaté et voir comment choisir les catégories échantillons pour comparer en tapant (dans la borne R):
anotaGetSigGenes? - Filtrer et intrigue gènes qui sont différentiellement traduits. Il ya plusieurs seuils qui peuvent être appliquées dans la fonction anotaPlotSigGenes et utilisation de l'aide sera de simplifier une combinaison personnalisée de ces seuils. Pour sélectionner des gènes analysés de façon fiable appliquer la (0,01) des paramètres minSlope (-0,5), maxSlope (1,5) et slopeP.
Remarque: En outre, les paramètres applicables aux RVM 23,26,30 taux de fausses découvertes (FDR) (0,15) et repliez les changements (log2 [1,5]) peut par exemple être utilisé pour identifier les gènes différemment traduits. D'autres filtres tels que "selDeltaPT" peuvent être utiles pour un filtrage plus strict (par exemple, la mise en selDeltaPT à log2 [1,5]). Il est également nécessaire de préciser que la comparaison doit être filtrée (en utilisant l'argument selCont). Appliquer les paramètres décrits en ajoutant la ligne suivante à la myCode.Rfichier:
anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) - Effectuer l'analyse à l'aide de la fonction de source de la borne R, comme décrit ci-dessus. Cela permettra également de générer une sortie graphique. L'examen de cette sortie est un bon point de départ pour évaluer la performance de l'analyse et identifier les changements nécessaires aux paramètres.
- Générer une table de sortie. Ajoutez le code suivant au fichier myCode.R:
write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = "MySignificantGenes.txt", sep = " t") - Exécutez le code en utilisant la fonction de source dans la R-terminal. Les colonnes de la table résultante sont expliqués dans l'aide de la fonction anotaPlotSigGenes.
- Générer un vecteur qui décritles catégories de l'échantillon (un vecteur est un type d'objet dans R). Ce vecteur doit refléter l'ordre de l'échantillon dans le myPolysomeData.txt et myCytosolicData.txt sorte que les trois objets ont un ordre identique des échantillons. Le vecteur sera utilisé lorsque l'instruction Anota autour duquel les échantillons à comparer. Ajoutez les lignes suivantes dans le fichier de myCode.R:
Representative Results
mTOR est un nœud important du réseau cellulaire qui coordonne les taux globaux de synthèse de protéines à la disponibilité des éléments nutritifs 19. traduction de l'ARNm est régulée principalement à l'initiation étape de limitation de vitesse 6. La proportion de ribosomes engagés dans les polysomes corrélation positive avec les taux d'initiation de traduction 28. Un exemple d'application de la méthode de fractionnement polysome pour étudier le rôle de la signalisation de mTOR dans la médiation des effets de l'insuline sur la traduction de l'ARNm est présenté. A cette fin, des cellules de cancer du sein humain MCF7 ont été maintenues dans du sérum bas et ensuite stimulées par l'insuline seule ou en combinaison avec l'inhibiteur de mTOR site actif Torin1. Les cellules non stimulées qui ont été constamment maintenus en bas sérum, ont servi de contrôle. mRNP, monosome (80S) et des fractions de polysomes ont été séparés en utilisant la méthode polysome de fractionnement. Par rapport aux cellules témoins, l'insuline a induit une augmentation de l'absorbance dans les fractions de gradient correspondantde polysomes, accompagnée d'une diminution concomitante de l'absorbance de la fraction d'monosome (figure 1). Ces résultats montrent que la proportion de ribosomes engagés dans les polysomes l'insuline est augmentée dans les traités par rapport aux cellules témoins, indiquant donc que, comme on s'y attendait, l'insuline stimule les taux globaux d'initiation de traduction. Torin1 inversé les effets de l'insuline sur les profils d'absorbance (Figure 1), ce qui confirme les conclusions que la signalisation mTOR joue un rôle majeur dans la médiation des effets de l'insuline sur la machinerie de traduction 19.
Basé sur un principe que les incohérences dans la préparation gradient ne peuvent être évités, des questions ont été soulevées quant à la reproductibilité des données obtenues en utilisant la méthode de fractionnement polysome 22. Pour tester empiriquement cette question potentiellement délétère, cytosolique et ARN polysome associée lourd (ARNm associé à 4 et plus de ribosomes) ont été isolés à partir de cellules MCF7 traitées par l'insuline seule ou en combinaison avec de l'insuline à partir de 4 répétitions Torin1 biologiques indépendants (figure 2). Les effets de l'insuline et Torin1 sur la composition du cytosolique et lourd ARNm polysome associée à chaque répétition a été déterminée sur une échelle du génome entier en utilisant une approche de microarray. Afin de déterminer la reproductibilité de la méthode de fractionnement polysomes l'analyse en composantes principales (ACP) a été appliquée. Cette analyse a montré que les échantillons appartenant à chaque état ont été positionnés fermement dans les deux premiers composants, tandis que les différentes conditions ont été bien séparés (Figure 2). Ces résultats montrent que la méthode de fractionnement polysome comme décrit ici est hautement reproductible et donc d'étudier les changements quantitatifs et qualitatifs de la traduction au niveau de l'ensemble du génome.
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Figure 1. Profils polysomal montrant les effets de la privation de sérum, de l'insuline et mTOR signalisation sur la conversion global dans les cellules MCF7. Des cellules MCF7 ont été privées de nutriments (maintenues dans 0,1% de FBS) pendant 16 heures et traitées avec 5 nM d'insuline (Ins), seul ou en combinaison avec 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) pendant 4 heures. Cellules non traitées qui ont été continuellement privés de nutriments (0,1% de FBS) ont été utilisés comme contrôle. Les extraits cytosoliques correspondants ont été sédimentées par centrifugation sur des gradients de 5 à 50% de saccharose. Sous-unités ribosomiques libres (40S et 60S), monosomes (80S) et le nombre de ribosomes dans les fractions de polysomes sont indiqués.
Figure 2. Données Genome-Wide obtenus en utilisant polysome profilage est hautement reproductible. des cellules MCF7 ont été traitées comme dans la figure 1. cytosolique et l'ARN de polysomes-associés (> 3 ribosomes) a été extrait à partir de 4 répétitions biologiques indépendants et leurs niveaux d'ARNm de l'ensemble du génome ont été déterminées en utilisant des tableaux GeneTitan (Affymetrix). PCA a été utilisé pour évaluer la reproductibilité des données résultantes. Présentés sont les deux premiers éléments de l'APC pour tous les traitements (T1 = Torin 1; ctrl = contrôle; Ins = insuline), l'origine de l'ARN (C = cytosolique; P = polysome associé) et réplique. Les échantillons provenant de la même condition et l'origine de l'ARN sont étroitement positionnés indiquant une reproductibilité élevée.
Discussion
Cet article décrit un protocole polysome fractionnement bien établie suivie par une méthode d'analyse développés en interne pour la capture des modifications qualitatives et quantitatives de l'activité de traduction à l'échelle du génome dans les cellules de mammifères. Pour la réussite de ce protocole une attention particulière devrait être accordée à 1) Cellule de confluence (comme les taux de prolifération et la disponibilité des éléments nutritifs en corrélation avec l'activité de traduction de l'ARNm et peuvent affecter la composition de la translatome, confluence cellulaire doit être homogène pour les répétitions et les conditions expérimentales), 2) la lyse cellulaire rapide (Malgré la présence de cycloheximide et les inhibiteurs de RNAse dans des tampons, lyse doit être rapide et extraits cellulaires doivent être superposées sur des gradients de saccharose, immédiatement après la lyse de prévenir la dégradation de l'ARN et la dissociation des polysomes), 3) la préparation de gradient (pour s'assurer grande reproductibilité des données, des gradients de saccharose doivent être préparés en utilisant la machine à gradient et spésoins sociale devrait être prise lors de leur manipulation).
En plus d'étudier les changements dans l'activité de traduction, ce protocole peut être utilisé pour isoler des complexes protéiques ribosomes associés et établir leurs fonctions physiologiques. A cet effet, les niveaux et l'état de phosphorylation de diverses protéines de ribosomes associés peuvent être déterminés par précipitation au TCA, suivis par transfert de Western, tandis que les complexes protéiques ribosomes associés peuvent être immunoprécipités à partir de fractions de gradient et analysées par Western blot ou spectrométrie de masse. Un inconvénient de cette technique est que la méthode de fraction de gradient lent pourrait entraîner la dissociation des protéines même étroitement liées dont la cinétique de liaison sont en rapide association / dissociation. Les facteurs associés à des polypeptides nouvellement synthétisés sont des exemples typiques. Des polypeptides nouvellement synthétisés émergents former les ribosomes peuvent être immobilisés sur des complexes protéiques associés à des ribosomes à l'aide des agents de reticulation chimiques tels que le 3, 3'-dithiobis [suifosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Cette approche a révélé que le récepteur pour C activée Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / facteur eucaryote d'élongation traduction 1A2 (eEF1A2) complexe régule la dégradation des polypeptides nouvellement synthétisés en réponse au stress 27. En outre, la méthodologie similaire a été utilisée dans des études montrant que la protéine kinase C BII (PKCbII) est recruté pour ribosomes par RACK1 32 et que l'activation du complexe mTOR 2 (mTORC2) se produit sur les ribosomes où elle phosphoryle polypeptides AKT nouvellement synthétisées et réglemente leur stabilité 33,34.
Les principales limites de la méthode polysomes de fractionnement, suivi par une analyse de Anota sont les suivants: 1) l'exigence d'un nombre relativement élevé de cellules (~ 15 x 10 6 cellules), 2) l'absence d'une information de position en ce qui concerne la localisation du ribosome sur une molécule d'ARNm donné, et 3 ) les questions liées à hétéro cellulaire et moléculairenéité de tissus normaux et tumoraux. Les questions liées au nombre de cellules nécessaires peuvent être résolus par l'alignement des pics des spectres d'absorbance correspondant à monosomes (80S) de cellules dont les montants sont de limiter à ceux obtenus à partir de cellules de haute abondance (par exemple des cellules HeLa) 35. Technique de profilage ribosome (voir ci-dessous) peut être utilisé pour déterminer la position exacte du ribosome sur une molécule d'ARNm donné, tandis que les questions liées aux effets de confusion de l'hétérogénéité des tissus sur l'interprétation des changements dans l'expression des gènes obtenus à partir de systèmes complexes tels que les tissus humains sont discutés en détail dans une publication de poireaux et Storey 36.
Récemment, une nouvelle technique de profilage ribosome a été développé, dans lequel des fragments de ribosome protégées (PRSA) sont générés par le traitement RNase I et analysés par séquençage profond 22. Cette technique permet de déterminer la position du ribosome à une résolution d'un seul nucléotide, fournissant ainsi jusqu'à UNPRidées ecedented en biologie ribosome. Par exemple, le profilage ribosome peut être utilisé pour la détermination de la densité du ribosome sur une molécule d'ARNm donné ou l'identification des éléments que les taux traduction de l'influence d'initiation tels que les sites d'initiation alternatifs, initiation aux codons non-AUG et des éléments de régulation tels que uORFs. Cependant, il existe plusieurs limites méthodologiques qui limitent la capacité de profilage ribosome d'estimer avec précision l'efficacité de traduction de l'ARNm. Il s'agit notamment des biais indépendants introduites par fragmentation aléatoire et RNAse je digestion, les biais introduits par les inhibiteurs de la traduction (par exemple des inhibiteurs allongement tels que l'émétine et cycloheximide sont susceptibles d'induire une accumulation ribosome à des sites d'initiation de la traduction), un grand nombre de faux résultats positifs et faux négatifs associés avec des scores TE ainsi que leur imprécision dans la prédiction du lit qui proviennent d'ARNm codant la protéine 37. Peut-être le plus important, alors queprofilage ribosome permet l'identification directe de la position du ribosome sur une molécule d'ARNm donné, le nombre de ribosomes qui est associé à un ARNm donné est estimée indirectement par la normalisation des fréquences de lit dans RPF (ARNm au ribosome-associé) au-dessus de celles observées dans les ARNm de façon aléatoire fragmentés (total ARNm). Par exemple, dans un cadre simple où quatre molécules d'ARNm «B» (Ba, Bb, Bc et Bd) sont occupés par quatre ribosomes dans les positions 1, 2, 3 et 4, une lacune inhérente à la technique de profilage de ribosome ne permettra pas une distinction entre un scénario où les 4 ribosomes associent uniquement avec un Ba ARNm dans les positions 1, 2, 3, et 4 et un scénario où Ba, Bb, Bc et Bd ARNm sont occupées chacune par un seul ribosome à la position 1, 2 , 3, et 4, respectivement. En revanche, au cours de polysomes fractionnement, polysomes intégrité est préservée, ce qui permet l'isolement de pools d'ARNm associées à un nombre défini de ribosomes (figure 1). Cette importationdistinction fourmi entre polysome fractionnement et le profilage ribosome suggère que tandis que la première méthode peut être utilisée pour comparer directement les ARNm dans mRNP, fractions légères et polysomes lourds, cette dernière méthode sera probablement pas à tenir compte des changements dans la translatome qui sont causées par des ARNm que la transition de s'allume pour polysomes lourds, tout en surestimant la contribution de ceux qui passer de la fraction mRNP à polysomes lourds. La signification biologique de ces différences entre les méthodes mentionnées ci-dessus est mise en évidence par une grande partie des données montrant que l'activation de la translation d'un sous-ensemble d'ARNm telles que celles qui sont eIF4E-sensible, de la transition du clair au polysomes lourds, tandis que d'autres, tels que ceux abritant éléments 5'TOP, sont recrutés pour polysomes lourds directement à partir de pools de libre ribosome-ARNm 6. Fait intéressant, la voie mTOR a été montré pour moduler de façon concomitante traduction pour "eIF4E sensible" et une 5'TOP ARNm1. Par conséquent, les différences méthodologiques qui sont discutés ci-dessus peuvent expliquer la discordance apparente de la conclusion d'une étude à l'aide de ribosome profilage 38,39 et polysome fractionnement 24 pour évaluer les effets de l'inhibition de mTOR sur la translatome.
En conclusion, les polysomes fractionnement et le profilage ribosome sont des méthodes complémentaires qui fournissent principalement des informations concernant le nombre de ribosomes associés à l'ARNm et de la position du ribosome sur l'ARNm, respectivement. Surtout, malgré les insuffisances et les avantages de ces méthodes, il demeure essentiel que les données de l'ensemble du génome obtenus par les deux procédures sont correctement analysés et fonctionnel et biochimique validés.
Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par les Instituts de recherche en santé (subvention des IRSC RdP-115195) et FRQ-S à l'informatique, qui est également récipiendaire du Prix du jeune chercheur des IRSC; et le Conseil suédois de la recherche et de la Société suédoise du cancer pour OL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Biobasic | HB0264 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | VWR | CABDH4532 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Biobasic | DB0058 | |
| Tris | Biobasic | TB0196 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9515 | RNA precipitation carrier |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1988 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 04693132001 | Tablets (EDTA-free) |
| RNase inhibitor | Promega | N2515 | |
| 0.45 µm Filter System 150 ml | Corning | 431155 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | RNA cleanup kit |
| Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW41Ti Rotor Package with accessories | Beckman Coulter | 331336 | |
| Optima L100 XP ultra centrifuge | Beckman Coulter | DS-9340A | |
| ISCO fraction collector | Brandel | FC-176-R1 | |
| Type II Detector with Chart Recorder | Brandel | UA-6 | UV detector |
| Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump | Brandel | BR-A86-5 | |
| UA-6 Detector Cable | Brandel | 60-1020-211 | |
| FC-176 Communication Cable | Brandel | FCC-176 | |
| Gradient Master Base Unit | Biocomp | 108-1 | Gradient Maker |
| Gradient Forming Attachments | Biocomp | 105-914A-1R | Gradient Maker attachment |
| Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device | MicroDAQ | USB-1208FS | Analysis software attachment |
| Measurement Computing Data Acquisition Software | MicroDAQ | TracerDAQ Pro | Analysis software (Download only) |
| 10x buffer for sucrose gradients: | |||
| 200 mM HEPES (pH7.6) | |||
| 1 M KCl | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 100 µg/ml cycloheximide | |||
| 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | |||
| 100 units/ml RNase inhibitor | |||
| Lysis buffer | |||
| 5 mM Tris-HCl (pH7.5) | |||
| 2.5 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM KCl | |||
| 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)] | |||
| Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text |
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